專(zhuān)利名稱(chēng)：鹽皮質(zhì)激素受體激活的生物標(biāo)志物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及患者中鹽皮質(zhì)激素受體(MR)激活的生物標(biāo)志物。
背景技術(shù)：
鹽皮質(zhì)激素受體(MR)是包括糖皮質(zhì)激素受體(GR)、雄激素受體(AR)、孕激素受體 (PR)和雌激素受體(ER)的經(jīng)典類(lèi)固醇激素受體中的一個(gè)成員(Fimder，1997)。這些受體是調(diào)節(jié)從器官發(fā)育和分化到情緒控制和應(yīng)激反應(yīng)的多種生理過(guò)程的激素激活的轉(zhuǎn)錄因子 (Beato等，1995)。針對(duì)MR的生理激素是醛固酮，其是由腎上腺分泌的類(lèi)固醇激素。MR已在血管、腦和心臟的非上皮位點(diǎn)上被定位(Bonvalet JP等，1995 ;Lombes M 等，1992 Janaka J.等，1997)。在過(guò)去10年中，有許多研究表明鹽皮質(zhì)激素的非上皮作用造成血管和心肌的纖維化和營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)(Brilla CG.等，1992，Ullian ME.等，1992 ;Young Μ.等，1994)。另外，已經(jīng)在包括人內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(VSMC) (Hatakeyama H.等， 1994)以及動(dòng)物試驗(yàn)中的心肌細(xì)胞(Silvestre JS.等，1988)中發(fā)現(xiàn)了 MR。一些研究 (Brilla CG等，1992 ；Young M.等，1994)通過(guò)刺激心肌細(xì)胞中的膠原形成將鹽皮質(zhì)激素與心肌纖維化聯(lián)系起來(lái)。Farquharson CA.等人Q000)間接地證明了醛固酮可能在慢性心力衰竭的內(nèi)皮功能障礙發(fā)揮作用。因此MR是重要的藥物靶點(diǎn)，特別是對(duì)于高血壓和心力衰竭的治療。例如，醛固酮拮抗劑螺內(nèi)酯(也稱(chēng)為ALDACTONE ，PFIZER)與鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合并阻斷醛固酮的結(jié)合。這一類(lèi)固醇化合物普遍用于治療充血性心力衰竭。實(shí)際上，螺內(nèi)酯已經(jīng)顯示出藥理學(xué)作用和良好的耐受性，從而降低總體死亡風(fēng)險(xiǎn)、進(jìn)行性心力衰竭導(dǎo)致的死亡和心源性猝死以及心臟原因?qū)е伦≡旱娘L(fēng)險(xiǎn)。在隨機(jī)螺內(nèi)酯評(píng)價(jià)研究(Randomized Aldactone Evaluation Study, RALES)中對(duì)螺內(nèi)酯施用于嚴(yán)重心力衰竭患者進(jìn)行了評(píng)估。 RALES是隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的實(shí)驗(yàn)，其招募的參與者患有嚴(yán)重的心力衰竭且左心室射血分?jǐn)?shù)不高于35%，和正在接受標(biāo)準(zhǔn)治療(其通常包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、袢利尿劑，且有些情況下包括地高辛)。以螺內(nèi)酯治療的RALES受試者相對(duì)于以安慰劑治療的受試者在死亡率和住院發(fā)生率方面具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的降低(Pitt B.等，1999)。相似地，依普利酮(印lerenone)代表了結(jié)合在鹽皮質(zhì)激素受體上的另一種醛固酮阻斷劑。相對(duì)于重組人糖皮質(zhì)激素受體、孕激素受體和雄激素受體，伊普利酮優(yōu)先與重組人鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合，因此其作用是選擇性的。與施用伊普利酮有關(guān)的治療效益已經(jīng)在多個(gè)臨床試驗(yàn)中得到了證明。在一個(gè)包括6600名受試者的這類(lèi)研究[the Eplerenone Post-Acute Myocardial Infarction Heart Failure Efficacy and Survival Study(EPHESUS)]中，發(fā)現(xiàn)伊普利酮顯著降低由心血管原因?qū)е滤劳龅娘L(fēng)險(xiǎn)和心血管事件導(dǎo)致住院的風(fēng)險(xiǎn)(Pitt B.等，2003)。也觀察到心源性猝死率的降低。但是，醛固酮不是已知激活MR的唯一的內(nèi)源性激素。例如內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素也可激活MR。實(shí)際上，糖皮質(zhì)激素已證明在心肌纖維化發(fā)展的早期階段產(chǎn)生氧化應(yīng)激和血管炎癥。因此即使在不存在醛留酮過(guò)多癥時(shí)也可能在心血管系統(tǒng)中發(fā)生MR激活的不利效應(yīng)(Funder JW，2006)，且醛固酮的血漿水平不提供心血管系統(tǒng)中MR激活的指示。而且，在心力衰竭、心肌梗塞或與高血壓有關(guān)的終末器官(end-organ)損傷中，在心臟和血管中MR表達(dá)增加(Nagata K 等，2006 ;Takeda Μ.等，2007)。因此，本領(lǐng)域中仍需要開(kāi)發(fā)用于評(píng)價(jià)心血管系統(tǒng)中MR激活的精確的和特異性的方法。另外，給予患者M(jìn)R拮抗劑可能會(huì)伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，例如高血鉀癥。實(shí)際上， RALES研究公布后已經(jīng)有一些嚴(yán)重的高血鉀癥的報(bào)告。在一個(gè)這樣的報(bào)告中描述了不少于 25名患者出現(xiàn)了需要進(jìn)行急救的螺內(nèi)酯相關(guān)的高血鉀癥(Schepkens H.等，2001)。這25 名患者中有4名需要心血管復(fù)蘇治療，25名患者中有2名死亡。一些作者估計(jì)在接受該MR 拮抗劑的患者中，臨床顯著的高血鉀癥的發(fā)生率約為10%。因此，本領(lǐng)域中仍然需要開(kāi)發(fā)精確的和特異性的方法來(lái)預(yù)測(cè)心力衰竭患者對(duì)MR 拮抗劑治療的反應(yīng)性，以防止或限制這種治療的不良反應(yīng)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種評(píng)價(jià)患者中鹽皮質(zhì)激素受體(MR)激活的方法，包括測(cè)定從所述患者獲得的生物樣品中選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)基因和SERPINA3 基因的一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。本發(fā)明也涉及一種預(yù)測(cè)患者對(duì)MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑的治療的反應(yīng)性的方法，所述方法包括測(cè)定從所述患者獲得的生物樣品中選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。本發(fā)明還涉及MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑用于治療患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代謝綜合癥(metabolic syndrome)的患者的用途，所述患者通過(guò)本發(fā)明方法被分類(lèi)為口向應(yīng)者(responder) ο發(fā)明詳述定義術(shù)語(yǔ)“MR”是指鹽皮質(zhì)激素受體。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“MR激活”是指通過(guò)鹽皮質(zhì)激素(即醛固酮)或糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致鹽皮質(zhì)激素受體的激活。術(shù)語(yǔ)“MR拮抗劑”是指能抑制(部分地或完全地)MR的生物激活的天然的或非天然的化合物。已知有眾多的MR拮抗劑，包括螺內(nèi)酯、印oxymexrenone和依普利酮。本發(fā)明的范圍包括所有目前已知的MR拮抗劑以及未來(lái)發(fā)現(xiàn)的MR拮抗劑。醛固酮拮抗劑可以是螺內(nèi)酯型的化合物(螺內(nèi)酯、螺內(nèi)酯的活性代謝物如坎利酮或其鹽，例如坎利酸鉀)。醛固酮拮抗劑也可以是環(huán)氧-類(lèi)固醇的醛固酮拮抗劑。另一毓系列的類(lèi)固醇型MR拮抗劑以含環(huán)氧的螺內(nèi)酯衍生物為例。例如，美國(guó)專(zhuān)利No. 4，559，332描述了作為MR拮抗劑的螺內(nèi)酯衍生物。進(jìn)一步的MR拮抗劑可以是屈螺酮(DRSP)，其是螺內(nèi)酯的類(lèi)似物。術(shù)語(yǔ)“醛固酮合成酶抑制劑”意圖包括抑制醛固酮合成酶的化合物或試劑，醛固酮合成酶通過(guò)使皮質(zhì)酮羥基化以形成18-0H-皮質(zhì)酮和使18-0H-皮質(zhì)酮形成醛固酮而將皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化成醛固酮。本領(lǐng)域已知許多的醛固酮合成酶抑制劑。本發(fā)明的范圍包括所有目前已知的醛固酮合成酶抑制劑以及未來(lái)發(fā)現(xiàn)的醛固酮合成酶抑制劑。所述醛固酮合成酶抑制劑可以是類(lèi)固醇類(lèi)或非類(lèi)固醇類(lèi)醛固酮合成酶抑制劑。醛固酮合成酶抑制劑可以是非類(lèi)固醇或類(lèi)固醇芳香酶抑制劑。非類(lèi)固醇芳香酶抑制劑可以包括阿那曲唑(anastrozole)和法倔唑(fadrozole)(包括其(+)_對(duì)映異構(gòu)體)。類(lèi)固醇芳香酶抑制劑的實(shí)例是依西美坦 (exemestane)。另一非類(lèi)固醇類(lèi)醛固酮合成酶抑制劑是法倔唑鹽酸鹽的(+)_對(duì)映異構(gòu)體 (美國(guó)專(zhuān)利4617307和4889861)，其在Fiebeler A.等(2005)中也有描述。術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2”或“NGAL”在本領(lǐng)域中具有一般的含義，其是指如在 Schmidt-Ott KM.等Q007)中描述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白。NGAL可以是任何來(lái)源的，但是通常是哺乳動(dòng)物(例如人類(lèi)和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)NGAL,特別是人NGAL。 術(shù)語(yǔ)“NGAL基因”是指編碼NGAL mRNA和蛋白質(zhì)的任何核苷酸序列，例如基因組DNA序列和任何天然存在的NGAL及其變體和修飾形式。其也包括編碼NGAL mRNA和蛋白質(zhì)的人工序列，例如cDNA。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中提供了人天然NGAL核苷酸序列的實(shí)例，其登陸號(hào)為 NM_005564。術(shù)語(yǔ)“NGAL mRNA”在本領(lǐng)域中具有一般的含義，是指在表達(dá)NGAL基因時(shí)合成的信使RNA。術(shù)語(yǔ)“NGAL蛋白質(zhì)”是指由NGAL基因的表達(dá)獲得的氨基酸序列，及任何天然存在的NGAL及其變體和修飾的形式。在GenP印t數(shù)據(jù)庫(kù)中提供了人天然NGAL氨基酸序列的實(shí)例，其登陸號(hào)為 NP_005555。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“NGAL蛋白質(zhì)”也包括由NGAL與金屬蛋白酶MMP_9 (也稱(chēng)為明膠酶B)、92kDa的IV型膠原酶、92kDa的明膠酶和V型膠原酶形成的異二聚體(Kjeldsen 等人，1993)。術(shù)語(yǔ)“抗NGAL抗體”指的是識(shí)別NGAL的抗體或其片段。術(shù)語(yǔ)“SERPINA3”基因具有本領(lǐng)域中的一般含義，其也稱(chēng)為CT、AACT、GIG24、 GIG25、MGC882M。該基因的正式全稱(chēng)為絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)肽酶抑制劑，分化體 Α(α-1抗蛋白酶、抗胰蛋白酶)，成員3。SERPINA3可以是任何來(lái)源的，但是通常是哺乳動(dòng)物(例如人類(lèi)和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)SERPINA3，特別是人SERPINA3。術(shù)語(yǔ)“SERPINA3基因” 是指編碼SERPINA3 mRNA和蛋白質(zhì)的任何核苷酸序列，例如基因組DNA序列和任何天然存在的SERPINA3及其變體和修飾形式。其也包括編碼SERPINA3 mRNA和蛋白質(zhì)的人工序列， 例如cDNA。術(shù)語(yǔ)“SERPINA3 mRNA”具有本領(lǐng)域的一般含義，是指在SERPINA3基因表達(dá)時(shí)合成的信使RNA0術(shù)語(yǔ)“SERPINA3蛋白質(zhì)”是指由SERPINA3基因的表達(dá)所得的氨基酸序列， 以及任何天然存在的SERPINA3及其變體和修飾的形式。術(shù)語(yǔ)“SERPINA3抗體”是指識(shí)別SERPINA3蛋白質(zhì)的抗體或其片段。術(shù)語(yǔ)“心血管系統(tǒng)”具有本領(lǐng)域中的一般含義，表示由心臟、血管或脈管以及構(gòu)成血液的細(xì)胞和血漿組成的系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)“心血管疾病”具有本領(lǐng)域中的一般含義，且用于歸類(lèi)影響心臟、心臟瓣膜、血液和身體的脈管系統(tǒng)的多種病癥。心血管疾病包括內(nèi)皮功能障礙、冠狀動(dòng)脈病、心絞痛、心肌梗死、充血性心力衰竭、高血壓、腦血管病、中風(fēng)、短暫性缺血發(fā)作、深靜脈血栓形成、外周動(dòng)脈疾病、心肌病、心律失常、主動(dòng)脈狹窄和動(dòng)脈瘤。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)志物的預(yù)定值”是指從普通群體或從選定的受試群體獲得的生物樣品中該生物標(biāo)志物的量。例如，選定的群體可由明顯健康的受試者組成，例如之前沒(méi)有任何表明存在心血管疾病的征兆或癥狀的個(gè)體。在另一實(shí)例中，預(yù)定值可以是從患有已確認(rèn)的心血管疾病的受試者獲得的生物標(biāo)志物的量。預(yù)定值可以是閾值或范圍。預(yù)定值可基于明顯健康的受試者與患有已確認(rèn)的心血管疾病的受試者之間的比較測(cè)量而設(shè)定。
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當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“患者”是指哺乳動(dòng)物，例如嚙齒動(dòng)物、貓科動(dòng)物、犬科動(dòng)物和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。優(yōu)選地，本發(fā)明的患者為人類(lèi)。對(duì)于MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑治療的“響應(yīng)者”或“具有反應(yīng)性”的患者或患者組是指在分別以MR拮抗劑或以醛固酮合成酶抑制劑治療時(shí)，表現(xiàn)出或會(huì)表現(xiàn)出心血管疾病的明顯的臨床改善的患者。根據(jù)本發(fā)明的方法，如果患者中選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)明顯不同于從普通群體或健康受試者獲得的預(yù)定值，則將該患者分類(lèi)為對(duì)治療的響應(yīng)者。優(yōu)選地， 如果患者中選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平高于從普通群體或健康受試者獲得的預(yù)定值，則該患者為響應(yīng)者。通常，如果患者中所述一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平與所述預(yù)定值的表達(dá)水平的比高于1. 2、優(yōu)選1. 5、甚至更優(yōu)選2、甚至還更優(yōu)選5、10或20時(shí)，則認(rèn)為該患者中所述一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平高于從普通群體或健康受試者獲得的預(yù)定值。當(dāng)用于本文時(shí)“健康受試者”是指未患有任何已知病癥的受試者，特別是未患有任何心血管疾病、糖尿病、肥胖或代謝綜合癥等任何疾病的受試者的群體。術(shù)語(yǔ)“生物樣品”是指任何得自患者的生物樣品。這類(lèi)樣品的實(shí)例包括體液、組織、 細(xì)胞樣品、器官、活組織樣品等。優(yōu)選的生物樣品是細(xì)胞或組織樣品。優(yōu)選的生物樣品是全血、血清、血漿或尿液。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)志物” 一般是指一種分子，即基因(或編碼所述基因的核酸)、蛋白質(zhì)，在來(lái)自患者的生物樣品中所述分子的表達(dá)可通過(guò)本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的方法 (以及本文公開(kāi)的方法)檢測(cè)并且預(yù)示或指示提供樣品的患者的病癥。本發(fā)明的預(yù)測(cè)方法本發(fā)明涉及一種評(píng)估患者中MR激活的方法，包括測(cè)定從所述患者獲得的生物樣品中選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種評(píng)估所述患者的心血管系統(tǒng)中MR激活的方法，包括測(cè)定從所述患者獲得的生物樣品中選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白 (NGAL)基因和SERPINA3基因的一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。本發(fā)明還涉及一種預(yù)測(cè)患者對(duì)MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑治療的反應(yīng)性的方法，所述方法包括測(cè)定從所述患者獲得的生物樣品中選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。在具體的實(shí)施方式中，患者患有心血管疾病。更具體地，所述患者患有內(nèi)皮功能障礙、冠狀動(dòng)脈病、心絞痛、心肌梗死、充血性心力衰竭、高血壓、腦血管病、中風(fēng)、短暫性缺血發(fā)作、深靜脈血栓形成、外周動(dòng)脈疾病、心肌病、心律失常、主動(dòng)脈狹窄或動(dòng)脈瘤。在具體的實(shí)施方式中，所述患者患有充血性心力衰竭或高血壓。在具體的實(shí)施方式中，所述患有心血管疾病的患者已經(jīng)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的治療，所述標(biāo)準(zhǔn)的治療選自血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、利尿劑、血管擴(kuò)張劑、β受體阻斷劑、洋地黃和抗凝劑。在另一具體的實(shí)施方式中，患者患有肥胖、糖尿病或代謝綜合癥。實(shí)際上，已經(jīng)證明MR激活與肥胖和代謝綜合癥的病理生理學(xué)發(fā)展有關(guān)(Caprio M.等人，2007; Lamounier-Zepter V.等人，2005)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及評(píng)估患者中MR激活的方法，包括測(cè)定得自所述患者的細(xì)胞或組織樣品中一種或兩種生物標(biāo)志物mRNA的量。本發(fā)明也涉及預(yù)測(cè)患者對(duì)MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑治療的反應(yīng)性的方法，該方法包括測(cè)定得自所述患者的細(xì)胞或組織樣品中一種或兩種生物標(biāo)志物mRNA的量。優(yōu)選的細(xì)胞是外周血單核細(xì)胞(PBMC)、巨噬細(xì)胞、多核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)胞為PBMC或內(nèi)皮細(xì)胞。可容易地從其中提取總 RNA。細(xì)胞或組織樣品可在使用之前進(jìn)行處理，例如以使得核酸可得。細(xì)胞或蛋白質(zhì)裂解、 核酸的濃縮或稀釋的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。對(duì)基因表達(dá)水平的測(cè)定可通過(guò)多種技術(shù)進(jìn)行。通常，檢測(cè)的表達(dá)水平是相對(duì)表達(dá)水平。更優(yōu)選地，測(cè)定包括使樣品與選擇性試劑(例如探針、引物或配體)接觸，從而檢測(cè)樣品中原有的感興趣的核酸的存在或測(cè)量其量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，表達(dá)水平可通過(guò)測(cè)定mRNA的量來(lái)確定。本領(lǐng)域公知測(cè)定mRNA的量的方法。例如先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如使用水解酶或化學(xué)溶液)提取包含在樣品(例如得自患者的細(xì)胞或組織)中的核酸，或按照制造商的指示使用核酸結(jié)合樹(shù)脂提取。然后通過(guò)雜交(例如RNA印跡分析)和/或擴(kuò)增(例如RT-PCR) 檢測(cè)提取的mRNA。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平通過(guò)RT-PCR， 優(yōu)選定量或半定量RT-PCR，甚至更優(yōu)選實(shí)時(shí)定量或半定量RT-PCR測(cè)定。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，NGAL基因的表達(dá)水平通過(guò)定量PCR使用正向引物5' -GGACCAGGGCTGTCGCTACT-3‘ (SEQ ID NO :1)和反向弓丨物 5 ‘ -GGTGGCCACTTGCACATTGT-3 ‘ (SEQ ID NO 2)進(jìn)行測(cè)量，或使用正向引物5' -TCACCCTGTACGGAAGAACC-3 ‘ (SEQ ID NO 3)禾Π反向引物 5' -GGTGGGAACAGAGAAAACGA-3‘ (SEQ ID NO :4)進(jìn)行測(cè)量。其它擴(kuò)增方法包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(ΤΜΑ)，鏈置換擴(kuò)增 (SDA)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。含有至少10個(gè)核苷酸并且表現(xiàn)出與本文關(guān)注的mRNA的序列互補(bǔ)性或同源性的核酸可用作雜交探針和擴(kuò)增引物。應(yīng)該理解的是所述核酸不必與大小相當(dāng)?shù)耐磪^(qū)域完全相同，但是通常與大小相當(dāng)?shù)耐磪^(qū)域至少約80%相同，更優(yōu)選地85%相同，再更優(yōu)選地 90% 95%相同。在某些實(shí)施方式中，有利的是將核酸與合適的手段(mean)(例如可檢測(cè)標(biāo)記)組合使用以檢測(cè)雜交。本領(lǐng)域已知許多合適的指示劑，包括熒光的、放射性的、酶的或其它配體(例如抗生物素蛋白/生物素)。探針通常包含長(zhǎng)度為10至1000個(gè)，例如10至800個(gè)、更優(yōu)選為15至700個(gè)，典型地為20至500個(gè)核苷酸的單鏈核酸。引物通常是長(zhǎng)度為10至25個(gè)核苷酸的較短的單鏈核酸，其設(shè)計(jì)為與待擴(kuò)增的目的核酸完全或幾乎完全匹配。探針和引物對(duì)其雜交的核酸是“特異的”，即它們優(yōu)選在高嚴(yán)格雜交條件(相應(yīng)于最高解鏈溫度Tm，例如50%的甲酰胺， 5x或6x的SCC。SCC是0. 15M NaCl,0. 015M的檸檬酸鈉)下雜交。上述擴(kuò)增和檢測(cè)方法中所用的核酸引物或探針可以組裝成試劑盒。所述試劑盒包括通用引物(consensus primer)和分子探針。優(yōu)選的試劑盒也包括確定是否發(fā)生擴(kuò)增所需的組分。試劑盒還可包括例如PCR緩沖劑和酶；陽(yáng)性對(duì)照序列，反應(yīng)控制引物(reaction control primer)；和用于擴(kuò)增和檢測(cè)特定序列的說(shuō)明。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及評(píng)估患者中MR激活的方法，包括測(cè)量得自所述患者的生物樣品中一種或兩種生物標(biāo)志物蛋白的濃度。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)患者對(duì)MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑治療的反應(yīng)性的方法，該方法包括測(cè)量得自所述患者的生物樣品中一種或兩種生物標(biāo)志物蛋白的濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，測(cè)量一種或兩種生物標(biāo)志物蛋白在得自所述患者的血液樣品、血漿樣品、血清樣品或尿液樣品中的濃度。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括使生物樣品與能夠選擇性地與生物樣品中的一種或兩種生物標(biāo)志物蛋白相互作用的結(jié)合伴體接觸。該結(jié)合伴體可以是多克隆的或單克隆的抗體，優(yōu)選是單克隆抗體。在另一實(shí)施方式中，結(jié)合伴體可以是適體。本發(fā)明的多克隆抗體或其片段可根據(jù)已知的方法通過(guò)給予宿主動(dòng)物合適的抗原或表位制備，所述宿主動(dòng)物可選自例如豬、奶牛、馬、兔、山羊、綿羊和小鼠等。本領(lǐng)域已知的各種助劑也可用于提高抗體產(chǎn)率。盡管用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體，但優(yōu)選使用單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體或其片段可使用任何用于由培養(yǎng)中的傳代細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)制備和分離。用于制備和分離的技術(shù)包括但不限于由Kohler和 Milstein (197 最初說(shuō)明的雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Cote等，198 和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985)?；蛘?，描述用于制備單鏈抗體的技術(shù)(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，946，778)可適用于制備抗NGAL或抗SERPINA3單鏈抗體。用于實(shí)施本發(fā)明的抗體也包括抗NGAL或抗SERPINA3 片段，包括但不限于F(ab' ) 2片段和Fab片段，F(xiàn)(ab' ) 2片段可通過(guò)胃蛋白酶消化完整的抗體分子生成，F(xiàn)ab片段可通過(guò)還原F(ab' )2片段的二硫鍵生成。或者，可構(gòu)建Fab和 /或scFv表達(dá)文庫(kù)以使得能夠快速識(shí)別具有期望的地NGAL或SERPINA3的特異性的片段。 例如，可使用抗體的噬菌體展示。在這種方法中，單鏈Fv(SCFV)或Fab片段在合適的噬菌體 (例如M13)的表面上表達(dá)。簡(jiǎn)言之，移除已經(jīng)以蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫的合適宿主(例如小鼠) 的脾細(xì)胞。從這些產(chǎn)生期望的抗該蛋白質(zhì)的抗體的細(xì)胞獲得VL和VH鏈的編碼區(qū)域。然后將這些編碼區(qū)域與噬菌體序列的末端融合。一旦噬菌體摻入了合適的載體，例如細(xì)菌，噬菌體會(huì)展示該抗體片段?？贵w的噬菌體展示也可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的組合方法提供。 然后噬菌體展示的抗體片段可用作免疫分析的一部分。例如Kjeldsen等人(1996)描述了 NGAL的單克隆抗體。市售的NGAL的單克隆抗體的實(shí)例包括從Antibody Shop (丹麥，哥本哈根)獲得的那些，如HYB-211-01、HTO-211_02 和NYB-211-05。通常HYB-211-01和HYB-211-02可以以其還原(reduced)和未還原 (unreduced)的形式與NGAL—起使用。NGAL抗體也可從R&D Systems購(gòu)得，編號(hào)為AF 1857。市售的SERPINA3的單克隆抗體的實(shí)例包括從Abgent Inc.(圣地亞哥)和從 Sigma-Aldrich Co.獲得的SERPINA3的單克隆抗體。在另一實(shí)施方式中，結(jié)合伴體可以是適體。適體是在分子識(shí)別方面作為抗體的替代物的一類(lèi)分子。適體是能以高親和力和特異性識(shí)別幾乎任何類(lèi)型的靶分子的寡核苷酸或寡肽。如Tuerk C. (1997)所述，這類(lèi)配體可通過(guò)隨機(jī)序列文庫(kù)的指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)分離。隨機(jī)序列文庫(kù)可通過(guò)DNA的組合化學(xué)合成獲得。在該文庫(kù)中，各個(gè)成員是具有獨(dú)特序列的線性寡聚物(最終經(jīng)化學(xué)修飾的)。Jayasena S. D. (1999)綜述了該類(lèi)分子的可能的修飾、用途及優(yōu)點(diǎn)。肽適體由通過(guò)兩種雜交方法選自組合文庫(kù)的由平臺(tái)蛋白(platform protein)(例如大腸桿菌硫氧還蛋白Α)展示的構(gòu)象約束性抗體可變區(qū)組成(Colas等，1996)。本發(fā)明的結(jié)合伴體，例如抗體或適體，可以用可檢測(cè)的分子或物質(zhì)標(biāo)記，例如熒光分子、放射性分子或任何其它本領(lǐng)域已知的標(biāo)記。本領(lǐng)域已知通常直接地或間接地提供信號(hào)的標(biāo)記。當(dāng)用于本文時(shí)，涉及抗體的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記的”意圖包括通過(guò)將可檢測(cè)物質(zhì)，例如放射性物質(zhì)或熒光團(tuán)(例如異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)或靛青andocyanine) (Cy5))偶聯(lián)(即物理連接)至抗體或適體而對(duì)抗體或適體進(jìn)行直接標(biāo)記，以及通過(guò)與可檢測(cè)物質(zhì)的反應(yīng)性對(duì)探針或抗體進(jìn)行間接標(biāo)記。本發(fā)明的抗體或適體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法用放射性分子標(biāo)記。例如放射性分子包括但不限于用于閃爍掃描研究的放射性原子，例如 1123、1124、Inlll、Rel86、Rel88。上述分析通常涉及將結(jié)合伴體(即抗體或適體)結(jié)合至固體載體。可用于實(shí)施本發(fā)明的固體載體包括基底例如硝基纖維素(例如膜或微滴定孔的形式)、聚氯乙烯(例如片或微滴定孔)、聚苯乙烯膠乳(例如珠或微滴定板)、聚偏氟乙烯、重氮化紙(diazotized paper) ^/ !!^ . ^ ] ! / (magnetically responsive bead)等。一種或兩種生物標(biāo)志物蛋白的濃度可通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的免疫診斷技術(shù)進(jìn)行測(cè)量，標(biāo)準(zhǔn)的免疫診斷技術(shù)包括免疫分析(例如競(jìng)爭(zhēng)法、直接反應(yīng)或夾心型測(cè)試(sandwich type assay))。這類(lèi)免疫分析包括但不限于凝集試驗(yàn)、酶標(biāo)記和介導(dǎo)的免疫測(cè)試(例如ELISA)、 生物素/抗生物素蛋白型測(cè)試、放射免疫測(cè)試、免疫電泳、免疫沉淀。更具體地，可使用ELISA方法，其中微滴定板的孔涂覆有一系列識(shí)別所述一種或兩種生物標(biāo)志物蛋白的抗體。然后將含有或懷疑含有所述一種或兩種生物標(biāo)志物蛋白的生物樣品加入涂覆的孔中。在孵育足夠的時(shí)間以使得形成抗體-抗原復(fù)合物后，可以洗滌該板以除去未結(jié)合的部分，再加入可檢測(cè)地標(biāo)記的二級(jí)結(jié)合分子。使二級(jí)結(jié)合分子與任何捕獲的樣品標(biāo)志物蛋白反應(yīng)，洗滌板并以本領(lǐng)域公知的方法檢測(cè)二級(jí)結(jié)合分子的存在。Kjeldsen 等(1996) ,Mishra J.等(2005)和 Wang 等(2007)說(shuō)明了用于檢測(cè) NGAL 的合適的ELISA方法。Blaser J.等(1995)說(shuō)明了用于檢測(cè)NGAL的夾心酶免疫分析方法。 Xu SY.等(1994)說(shuō)明了用于檢測(cè)NGAL的放射免疫分析方法。用于檢測(cè)NGAL 的 ELISA 試劑盒可購(gòu)自 AntibodyShop (Grusbakken 8 DK-2820Gentofte-Denmark),編號(hào)為 KIT 036 或 KIT 037 ;R&D Systems Europe(Lille-France),編號(hào)為 DLCN20 ；MBL International (ffoburn, MA 01801, USA), 編號(hào)為CY-8070。用于定量NGAL/MMP9復(fù)合物濃度的免疫測(cè)試可購(gòu)自R&D Systems Europe(Lille-France)，編號(hào)為 DM9L20。測(cè)量一種或多種生物標(biāo)志物蛋白的濃度(使用或未使用基于免疫測(cè)試的方法)也可以包括化合物的分離基于化合物分子量的離心、基于質(zhì)量和電荷的電泳、基于疏水性的HPLC、基于大小的分子排阻色譜和基于化合物對(duì)所用的特定固體相的親和力的固相親和分離。一旦分離，所述一種或兩種生物標(biāo)志物蛋白可基于該化合物已知的“分離特性”(例如保留時(shí)間)進(jìn)行識(shí)別和使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行測(cè)量。或者，分離的化合物可通過(guò)例如質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法還可以包括將所述一種或兩種生物標(biāo)志物蛋白的濃度與預(yù)定閾值比較的步驟。所述比較是患者中MR激活的指示，或是患者對(duì)MR拮抗劑治療的反應(yīng)性的指示。通常，如果在治療前人類(lèi)患者的血液NGAL蛋白的濃度高于70μ g/Ι，優(yōu)選高于 80 μ g/Ι，甚至更優(yōu)選高于 85μ g/l,90y g/l,95y g/lU00y g/lU25y g/lU50y g/1 或200 μ g/1，則可以認(rèn)為該人類(lèi)患者是治療的響應(yīng)者。本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明另一實(shí)施方式提供了試劑盒，該試劑盒包括用于實(shí)施評(píng)估患者中的MR激活的方法和用于預(yù)測(cè)患者對(duì)以MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑治療的反應(yīng)性的方法的物質(zhì)。這些方法可通過(guò)診斷實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)室或操作人員實(shí)施。本發(fā)明提供可用于這些不同環(huán)境的試劑盒。用于檢測(cè)生物樣品中的NGAL和/或SERPINA3的物質(zhì)和試劑可一起組裝在試劑盒內(nèi)。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及包括如下部分的試劑盒a)檢測(cè)NGAL蛋白的裝置；及b)檢測(cè)SERPINA3蛋白的裝置。通常，所述試劑盒包括a) NGAL蛋白的結(jié)合伴體；及b) SERPINA3蛋白的結(jié)合伴體；及通常，所述結(jié)合伴體是抗體。結(jié)合伴體可以被標(biāo)記以便于檢測(cè)。其可以固定或不固定在基底表面(例如珠、陣列等)上。通常，在試劑盒中可包括基底表面(例如膜)以用于固定結(jié)合伴體(例如經(jīng)凝膠電泳和轉(zhuǎn)移到膜上)。另外，本發(fā)明的試劑盒通常也包括至少一種用于檢測(cè)包括在試劑盒中的結(jié)合伴體與本發(fā)明生物標(biāo)志物之間的復(fù)合物的試劑。取決于具體過(guò)程，試劑盒還可以包含一種或多種提取緩沖液和/或試劑、蛋白質(zhì)印跡緩沖液和/或試劑及檢測(cè)裝置。試劑盒中可包括使用這些緩沖液和試劑實(shí)施該過(guò)程的不同步驟的方案。本發(fā)明試劑盒中包括的不同試劑可以以固體(例如凍干的)或液體形式提供。本發(fā)明的試劑盒可任選地包括用于各種單獨(dú)的緩沖液和/或試劑的不同容器(例如，小瓶、安瓿、試管、燒瓶或瓶子)。各種組分通常適當(dāng)?shù)刈鳛樵诟髯缘娜萜髦械牡确衷嚇踊蛞詽饪s的形式提供。也可提供適用于實(shí)施所公開(kāi)的方法的特定步驟的其它容器。試劑盒的單個(gè)容器優(yōu)選保持地用于商業(yè)銷(xiāo)售的封閉空間中。在某些實(shí)施方式中，試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明方法使用其組分預(yù)測(cè)受試者的心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的說(shuō)明書(shū)。根據(jù)本發(fā)明的方法使用試劑盒的說(shuō)明可包括用于處理得自受試者的生物樣品和/或用于進(jìn)行測(cè)試的說(shuō)明，或用于解釋結(jié)果的說(shuō)明。試劑盒也可以以由管理藥品或
10生物制品生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式包含注意事項(xiàng)。本發(fā)明的治療方法本發(fā)明的方法可以用于對(duì)患有心血管疾病的患者進(jìn)行分類(lèi)，然后可用于給所述患者選擇正確的治療方法。例如，分類(lèi)為響應(yīng)者或非響應(yīng)者的患者可以因此接受合適量的MR 拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑。因此這種方法可有助于醫(yī)生對(duì)治療方法進(jìn)行選擇。從而可使治療費(fèi)用與患者的風(fēng)險(xiǎn)相適應(yīng)。因此，本發(fā)明另一方面涉及治療患有疾病的患者和/或防止患者患疾病的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括如下步驟a)通過(guò)根據(jù)本發(fā)明在體外進(jìn)行預(yù)測(cè)患者對(duì)MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑治療的反應(yīng)性的方法，確定所述患者是MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑治療的響應(yīng)者還是非響應(yīng)者，其中如果所述患者中所述一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平高于從普通群體或從健康受試者獲得的預(yù)定值，則將所述患者分類(lèi)為響應(yīng)者，以及b)如果所述患者在步驟a)中被確定為響應(yīng)者，則給予所述患者M(jìn)R拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述疾病是心血管疾病。在另一實(shí)施方式中，所述疾病是代謝綜合癥、肥胖或糖尿病。MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑可以以藥物組合物的形式給予。優(yōu)選地，所述拮抗劑或抑制劑以治療有效量給予?！爸委熡行Я俊笔侵冈谶m用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理效益/風(fēng)險(xiǎn)比下，MR拮抗劑或抑制劑足以治療和/或預(yù)防心血管疾病的量。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明化合物和組合物的總的每日使用量由主治醫(yī)生在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)決定。用于任何特定患者的具體的治療有效劑量水平取決于多種因素，包括待治療的疾病和疾病的嚴(yán)重程度、所用的特定化合物的活性、所用的特定組合物、患者的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食、所用的特定化合物的給藥時(shí)間、給藥途徑和排泄速率、治療持續(xù)時(shí)間、與所用的特定多肽組合使用或同時(shí)使用的藥物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)熟知的類(lèi)似因素。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的是，在開(kāi)始給予化合物時(shí)，其劑量低于獲得期望治療效果所需的劑量，再逐漸增加劑量直到獲得期望的效果。但是，藥物的日劑量可以在每位成人每天0. 01至IOOOmg的較寬的范圍內(nèi)變化。優(yōu)選地，組合物含有0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、 1. 0,2. 5,5. 0,10. 0,15. 0,25. 0,50. 0,100,250和500mg活性成分，以對(duì)癥調(diào)整用于所治療的患者的劑量。藥物通常含有約0. Olmg至約500mg的活性成分，優(yōu)選含有Img至約IOOmg 的活性成分。藥物的有效量通常以每天0. 0002mg/kg至約20mg/kg體重的劑量水平提供， 特別是以每天約0. OOlmg/kg至7mg/kg體重的劑量水平提供。本發(fā)明另一目的在于MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑用于制備治療患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代謝綜合癥的患者的藥物的用途，所述患者通過(guò)上述方法被分類(lèi)為響應(yīng)者。本發(fā)明另一目的涉及MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑用于治療患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代謝綜合癥的患者的用途，所述患者通過(guò)本發(fā)明方法被分類(lèi)為響應(yīng)者。因此，本發(fā)明另一目的涉及MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑用于治療患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代謝綜合癥的患者的用途，其中所述患者的所述一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平高于從普通群體或健康受試者獲得的預(yù)定值。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述患者患有心血管疾病。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述患者患有肥胖。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述患者患有糖尿病。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述患者患有代謝綜合癥。本發(fā)明另一目的在于將選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)基因和 SERPINA3基因的一種或兩種生物標(biāo)志物用作患者中MR激活的生物標(biāo)志物。本發(fā)明另一目的在于監(jiān)測(cè)患者的MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑治療，包括根據(jù)本發(fā)明方法評(píng)估MR激活，以及任選地將所述一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平與代表 MR激活的預(yù)定階段的預(yù)定值比較，所述一種或兩種生物標(biāo)志物相對(duì)于預(yù)定值的表達(dá)水平指示了 MR激活的進(jìn)展，從而指示了治療的有效程度。本發(fā)明將通過(guò)附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。


圖IA 條件性MR心臟過(guò)度表達(dá)模型中NGAL表達(dá)的時(shí)間過(guò)程。Lcn2表示脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 (NGAL)。HPRT表示管家對(duì)照基因(housekeeping control gene)。Cnt表示對(duì)照同窩小鼠。DT表示具有條件性hMR過(guò)度表達(dá)的雙轉(zhuǎn)基因小鼠。圖IB 在MR的心臟中NGAL蛋白的表達(dá)。Lcn2表示脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 (NGAL)。GAPDH 表示管家對(duì)照基因。Cnt表示對(duì)照同窩小鼠。DT表示具有條件性hMR過(guò)度表達(dá)的雙轉(zhuǎn)基因小鼠。圖2 在MR與GR過(guò)度表達(dá)的小鼠的心臟中的NGAL表達(dá)。Lcn2表示脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 (NGAL)。HPRT表示管家對(duì)照基因。Cnt表示對(duì)照同窩小鼠。DT表示具有條件性hMR或 hGR過(guò)度表達(dá)的雙轉(zhuǎn)基因小鼠。圖3 在各種模型中的NGAL表達(dá)。A和B 定量PGR ；C和D :ELISA。Cnt表示對(duì)照同窩小鼠。DT表示具有條件性hMR過(guò)度表達(dá)的雙轉(zhuǎn)基因小鼠。醛固酮-鹽表示以醛固酮灌注處理并給予NaCl的飲水的單側(cè)腎切除小鼠。內(nèi)皮特異性的MR表達(dá)通過(guò)僅靶向于內(nèi)皮的條件性MR表達(dá)獲得。圖4 在穩(wěn)定表達(dá)大鼠MR的大鼠心肌細(xì)胞(H9C2細(xì)胞)模型中的NGAL表達(dá)。Cnt 表示對(duì)照(稀釋劑)。Aldo和cortico分別表示醛固酮和皮質(zhì)酮。R似8318是MR拮抗劑， RU486是GR拮抗劑。β -肌動(dòng)蛋白是用于進(jìn)行歸一化的管家基因。圖5Α :11型糖尿病小鼠模型中的NGAL表達(dá)。Lcn2表示脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 (NGAL)。Cnt表示對(duì)照同窩小鼠。db/db表示糖尿病小鼠°圖5B 脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL血漿水平的演變。在對(duì)照和db/db小鼠中的血漿 Lcn2,以坎利酸鹽處理了 17周或未處理。圖6 具有心力衰竭的大鼠的心臟和血漿中MR依賴(lài)性的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL的誘導(dǎo)。A.具有惡病質(zhì)誘導(dǎo)的心力衰竭的大鼠左心室中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL的表達(dá)增加了兩倍。有效劑量的螺內(nèi)酯(50mg/Kg/天，能預(yù)防心力衰竭癥狀)完全阻止了誘導(dǎo)。B.具有心力衰竭的大鼠的血漿中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL的血漿水平也升高(圖6B)。當(dāng)動(dòng)物以50mg/Kg/j的螺內(nèi)酯處理時(shí)(HF+螺內(nèi)酯50mg/Kg/j相對(duì)于HF)，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL的血漿水平升高被阻止。圖7 :MR心臟過(guò)度表達(dá)的小鼠模型中微陣列識(shí)別的差異基因(differential gene)的驗(yàn)證。krpina3的表達(dá)在過(guò)度表達(dá)MR的小鼠(DT-MR)的心臟中明顯增加，但是在過(guò)度表達(dá)GR的小鼠(DT-GR)的心臟中沒(méi)有變化。各樣品中mRNA水平的值相對(duì)于ubc mRNA 水平歸一化。對(duì)照中的這些值對(duì)于各基因設(shè)置為1，圖中顯示了倍數(shù)的變化。*，p < 0. 05， **，ρ < 0. 01相對(duì)于對(duì)照，使用曼-惠特尼U檢驗(yàn)。圖8 :H9C2/MR細(xì)胞中serpina3表達(dá)的MR特異性。InM的醛固酮(aldo)和IOnM 的皮質(zhì)酮(cortico)處理M小時(shí)提高了 serpina3的表達(dá)，該表達(dá)水平的提高是通過(guò)MR依賴(lài)性的機(jī)制，如使用R似8318 (特異性的MR拮抗劑)所顯示的。各樣品中mRNA水平值相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白mRNA的水平歸一化。對(duì)于各基因?qū)φ?未處理的細(xì)胞)中的這些值設(shè)置為1，圖中顯示了倍數(shù)的變化。**，ρ <0.01相對(duì)于對(duì)照(無(wú)類(lèi)固醇)，使用ANOVA分析。圖9A 以IOnM醛固酮處理的H9C2/MR細(xì)胞中krpina3誘導(dǎo)的時(shí)間過(guò)程。在暴露在醛固酮下M小時(shí)后，高度誘導(dǎo)了 krpina3的表達(dá)。各樣品中mRNA水平值相對(duì)于β -肌動(dòng)蛋白mRNA的水平歸一化。對(duì)于各基因?qū)φ?未處理的細(xì)胞)中的這些值設(shè)置為1，圖中顯示了倍數(shù)的變化。*，p <0.05，**，p <0.01相對(duì)于對(duì)照(無(wú)類(lèi)固醇)，使用ANOVA分析。圖9B 以醛固酮誘導(dǎo)的krpina3的劑量反應(yīng)。醛固酮對(duì)krpina3表達(dá)的誘導(dǎo)是劑量依賴(lài)性的。各樣品中mRNA水平值相對(duì)于 β-肌動(dòng)蛋白mRNA的水平歸一化。對(duì)于各基因?qū)φ?未處理的細(xì)胞)中的這些值設(shè)置為1， 圖中顯示了倍數(shù)的變化。*，ρ < 0. 05，**，ρ < 0. 01相對(duì)于對(duì)照(無(wú)類(lèi)固醇)，使用ANOVA 分析。圖10 患有心力衰竭的大鼠心臟中krpina3的MR依賴(lài)的誘導(dǎo)。具有惡病質(zhì)誘導(dǎo)的心力衰竭的大鼠左心室中，Serpina3的表達(dá)高度增加。有效劑量的螺內(nèi)酯(50mg/Kg/天，能預(yù)防心力衰竭癥狀)阻止了誘導(dǎo)。**，ρ <0.01相對(duì)于假飼 (sham) #，ρ < 0. 05相對(duì)于安慰劑(心力衰竭，給予安慰劑)，使用ANOVA分析。
實(shí)施例實(shí)施例1MR和GR轉(zhuǎn)基因小鼠鹽皮質(zhì)激素受體(MR)和糖皮質(zhì)激素受體(GR)轉(zhuǎn)基因小鼠分別允許條件性地表達(dá)人MR或GR。MR和GR轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)繁殖自產(chǎn)的受體小鼠獲得，該受體小鼠在與合適的反式激活(transactivator)小鼠雜交時(shí)允許條件性的誘導(dǎo)性hMR或 hGR 表達(dá)。Ouvrard-Pascaud 等(2005)和 Sainte-Marie 等(2007)已經(jīng)描述了這些條件性轉(zhuǎn)基因模型。為識(shí)別心臟中的MR選擇性地調(diào)控的基因，MR和GR受體小鼠與MHC-tTA反式激活小鼠(由 G. Fishman 提供，Columbia University, NY, USA)雜交(Yu 等人，1996)以分別允許hMR和hGR的心肌細(xì)胞特異性表達(dá)。與對(duì)照的同窩小鼠相比，這分別導(dǎo)致在MR或GR 條件化小鼠的心臟中，4倍的MR過(guò)度表達(dá)或糖皮質(zhì)激素結(jié)合3倍的增加。為避免早期胚胎致死性，MR子代從懷孕直至出生一直用Dox處理，使得僅在出生后第7天出現(xiàn)表達(dá)。樣品、RNA分離、標(biāo)記和雜交總RNA使用TRIZOL 試劑(Life technologies)從 5只一個(gè)月大的MR轉(zhuǎn)基因小鼠、5只一個(gè)月大的GR轉(zhuǎn)基因小鼠的全心臟中分離。用于MR轉(zhuǎn)基因小鼠的基準(zhǔn)樣品由提取自該MR轉(zhuǎn)基因小鼠的5只對(duì)照同窩小鼠(相同的年齡，相同的家系)的全心臟總RNA組成。用于GR轉(zhuǎn)基因小鼠的基準(zhǔn)樣品由提取自該GR轉(zhuǎn)基因小鼠的 5只對(duì)照同窩小鼠(相同的年齡，相同的家系)的全心臟總RNA組成。mRNA使用Oligotex mRNA試劑盒Oliagen)分離。RNA和mRNA質(zhì)量使用Agilent 2100生物分析儀器評(píng)價(jià)。合并來(lái)自MR轉(zhuǎn)基因小鼠的mRNA并在三個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中用Cy5標(biāo)記。合并來(lái)自用于MR轉(zhuǎn)基因小鼠的基準(zhǔn)的mRNA并在三個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中用Cy3標(biāo)記。來(lái)自GR轉(zhuǎn)基因小鼠的mRNA合并為 3組，每一組用Cy5在兩個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中標(biāo)記。合并來(lái)自用于GR轉(zhuǎn)基因小鼠的基準(zhǔn)的mRNA 并以Cy3在六個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中標(biāo)記。使用CyScribe cDNA Post Labeling Kit (Amersham Pharmacia Biotech)制備Cy3_和Cy5_標(biāo)記的cDNA。對(duì)各微陣列獨(dú)立地進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。對(duì) MR轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行三次微陣列雜交，和對(duì)GR轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行6次微陣列雜交。雜交混合物與人Cot-I DNA (Gibco-BRL)、酵母tRNA和聚腺苷酸RNA —起預(yù)孵育，再雜交至微陣列。微陣列微陣列使用50-mer寡核苷酸探針(MWG Biotech )自制。探針使用 Lucidea Array Spotter (購(gòu)自Amersham)點(diǎn)樣到環(huán)氧-硅烷涂覆的玻璃載片上?；趨⑴c心血管和/或骨骼肌正常和病理機(jī)能，對(duì)列于微陣列上的M19個(gè)基因進(jìn)行選擇。選擇是基于 1)減除雜交(subtractive hybridization)試驗(yàn)(Steenman 等，2005)，2)基因組范圍的微陣列雜交(Steenman等人，200 和幻文獻(xiàn)數(shù)據(jù)。微陣列包含小鼠特異性寡核苷酸和與相應(yīng)的小鼠序列具有至少80%的同源性的人寡核苷酸。各基因探針一式三份點(diǎn)樣。原始數(shù)據(jù)的提取和整合通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡(kanarray 4000XL, GSI-Lumonics)掃描雜交陣列。對(duì)于各熒光染料以10 μ m/像素的分辨率獨(dú)立地獲得熒光信號(hào)測(cè)量。使用GenePix Pro 5.0(ΑχΟη )測(cè)量雜交和背景信號(hào)強(qiáng)度以及質(zhì)量控制參數(shù)。進(jìn)行Lowess歸一化過(guò)程(Yang等人，200 以糾正技術(shù)偏差。該過(guò)程根據(jù)先前所述(Workman 等人，200 逐通道地實(shí)施。對(duì)于各微陣列，Cy3-和Cy5-信號(hào)強(qiáng)度單獨(dú)地相對(duì)于定義為所有Cy3_和Cy5_信號(hào)強(qiáng)度的中位數(shù)的原型歸一化。微陣列的統(tǒng)計(jì)分析微陣列的顯著性分析(SAM) (Tusher等，2001)和微陣列數(shù)據(jù)的線性模型(Limma) (Smyth 2004)用于識(shí)別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異表達(dá)的基因。一類(lèi)分析(One-class analysis)用于識(shí)別轉(zhuǎn)基因小鼠和基準(zhǔn)小鼠間差異表達(dá)的基因，而二類(lèi)分析(two-class analysis)用于識(shí)別兩個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠模型之間差異表達(dá)的基因。MR轉(zhuǎn)基因小鼠的一類(lèi)分析導(dǎo)致識(shí)別了 520個(gè)基因，其同時(shí)被SAM(FDR(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)=0. 05% )和 LimmaC FDR"-校正，ρ < 0. 01)識(shí)別。GR轉(zhuǎn)基因小鼠的一類(lèi)分析導(dǎo)致識(shí)別了 1232個(gè)基因，其同時(shí)被SAM (FDR = 0. 03% )禾口 LimmaC FDR"-校正，ρ < 0. 01)識(shí)別。二類(lèi)分析導(dǎo)致識(shí)別了 5 個(gè)基因，其同時(shí)被SAM(FDR = 0.09%)和Limma(〃 FDR"-校正，ρ <0.01) 識(shí)別。MR激活的各種轉(zhuǎn)基因或藥理學(xué)小鼠模型中NGAL的表達(dá)定量的 NGAL mRNA 表達(dá)通過(guò)定量 PCR(Q_PCR，Light Cycler, Biorad)使用正向引物 5 ‘ -GGACCAGGGCTGTCGCTACT-3 ‘ (SE0 ID NO :1)和反向弓丨物 5' -GGTGGCCACTTGCACATTGT-3‘ (SE0 ID NO : 在使用 2 μ g提取自 1、2、3 個(gè)月大的 MR轉(zhuǎn)基因小鼠的不含DNA的總RNA制備的25 μ 1的RT-PCR上進(jìn)行分析(使用Sybr Green I的 qPCR Core試劑盒(購(gòu)自Eurogentec))，并與匹配的同窩小鼠及2個(gè)月大的GR轉(zhuǎn)基因小鼠 (以及相應(yīng)的的對(duì)照同窩小鼠)進(jìn)行比較。使用特異性的NGAL抗體(AF1857，R&D Systems)分析來(lái)自2個(gè)月大的MR小鼠的心肌蛋白提取物中NGAL的蛋白表達(dá)。使用鼠類(lèi)NGAL特異性的ELISA測(cè)定(由A. Xu,香港提供)評(píng)估NGAL的血漿濃度(Wang等，2007)。也通過(guò)Q-PCR分析具有單側(cè)腎切除及用醛固酮灌注(60yg/kg/j，0.25y 1/h ALZET微型泵)和含有鹽的飲水處理3周(與僅單側(cè)腎切除的對(duì)照小鼠比較)的小鼠心臟中，和來(lái)自?xún)H在上述MR轉(zhuǎn)基因小鼠與使得僅在內(nèi)皮內(nèi)允許條件性hMR過(guò)度表達(dá)的內(nèi)皮特異性的反式激活小鼠(由L. E.Ben jamine，Harvard，USA提供)適當(dāng)繁殖后獲得的在內(nèi)皮中條件性過(guò)度表達(dá)人MR的9個(gè)月大的小鼠的胸主動(dòng)脈中的定量的NGALmRNA表達(dá)(Sim等， 2005)。對(duì)于3個(gè)月大的單側(cè)腎切除的及用醛固酮灌注(60μ g/kg/j，0. 25 μ 1/hALZET微型泵)和含有鹽的飲水處理3周小鼠(與僅單側(cè)腎切除的對(duì)照小鼠比較)以及9個(gè)月大的具有內(nèi)皮特異性MR過(guò)度表達(dá)的小鼠(與對(duì)照同窩小鼠進(jìn)行比較)，也對(duì)其血漿中的NGAL 血漿濃度進(jìn)行評(píng)估。穩(wěn)定地過(guò)度表達(dá)大鼠MR的大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)的細(xì)胞模型中NGAL的表達(dá) (Fejes-toth, Endocrinology,2007)定量NGAL 的 mRNA 表達(dá)通過(guò)定量 PCR^-PCR，Light Cycler, Biorad) 使用正向引物 5 ‘ -TCACCCTGTACGGAAGAACC-3 ‘ (SE0 ID NO 3)和反向弓丨物 5 ‘ -GGTGGGAACAGAGAAAACGA-3 ‘ (SEQ ID NQ 4)在使用 2 μ g 提取自大鼠 H9C2/MR 細(xì)胞的不含DNA的總RNA制備的25 μ 1 RT-PCR上進(jìn)行分析(使用Sybr Green I的qPCR Core試劑盒(購(gòu)自Eurogentec))，所述大鼠H9C2/MR細(xì)胞用各種不同濃度的醛固酮或的皮質(zhì)酮或KT6M的MR拮抗劑RU 28318或GR拮抗劑RU 486單獨(dú)或組合處理。II型糖尿病小鼠模型中NGAL的表達(dá)(瘦蛋白受體基因中具有自發(fā)突變的db/db 小鼠)對(duì)于以藥理MR拮抗劑坎利酸鹽(坎利酸鹽，Sigma-Alderich, 100mg/Kg/day,于飲水中，45天)處理前和處理后的db/db小鼠，使用鼠NGAL-特異性的ELISA測(cè)試(A. Xu, Hong-Kong提供)評(píng)估NGAL的血漿濃度(Wang等，2007)。結(jié)果相比于1、1. 5或3個(gè)月大的同窩對(duì)照小鼠(Cnt)，在具有條件性人MR過(guò)度表達(dá)的小鼠(DT)心臟中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL mRNA強(qiáng)烈表達(dá)(X60-200)(圖1A)。相比于同窩對(duì)照小鼠(Cnt)，在1.5個(gè)月大的具有條件性人MR過(guò)度表達(dá)的小鼠(DT)心臟中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白 2/NGAL蛋白也強(qiáng)烈地被誘導(dǎo)(圖1B)。由于對(duì)照同窩小鼠中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL表達(dá)的誘導(dǎo)從未超過(guò)1. 3倍，因此這是高度敏感的。通過(guò)分析2個(gè)月大的GR過(guò)度表達(dá)小鼠的心臟中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白/NGAL表達(dá)評(píng)估密切相關(guān)的GR的特異性(圖2)。MR過(guò)度表達(dá)小鼠的心臟中誘導(dǎo)的NGAL表達(dá)比在GR過(guò)度表達(dá)的小鼠中高75倍。在以藥理學(xué)MR刺激(醛固酮/鹽模型)3周的小鼠的心臟中以及在具有靶向于內(nèi)皮的條件性MR過(guò)度表達(dá)的9個(gè)月大小鼠(DT，與同窩對(duì)照小鼠Cnt相比較)的主動(dòng)脈中，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL的表達(dá)增加(圖3A-C)。有趣的是，在這兩種小鼠模型中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白 2/NGAL的血漿水平也升高，這表明來(lái)自?xún)?nèi)皮壁的分泌(圖:3B-D)。在以10- 醛固酮處理M小時(shí)的H9C2/MR細(xì)胞中，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL表達(dá)增加(圖4A)。該脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL表達(dá)的增加通過(guò)向1(Γ8Μ的醛固酮加入MR拮抗劑RU28318阻止，但是不會(huì)通過(guò)加入GR拮抗劑RU 486阻止(圖4A)。1(Γ8Μ的皮質(zhì)酮(糖皮質(zhì)激素)也刺激脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL在H9C2/MR細(xì)胞中的表達(dá)(圖4B)。該增加也通過(guò)MR 拮抗劑RU 28318阻止，但是被GR拮抗劑RU 486阻止(圖4B)，這表明皮質(zhì)酮也通過(guò)MR刺激脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL的表達(dá)。時(shí)間過(guò)程研究表明，在10Λ1醛固酮刺激M小時(shí)后誘導(dǎo)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL的表達(dá)，并在48小時(shí)刺激后保持持續(xù)誘導(dǎo)(圖4C)。通過(guò)增加醛固酮的濃度刺激了脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL的表達(dá)，這表明特異性的MR介導(dǎo)的效應(yīng)(圖4D)。在II型糖尿病小鼠模型(db/db)的血漿中，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL的血漿水平也升高(圖5A和圖5B對(duì)照相對(duì)于db/db)。也分析了在這些小鼠中17周的藥理學(xué)MR拮抗的作用。圖5B表示對(duì)照和db/db小鼠(以坎利酸鹽處理或未處理)中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL 的血漿水平。以MR拮抗劑坎利酸鹽體內(nèi)處理db/db小鼠17周阻止了 db/db小鼠中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL血漿水平的升高(Figure 5B，db/db+坎利酸鹽)。坎利酸鹽對(duì)對(duì)照小鼠中的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL血漿水平?jīng)]有影響(對(duì)照+坎利酸鹽)。這證明了脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/ NGAL血漿水平可用于指示MR拮抗劑在II型糖尿病中的效力。在與惡病質(zhì)相關(guān)的大鼠心力衰竭(HF)模型中，如通過(guò)實(shí)時(shí)PCR評(píng)估的，心臟脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL mRNA表達(dá)被誘導(dǎo)最高至2倍(假飼相對(duì)于Ml)(圖6A)。當(dāng)給予有效濃度的螺內(nèi)酯以阻止心力衰竭癥狀的發(fā)展時(shí)(HF+螺內(nèi)酯50mg/Kg/j相對(duì)于HF)，完全阻止了脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/NGAL mRNA的誘導(dǎo)(圖6A)?；加行牧λソ叩拇笫蟮难獫{中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2/ NGAL的血漿水平也升高(圖6B)。當(dāng)動(dòng)物以50mg/Kg/j的螺內(nèi)酯處理時(shí)(HF+螺內(nèi)酯50mg/ Kg/j相對(duì)于HF)，該升高被阻止。因此，可通過(guò)確定NGAL基因的表達(dá)水平特異性地和有效地評(píng)價(jià)MR激活。患者對(duì) MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑治療的反應(yīng)性可通過(guò)確定從所述患者獲得的生物樣品中 NGAL基因的表達(dá)水平進(jìn)行預(yù)測(cè)。實(shí)施例2測(cè)量了健康受試者的群體中Lcn2/NGAL的血漿水平。該研究納入了年齡在18至85歲的男性和女性，只要他們?cè)谶^(guò)去的7天內(nèi)未表現(xiàn)出急性病變并且未接受任何心血管治療。健康對(duì)照的進(jìn)一步排除標(biāo)準(zhǔn)為已知高血壓(高于140/90mmHg，或如果年齡大于65歲血壓高于160mm Hg)、已知腎衰竭、已知糖尿病、懷孕、過(guò)去5年內(nèi)被診斷為癌癥或進(jìn)行性瘤形成(evolutive neoplasia)、慢性肝病、 connectivitis、克羅恩病、進(jìn)行性結(jié)核病(evolutive tuberculosis)、勞累型心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈(coronarien)綜合征、冠狀動(dòng)脈病(coronopathy)病史、頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù) (carotid endarterectomy)禾口已知腹云力脈瘤。健康受試者的Lcn2/NGAL血漿水平通常達(dá)到40至80 μ g/ml。也測(cè)量了患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代謝綜合癥的患者的Lcn2/NGAL血漿水平。其高于健康受試者的Lcn2/NGAL血漿水平。實(shí)施例3心肌細(xì)胞中MR或GR的長(zhǎng)期過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致不同于短期皮質(zhì)類(lèi)固醇治療誘導(dǎo)的信號(hào)通路改變(這代表了細(xì)胞的適應(yīng))。為分析心臟中的體內(nèi)長(zhǎng)期MR激活的分子后果，我們使用Cardiochips, (即包括由于其參與心血管和/或骨骼肌正常和病理機(jī)能而選擇的M19 個(gè)基因的微陣列)研究了 MR-心臟小鼠的心臟基因表達(dá)。心肌細(xì)胞MR過(guò)度表達(dá)6周導(dǎo)致約M個(gè)上調(diào)的基因和23個(gè)下調(diào)的基因。有趣的是，這些基因中的大多數(shù)不同于在GR-心臟小鼠中平行確定的GR調(diào)節(jié)基因(大約74個(gè)GR上調(diào)的基因和70個(gè)GR下調(diào)的基因)。而且，大多數(shù)MR調(diào)節(jié)基因在GR心臟小鼠模型中不發(fā)生改變，這表明各類(lèi)固醇受體控制心肌細(xì)胞中明顯不同的基因表達(dá)譜。MR和GR轉(zhuǎn)基因小鼠鹽皮質(zhì)激素受體(MR)和糖皮質(zhì)激素受體(GR)轉(zhuǎn)基因小鼠分別允許條件性地表達(dá)人MR或GR。MR和GR轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)自產(chǎn)受體小鼠的繁殖獲得，該受體小鼠在與合適的反式激活小鼠雜交時(shí)允許條件性的誘導(dǎo)性hMR或hGR表達(dá)。 Ouvrard-Pascaud等O005)和Sainte-Marie等O007)已經(jīng)描述了這些條件性轉(zhuǎn)基因模型。為識(shí)別由心臟中MR選擇性地調(diào)控的基因，MR和GR受體小鼠與MHC-tTA反式激活小鼠 (由 G. Fishman 提供，Columbia University, NY, USA)雜交(Yu 等人，1996)以分別使得心肌細(xì)胞特異地表達(dá)hMR和hGR。與對(duì)照的同窩小鼠相比，這分別導(dǎo)致MR或GR條件性小鼠的心臟中，4倍的MR過(guò)度表達(dá)或3倍的糖皮質(zhì)激素結(jié)合增加。為避免早期胚胎致死性，MR子代從懷孕直至出生一直用Dox處理，使得僅在出生后第7天出現(xiàn)表達(dá)。樣品、RNA分離、標(biāo)記和雜交總RNA使用TRIZOL 試劑(Life technologies)從 5只一個(gè)月大的MR轉(zhuǎn)基因小鼠、5只一個(gè)月大的GR轉(zhuǎn)基因小鼠的全心臟中分離。用于MR 轉(zhuǎn)基因鼠的基準(zhǔn)樣品由提取自該MR轉(zhuǎn)基因小鼠的5只對(duì)照同窩小鼠(相同的年齡，相同的家系)的全心臟總RNA組成。用于GR轉(zhuǎn)基因小鼠的基準(zhǔn)樣品由提取自該GR轉(zhuǎn)基因小鼠的 5只對(duì)照同窩小鼠(相同的年齡，相同的家系)的全心臟總RNA組成。mRNA使用Oligotex mRNA試劑盒Oliagen)分離。RNA和mRNA質(zhì)量使用Agilent 2100生物分析儀器評(píng)價(jià)。合并來(lái)自MR轉(zhuǎn)基因小鼠的mRNA并在三個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中用Cy5標(biāo)記。合并來(lái)自用于MR轉(zhuǎn)基因小鼠的基準(zhǔn)的mRNA并在三個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中用Cy3標(biāo)記。來(lái)自GR轉(zhuǎn)基因小鼠的mRNA合并為 3組，每一組用Cy5在兩個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中標(biāo)記。合并來(lái)自用于GR轉(zhuǎn)基因小鼠的基準(zhǔn)的mRNA 并以Cy3在六個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中標(biāo)記。使用CyScribe cDNA Post Labeling Kit (Amersham Pharmacia Biotech)制備Cy3_和Cy5_標(biāo)記的cDNA。獨(dú)立地進(jìn)行各微陣列的標(biāo)記反應(yīng)。對(duì) MR轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行三次微陣列雜交，而對(duì)GR轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行6次微陣列雜交。雜交混合物與人Cot-I DNA (Gibco-BRL)、酵母tRNA和聚腺苷酸RNA —起預(yù)孵育，再雜交至微陣列。微陣列微陣列使用50-mer寡核苷酸探針(MWG Biotech. )自制。探針使用 Lucidea Array Spotter (購(gòu)自Amersham)點(diǎn)樣到環(huán)氧-硅烷涂覆的玻璃載片上?；趨⑴c心血管和/或骨骼肌正常和病理機(jī)能，對(duì)列于微陣列上的M19個(gè)基因進(jìn)行選擇。選擇是基于1)減除雜交試驗(yàn)(3切拙111￡111等，2005)，2)基因組范圍的微陣列雜交(Steenman等人， 2003)和3)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)。微陣列包含小鼠特異的寡核苷酸和與相應(yīng)的小鼠序列具有至少80% 同源性的人寡核苷酸。各基因探針一式三份地點(diǎn)樣。原始數(shù)據(jù)的提取和整合通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡(kanarray 4000XL, GSI-Lumonics)掃描雜交陣列。對(duì)于各熒光染料以10 μ m/像素的分辨率獨(dú)立地獲得熒光信號(hào)測(cè)量值。使用GenePix Pro 5. O (Axon )測(cè)量雜交和背景信號(hào)強(qiáng)度以及質(zhì)量控制參數(shù)。進(jìn)行Lowess歸一化過(guò)程(Yang等人，200 以糾正技術(shù)偏差。該過(guò)程根據(jù)先前的描述 (Workman等人，2002)逐通道地進(jìn)行。對(duì)于各微陣列，Cy3_和Cy5_信號(hào)強(qiáng)度單獨(dú)地相對(duì)于定義為所有Cy3_和Cy5_信號(hào)強(qiáng)度的中位數(shù)的原型歸一化。微陣列的統(tǒng)計(jì)分析微陣列的顯著性分析(SAM) (Tusher等，2001)和微陣列數(shù)據(jù)的線性模型(Limma) (Smyth 2004)用于識(shí)別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異表達(dá)的基因。一類(lèi)分析用于識(shí)別轉(zhuǎn)基因小鼠和基準(zhǔn)小鼠之間差異表達(dá)的基因，二類(lèi)分析用于識(shí)別兩個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠模型之間差異表達(dá)的基因。MR轉(zhuǎn)基因小鼠的一類(lèi)分析導(dǎo)致識(shí)別了同時(shí)被SAM(FDR(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)=0.05%)和Limma(〃 FDR" _校正，ρ < 0. 01)識(shí)別的520個(gè)基因。GR轉(zhuǎn)基因小鼠的一類(lèi)分析導(dǎo)致識(shí)別了同時(shí)被SAM(FDR = 0.03%)和Limma(〃 FDR"-校正，ρ<0·01)識(shí)別的1232個(gè)基因。二類(lèi)分析導(dǎo)致識(shí)別了同時(shí)被SAM (FDR = 0. 09% )和Limma (〃 FDR"-校正，ρ < 0. 01)識(shí)別的5 個(gè)基因。MR或GR激活的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中serpina3的表達(dá)定量的 Serpina3 mRNA 表達(dá)通過(guò)定量 PCR(Q_PCR， Light Cycler, Biorad)使用正向引物 5 ‘ -CATCCCTGTGGGAAGTCAGT-3 ‘ (SEO ID NO 5)和反向弓丨物 5' -CTTTTGGGTGGAGGCAGATA-3‘ (SEO ID NO :6)在使用 2 μ g提取自 1、2、3 個(gè)月大的 MR轉(zhuǎn)基因小鼠的不含DNA的總RNA制備的25 μ 1的RT-PCR(使用Sybr Green I的qPCR Core 試劑盒(購(gòu)自Eurogentec))上進(jìn)行分析，并與匹配的同窩小鼠及2個(gè)月大的GR轉(zhuǎn)基因小鼠(以及相應(yīng)的對(duì)照同窩小鼠)進(jìn)行比較。穩(wěn)定地過(guò)度表達(dá)大鼠MR的大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)細(xì)胞模型中krpina3的表達(dá) (Fej es-toth, Endocrinology,2007)定量的Serpina3 mRNA 表達(dá)通過(guò)定量 PCI^Q-PCR，Light Cycler, Biorad) 使用正向引物 5 ' -AGACAAGGGGACACAACTGG-3 ‘ (SEQ ID NO 7)和反向弓丨物 5 ‘ -TGAGATGCTAAGTGGGGAGAA-3 ‘ (SEQ ID NO 8)在使用 2 μ g 提取自大鼠 H9C2/MR 細(xì)胞的不含DNA的總RNA制備的25 μ 1的RT-PCR(使用Sybr Green I的qPCR Core試劑盒(購(gòu)自Eurogentec))上進(jìn)行分析，所述大鼠H9C2/MR細(xì)胞以各種不同濃度的醛固酮或10_8M的皮質(zhì)酮或ΙΟ—Μ的MR拮抗劑RU 28318單獨(dú)或組合處理。惡病質(zhì)誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭模型中krpina3的表達(dá)。螺內(nèi)酯的藥理學(xué)MR拮抗效應(yīng)定量Serpina3 mRNA 的表達(dá)通過(guò)定量 PCI^Q-PCR，Light Cycler, Biorad) 使用正向引物 5 ' -AGACAAGGGGACACAACTGG-3 ‘ (SEQ ID NQ 7)和反向弓丨物 5 ‘ -TGAGATGCTAAGTGGGGAGAA-3 ‘ (SEQ ID NQ 8)在使用 2 μ g 提取自左心室的不含 DNA的總RNA制備的25 μ 1的RT-PCR(使用Sybr Green I的qPCR Core試劑盒(購(gòu)自 Eurogentec))上進(jìn)行分析。結(jié)果經(jīng)實(shí)時(shí)PCR確定，絲氨酸-蛋白酶抑制劑SERPINA3(或α -抗凝乳蛋白酶)的 mRNA表達(dá)在MR-心臟小鼠的心臟中上調(diào)了 25倍，但是在GR-心臟小鼠中沒(méi)有明顯的變化 (圖 7)。為研究MR的慢性效應(yīng)與較早發(fā)生的效應(yīng)之間的可能聯(lián)系，將在MR-心臟小鼠中識(shí)別的一些體內(nèi)MR-調(diào)節(jié)基因在H9C2/MR+細(xì)胞系中進(jìn)行測(cè)試。在低劑量的醛固酮(InM)存在下M小時(shí)，SERPINA3 mRNA被誘導(dǎo)了約8倍(圖8)。MR拮抗劑R似8318的存在抑制了誘導(dǎo)，這證明其涉及與MR的特異性相互作用。值的注意的是，IOnM的皮質(zhì)酮具有與醛固酮相似的作用，該作用可以被MR拮抗劑阻止(圖8)。時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)(圖9A)表明醛固酮(IOnM) 作用10小時(shí)后誘導(dǎo)serpina3，24小時(shí)后具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)(χ 15)。觀察到了濃度依賴(lài)性的誘導(dǎo)，以InM的醛固酮開(kāi)始(圖9B)。在惡病質(zhì)相關(guān)的大鼠心力衰竭(HF)模型中，如實(shí)時(shí)PCR估計(jì)的，心臟krpina3 mRNA表達(dá)被誘導(dǎo)最高至6倍(假飼相對(duì)于HF)(圖10)。當(dāng)給予有效濃度的螺內(nèi)酯以阻止心衰癥狀的發(fā)展時(shí)(HF+螺內(nèi)酯50mg/Kg/j相對(duì)于HF)，完全阻止了 krpina3 mRNA的誘導(dǎo) (圖 10)。如在過(guò)度表達(dá)MR的小鼠中所見(jiàn)的，這些數(shù)據(jù)表明SERPINA3涉及心肌細(xì)胞中對(duì)醛固酮的早期反應(yīng)，還涉及對(duì)增強(qiáng)的MR信號(hào)傳導(dǎo)的慢性適應(yīng)。由于serpina3是分泌酶，其可用作與MR激活有關(guān)的心肌損傷的標(biāo)志物。參考文獻(xiàn)在該申請(qǐng)中，各篇文獻(xiàn)說(shuō)明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)狀況。將這些文獻(xiàn)在此以引用的方式合并入本發(fā)明。Beato M， Herrlich P， Schutz G.Steroid hormone receptors :many actors in
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1.一種評(píng)估患者中鹽皮質(zhì)激素受體(MR)激活的方法，包括測(cè)定從所述患者獲得的生物樣品中選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。
2.一種預(yù)測(cè)患者對(duì)MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑治療的反應(yīng)性的方法，所述方法包括測(cè)定從所述患者獲得的生物樣品中選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL) 基因和SERPINA3基因的一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述一種或兩種生物標(biāo)志物的所述表達(dá)水平通過(guò)測(cè)定該一種或兩種生物標(biāo)志物mRNA的量來(lái)確定，并且所述生物樣品是細(xì)胞或組織樣
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細(xì)胞樣品是外周血單核細(xì)胞(PBMC)樣品或內(nèi)皮細(xì)胞樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平通過(guò)RT-PCR測(cè)定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平通過(guò)測(cè)量從所述患者獲得的生物樣品中的該一種或兩種生物標(biāo)志物蛋白的濃度而確定。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述生物樣品是血液樣品、血清樣品、血漿樣品或尿樣品。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者患有心血管疾病。
9 根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者患有充血性心力衰竭或高血壓。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者已經(jīng)用選自血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、利尿劑、血管擴(kuò)張劑、β受體阻斷劑、洋地黃和抗凝劑的標(biāo)準(zhǔn)療法進(jìn)行了治療。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者患有肥胖、糖尿病或代謝綜合癥。
12.MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑用于治療患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代謝綜合癥的患者的用途，其中所述患者的選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平高于從一般群體或從健康受試者獲得的預(yù)定值。
13.MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑用于制備治療患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代謝綜合癥的患者的藥物的用途，其中所述患者的選自中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白 (NGAL)基因和SERPINA3基因的一種或兩種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平高于從一般群體或從健康受試者獲得的預(yù)定值。
14.一種試劑盒，包含a)檢測(cè)NGAL蛋白的裝置；及b)檢測(cè)SERPINA3蛋白的裝置。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，包含a)NGAL蛋白結(jié)合伴體；及b)SERPINA3蛋白結(jié)合伴體。
全文摘要
本發(fā)明涉及中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)和SERPINA3用作患者中鹽皮質(zhì)激素受體(MR)激活的生物標(biāo)志物的用途。更具體地，本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)患者對(duì)MR拮抗劑或醛固酮合成酶抑制劑的治療的反應(yīng)性的方法，所述方法包括測(cè)定得自所述患者的生物樣品中NGAL基因和/或SERPINA3基因的表達(dá)水平。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102197146SQ200980143572
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2009年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者亞尼斯·圣瑪麗, 塞利娜·拉圖什, 妮科萊特·法爾曼, 弗雷德里克·雅斯, 馬爾雅·斯特曼 申請(qǐng)人:國(guó)家健康與醫(yī)學(xué)研究院