一種基于納米金的水中病原微生物檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種基于納米金粒子的水中病原微生物檢測方法，屬于納米生物技術(shù)檢測領(lǐng)域。本發(fā)明的主要特征在于利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法。待檢測病原微生物特殊引物（探針）的消耗，導(dǎo)致納米金粒子重新暴露在鹽濃度下發(fā)生聚集，使其顏色和吸光度值發(fā)生變化，通過肉眼觀察和吸光度值的測量可以對靶DNA進(jìn)行定性檢測。該方法簡潔、成本低廉、特異性和靈敏度都較高，可以應(yīng)用到野外分析以及應(yīng)急水事件中病原微生物的檢測。
【專利說明】一種基于納米金的水中病原微生物檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種使用納米金粒粒子溶液的顏色為檢測信號，在體系中將水中病原微生物引物作為納米金粒子穩(wěn)定劑的檢測比色方法。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，微生物污染是飲用水最常見的健康風(fēng)險之一。目前，飲用水中發(fā)現(xiàn)的病原微生物種類已超過140種，它們對人類健康有著嚴(yán)重的威脅。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)，每年有400萬以上的兒童死于水傳疾病(World Health Organization, 2011)。我國在近10年間發(fā)生的271起飲用水突發(fā)污染公共事件中，微生物污染案例占據(jù)主導(dǎo)，造成3萬余人罹患疾病。對水傳病原微生物進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，是保障水質(zhì)安全的必要手段。
[0003]目前日常的水質(zhì)微生物學(xué)檢測主要采用基于培養(yǎng)的平皿計數(shù)法、多管發(fā)酵法(GB/T 5750,2006)進(jìn)行，由于環(huán)境中大部分微生物處于有活性但無法培養(yǎng)(viable butnon-culture, VBNC)的狀態(tài)，這些傳統(tǒng)方法往往會低估或者漏查病原微生物的數(shù)量或種類。另外，培養(yǎng)法雖然對設(shè)備和技術(shù)條件要求不高，但操作繁瑣且耗時較長，在目前水源水和飲用水污染事故發(fā)生較為頻繁的情況下，無法滿足現(xiàn)場或應(yīng)急檢測快速定性的要求。而以定量PCR技術(shù)為代表的新型分子生物學(xué)技術(shù)可以通過標(biāo)記有放射性、熒光和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的探針與靶序列的雜交實現(xiàn)對水中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的病原微生物的快速檢測，但其設(shè)備和試劑成本較高，且標(biāo)記物質(zhì)對人體往往具有一定的毒性，本身具有一定的污染風(fēng)險。
[0004]納米金粒子(AuNPs)具有良好的生物相容性且無毒副作用，在生命科學(xué)，材料科學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。另外，分散在溶液中的納米金粒子重新聚集會產(chǎn)生肉眼可見的明顯顏色變化，是理想的顏色信號元件。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)未公開不修飾的納米金對水中病原微生物檢測的技術(shù)方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提出了一種基于納米金粒子的水中病原微生物檢測方法。此發(fā)明首次利用不修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物種類，具體使用待檢測病原微生物特殊引物(探針)作為納米金粒子的穩(wěn)定劑，通過其含量變化導(dǎo)致納米金粒子穩(wěn)定性變化，最終造成反應(yīng)體系的顏色和吸光度值發(fā)生變化，納米金粒子作為顏色信號元件。
[0007]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
一種利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法。使用待檢測病原微生物特殊引物(探針)作為穩(wěn)定劑，納米金粒子作為顏色信號元件。
[0008]更確切地，本發(fā)明所述的方法具體包括如下步驟:
(1)采用檸檬酸鈉還原氯金酸方法制備納米金粒子溶液，
(2)采用富集方法獲得水樣樣品，
(3)采用裂解方法獲得水樣DNA粗提產(chǎn)物，
(4)采用特定的條件對水樣樣品進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)， (5)采用特定的體積混合步驟(I)和(4)中溶液，并加入PBS緩沖液，觀察溶液顏色變化或?qū)θ芤哼M(jìn)行檢測，得到相應(yīng)的紫外可見光譜。
[0009]根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步驟(I)中檸檬酸鈉還原法是利用1%的氯金酸溶液還原制備得體系為50ml納米金粒子溶液,納米金粒子粒徑約為15nm。
[0010]根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步驟(2)中富集方法為濾膜截留水樣中的微生物得到水樣樣品，濾膜孔徑為0.22-0.45 μ m,材質(zhì)為混合纖維素酯膜，優(yōu)選0.22 μ m。
[0011]根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步驟(3)中裂解液成分為濃度0.1-1%的十二烷基磺酸鈉(SDS)，優(yōu)選 0.5%ο
[0012]根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，步驟(4)中PCR擴增條件統(tǒng)一設(shè)定為95° C，預(yù)變性5min ;95° C，45s，55.5° C，45s，72。C，45s，進(jìn)行 35 個循環(huán)反應(yīng)；72。C, IOmin0
[0013]根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，步驟(5)中選取PCR產(chǎn)物體系為10 μ 1，納米金粒子溶液體系為90 μ 1，PBS緩沖溶液的終濃度為2.5mM-12.5mM，優(yōu)選2.5mM ;納米金粒子溶液與PBS緩沖溶液體積比為 1:10-1:2，優(yōu)選 1:3 (30μ 1: 90μ1)。
[0014]根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，步驟(5)中反應(yīng)時間為Ι-lOmin，優(yōu)選5min。
[0015]根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，步驟(5)中測定吸光度值范圍為450nm-750nm，測定儀器為酶標(biāo)儀。
[0016]更具體地，本發(fā)明所述檢測水中病原微生物的方法，包括如下步驟:
(1)采用準(zhǔn)確稱重的檸檬酸三鈉還原Iml1%的氯金酸方法制備得到50ml的納米金粒子溶液，
(2)待測水樣通過0.22-0.45 μ m混合纖維素酯膜，直至抽濾無法進(jìn)行，
(3)剪碎(2)中混合纖維素酯膜于1.5ml離心管，加入Iml裂解液，80° C水浴，15min，
(4)取(3)中離心管，微離，取上清液2ul作為PCR反應(yīng)模板，PCR擴增條件統(tǒng)一設(shè)定為95。C，預(yù)變性 5min ;95° C, 45s, 55.5° C, 45s, 72° C，45s，進(jìn)行 35 個循環(huán)反應(yīng)；72° C，IOmin0
[0017](5)取(I)中納米金粒子溶液90μ I與(2)中產(chǎn)物10μ I混合，加入終濃度為
2.5-12.5mM的PBS緩沖溶液，1-1Omin后，觀察顏色變化，另取100 μ I混合溶液加入96微孔板于酶標(biāo)儀上測量450_750nm的吸光度值。
[0018]本發(fā)明將PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入到納米金粒子溶液中。一定時間后，加入PBS緩沖溶液。由于用于PCR反應(yīng)的引物能使納米金粒子抵抗鹽離子，導(dǎo)致納米金粒子溶液沒有顏色變化。當(dāng)水體中存在引物對應(yīng)的病原微生物，引物會被消耗，納米金粒子就會重新暴露在鹽離子下，從而發(fā)生聚集，最終造成溶液顏色發(fā)生變化。顏色的變化與水中病原微生物有關(guān)，故該發(fā)明可用于檢測水中病原微生物的種類。
[0019]本發(fā)明所述的技術(shù)方案所用的納米金粒子穩(wěn)定劑為PCR反應(yīng)引物，無需額外添加底物，方便簡單；本發(fā)明所需納米金顆粒無需標(biāo)記巰基(-SH)，磁珠或熒光物質(zhì)等材料，降低了耗材成本；此外，本發(fā)明的檢測靈敏度較高，只需PCR過程有特異性片段產(chǎn)生，就能通過肉眼可見的溶液顏色變化對相應(yīng)病原微生物進(jìn)行定性，適合條件相對不優(yōu)越的現(xiàn)場檢測，有較好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明中5種待測病原微生物菌株的PCR產(chǎn)物與不修飾的納米金粒子顯色反應(yīng)的紫外可見光譜圖。
[0021]如圖，不匹配的非特異性探針(圖1中Control,實心正方形)不會結(jié)合特定的PCR產(chǎn)物，游離的探針包裹納米金顆粒形成保護(hù)，吸光度峰值保持530nm左右不變，OD高達(dá)
0.36 ;而匹配的特異性探針(圖1中5株實驗用菌，其他形狀)，由于探針的數(shù)量減少甚至消失，納米金顆粒在一定的鹽濃度下發(fā)生聚合，吸光度值下降，峰值范圍約0.2-0.26，對應(yīng)的溶液顏色變化為紫色或近于無色。
【具體實施方式】實施例
[0022]( I)納米金粒子溶液的制備
納米金粒子溶液采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制得。其具體制備過程為:
取48ml超純水+Iml 1%氯金酸加熱至90-100° C，回流，再加入準(zhǔn)確稱取0.0714g檸檬酸三鈉(用Iml超純水溶解)，繼續(xù)加熱10-15min后停止加熱，冷卻至室溫，得到一定濃度實驗用納米金溶液。納米金粒子大小與加入的檸檬酸三鈉的量有關(guān)。
[0023](2)待測病原微生物引物設(shè)計
木文例選収5種常見水傳病化微卞物設(shè)到兒相1、mi物αα如K灰:
【權(quán)利要求】
1.一種基于納米金粒子的水中病原微生物檢測方法，其特征在于利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法；待檢測病原微生物特殊引物(探針)的消耗，導(dǎo)致納米金粒子重新暴露在含鹽的溶液中而發(fā)生聚集，其顏色和吸光度值發(fā)生變化，通過肉眼觀察和吸光度值的測定可以對靶DNA進(jìn)行定性檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米金粒子的水中病原微生物檢測方法，其特征在于利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法包括如下步驟: (1)采用檸檬酸鈉還原氯金酸方法制備納米金粒子溶液， (2)采用富集方法獲得水樣樣品， (3)采用裂解方法獲得水樣DNA粗提產(chǎn)物， (4)采用特定的條件對水樣樣品進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)， (5)采用特定的體積混合步驟(I)和(4)中溶液，并加入PBS緩沖液，觀察溶液顏色變化或?qū)θ芤哼M(jìn)行檢測，得到相應(yīng)的紫外可見光譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步驟(I)中檸檬酸鈉還原法是利用1%的氯金酸溶液還原制備得體系為50ml納米金粒子溶液,納米金粒子粒徑約為15-20nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步驟(2)中富集方法為濾膜截留水樣中的微生物得到水樣樣品，濾膜孔徑為0.22-0.45 μ m，材質(zhì)為混合纖維素酯膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步驟(3)中裂解液成分為濃度0.1-1%的十二烷基磺酸鈉(SDS)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，步驟(4)中PCR擴增條件統(tǒng)一設(shè)定為95° C，預(yù)變性5min ;95° C，45s，55.5° C，45s，72。C，45s，進(jìn)行 35 個循環(huán)反應(yīng)；72。C, IOmin0
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，步驟(5)中選取PCR產(chǎn)物體系為5-15 μ 1，納米金粒子溶液體系為60-90 μ I，PBS緩沖溶液的終濃度為2.5mM-12.5mM ;納米金粒子溶液與PBS緩沖溶液體積比為 1:10-1:2。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，步驟(5)中反應(yīng)時間為l-10min。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用無基團(tuán)修飾的納米金粒子檢測水中病原微生物的比色法，其特征在于，步驟(5)中測定吸光度值范圍為450nm-750nm，測定儀器為酶標(biāo)儀。
【文檔編號】G01N21/78GK103822917SQ201410061370
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】于鑫, 葉成松, 王春明 申請人:中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所