專利名稱：一種制備7-氨基頭孢烷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物合成領(lǐng)域，具體涉及一種采用微生物方法來制備7-氨基頭孢烷酸。
背景技術(shù)：
7-氨基頭孢烷酸，分子量為272. 27，是頭孢菌素(β內(nèi)酰胺類)抗生素關(guān)健中間體。生產(chǎn)過程是通過生物發(fā)酵、化學(xué)提煉制取頭孢菌C，再由頭孢菌C化學(xué)裂解或酶解成 7-氨基頭孢烷酸。7-氨基頭孢烷酸有兩個(gè)活性基團(tuán)，3-位的乙酰氧基和7-位的氨基，在這兩個(gè)活性基團(tuán)上連接不同的側(cè)鏈，就構(gòu)成不同性質(zhì)的頭孢類抗生素，可以生成80余種下游頭孢抗生素產(chǎn)品，如頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉、頭孢美唑鈉、頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮鈉等，因此已成為當(dāng)今國(guó)際抗生素市場(chǎng)的主角。目前國(guó)際上生產(chǎn)國(guó)家主要集中在意大利、奧地利和西班牙，由于他們大多采用酶法工藝生產(chǎn)，因而7-氨基頭孢烷酸產(chǎn)品的化學(xué)溶媒殘留少、 純度高，一直牢牢占據(jù)歐美高端法規(guī)市場(chǎng)。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)主要是采取化學(xué)裂解法工藝生產(chǎn)， 在生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制上與國(guó)外先進(jìn)的生產(chǎn)企業(yè)還有一定的差距?，F(xiàn)有技術(shù)主要是采用化學(xué)裂解法來生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸，其主要不足有Α.防火防爆要求高?；瘜W(xué)法所使用的原材料包括大量的溶媒，這些溶媒在生產(chǎn)過程以及回收過程中具有很強(qiáng)的揮發(fā)性以及易燃易爆，其對(duì)防火防爆要求等級(jí)很高。B.環(huán)境污染大?；瘜W(xué)法在反應(yīng)過程中使用大量的二氯甲烷、苯胺和氯硅烷等均為有毒有害的強(qiáng)烈污染源，這些污染源在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量高COD、難生化的廢水、有害的廢氣等的治理成本很高。C.生產(chǎn)成本高。化學(xué)法生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸的通常步驟為酯化、氯化、醚化、水解、結(jié)晶等5個(gè)步驟，在生產(chǎn)過程中的使用的溶媒還需專門的回收車間建立回收工序進(jìn)行回收，同時(shí)化學(xué)法在生產(chǎn)過程中使用了多種有機(jī)溶劑以及蒸汽，承擔(dān)著較重的能耗成本以及治污成本。D. 反應(yīng)條件苛刻生產(chǎn)過程不易控制?；瘜W(xué)法必須在無水條件下反應(yīng)，所以必須使用頭孢菌素 C鈉鹽固體投料，頭孢菌素C必須通過結(jié)晶干燥除去水分后才能用于7-氨基頭孢烷酸的生產(chǎn)。E. 7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液中雜質(zhì)多，容易對(duì)其結(jié)晶過程產(chǎn)生不利影響，造成產(chǎn)品晶型不好，含量低，色級(jí)高，穩(wěn)定性差并且殘留溶媒多。另一方面，由于7-氨基頭孢烷酸分子內(nèi)含有比較活潑的內(nèi)酰胺環(huán)和游離的伯氨基，穩(wěn)定性相對(duì)較差。在長(zhǎng)途運(yùn)輸以及室溫放置時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，內(nèi)酰胺環(huán)可能開環(huán)，產(chǎn)生的雜質(zhì)包括去乙酰7-氨基頭孢烷酸及去乙酰氧基 7-氨基頭孢烷酸等，并會(huì)進(jìn)一步形成高分子聚合物.

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上問題，本發(fā)明提出了一種酶法裂解法制備7-氨基頭孢烷酸的方法，使生產(chǎn)過程大大簡(jiǎn)化，發(fā)酵得到的頭孢菌素C不需結(jié)晶就可用于酶解，生產(chǎn)過程中沒有用到有毒溶劑，省掉加保護(hù)劑和去保護(hù)劑等步驟，產(chǎn)品能夠達(dá)到高收率、高質(zhì)量，同時(shí)降低成本和減少污染。具體的實(shí)施步驟如下在酶反應(yīng)器中加入頭孢菌素C鈉鹽溶液，再加入D-氨基酸氧化酶氧化，經(jīng)雙氧水中轉(zhuǎn)后，加GL-7氨基頭孢烷酸酰化酶裂解，再經(jīng)結(jié)晶，離心過濾，洗滌，干燥，檢驗(yàn)即得 -氨基頭孢烷酸，純度在96%以上。所述的頭孢菌素C鈉鹽溶液的濃度是4%，其配制步驟稱取48克頭孢菌素C鈉鹽于1200ml燒杯中，加入適量蒸餾水，充分溶解后，用3N氨水調(diào)節(jié)PH至7. 0左右，真空抽濾除去不溶物，加蒸餾水至1200ml，20°C恒溫水浴備用，取樣HPLC分析。所述的氧化酶的投入量為每升頭孢菌素C鈉鹽溶液投入2500U氧化酶。所述的?；傅耐度肓繛槊可^孢菌素C鈉鹽溶液投入5000U?；浮Ｑ趸^程中酶反應(yīng)器的溫度控制在20°C，氧氣的流量保持100L/h，反應(yīng)器罐上壓力0. 1 士0. OlMPa，滴加1.5N氨水控制反應(yīng)pH7. 2 7. 25，每10分鐘記錄一次pH，當(dāng)pH上升至7. 6-7. 8時(shí)結(jié)束反應(yīng)，取樣HPLC分析。中轉(zhuǎn)加雙氧水過程是將過氧化氫電極插入氧化反應(yīng)液中，滴加:3ml過氧化氫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是10%的雙氧水，控制過氧化氫讀數(shù)l(T40ppm，取樣HPLC分析。?；^程中酶反應(yīng)器的溫度控制在20°C，在氧化中轉(zhuǎn)溶液中滴加3N氨水控制反應(yīng)pH8. 3 8. 4，控制反應(yīng)溫度20°C，每10分鐘記錄一次pH值，當(dāng)PH值能維持3-5min不變時(shí)，停止反應(yīng)，取樣HPLC分析。結(jié)晶過程是攪拌下在?；蟮娜芤褐芯徛渭?N HCL，在30、5分鐘內(nèi)調(diào)節(jié)PH至 5. 6飛.0，出現(xiàn)沉淀時(shí)，暫停加酸，降低攪拌速度，在冰浴中冷卻至2、°C，讓結(jié)晶慢慢析出約 20^30分鐘，繼續(xù)加酸調(diào)節(jié)PH至4. (Γ4. 2 ；保持溶液在廣4°C下，養(yǎng)晶約2 3小時(shí)；過濾，用少量冷蒸餾水(2、°C)洗滌兩次，丙酮充分洗滌結(jié)晶3次，真空抽于；結(jié)晶粉置于真空干燥箱中，真空度0. 06^0. IMPa下，溫度30 36°C下，干燥4_8h。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)和創(chuàng)新點(diǎn)如下
1、本發(fā)明是采用酶法裂解法。它利用生物催化裂解反應(yīng)，且催化劑可反復(fù)使用；反應(yīng)過程在常溫中進(jìn)行；反應(yīng)在水相中進(jìn)行；反應(yīng)步驟少，副反應(yīng)少，雜質(zhì)少。用碳酸氫鈉洗脫替代醋酸鈉洗脫方法，從而達(dá)到降低生產(chǎn)過程的COD總量和清潔生產(chǎn)的目的。減少傳統(tǒng)工藝的溶媒結(jié)晶、過濾、干燥工序，直接用液體進(jìn)行酶法裂解。工藝路線達(dá)到經(jīng)濟(jì)、安全、環(huán)保的目的。2、菌種篩選主要優(yōu)點(diǎn)及創(chuàng)新點(diǎn)
采用分子遺傳學(xué)和理性化篩選相結(jié)合的方法進(jìn)行，利用兩株菌種的不同特性，通過雜交育種，將不同菌株的優(yōu)良特性集合到一個(gè)新菌株中，然后再經(jīng)誘變、篩選獲得具有高產(chǎn)性能、穩(wěn)定的新型重組體菌株，提高發(fā)酵濾液頭孢菌素C純度，提高菌株發(fā)酵效價(jià)水平。3、頭孢菌素C提煉工藝主要優(yōu)點(diǎn)及創(chuàng)新點(diǎn)
主要是膜技術(shù)，包括超濾、納濾、反滲透等膜技術(shù)在頭孢菌素C鈉鹽提煉工藝的運(yùn)用。 盡可能去除蛋白質(zhì)和色素；濃縮除水和鹽類，提高中間產(chǎn)品的質(zhì)量從而達(dá)到后面酶法裂解的質(zhì)量要求。從而能夠根據(jù)自身物料的不同階段的特性，靈活組合各種膜技術(shù)與其他樹脂除雜的技術(shù)，達(dá)到除雜、提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的。4、質(zhì)量研究上主要優(yōu)點(diǎn)及創(chuàng)新點(diǎn)
首創(chuàng)7-氨基頭孢烷酸蛋白質(zhì)測(cè)定方法，解決7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)測(cè)定方法，從而為工藝去除蛋白質(zhì)和色素創(chuàng)造了條件；首創(chuàng)了 7-氨基頭孢烷酸高分子雜質(zhì)測(cè)定方法，從而實(shí)現(xiàn)從源頭上控制頭孢菌素的高分子雜質(zhì)；應(yīng)用先進(jìn)的LC-MS及LC-MS-MS等技術(shù)對(duì)7-氨基頭孢烷酸可能雜質(zhì)進(jìn)行深入研究，從而徹底分析出7-氨基頭孢烷酸產(chǎn)品生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)的副產(chǎn)物結(jié)構(gòu)；應(yīng)用現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)7-氨基頭孢烷酸立體結(jié)構(gòu)，晶形結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，并與化學(xué)法生產(chǎn)產(chǎn)品進(jìn)行比對(duì)，確定其絕對(duì)構(gòu)型及結(jié)構(gòu)。5、技術(shù)效果及與原工藝比對(duì)
A.生產(chǎn)過程環(huán)境要求降低，環(huán)保壓力小，生產(chǎn)安全性高。酶法生產(chǎn)不采用溶媒，在非防爆的工作環(huán)境下即可生產(chǎn)，生產(chǎn)工藝安全性高。在生產(chǎn)過程中基本不產(chǎn)生廢氣，而廢水具有良好的可生化性，易處理，相比化學(xué)法節(jié)省了不少環(huán)保支出。使用較少的環(huán)保支出即可使環(huán)保達(dá)標(biāo)排放。B.成本上具有優(yōu)勢(shì)兩步酶法生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸步驟為氧化、?；?、結(jié)晶等3個(gè)步驟，酶法裂解在反應(yīng)過程中均采用水相，生產(chǎn)過程條件溫和，易于控制不采用沒有使用溶媒及有毒有害物質(zhì)，可以使用頭孢菌素C的液體直接投料，節(jié)省了 CPC的結(jié)晶干燥過程，從而節(jié)省了大量的電、蒸汽、水等能源和治污成本，使7-氨基頭孢烷酸的成本更具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。C.本發(fā)明的制備的7-氨基頭孢烷酸質(zhì)量，穩(wěn)定性，化學(xué)立體構(gòu)型以及晶型等與原化學(xué)裂解法生產(chǎn)的產(chǎn)品一致。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
在酶反應(yīng)器中加入頭孢菌素C鈉鹽溶液，再加入D-氨基酸氧化酶氧化，經(jīng)雙氧水中轉(zhuǎn)后，加GL-7氨基頭孢烷酸?；噶呀?，再經(jīng)結(jié)晶，離心過濾，洗滌，干燥，檢驗(yàn)即得7-氨基頭孢烷酸，純度在96%以上。所述的頭孢菌素C鈉鹽溶液的濃度是4%，其配制步驟稱取48克頭孢菌素C鈉鹽于1200ml燒杯中，加入適量蒸餾水，充分溶解后，用3N氨水調(diào)節(jié)PH至7. 0左右，真空抽濾除去不溶物，加蒸餾水至1200ml，20°C恒溫水浴備用。所述的氧化酶的投入量為每升頭孢菌素C鈉鹽溶液投入2500U氧化酶。所述的?；傅耐度肓繛槊可^孢菌素C鈉鹽溶液投入5000U?；?。氧化過程中酶反應(yīng)器的溫度控制在20°C，氧氣的流量保持100L/h，反應(yīng)器罐上壓力0. IMPa,滴加1. 5N氨水控制反應(yīng)pH7. 2，每10分鐘記錄一次pH，當(dāng)pH上升至7. 6時(shí)結(jié)束反應(yīng)。中轉(zhuǎn)加雙氧水過程是將過氧化氫電極插入氧化反應(yīng)液中，滴加:3ml過氧化氫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是10%的雙氧水，控制過氧化氫讀數(shù)lOppm。酰化過程中酶反應(yīng)器的溫度控制在20°C，在氧化中轉(zhuǎn)溶液中滴加3N氨水控制反應(yīng)pH8. 3，控制反應(yīng)溫度20°C，每10分鐘記錄一次pH值，當(dāng)PH值能維持^iin不變時(shí)，停止反應(yīng)。結(jié)晶過程是攪拌下在?；蟮娜芤褐芯徛渭?N HCl，在30分鐘內(nèi)調(diào)節(jié)PH至 5. 6，出現(xiàn)沉淀時(shí)，暫停加酸，降低攪拌速度，在冰浴中冷卻至2°C，讓結(jié)晶慢慢析出約20分鐘，繼續(xù)加酸調(diào)節(jié)PH至4.0 ；保持溶液在1°C下，養(yǎng)晶約2小時(shí)；過濾，用少量冷蒸餾水(2°C) 洗滌兩次，丙酮充分洗滌結(jié)晶3次，真空抽于；結(jié)晶粉置于真空干燥箱中，真空度0. 06MPa 下，溫度30°C下，干燥4h。實(shí)施例2在酶反應(yīng)器中加入頭孢菌素C鈉鹽溶液，再加入D-氨基酸氧化酶氧化，經(jīng)雙氧水中轉(zhuǎn)后，加GL-7氨基頭孢烷酸酰化酶裂解，再經(jīng)結(jié)晶，離心過濾，洗滌，干燥，檢驗(yàn)即得7-氨基頭孢烷酸，純度在96%以上。所述的頭孢菌素C鈉鹽溶液的濃度是4%，其配制步驟稱取48克頭孢菌素C鈉鹽于1200ml燒杯中，加入適量蒸餾水，充分溶解后，用3N氨水調(diào)節(jié)PH至7. 0左右，真空抽濾除去不溶物，加蒸餾水至1200ml，20°C恒溫水浴備用。所述的氧化酶的投入量為每升頭孢菌素C鈉鹽溶液投入2500U氧化酶。所述的?；傅耐度肓繛槊可^孢菌素C鈉鹽溶液投入5000U酰化酶。氧化過程中酶反應(yīng)器的溫度控制在20°C，氧氣的流量保持100L/h，反應(yīng)器罐上壓力0. IlMPa,滴加1. 5N氨水控制反應(yīng)pH7. 25，每10分鐘記錄一次pH，當(dāng)pH上升至7. 8時(shí)
結(jié)束反應(yīng)。中轉(zhuǎn)加雙氧水過程是將過氧化氫電極插入氧化反應(yīng)液中，滴加:3ml過氧化氫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是10%的雙氧水，控制過氧化氫讀數(shù)40ppm。?；^程中酶反應(yīng)器的溫度控制在20°C，在氧化中轉(zhuǎn)溶液中滴加3N氨水控制反應(yīng)pH8. 4，控制反應(yīng)溫度20°C，每10分鐘記錄一次pH值，當(dāng)PH值能維持5min不變時(shí)，停止反應(yīng)。結(jié)晶過程是攪拌下在?；蟮娜芤褐芯徛渭?N HCl，在45分鐘內(nèi)調(diào)節(jié)PH至 6. 0，出現(xiàn)沉淀時(shí)，暫停加酸，降低攪拌速度，在冰浴中冷卻至2、°C，讓結(jié)晶慢慢析出約30 分鐘，繼續(xù)加酸調(diào)節(jié)PH至4. 2 ；保持溶液在4°C下，養(yǎng)晶約3小時(shí)；過濾，用少量冷蒸餾水 (4°C)洗滌兩次，丙酮充分洗滌結(jié)晶3次，真空抽于；結(jié)晶粉置于真空干燥箱中，真空度 0. IMPa下，溫度36°C下，干燥8h。實(shí)施例3
7-氨基頭孢烷酸雙酶轉(zhuǎn)化HPLC分析方法一、流動(dòng)相的配制 1、A相
稱取1. 542g乙酸銨加IOOOml蒸餾水溶解后，用冰乙酸調(diào)pH至4. 5，0. 45 μ m的水系濾膜過濾后脫氣20分鐘。2、B 相
量取900ml的A相，加IOOml乙腈混合均勻后脫氣20min。二、HPLC分析條件
柱子類型Rp_8e，5 μ m, LiChroCART 250-4 總流速:1. Oml/min 檢測(cè)波長(zhǎng)260nm
轉(zhuǎn)化液精確移取0. 5ml轉(zhuǎn)化液至50ml容量瓶中，用流動(dòng)相A相稀釋并定容至刻度，搖勻后進(jìn)液相分析。標(biāo)準(zhǔn)液
精確稱取CPC標(biāo)準(zhǔn)品2(T25mg，用流動(dòng)相A相溶解后定容至50ml，搖勻后進(jìn)液相分析。精確稱取7-ACA標(biāo)準(zhǔn)品l(Tl5mg，用流動(dòng)相A相溶解后定容至50ml，搖勻后進(jìn)液相分析。
精確稱取GL-7-ACA標(biāo)準(zhǔn)品15 20mg，用流動(dòng)相A相溶解后定容至50ml，搖勻后進(jìn)液相分析。進(jìn)樣量5μ1
時(shí)間程序表
權(quán)利要求
1. 一種制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于包括以下步驟在酶反應(yīng)器中加入頭孢菌素C鈉鹽溶液，再加入D-氨基酸氧化酶氧化，經(jīng)雙氧水中轉(zhuǎn)后，加GL-7氨基頭孢烷酸酰化酶裂解，再經(jīng)結(jié)晶，離心過濾，洗滌，干燥，檢驗(yàn)即得7-氨基頭孢烷酸，結(jié)構(gòu)式如下
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于頭孢菌素C鈉鹽溶液的濃度是4%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于頭孢菌素C鈉鹽溶液的配制步驟稱取48克頭孢菌素C鈉鹽于1200ml燒杯中，加入適量蒸餾水，充分溶解后，用3N氨水調(diào)節(jié)PH至7. 0左右，真空抽濾除去不溶物，加蒸餾水至1200ml，20°C恒溫水浴
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于氧化酶的投入量為每升頭孢菌素C鈉鹽溶液投入2500U氧化酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于?；傅耐度肓繛槊可^孢菌素C鈉鹽溶液投入5000U?；浮?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于氧化過程中酶反應(yīng)器的溫度控制在20°C，氧氣的流量保持100L/h，反應(yīng)器罐上壓力0. 1 士0. OlMPa，滴加 1. 5N氨水控制反應(yīng)pH7. 2^7. 25，每10分鐘記錄一次pH，當(dāng)pH上升至7. 6-7. 8時(shí)結(jié)束反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于中轉(zhuǎn)加雙氧水過程是將過氧化氫電極插入氧化反應(yīng)液中，滴加:3ml過氧化氫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是10%的雙氧水， 控制過氧化氫讀數(shù)l(T40ppm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于?；^程中酶反應(yīng)器的溫度控制在20°C，在氧化中轉(zhuǎn)溶液中滴加3N氨水控制反應(yīng)pH 8. 3^8. 4，控制反應(yīng)溫度20°C，每10分鐘記錄一次pH值，當(dāng)PH值能維持3-5min不變時(shí)，停止反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于結(jié)晶過程是攪拌下在酰化后的溶液中緩慢滴加6N HCl，在30 45分鐘內(nèi)調(diào)節(jié)PH至5. 6 6. 0，出現(xiàn)沉淀時(shí)，暫停加酸，降低攪拌速度，在冰浴中冷卻至2、°C，讓結(jié)晶慢慢析出約2(Γ30分鐘，繼續(xù)加酸調(diào)節(jié)PH至4. (Γ4. 2 ；保持溶液在1、°C下，養(yǎng)晶約2 3小時(shí)；過濾，用少量冷蒸餾水洗滌兩次， 丙酮充分洗滌結(jié)晶3次，真空抽于；結(jié)晶粉置于真空干燥箱中，真空度0. 06、. IMI^a下，溫度 30 36°C下，干燥4-8h。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于冷蒸餾水的溫度是2、°C。
全文摘要
本發(fā)明是一種制備7-氨基頭孢烷酸的方法。在酶反應(yīng)器中加入頭孢菌素C鈉鹽溶液，再加入D-氨基酸氧化酶氧化，經(jīng)雙氧水中轉(zhuǎn)后，加GL-7氨基頭孢烷酸酰化酶裂解，再經(jīng)結(jié)晶，離心過濾，洗滌，干燥，檢驗(yàn)即得7-氨基頭孢烷酸。生產(chǎn)過程大大簡(jiǎn)化，發(fā)酵得到的頭孢菌素C不需結(jié)晶就可用于酶解，生產(chǎn)過程中沒有用到有毒溶劑，省掉加保護(hù)劑和去保護(hù)劑等步驟，產(chǎn)品能夠達(dá)到高收率、高質(zhì)量，同時(shí)降低成本和減少污染。
文檔編號(hào)C12P35/02GK102286597SQ20111019422
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者趙松 申請(qǐng)人:福建省?？顾帢I(yè)股份有限公司