專利名稱：一種檢測奶粉中β-內(nèi)酰胺類抗生素的前處理方法及使用其的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于抗生素檢測的前處理方法及使用其的檢測方法，特別適用于檢測奶粉中的β-內(nèi)酰胺類抗生素。
背景技術(shù)：
目前國內(nèi)外關(guān)于奶粉中抗生素的檢測方法主要包括液相色譜-質(zhì)譜法、質(zhì)譜法和微生物抑制法。微生物抑制法檢測抗生素時，常用利普斯50試劑盒(ECLIPSE50)和戴爾沃SP-NT試劑盒(Delvotest SP-NT)進行抗生素檢測。其優(yōu)點能夠快速檢測且不依賴昂貴的檢測儀器。使用微生物試劑盒檢測奶粉抗生素時，需先向奶粉樣本中加水，將其稀釋成復(fù)原乳，再用試劑盒檢測。利用前述方法使用利普斯50試劑盒檢測奶粉中青霉素的檢出限為24-32 μ g/kg，利用前述方法使用戴爾沃SP-NT試劑盒檢測奶粉中青霉素的檢出限為16-24yg/kg。檢出限較高，不適用于對靈敏度要求更高的檢測。并且由于其樣本前處理過程中保留了奶粉中存在的所有抗生素，無法單獨檢測其中β_內(nèi)酰胺類抗生素的含量。在國家標準GB-T 21315-2007《動物源性食品中青霉素族抗生素殘留量檢測方法》及GB-T 22975-2008《牛奶和奶粉中阿莫西林、氨芐西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和雙氯西林殘留量的測定》中，均提到用液相色譜-質(zhì)譜或質(zhì)譜法檢測牛奶或奶粉中內(nèi)酰胺類抗生素的方法。檢測前牛奶或奶粉的前處理方法均包括沉淀蛋白和固相萃取過程，用以提取和凈化樣本中的β_內(nèi)酰胺類抗生素，GB-T21315-2007中的前處理方法還可以對樣本中的β _內(nèi)酰胺類抗生素起到濃縮作用，但經(jīng)前處理后的樣本用于抗生素的微生物試劑盒檢測時，空白樣本顯示陽性，檢測結(jié)果無意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是發(fā)明一種奶粉的前處理方法，待測奶粉經(jīng)過這種方法進行前處理后可使其中含有的β_內(nèi)酰胺類抗生素得到有效的凈化和濃縮，適用于β_內(nèi)酰胺類抗生素的微生物試劑盒檢測。本發(fā)明的另一目的是發(fā)明一種奶粉中β_內(nèi)酰胺類抗生素的檢測方法，先對待測奶粉進行前處理，再用微生物試劑盒進行檢測。這種檢測方法與傳統(tǒng)微生物試劑盒檢測方法相比，能夠單獨檢測奶粉中β_內(nèi)酰胺類抗生素，且具有較高的靈敏度。本發(fā)明提供了一種檢測奶粉中β_內(nèi)酰胺類抗生素的前處理方法，包括如下步驟向待測奶粉中加水并混勻，用乙腈-水溶液提取后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙腈，得到無乙腈上清液；在無乙腈上清液中加入磷酸鹽緩沖液，混勻后過HLB固相萃取柱凈化，得到洗脫液；用氮氣吹干洗脫液，得到沉淀物；將處理每克待測奶粉產(chǎn)生的沉淀物溶解在O. 5或ImL無抗生素液態(tài)奶中，制得待測奶粉的待檢測液。在前處理方法的一種示意性實施方式中，其中，乙腈-水溶液中乙腈與水的體積 比為3:1。
在前處理方法的一種示意性實施方式中，其中，提取的過程中，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min,離心時間為 8min。本發(fā)明還提供了一種奶粉中內(nèi)酰胺類抗生素的檢測方法，包括如下步驟向待測奶粉中加水并混勻，用乙腈-水溶液提取后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙腈，得到無乙腈上清液；在無乙腈上清液中加入磷酸鹽緩沖液，混勻后過HLB固相萃取柱凈化，得到洗脫液；用氮氣吹干洗脫液，得到沉淀物；將處理每克待測奶粉產(chǎn)生的沉淀物溶解在O. 5mL無抗生素液態(tài)奶中，制待測奶粉的待檢測液；以及用利普斯50試劑盒對待檢測液進行檢測。本發(fā)明又提供了一種奶粉中β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測方法，包括如下步驟向待測奶粉中加水并混勻，用乙腈-水溶液提取后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙腈，得到無乙腈上清液；在無乙腈上清液中加入磷酸鹽緩沖液，混勻后過HLB固相萃取柱凈化，得到洗脫液；用氮氣吹干洗脫液，得到沉淀物；將處理每克待測奶粉產(chǎn)生的沉淀物溶解在ImL無抗生素液態(tài)奶中，制得待測奶粉的待檢測液；和用戴爾沃SP-NT試劑盒對待檢測液進行檢測。本發(fā)明的檢測奶粉中β -內(nèi)酰胺類抗生素的前處理方法中，待測奶粉通過沉淀蛋白、固相萃取、氮氣吹干及無抗生素液態(tài)奶回溶的過程，不僅達到了凈化和濃縮的效果，且其最終溶解于無抗生素液態(tài)奶，適宜于β-內(nèi)酰胺類抗生素的微生物試劑盒檢測，避免了假陽性結(jié)果。并且有效降低了用微生物試劑盒檢測奶粉中β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢出限。本發(fā)明的奶粉中內(nèi)酰胺類抗生素的檢測方法通過對奶粉樣本進行特定的前處理，降低使用微生物試劑盒檢測奶粉中β_內(nèi)酰胺類抗生素的檢出限，使其達到更高的靈敏度，適應(yīng)快速并且靈敏度較高的奶粉工業(yè)化檢測。
具體實施例方式為了對發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合各實施例具體說明本發(fā)明。實施例I :一種檢測奶粉中β -內(nèi)酰胺類抗生素的前處理方法。I.儀器設(shè)備。離心機，漩渦混合儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，氮吹儀。2.試劑。乙腈-水溶液取300mL乙腈(液相色譜純)與IOOmL純水充分混合。磷酸鹽緩沖液準確稱量6g磷酸二氫鈉，溶解于450mL純水中，用質(zhì)量分數(shù)為5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為8，加純水定容至500mL，此溶液需使用前配置。無抗生素復(fù)原乳稱取12. 5g無抗生素奶粉,用純水溶解后定容至100mL?；罨腍LB固相萃取柱向HLB固相萃取柱中加入3mL甲醇，待液體流干后加入3mL純水,待液體流干后加入3mL磷酸鹽緩沖溶液,待用。3.操作步驟。I)取待測奶粉I. Og于50mL離心管中，加入4mL純水，于漩渦混合儀上漩渦混勻，再加入20mL乙腈-水溶液混合，高速震蕩提取2min后，得到含有沉淀的混合溶液A ;將混合溶液A用離心機5000r/min離心8min，取上清液得到上清液B，將上清液B轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約7mL，得到無乙腈上清液C。2)在無乙腈上清液C中加入2mL磷酸鹽緩沖液混勻得到溶液D，將溶液D轉(zhuǎn)移至活化的HLB固相萃取柱上，控制溶液D流速小于2mL/min ;再用2mL磷酸鹽緩沖液洗滌旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶得到洗滌液E，將洗滌液E轉(zhuǎn)移到HLB固相萃取柱上，控制洗滌液E的流速小于2mL/min ;用3mL純水淋洗并抽干HLB固相萃取柱，用4mL乙腈洗脫HLB固相萃取柱得到洗脫液F并收集于15mL離心管中，控制乙腈流速小于2mL/min。3)將洗脫液F用氮吹儀45°C下氮氣吹干，得到沉淀物G。4)向沉淀物G中加入O. 5mL無抗生素復(fù)原乳，高速震蕩溶解2min后，得到待檢測液H。實施例2 :另一種檢測奶粉中β -內(nèi)酰胺類抗生素的前處理方法。本實施例參照實施例I執(zhí)行，其中，步驟4)中無抗生素復(fù)原乳的用量為lmL，其余部分與實施例I中所述一致。實施例3 :—種奶粉中β -內(nèi)酰胺類抗生素的檢測方法。 I.試劑。待測奶粉向無抗生素奶粉中添加如表I所示不同比例的青霉素或氨芐西林。微生物試劑盒利普斯50試劑盒。無抗生素復(fù)原乳稱取12. 5g無抗生素奶粉,用純水溶解后定容至100mL。待測奶粉的復(fù)原乳(復(fù)原乳R):稱取12. 5g待測奶粉，用純水溶解后定容至100mL。2.操作步驟。I)根據(jù)實施例I所述的前處理方法對待測奶粉進行前處理得到待檢測液H。同時，為證明本發(fā)明的技術(shù)效果，將待測奶粉用水稀釋成復(fù)原乳(復(fù)原乳R)作為對照實驗。2)在利普斯50試劑盒的微孔板的微孔中分別加入100μ L待檢測液H或復(fù)原乳R，同時用無抗生素復(fù)原乳作為陰性對照，用膠粘紙密封微孔板，將微孔板放入到預(yù)熱到65°C的培養(yǎng)器中。3)在陰性對照樣變黃時，從微孔側(cè)面觀察結(jié)果，藍色為抗生素陽性，黃色為抗生素陰性。檢測結(jié)果見表I。表I :待測奶粉的利普斯50試劑盒檢測結(jié)果_
權(quán)利要求
1.一種檢測奶粉中β-內(nèi)酰胺類抗生素的前處理方法，包括如下步驟 向待測奶粉中加水并混勻，用乙腈-水溶液提取后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙腈，得到無乙腈上清液； 在所述無乙腈上清液中加入磷酸鹽緩沖液，混勻后過HLB固相萃取柱凈化，得到洗脫液； 用氮氣吹干所述洗脫液，得到沉淀物； 其特征在于還包括， 將處理每克所述待測奶粉產(chǎn)生的所述沉淀物溶解在O. 5或ImL無抗生素液態(tài)奶中，制得所述待測奶粉的待檢測液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的前處理方法，其中，所述乙腈-水溶液中乙腈與水的體積比為3 :1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的前處理方法，其中，所述提取的過程中，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min,離心時間為8min。
4.一種奶粉中內(nèi)酰胺類抗生素的檢測方法，包括如下步驟 向待測奶粉中加水并混勻，用乙腈-水溶液提取后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙腈，得到無乙腈上清液； 在所述無乙腈上清液中加入磷酸鹽緩沖液，混勻后過HLB固相萃取柱凈化，得到洗脫液； 用氮氣吹干所述洗脫液，得到沉淀物； 將處理每克所述待測奶粉產(chǎn)生的所述沉淀物溶解在O. 5mL無抗生素液態(tài)奶中，制得所述待測奶粉的待檢測液；和 用利普斯50試劑盒對所述待檢測液進行檢測。
5.一種奶粉中內(nèi)酰胺類抗生素的檢測方法，包括如下步驟 向待測奶粉中加水并混勻，用乙腈-水溶液提取后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙腈，得到無乙腈上清液； 在所述無乙腈上清液中加入磷酸鹽緩沖液，混勻后過HLB固相萃取柱凈化，得到洗脫液； 用氮氣吹干所述洗脫液，得到沉淀物； 將處理每克所述待測奶粉產(chǎn)生的所述沉淀物溶解在ImL無抗生素液態(tài)奶中，制得所述待測奶粉的待檢測液；和 用戴爾沃SP-NT試劑盒對所述待檢測液進行檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測奶粉中β-內(nèi)酰胺類抗生素的前處理方法，前處理方法包括沉淀蛋白、固相萃取、氮氣吹干、無抗生素液態(tài)奶回溶過程。待測奶粉經(jīng)過特定的前處理，其中的β-內(nèi)酰胺類抗生素得到濃縮和凈化，且由于選用無抗生素液態(tài)奶回溶，使處理后的樣本適用于微生物試劑盒檢測。本發(fā)明還提供了一種將待測奶粉使用上述方法前處理后，使用微生物試劑盒檢測其中β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測方法。待測奶粉經(jīng)過上述方法進行前處理后，可用于β-內(nèi)酰胺類抗生素的微生物試劑盒檢測，且有效降低微生物試劑盒檢測的檢出限，提高檢測的靈敏度。
文檔編號C12Q1/18GK102876769SQ20111019443
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者劉志楠, 李梅, 喻東威, 趙源, 劉曉川, 薛志清, 杜麗, 劉衛(wèi)星 申請人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司