一種快速檢測中藥注射劑綜合毒性的生物測試方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測中藥注射劑綜合毒性的生物測試方法，包括如下步驟：（1)制備測試用菌液：取發(fā)光細(xì)菌凍干粉，用濃度為1?5%(w/v)的氯化鈉溶液復(fù)蘇，得測試用菌液；（2)檢測：取待檢樣品，用測試用菌液檢測，確定發(fā)光強度抑制率為50%的稀釋度以及稀釋度-效應(yīng)動力曲線。本發(fā)明方法檢測準(zhǔn)確度和靈敏度均較高，操作簡單。
【專利說明】一種快速檢測中藥注射劑綜合毒性的生物測試方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測中藥注射劑綜合毒性的生物測試方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 中藥注射劑在我國已經(jīng)有70多年的應(yīng)用歷史，對心腦血管、抗腫瘤、呼吸系統(tǒng)等 疾病的療效顯著，具有獨特的優(yōu)勢，在臨床上使用廣泛。近年來，隨著中藥注射劑臨床應(yīng)用 的日趨廣泛，不良反應(yīng)報道亦日漸增多。從2006年"葛根素事件"、"魚腥草事件"到2008 年的"刺五加事件"、"茵梔黃事件"，再到2009年的"雙黃連事件"和"清開靈事件"，讓整個 中藥注射劑行業(yè)陷入信任危機。2006年之后，國家對中藥注射劑安全問題的關(guān)注達(dá)到了前 所未有的高度。 2〇〇9年7月，國家食品藥品監(jiān)管局下發(fā)《關(guān)于做好中藥注射劑安全再評價 工作的通知》，全面開展生產(chǎn)及質(zhì)量控制環(huán)節(jié)的風(fēng)險排查切實控制中藥注射劑安全隱患。
[0003] 目前，中藥注射劑質(zhì)量控制檢測的項目包括：性狀、鑒別、pH值、重金屬、灼熾殘 渣、有關(guān)物質(zhì)(蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹酯、草酸鹽、鉀離子)、熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌、裝量、不溶性 微粒、可見異物、含量測定、降壓物質(zhì)、異常毒性、過敏反應(yīng)檢查、溶血與凝聚、滲透壓、有害 元素、聚山梨酯80、5-HMF、指紋圖譜、大分子蛋白檢查等。但是，這些檢測指標(biāo)仍然無法有效 的保證其藥效的一致性和降低其過敏反應(yīng)的發(fā)生率。因此，有必要引入新的質(zhì)量控制方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種快速檢測中藥注射劑綜合毒性的生物測試 方法。
[0005] 本發(fā)明快速檢測中藥注射劑綜合毒性的生物測試方法，包括如下步驟：
[0006] (1)制備測試用菌液：取發(fā)光細(xì)菌凍干粉，用濃度為1?5% (w/v)的氯化鈉溶液 復(fù)蘇，得測試用菌液；
[0007] (2)檢測：取待檢樣品，用測試用菌液檢測，確定稀釋度-效應(yīng)動力曲線以及發(fā)光 強度抑制率為50%的稀釋度。
[0008] 稀釋度-效應(yīng)動力曲線，是指待檢溶液稀釋度與發(fā)光強度抑制率的關(guān)系曲線。
[0009] 步驟（1)中，所述發(fā)光細(xì)菌是費氏弧菌、明亮發(fā)光桿菌T3小種、青海弧菌及其它非 致病發(fā)光細(xì)菌。
[0010]步驟（1)中，所述制備方法是：取型號為CS234的費氏弧菌凍千粉1支，加入 0· 2-1. 0ml的濃度為3% (w/v)的氯化鈉溶液復(fù)蘇，即得測試用菌液。
[0011] 步驟（1)中，所述氯化鈉溶液的pH為5?9。
[0012] 步驟（2)所述檢測的方法如下：
[0013] a、預(yù)測試：取待檢樣品，用水稀釋成5個梯度的待檢液，體積百分比分別是：100%、 25%、 6· 25%、1. 5625%、0_ 39%，以1?5% (w/v)的氯化鈉溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，在所述待測液和標(biāo)準(zhǔn) 液中加入測試用菌液，菌液加入量為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的1/25?1/15,放置5?30min, 檢測發(fā)光強度，計算5個稀釋度的發(fā)光度抑制率；
[0014] b、確定檢測稀釋度的上限及下限：根據(jù)步驟a的結(jié)果，以抑制率為90?1〇〇%的任 一稀釋度為上限，若樣品原液的抑制率未達(dá)到 9〇%,則以樣品原液為上限；以抑制率為〇? 10%的任一稀釋度為下限；
[0015] c、測試：在步驟b確定的稀釋度上限和下限之間增配6?9個均勻稀釋梯度的待 檢液，以1?5% (w/v)的氯化鈉溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，在所述待測液和標(biāo)準(zhǔn)液中加入測試用菌液， 菌液加入量為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的I/25?1/1 5,放置5?30min，檢測發(fā)光強度，制作稀 釋度-效應(yīng)動力曲線，計算抑制率為50%的稀釋度。
[0016] 本發(fā)明稀釋度，是指待檢溶液被沖淡的程度。例如，1ml中藥注射液液用3ml水稀 釋，稀釋度為25%。
[0017] 如果稀釋度的值小，說明待檢魚腥草注射液的毒性大，如果稀釋度的值大，說明待 檢魚腥草注射液的毒性小。
[0018] 抑制率為50%的稀釋度，即本發(fā)明EC5。。
[0019] 步驟a和步驟c中，所述待檢液中加有氯化鈉，其濃度為3% (w/v);所述標(biāo)準(zhǔn)液中 氯化鈉的濃度為3% (w/v)。
[0020] 步驟a和步驟C中，所述待檢液和標(biāo)準(zhǔn)液的pH為5?9。
[0021] 步驟a和步驟C中，所述菌液加入量為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的1/20。
[0022] 步驟a和步驟c中，所述放置時間為15min。
[0023] 前述檢測方法中，發(fā)光強度采用型號為LUMIStox300的生物毒性測試儀檢測。
[0024]本發(fā)明方法可以有效檢測中藥注射液的毒性，為其臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)，同時， 本發(fā)明檢測方法具有如下優(yōu)點：（1)檢測速度快：在1小時內(nèi)可以得出結(jié)果，評估其綜合毒 性；（2)操作簡單：無需灌胃、靜脈注射等專業(yè)技術(shù)，操作簡單，方便易行；（3)反應(yīng)靈敏；利 用現(xiàn)代靈敏的光電檢測技術(shù)，能對極微弱的光強度變化進(jìn)行檢測，比一般生物細(xì)胞反應(yīng)靈 敏幾個數(shù)量級；（4)能對綜合毒性的大小進(jìn)行判斷；（5)細(xì)菌樣本量大，克服了動物試驗中 樣本數(shù)量少以及個體差異等影響。
[0025]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0026]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1濃度1費氏弧菌發(fā)光強度隨時間的變化圖
[0028] 圖2濃度2費氏弧菌發(fā)光強度隨時間的變化圖 [0029] 圖3濃度3費氏弧菌發(fā)光強度隨時間的變化圖 [0030] 圖4濃度4費氏弧菌發(fā)光強度隨時間的變化圖 [0031] 圖5濃度5費氏弧菌發(fā)光強度隨時間的變化圖
[0032]圖6魚腥草注射液樣品對費氏弧菌的濃度-效應(yīng)動力曲線 [0033]圖7魚腥草注射液樣品對費氏弧菌的濃度-效應(yīng)動力曲線 [0034]圖8紅花注射液樣品A對費氏弧菌的濃度-效應(yīng)動力曲線
[0035] 圖9紅花注射液樣品A對費氏弧菌的濃度-效應(yīng)動力曲線
[0036] 圖10紅花注射液樣品B對費氏弧菌的濃度-效應(yīng)動力曲線
[0037] 圖11紅花注射液樣品B對費氏弧菌的濃度-效應(yīng)動力曲線

【具體實施方式】
[0038] 實施例1本發(fā)明毒性檢測方法
[0039] 1實驗材料
[0040] 1· 1 菌種
[0041] 費氏弧菌凍千粉（CS234)，購自北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，-2(TC避光保存。
[0042] 1. 2主要試劑
[0043] 復(fù)蘇稀釋液：3%氯化鈉溶液；
[0044] 滲透壓調(diào)節(jié)液：20%氯化鈉溶液；
[0045] 中藥注射液：魚腥草注射液劑，市售。
[0046] 1. 3主要儀器及器材
[0047] LUMIStox3〇0生物毒性測試儀及配套的LUMIStherm預(yù)溫槽和測試管（Dr. Bruno Lange GmbH)、BCD-539WF電冰箱(海爾）、PB_10酸度計(賽多利斯）
[0048] 2實驗方法
[0049] 2. 1測試用菌液的制備
[0050] 從冰箱冷凍室（-20°C)取出費氏弧菌凍干粉1支，置于室溫（2(TC左右)平衡15min 后，加入0· 2-1. 0ml復(fù)蘇稀釋液，于室溫下放置lOmin,即可用于測試。
[0051] 2· 2預(yù)試驗
[0052]將中藥注射劑用蒸飽水按1 :4稀釋成5個濃度梯度（g卩稀釋度梯度）：ι〇〇%、25%、 6· 25%、1· 5625%、0_洲％，按2. 3所述制備成待測樣品溶液，按2. 5所述方法粗測一遍，確定上 限及下限的濃度（即稀釋度）范圍。上限為抑制率達(dá)到90?1〇〇%時樣品的濃度，若樣品原 液的抑制率未達(dá)到 9〇%，則以樣品原液為上限；下限為抑制率達(dá)到〇?10%時樣品的濃度。 [0053] 2. 3待測樣品溶液制備
[0054]在上限和下限之間根據(jù)需要再增配6?I2個濃度。將樣品用蒸饋水稀釋到各濃 度，再將各濃度樣品與滲透壓調(diào)節(jié)液以I7:3的比例混合，配制成待測樣品溶液，使待測樣 品溶液NaCl濃度為3%。
[0055] 2. 4空白對照液(標(biāo)準(zhǔn)液）制備
[0056] 采用復(fù)蘇稀釋液作為空白對照液。
[0057] 2. 5發(fā)光強度測定
[0058]待測樣品每個濃度準(zhǔn)備3支測試管，每支測試管加入lml待測樣品，設(shè) 3個平行 樣；空白對照液也取3支測試管，每支測試管加入imi復(fù)蘇稀釋液，同樣設(shè)置3個平行樣。 用移液器向各測試管中依次加入0. 05ml測試用菌液，輕輕振蕩，使之充分混勻，每個測試 管加菌液的間隔時間為I5秒，于育溫槽中放置l 5min后用生物毒性測試儀依次間隔15秒 測定各測試管的發(fā)光強度，按下式計算抑制率，以EC 5Q(抑制率等于50%時該樣品的濃度值） 表示各樣品的毒性大小，EC5。值越小，毒性越大。
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測中藥注射劑綜合毒性的生物測試方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 制備測試用菌液：取發(fā)光細(xì)菌凍干粉，用濃度為?5% (w/v)的氯化鈉溶液復(fù)蘇 得測試用菌液； ' (2) 檢測：取待檢樣品，用測試用菌液檢測，確定稀釋度-效應(yīng)動力曲線以及發(fā)光強度 抑制率為50%的稀釋度。 2_根據(jù)權(quán)利要求1所述的測試方法，其特征在于：步驟（D中，所述發(fā)光細(xì)菌是費氏弧 菌、明亮發(fā)光桿菌T3小種、青?；【捌渌侵虏“l(fā)光細(xì)菌。 '
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測試方法，其特征在于：步驟（1)中，所述制備方法是：取型 號為CS234的費氏弧菌凍千粉1支，加入〇· 2-1. (Μ的濃度為3%(w/v)的氯化鈉溶液復(fù)蘇 即得測試用菌液。
4·根據(jù)權(quán)利要求1所述的測試方法，其特征在于：步驟（丨）中，所述氯化鈉溶液的pH為 5?9。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測試方法，其特征在于：步驟（2)所述檢測的方法如下： a、 預(yù)測試：取待檢樣品，用水稀釋成5個梯度的待檢液，體積百分比分別是：100%、25%、 6· 25%、1· 5625%、〇· 39%，以1?5% (w/v)的氯化鈉溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，在所述待測液和標(biāo)準(zhǔn)液中 加入測試用菌液，菌液加入量為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的1/25?1/15,放置5?30min,檢測 發(fā)光強度，計算5個稀釋度的發(fā)光度抑制率； ' b、 確定檢測稀釋度的上限及下限：根據(jù)步驟a的結(jié)果，以抑制率為90?100%的任一 稀釋度為上限，若樣品原液的抑制率未達(dá)到 9〇%，則以樣品原液為上限；以抑制率為〇?1〇% 的任一稀釋度為下限； c、 測試：在步驟b確定的稀釋度上限和下限之間增配6?9個均勻稀釋梯度的待檢液， 以1?5% (w/v)的氯化鈉溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，在所述待測液和標(biāo)準(zhǔn)液中加入測試用菌液，菌液 加入量為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的I/25?1/1 5,放置5?3〇min，檢測發(fā)光強度，制作稀釋 度-效應(yīng)動力曲線，計算抑制率為50%的稀釋度。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的測試方法，其特征在于：步驟a和步驟c中，所述待檢液中加 有氯化鈉，其濃度為3% (w/v);所述標(biāo)準(zhǔn)液中氯化鈉的濃度為3% (w/v)。
7·根據(jù)權(quán)利要求5所述的測試方法，其特征在于：步驟a和步驟c中，所述待檢液和標(biāo) 準(zhǔn)液的pH為5?9。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的測試方法，其特征在于：步驟a和步驟c中，所述菌液加入量 為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的1/20。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的測試方法，其特征在于：步驟a和步驟c中，所述放置時間為 15min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1?9任意一項所述的測試方法，其特征在于：檢測發(fā)光強度采用型 號為LUMIStox300的生物毒性測試儀檢測。
【文檔編號】G01N1/28GK104215479SQ201310210195
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月30日
【發(fā)明者】趙軍寧, 鄢良春, 鄭曉秋 申請人:四川省中醫(yī)藥科學(xué)院