專利名稱：鯊肌醇產(chǎn)生細(xì)胞和使用該細(xì)胞的鯊肌醇制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鯊肌醇(scyllo-inositol :SI)產(chǎn)生細(xì)胞和使用該細(xì)胞的鯊肌醇的制造方法。更詳細(xì)而言，該細(xì)胞的特征在于，具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低。本申請要求通過參照而援用的日本申請?zhí)卦?008-281348號的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
鯊肌醇是肌肉肌醇(myo-inositol :MI)的一個(gè)立體異構(gòu)體，是廣泛存在于動(dòng)物 植物中的化合物。人們期待鯊肌醇作為阿耳茨海默氏病的治療藥、生理活性物質(zhì)的合成原料、液晶化合物的合成原料的用途。由于鯊肌醇與便宜供給的肌肉肌醇相比是高價(jià)的化合物，因此，迄今為止，人們對以肌肉肌醇作為原料的鯊肌醇的制造方法開展了各種研究。作為鯊肌醇制造方法的化學(xué)合成方法，有以下方法，即用鉬催化劑氧化肌肉肌醇， 獲得2-酮肌肉肌醇(2-keto-myo-inositol)(青蟹肌糖(scyllo-inosose))，接著，在酯化后進(jìn)行還原和水解，獲得鯊肌醇的方法等。此外，作為肌肉肌醇變化為鯊肌醇的方法，公開了使用從自然界分離的假單胞菌屬細(xì)菌、醋桿菌屬細(xì)菌的方法。該方法，使用前述菌由肌肉肌醇產(chǎn)生2-酮肌肉肌醇，通過對 2-酮肌肉肌醇進(jìn)行化學(xué)還原，獲得鯊肌醇(專利文獻(xiàn)1)。由肌肉肌醇少量生產(chǎn)鯊肌醇的菌株由醋桿菌屬的細(xì)菌等獲得(專利文獻(xiàn)幻。已知，在這些菌株中，NADPH依賴性地將2-酮肌肉肌醇立體特異地還原為鯊肌醇的酶起作用。報(bào)道了，在芽孢桿菌屬的菌中，通過基因改變肌醇代謝系基因簇，獲得了由肌肉肌醇有效產(chǎn)生D-手性肌醇的菌株(專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)1)。該菌株(YF256株)缺損了肌醇代謝相關(guān)的iolE基因和iolR基因。專利文獻(xiàn)1 日本專利第3981597號專利文獻(xiàn)2 國際公開W02005/035774號小冊子專利文獻(xiàn)3 特開2006-141216號公報(bào)非專利文獻(xiàn)1 =Appl Environ Microbiol. 2006Feb ；72 (2) :1310-5.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供能夠由肌肉肌醇(myo-inositol)有效且簡便地產(chǎn)生鯊肌醇的細(xì)胞和使用該細(xì)胞的鯊肌醇制造方法。為了解決上述問題，本發(fā)明人進(jìn)行了積極的研究，結(jié)果首次確認(rèn)了枯草桿菌中存在具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)和具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)通過肌醇產(chǎn)生細(xì)胞中具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能缺損的細(xì)胞，可以有效地產(chǎn)生鯊肌醇，從而完成了本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明由以下內(nèi)容構(gòu)成。1. 一種鯊肌醇產(chǎn)生細(xì)胞，至少具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或
4降低。2.根據(jù)前項(xiàng)1所述的細(xì)胞，具有2-酮肌肉肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能和肌醇代謝類基因簇的阻遏蛋白的功能發(fā)生缺損或降低。3.根據(jù)前項(xiàng)1或2所述的細(xì)胞，具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能的發(fā)生缺損或降低是通過人為破壞編碼具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因所致的。4.根據(jù)前項(xiàng)1 3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，鯊肌醇脫氫酶活性是將鯊肌醇的2位羥基脫氫的活性。5.根據(jù)前項(xiàng)1 4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)是由選自以下的(a) (c)中的任意一個(gè)DNA編碼的蛋白質(zhì)(a)由序列號1表示的堿基序列構(gòu)成的DNA ；(b)由在序列號1表示的堿基序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個(gè)以上的核苷酸的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ；(c)與由序列號1表示的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交，且編碼具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。6.根據(jù)前項(xiàng)1 5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)是選自以下的(a) (c)中的任意一個(gè)蛋白質(zhì)(a)由序列號2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；(b)由在序列號2表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加了一個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)；(c)由與序列號2表示的氨基酸序列具有40%以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成， 且具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。7.根據(jù)前項(xiàng)1 6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)依賴于 NAD+發(fā)揮作用。8.根據(jù)前項(xiàng)1 7中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。9.根據(jù)前項(xiàng)8所述的細(xì)胞，具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)是由選自以下的(a) (c)中的任意一個(gè)DNA編碼的蛋白質(zhì)(a)由序列號3表示的堿基序列構(gòu)成的DNA ；(b)由在序列號3表示的堿基序列中取代、缺失、插入和/或添加了 1個(gè)以上的核苷酸的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ；(c)與由序列號3表示的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交，且編碼具有 2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。10.根據(jù)前項(xiàng)8所述的細(xì)胞，具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)是選自以下(a) (c)中的任意一個(gè)蛋白質(zhì)(a)由序列號4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；(b)由在序列號4表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加了一個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)；(c)由與序列號4表示的氨基酸序列具有40%以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成， 且具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)前項(xiàng)1 10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞是屬于芽孢桿菌屬的菌。12.根據(jù)前項(xiàng)1 11中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞是受領(lǐng)番號為 FERMABP-11185(國內(nèi)受託番號FERM P-21700、國內(nèi)保藏日2008年10月8日)的枯草桿菌TM030株。13.根據(jù)前項(xiàng)1 12中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，具有青蟹肌糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的功能也降低或缺損了。14.鯊肌醇制造方法，包括在肌肉肌醇(myo-inositol)的存在下培養(yǎng)前項(xiàng)1 13 中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞的工序。15.根據(jù)前項(xiàng)14所述的鯊肌醇制造方法，其還包括從進(jìn)行前述培養(yǎng)的工序中獲得的培養(yǎng)濾液中除去細(xì)胞的工序，和從除去了細(xì)胞的培養(yǎng)濾液中分離鯊肌醇的工序。本發(fā)明的細(xì)胞能夠以便宜的肌肉肌醇作為原料，在細(xì)胞內(nèi)有效產(chǎn)生可以作為阿耳茨海默氏病的治療藥等使用的鯊肌醇。而且，使用這種細(xì)胞的本發(fā)明的鯊肌醇的制造方法不需要還原劑等添加物，能夠在一個(gè)步驟中進(jìn)行鯊肌醇的生產(chǎn)，十分簡便。


[圖1]是表示枯草桿菌中肌醇的代謝系的圖。[圖2]是表示對各種基因進(jìn)行表達(dá)分析的結(jié)果的圖。(參考例2)[圖3]是表示對yisS基因的表達(dá)量進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果的照片。(參考例2)[圖4]是表示培養(yǎng)yisS基因破壞株的結(jié)果的圖。(參考例3)[圖5]是表示培養(yǎng)yisS基因破壞株的結(jié)果的照片。(參考例3)[圖6]是表示培養(yǎng)TM039株的培養(yǎng)液的分析結(jié)果的圖。(實(shí)施例4)
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的對象為，由于細(xì)胞內(nèi)原本存在的具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低，能夠有效產(chǎn)生鯊肌醇的細(xì)胞。本發(fā)明中，所謂“蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低”的細(xì)胞，可例示為，與野生型細(xì)胞相比，對象蛋白質(zhì)自身的功能降低或消失，或量減少，或不表達(dá)的細(xì)胞等。具體的是，所謂 “蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低”的細(xì)胞，可例示為，在編碼對象蛋白質(zhì)的基因中導(dǎo)入變異， 或者該基因被破壞了的細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞可以是天然產(chǎn)生的，也可以是通過人為破壞該基因而制備的細(xì)胞。優(yōu)選的本發(fā)明的細(xì)胞，是通過人為破壞編碼對象蛋白質(zhì)的基因而制備的。本發(fā)明中所謂“細(xì)胞”，可以是具有肌醇代謝系的酶，具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低的細(xì)胞，微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞等，種類沒有限制。優(yōu)選可以使用肌醇代謝系酶成群存在的(具有肌醇代謝系基因簇或操縱子)微生物。微生物優(yōu)選是細(xì)菌，作為已知形成肌醇代謝系基因簇的細(xì)菌，可以列舉芽孢桿菌屬(Bacillus)、土芽孢桿菌屬(Geobacillus)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、沙門氏菌屬(Salmonella)等。而且， 屬于隱球菌屬(Cryptococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)、中華根瘤菌屬(arinorhizobium)的菌也存在具有肌醇代謝系基因簇的可能性，也可以使用這些菌。尤其是，優(yōu)選使用屬于芽孢桿菌屬的菌，更優(yōu)選使用枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
作為肌醇代謝系的酶，至少可例示出鯊肌醇脫氫酶、2-酮肌肉肌醇酮還原酶、肌肉肌醇-2-脫氫酶。還可以列舉青蟹肌糖異構(gòu)酶、2-酮肌肉肌醇脫氫酶等。肌醇代謝系的酶中包括由肌醇代謝系基因簇編碼的酶，例如在枯草桿菌中，肌肉肌醇-2-脫氫酶、青蟹肌糖 (scyllo-inosose)異構(gòu)酶、2_酮肌肉肌醇脫氫酶等由肌醇代謝系基因簇編碼的酶。本發(fā)明的細(xì)胞的特征在于，至少具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低。鯊肌醇脫氫酶催化由鯊肌醇轉(zhuǎn)化為2-酮肌肉肌醇的反應(yīng)，具有對鯊肌醇的2位羥基脫氫的活性。而且，鯊肌醇脫氫酶活性依賴于NAD+。具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)優(yōu)選是由選自以下(a) (c)中任意一個(gè)DNA編碼的蛋白質(zhì)(a)由序列號1表示的堿基序列構(gòu)成的DNA ； (b)由在序列號1表示的堿基序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個(gè)以上的核苷酸的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ； (c)與由序列號1表示的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交，且編碼具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA?；蛘?，具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)是選自以下(a) (c)中任意一個(gè)蛋白質(zhì)(a)由序列號2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；(b)由在序列號2表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加了一個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)；(c)由與序列號2表示的氨基酸序列具有40%以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選保持具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)的功能。 2-酮肌肉肌醇酮還原酶催化由2-酮肌肉肌醇轉(zhuǎn)化為鯊肌醇的反應(yīng)。此外，2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性依賴于NADPH。具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)是優(yōu)選由選自以下的(a) (C)中的任意一個(gè)DNA編碼的蛋白質(zhì)(a)由序列號3表示的堿基序列構(gòu)成的DNA; (b)由在序列號 3表示的堿基序列中取代、缺失、插入和/或添加了 1個(gè)以上的核苷酸的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ； (c)與由序列號3表示的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交，且編碼具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。 或者，具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)是選自以下(a) (c)中的任意一個(gè)蛋白質(zhì)(a)由序列號4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；(b)由在序列號4表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加了一個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)；(c)由與序列號4表示的氨基酸序列具有40%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，所謂在嚴(yán)緊條件下雜交的DNA，是指例如，以具有序列號1或3表示的堿基序列的DNA或其一部分的DNA片段作為探針，使用菌落雜交法、噬斑雜交法或Southern 雜交法等而獲得的DNA，具體可以列舉，通過使用固定了菌落或噬斑來源的DNA的過濾器， 在0. 7 1. OM的氯化鈉存在下，在65°C進(jìn)行雜交后，使用0. 1 2倍濃度的SSC溶液(1 倍濃度的SSC溶液的組成由150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉構(gòu)成)，在65°C條件下清洗過濾器能夠鑒定的DNA。雜交可以按照記載于《分子克隆》，實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1989(以下簡稱為分子克隆第 2 版)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，1987-1997 (以下，簡稱 Current Protocols in Molecular Biology)、 DNA Cloning 1 :Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等中記載的方法進(jìn)行。作為可以雜交的DNA，具體可以列舉由與序列號
71或3表示的堿基序列至少具有30%以上的同源性的堿基序列構(gòu)成的DNA、優(yōu)選具有60% 以上、更優(yōu)選具有80%以上、更為優(yōu)選具有90%以上、最優(yōu)選具有98%以上同源性的DNA。本發(fā)明中，由在序列號1或3表示的堿基序列中取代、缺失、插入和/或添加了 1 個(gè)以上的核苷酸的堿基序列編碼的蛋白質(zhì)，和由在序列號2或4表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加了 1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)可以使用分子克隆第 2 版，Current Protocols in Molecular Biology> Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA,79，6409 (1982)，Gene,34,315 (1985)，Nucleic Acids Research, 13,4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82,488 (1985)等中記載的定點(diǎn)誘變法來獲得。缺失、取代、插入和/或添加的核苷酸或氨基酸的數(shù)目在1個(gè)以上，其數(shù)目并沒有特別限制，但是通過上述的定點(diǎn)誘變法等公知技術(shù)能夠缺失、取代或添加的程度的數(shù)目，例如是1 數(shù)十個(gè)、優(yōu)選1 20個(gè)、更優(yōu)選1 10個(gè)、更優(yōu)選1 5個(gè)。而且，本發(fā)明中，具有鯊肌醇脫氫酶活性或肌肉肌醇-2-脫氫酶活性的功能的蛋白質(zhì)，在分別用序列號2或4表示的氨基酸序列和BLASTiJ. Mol. Biol.，215，403 (1990)〕或 FASTAiMethods in Enzymology，183，63 (1990)〕等分析軟件進(jìn)行計(jì)算時(shí)，具有至少40%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上的同源性。這種由與序列號2或 4中記載的氨基酸序列具有40%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)包括與由序列號2 或4中記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)類似的蛋白質(zhì)。對象蛋白質(zhì)是否具有鯊肌醇脫氫酶活性或肌肉肌醇-2-脫氫酶活性，對象基因是否編碼具有這些活性的蛋白質(zhì)，可以用本身公知的酶學(xué)測試等方法來確認(rèn)。此外，還可以通過例如，在只以鯊肌醇或只以2-酮肌肉肌醇作為碳源的培養(yǎng)基中使人為使對象蛋白質(zhì)功能發(fā)生缺損的菌株生長來確定。本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選具有2-酮肌肉肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能和肌醇代謝系基因簇的阻遏蛋白的功能發(fā)生缺損或降低。本發(fā)明的細(xì)胞更優(yōu)選具有青蟹肌糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低。在本發(fā)明的細(xì)胞的制作中，作為人為使目的蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低的方法，例舉了破壞編碼目的蛋白質(zhì)的基因的方法，也可以使用通常的通過變異進(jìn)行的方法。例如，通過物理的和/或化學(xué)的誘變處理中，除了 UV照射、放射線照射等物理變異方法之外， 還例舉了通過N亞硝基胍、甲磺酸乙酯、亞硝酸、甲磺酸甲酯、吖啶色素、苯并芘、硫酸二甲酯等變異劑的混合而進(jìn)行的化學(xué)的變異方法。這些變異處理是期待在基因上進(jìn)行堿基的插入、缺失和/或取代的方法。變異處理中，只要基因被破壞，可以插入、缺失和/或取代一個(gè)堿基，也可以插入、缺失、和/或取代多個(gè)堿基。此外，作為從實(shí)施了變異處理的細(xì)胞獲得目的細(xì)胞的方法，可以列舉以肌肉肌醇的代謝分解能力缺失作為指標(biāo)的篩選方法、以在添加了葡萄糖的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞的肌醇代謝酶活性的高度作為指標(biāo)的篩選方法。此外，作為編碼目的蛋白質(zhì)的基因的其它人為的破壞方法，有通過同源重組進(jìn)行堿基的插入、缺失和/或取代的方法。同源重組法，是導(dǎo)入人為實(shí)施了堿基的插入、缺失和 /或取代，且部分具有與目的基因相同序列的堿基序列，通過同源重組進(jìn)行變異的方法。例如，導(dǎo)入插入了作為耐藥基因的氯霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因、四環(huán)素耐性基因、紅霉素耐性基因、壯觀霉素耐性基因、氨芐西林耐性基因、潮霉素耐性基因等的堿基序列后，
8用相應(yīng)的藥劑進(jìn)行篩選，獲得存活細(xì)胞的方法。而且，還可以通過用PCR等機(jī)器確認(rèn)是否在所期望的部分插入，從而獲得目的細(xì)胞。而且，所謂“人為破壞目的蛋白質(zhì)的功能或編碼目的蛋白質(zhì)的基因”是指，例如，通過導(dǎo)入突變、或同源重組，抑制該基因的轉(zhuǎn)錄，或破壞該基因編碼的蛋白質(zhì)的功能。對于肌醇代謝系的酶和肌醇代謝，例示枯草桿菌進(jìn)行說明(參照圖1)。肌肉肌醇-2-脫氫酶是肌醇代謝系基因簇中的1種、即idG基因編碼的肌肉肌醇代謝的初始酶。肌肉肌醇-2-脫氫酶通過NAD+依賴的反應(yīng)將肌肉肌醇(MI)轉(zhuǎn)化為2-酮肌肉肌醇(2-keto-myo-inositol :2KMI)(也稱為“青蟹肌糖”)。而且，肌肉肌醇-2-脫氫酶也催化將D-手性肌醇(D-chiro-inositol =DCI)轉(zhuǎn)化為1_酮基-D-手性肌醇(1-keto-D-chiro-inositol :1KDCI)的反應(yīng)。2-酮肌肉肌醇酮還原酶是由yvaA基因(Swiss-Prot :032223)編碼的酶。本發(fā)明首次確認(rèn)了在枯草桿菌中存在具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)。2-酮肌肉肌醇酮還原酶將2-酮肌肉肌醇QKMI)轉(zhuǎn)化為鯊肌醇(Si)。這種反應(yīng)依賴于NADPH。鯊肌醇脫氫酶是由yisS基因(Swiss-Prot :P40332)編碼的酶。本發(fā)明首次確認(rèn)了在枯草桿菌中存在具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。鯊肌醇脫氫酶將鯊肌醇(Si)轉(zhuǎn)化為2-酮肌肉肌醇0KMI)，將鯊肌醇的2位羥基脫氫。轉(zhuǎn)化反應(yīng)是依賴于NAD+的反應(yīng)。青蟹肌糖異構(gòu)酶是由肌醇代謝系基因簇中的一種、即ioll基因編碼的酶，是相互轉(zhuǎn)化(異構(gòu)化)2-酮肌肉肌醇QKMI)和1-酮基-D-手性肌醇(IKDCI)的酶。此外，2-酮肌肉肌醇脫氫酶是由肌醇代謝系基因簇中的一種，S卩iolE基因編碼，對2-酮肌肉肌醇QKMI)進(jìn)行脫氫，轉(zhuǎn)化為D-2，3-二酮-4-脫氧基-表肌醇(D-2， 3-diketo-4-deoxy-epi-inositol :DKDI)的酶。作為肌醇代謝系基因簇編碼的酶，還可以列舉還代謝D-2，3- 二酮-4-脫氧基-表肌醇(DKDI)的酶。但是，在不生成D-2，3-二酮-4-脫氧基-表肌醇(DKDI)時(shí)(例如，沒有 2-酮肌肉肌醇脫氫酶活性時(shí))，不進(jìn)行D-2，3- 二酮-4-脫氧基-表肌醇(DKDI)的代謝。已知在枯草桿菌中，肌醇代謝系基因簇，即使在培養(yǎng)液中含有肌肉肌醇，在同時(shí)含有葡萄糖等糖時(shí)，也基本不表達(dá)(Yoshida, K. et al.，Nucleic Acids Resarch, vol. 29, p. 683-692(2001))。因此，在通常的含有葡萄糖等的培養(yǎng)條件下，肌醇代謝系基因簇的酶活性非常低，由肌肉肌醇(MI)向鯊肌醇(Si)或D-手性肌醇(DCI)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)也基本不進(jìn)行。已知，在肌醇代謝系基因簇的基因上的上游存在轉(zhuǎn)錄控制蛋白質(zhì)。這種轉(zhuǎn)錄控制蛋白質(zhì)是由iolR基因編碼的阻遏蛋白，也稱為負(fù)調(diào)控子(Negative regulator)或負(fù)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。已知，在這種阻遏蛋白中，肌醇代謝中間體2-脫氧基5-酮基-D-葡糖醛酸6-磷酸起著誘導(dǎo)物的作用，肌醇代謝系基因簇的轉(zhuǎn)錄抑制被解除，該代謝系基因簇的酶受到翻譯誘導(dǎo)(Yo shi da, K. et al.，Journal of Biological Chemistry, Vol. 283， p. 10415-10424(2008))。而且，實(shí)驗(yàn)性地公開了，即使通過破壞iolR基因，肌醇代謝系基因簇的轉(zhuǎn)錄抑制被解除，該代謝系基因簇仍組成型表達(dá)aoshida，K. et al.，Journal of Molecular Biology, Vol. 285，917-929(1999))。例如，在破壞了肌醇代謝系基因簇中的編碼具有2-酮肌肉肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因(iolE基因)和肌醇代謝系基因簇的編碼阻遏蛋白的基因(iolR基因)的枯草桿菌菌株(YF256株)中，由肌肉肌醇向D-手性肌醇的轉(zhuǎn)化效率上升。這是因?yàn)?，在解除了轉(zhuǎn)錄抑制的狀態(tài)下，可以使2-酮肌肉肌醇脫氫酶以外的肌醇代謝系基因簇的酶進(jìn)行生物合成，結(jié)果能夠不產(chǎn)生肌肉肌醇的不好的代謝分解。在這種由肌肉肌醇向D-手性肌醇的轉(zhuǎn)化中，盡管與由2-酮肌肉肌醇QKMI)向 1-酮基-D-手性肌醇(IKDCI)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)相關(guān)，但該反應(yīng)由青蟹肌糖異構(gòu)酶催化。人們報(bào)道了枯草桿菌的肌醇代謝系基因簇中，ioll基因編碼青蟹肌糖異構(gòu)酶aoshida，K. et al.， Applied andEnvironmental Microbiology,72(2),1310-5(2006Feb))。本發(fā)明人，首次確認(rèn)了在枯草桿菌中由yisS基因和yvaA基因編碼的蛋白質(zhì)與鯊肌醇和2-手性-肌肉肌醇之間的轉(zhuǎn)化相關(guān)，除了 iolE基因和iolR基因之外，還制作了破壞了鯊肌醇的分解所必需的yisS基因(編碼具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因)的枯草桿菌(TM030株)。用存在肌肉肌醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)枯草桿菌TM030菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與YF256 株相比，可以有效地產(chǎn)生鯊肌醇。通過對iolE基因?qū)嵤┧幬镒儺惗怪Щ?，通過iolR基因與yisS基因的同源重組，分別插入耐藥標(biāo)記物(氯霉素耐性基因、例如氯霉素乙?；D(zhuǎn)化酶)和整合載體 pMUTIN(Vagner, V. et al.，Mirocbilogy, Vol. 144，p. 3097-3104 (1998))，而被破壞的變異枯草桿菌株(名稱Bacillus subtilis TM030株)，將其于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566茨城縣筑波市東1-1-1筑波中心中央第6)，保藏編號 FERM BP-11185(國內(nèi)保藏號FERM P-21700、國內(nèi)保藏日2008年10月8日)進(jìn)行國際保藏?；虻钠茐姆椒ê秃Y選的具體方案，參照^shida，K. et al.，Microbiology，Vol. 150， p. 571-580 (2004)，進(jìn)行改變后使用。本發(fā)明人，制作了枯草桿菌中，除了 iolE基因、iolR基因、yisS基因(編碼具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因)之外，還破壞了 ioll基因(編碼具有青蟹肌糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的基因)的枯草桿菌(TM039株)。具體的是，在變異枯草桿菌株TM030株中，通過對ioll基因進(jìn)行同源重組，插入壯觀霉素耐性基因進(jìn)行破壞，制作變異枯草桿菌株(名稱Bacillus subtilis TM039株)。用存在肌肉肌醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)枯草桿菌TM039 菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了能夠以高純度產(chǎn)生鯊肌醇。而且，基因的破壞方法和篩選的具體方案，參照 Yoshida, K. et al.，Microbiology, Vol. 150，p. 571-580 (2004)和 Yoshida, K. et al.， J. Bacteriol. Vol. 181，p. 6081-6091 (1999)，改變后再使用。本發(fā)明還包括鯊肌醇的制造方法。鯊肌醇的制造方法包括在含有肌肉肌醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低的本發(fā)明的細(xì)胞的工序。而且，本申請的鯊肌醇的制造方法優(yōu)選含有從前述培養(yǎng)工序中獲得的培養(yǎng)濾液中除去細(xì)胞的工序，和從除去了細(xì)胞的培養(yǎng)濾液中分離鯊肌醇的工序。培養(yǎng)基含有肌肉肌醇，其組成只要能達(dá)到目的，就沒有特別限制。可以是除了作為原料的肌肉肌醇之外，還含有碳源、氮源、有機(jī)營養(yǎng)源、無機(jī)鹽類等的培養(yǎng)基，可以使用合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基中的任意一種。而且，培養(yǎng)基優(yōu)選是培養(yǎng)液(液體培養(yǎng)基)。培養(yǎng)基優(yōu)選使用，例如按如下方式配合的培養(yǎng)基。理想的是，添加相對于培養(yǎng)基整體重量的0. 1重量％ 40重量％，優(yōu)選1重量％ 30重量％、更優(yōu)選1重量％ 10重量％的肌肉肌醇，作為碳源，添加0. 1重量％ 20重量％、更優(yōu)選0. 3重量％ 5重量％的蘋果酸、甘油、蔗糖、麥芽糖或淀粉等，作為氮源，添加0. 01重量％ 5. 0重量％、優(yōu)選0. 5重量％ 2.0重量％的大豆胨、酪蛋白氨基酸、蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨或尿素等。此外，根據(jù)需要，可以在培養(yǎng)基中添加鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、錳、鋅、鐵、銅、鉬、磷酸、硫酸等能夠生成離子的無機(jī)鹽類。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以任意決定無機(jī)鹽類的添加量。培養(yǎng)液中的氫離子濃度不需要特別調(diào)整，但可以調(diào)整到優(yōu)選pH5 10、更優(yōu)選 pH6 9，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件根據(jù)菌的種類而不同，培養(yǎng)溫度可以設(shè)為12 45°C，更優(yōu)選設(shè)為15 37°C。此外，培養(yǎng)，可以振蕩培養(yǎng)液，或在培養(yǎng)液中吹入空氣或氧氣等需氧進(jìn)行。培養(yǎng)時(shí)間， 可以進(jìn)行到鯊肌醇顯示最大或必要量的蓄積量，通常為1 7天，優(yōu)選1 2天。細(xì)胞培養(yǎng)后的培養(yǎng)液中不僅含有鯊肌醇，還含有肌肉肌醇和D-手性肌醇。例如， 在培養(yǎng)TM030菌株時(shí)，培養(yǎng)液中可以含有鯊肌醇、肌肉肌醇、D-手性肌醇，在培養(yǎng)TM039菌株時(shí)，培養(yǎng)液中不含D-手性肌醇，而含有鯊肌醇和肌肉肌醇。從培養(yǎng)液中分離鯊肌醇的方法，可以使用本身公知的方法或今后開發(fā)的方法。而且，鯊肌醇的分離可以按根據(jù)目的的純度進(jìn)行，也可以作為鯊肌醇和D-手性肌醇的混合物，或鯊肌醇和肌肉肌醇的混合物等被分
1 O例如，從培養(yǎng)液中收集鯊肌醇的方法，可以應(yīng)用一般的方法分離純化通常的水溶性中性物質(zhì)。也就是說，從培養(yǎng)液中除去菌體后，通過用活性碳或離子交換樹脂等處理培養(yǎng)上清液，就可以基本除去肌醇類以外的雜質(zhì)。然后，通過使用再結(jié)晶等方法，就可以分離目的物質(zhì)。具體而言，例如，使蓄積了鯊肌醇的培養(yǎng)上清液通過填充了強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂、例如Duolite (注冊商標(biāo))C-20 (H+型)的柱以除去不希望的成分，收集通過液，然后使脫離子水通過該柱，清洗，收集清洗液，合并獲得的通過液和清洗液。使這樣獲得的溶液通過填充了強(qiáng)堿基性陰離子交換樹脂、例如Duolite (注冊商標(biāo))A116 (OH—型)的柱，收集通過液，然后使脫離子水通過該柱，清洗，收集清洗液，合并獲得的通過液和清洗液，獲得了含有肌醇類，而基本不含肌醇類以外的雜質(zhì)的水溶液。在對該水溶液進(jìn)行濃縮而獲得的鯊肌醇的濃溶液中加入適量乙醇，在室溫或低溫下放置一晚，就可以結(jié)晶形成純的鯊肌醇的結(jié)晶。此外，利用鯊肌醇的水溶解性低這一點(diǎn)，濃縮該水溶液，即使只通過過濾，也可以結(jié)晶形成純的鯊肌醇的結(jié)晶。此外，在進(jìn)行柱操作時(shí)，以脫色為目的，還可以使用填充了活性碳的柱。作為其它的純化方法，例如，通過在培養(yǎng)獲得的含有鯊肌醇的溶液中加入硼酸和 NaCl，制成鯊肌醇 硼酸復(fù)合體，將其過濾后，用酸使硼酸游離，加入甲醇這種有機(jī)溶劑使之結(jié)晶的方法，也可以獲得純的鯊肌醇結(jié)晶(專利文獻(xiàn)2)。實(shí)施例以下，為了加深本發(fā)明的理解，通過參考例和實(shí)施例具體地說明。參考例中，說明了完成本發(fā)明的經(jīng)過，實(shí)施例中盡管具體說明了發(fā)明內(nèi)容，但顯然它們并不限定本發(fā)明的范圍。(參考例1)枯草桿菌變異株YF256株的培養(yǎng)液的分析將枯草桿菌變異株(Bacillus subtilis YF256株、保藏編號FERM P-20286)加入到裝入了肉湯培養(yǎng)基30ml (1重量％大豆胨、0. 5重量％酵母提取物、0. 5重量％ NaClU重
11量％肌肉肌醇)的500ml廣口燒瓶中，在需氧條件下，37°C下培養(yǎng)17小時(shí)。收集該培養(yǎng)液， 離心分離(10000rpm、15分鐘)，回收培養(yǎng)上清液。通過高效液相色譜法，在前述條件下分析該培養(yǎng)上清液。柱Wakosi1 5NH2 (4. 6 X 250mm)柱溫度20°C或40°C檢測器RIDETECTER L-2490 (Hitachi)注入量10μ 1溶劑乙腈水=4 1流量2ml/min洗脫時(shí)間D-手性肌醇，11. 6分鐘肌肉肌醇，17. 8分鐘鯊肌醇，18. 2分鐘其結(jié)果是，在緊隨肌肉肌醇的峰之后，檢測出鯊肌醇的峰，判明了 YF256株產(chǎn)生鯊肌醇。(參考例2)與鯊肌醇代謝功能相關(guān)的基因的探索用數(shù)據(jù)庫 SSDB (http //ssdb. genome. jp/ssdb_bin/ssdb_paralog ？ org_gene = bsu :BSU39700)，從枯草桿菌的基因組中，檢索與idG基因的序列同源性高的并系同源 (paralog)基因，選擇出 7 個(gè)(yfil、yhjj、yisS、yrbE、yteU、yulF、yvaA)。對于這些基因，就它們在各種肌醇類的存在下(鯊肌醇存在下(Si)、肌肉肌醇存在下(MI)、D-手性肌醇存在下(DCI)、D-松醇的存在下(PI))的表達(dá)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析。 各培養(yǎng)操作，使用以0. 5%酪蛋白氨基酸作為碳源的合成培養(yǎng)基中添加10%上述肌醇類的培養(yǎng)基，于37°C振蕩培養(yǎng)野生型枯草桿菌或變異株Y256株直至對數(shù)增殖中期(S6培養(yǎng)基； Yoshida, K. et al.，Journal of Bacteriology, Vol. 79，p. 4591-4598 (1997))。微陣列使用SIGMAGEN0SYS公司的Panorama Gene Array, RNA印跡法中，以通過PCR擴(kuò)增yisS的結(jié)構(gòu)基因區(qū)域的一部分的產(chǎn)物作為模板，使用通過整合了 32P磷酸的隨機(jī)引物法產(chǎn)生的放射活性標(biāo)識的DNA探針(相當(dāng)于從yisS結(jié)構(gòu)基因的翻譯起始點(diǎn)開始的415bp之后到794bp 的 380bp)。結(jié)果示于圖2、圖3。圖2上半部分是表示微陣列結(jié)果的照片，下半部分是將微陣列結(jié)果數(shù)值化的表格。圖3是表示RNA印跡法結(jié)果的照片。這些結(jié)果提示，與其它基因相比，yisS基因和yvaA基因的表達(dá)水平高，尤其是， yisS基因在分解利用鯊肌醇的生長條件(Si存在下)下被誘導(dǎo)。由此表明，yisS基因和 yvaA基因二者或它們中的一個(gè)可能編碼以鯊肌醇作為底物的脫氫酶。(參考例3)yisS基因功能的確認(rèn)對于yisS基因的功能，通過制作破壞了 yisS基因的菌株，進(jìn)行確認(rèn)。yisS基因用pMUTIMMCS質(zhì)粒來破壞。使用特異的引物對(被設(shè)計(jì)成擴(kuò)增相當(dāng)于枯草桿菌168株的染色體堿基編號1163917至1164171的區(qū)域的引物對)和作為模板的枯草桿菌野生株168 的DNA，通過PCR擴(kuò)增yisS基因的一部分。PCR產(chǎn)物用HindIII和BamHI (或BglII)的酶組合進(jìn)行消化，連接到PMUTIN4MCS限制性酶臂中(Vegner, V. et al.，1998)。用這樣制作的重組質(zhì)粒pMUTIMMCS進(jìn)行野生株168的轉(zhuǎn)化。加入PMUTIN4MCS，就賦予了紅霉素抵抗性，這樣就可以進(jìn)行篩選。通過這樣的篩選，獲得了 BSF3018菌株。該菌株包含在通過枯草桿菌基因組功能分析項(xiàng)目制備的變異株庫中(Kobayashi，K. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 100，p. 4678-4685 (2003))。該變異株庫保管于國立遺傳學(xué)研究所中，作為國家生物資源項(xiàng)目(National Bioresource project)的一環(huán),一般可以公開發(fā)放(http://www. nbrp.jp/report/reportProject. jsp ； jsessionid = 6C442727811FEDB94CF60031CCDAFE9 2. Ibl ？ project = bsub)。而且，BF3018菌株中存在trpC2這樣的色氨酸需求性變異。使BSF3018菌株在葡萄糖存在下(Gluc)、肌肉肌醇存在下(Ml)、鯊肌醇存在下 (Si)生長，進(jìn)行觀察。作為對照，使用野生型和YF248菌株(由于破壞肌醇代謝系操縱子的啟動(dòng)子，肌醇代謝系酶群所有的表達(dá)缺失，因此無法代謝所有肌醇類)。其結(jié)果示于圖4、圖5。圖4是細(xì)胞增殖的經(jīng)時(shí)變化的圖(縱軸是波長660nm的吸光度)，圖5是30小時(shí)后的細(xì)胞增殖的照片。BFS3018菌株，在葡萄糖存在下和肌肉肌醇存在下，細(xì)胞增殖，但在鯊肌醇存在下， 沒發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖。由此提示yisS基因具有作為代謝鯊肌醇的酶的功能。(實(shí)施例1)鯊肌醇產(chǎn)生變異株的制作用BFS3018菌株的DNA，以紅霉素耐性轉(zhuǎn)化YF256菌株，破壞YF256菌株的yisS基因。使用感受態(tài)細(xì)胞法將BFS3018菌株的染色體DNA導(dǎo)入于細(xì)胞中，通過與YF256菌株的基因組DNA的同源重組轉(zhuǎn)化YF256菌株。加入了 BFS3018菌株中的yisS基因(被pMUTIMMCS 破壞的yisS基因)，被賦予了紅霉素抵抗性，因此可以進(jìn)行篩選。經(jīng)過這樣的篩選，獲得了 TM030菌株。(實(shí)施例2)鯊肌醇的制造方法將變異株TM030株加入到裝入了肉湯培養(yǎng)基30ml (1重量％大豆胨、0. 5重量％酵母抽出物、0. 5重量％ NaClU重量％肌肉肌醇)的500ml廣口燒瓶中，需氧條件下，37°C培養(yǎng)17小時(shí)。收集該培養(yǎng)液，離心分離(10000rpm、15分鐘)，回收培養(yǎng)上清液。通過高效液相色譜法，在前述條件下分析該培養(yǎng)上清液。柱Wakosi1 5NH2 (4. 6 X 250mm)柱溫度20°C檢測器RIDETECTER L-2490 (Hitachi)注入量10μ 1溶劑乙腈水=4 1流量2ml/min洗脫時(shí)間D-手性肌醇，11. 6分鐘肌肉肌醇，17. 8分鐘鯊肌醇，18. 2分鐘按培養(yǎng)上清中的鯊肌醇摩爾數(shù)相對于培養(yǎng)前的肌肉肌醇的摩爾數(shù)的百分比計(jì)算鯊肌醇的轉(zhuǎn)化率。TM030株產(chǎn)生的肌肉肌醇向鯊肌醇的轉(zhuǎn)化效率為16. 1%，肌肉肌醇向D-手性肌醇的轉(zhuǎn)化效率為4.3%。YF256菌株中，向鯊肌醇和D-手性肌醇的轉(zhuǎn)化效率分別為6. 4%和8. 3%。(實(shí)施例3)鯊肌醇產(chǎn)生變異株的制作2
制作破壞TM030菌株中的ioll基因的菌株。通過同源重組，插入壯觀霉素耐性基因，破壞ioll基因，制作變異株TM039株。具體方法，按與記載于文獻(xiàn)Aoshida，K. et al. J. Bacteriol. Vol. 181，p. 6081-6091 (1999)的asnH基因的破壞方法基本相同的方式進(jìn)行，設(shè)法將相當(dāng)于ioll結(jié)構(gòu)基因的翻譯起始點(diǎn)開始的335bp之后到528bp的194bp取代為壯觀霉素耐性基因。以枯草桿菌168株的染色體作為模板，分別用ioll IF :TGCGGTTGAACTTGAAGTGG (序列號 5)和 iolI2R :TCTTCTGCTCTGTCACAAGC(序列號 6)的引物對，和 iolI5F CACTTCCATGCAATGGGTTC(序列號 7)與 iolI6R :ATATTGATCTTCGCGTGGCC(序列號 8)的引物對，通過PCR擴(kuò)增相當(dāng)于IolI基因的前半部分(含有從翻譯起始點(diǎn)開始直至334bp的部分)、和后半部分(含有529bp之后的部分)的DNA。另一方面，壯觀霉素耐性基因盒的DNA、以FU341株(通過插入壯觀霉素耐性基因而破壞了 asnH基因的枯草桿菌變異株)的染色體作為模板，用iolI3F :GCTTGTGACAGAGCAGAAGACAATAACGCTATTGGGAG(序列號鍆和 iolI4R =GAAC CCATTGCATGGAAGTGCTATATGCTCCTTCTGGC (序列號 10)的引物對，通過 PCR 擴(kuò)增。將相當(dāng)于IolI基因的前半部分、壯觀霉素耐性基因盒、IolI基因的后半部分的上述3類DNA以大體相同的摩爾比混合，用iolIlF :TGCGGTTGAACTTGAAGTGG(序列號5)和 iolI6R :ATATTGATCTTCGCGTGGCC (序列號8)的引物，通過PCR擴(kuò)增，將上述3類DNA按所記載的順序連接。通過用適量的得到的連接DNA，轉(zhuǎn)化TM030菌株，賦予壯觀霉素耐性，從而獲得TM039株。(實(shí)施例4)鯊肌醇的制造方法2用與實(shí)施例2相同的方法培養(yǎng)變異株TM039株、TM030株或YF256菌株后，收集培養(yǎng)液，離心分離(10000rpm、15分鐘)，回收培養(yǎng)上清液。用與實(shí)施例2相同的方法，用高效液相色譜法分析該培養(yǎng)上清液。按培養(yǎng)上清中的鯊肌醇摩爾數(shù)相對于培養(yǎng)前的肌肉肌醇的摩爾數(shù)的百分比計(jì)算鯊肌醇的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果示于圖6。TM030株產(chǎn)生的肌肉肌醇向鯊肌醇的轉(zhuǎn)化效率為12%，肌肉肌醇向D-手性肌醇的轉(zhuǎn)化效率為5%。TM039株產(chǎn)生的肌肉肌醇向鯊肌醇的轉(zhuǎn)化效率為15%，肌肉肌醇向D-手性肌醇的轉(zhuǎn)化效率為O %。另一方面，YF256菌株中，向鯊肌醇和D-手性肌醇的轉(zhuǎn)化效率分別為10%和5%。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性使用本發(fā)明的細(xì)胞的鯊肌醇的制造方法便宜地提供無法從天然素材中微量提取的鯊肌醇，能夠由肌肉肌醇以良好純度簡便地制造鯊肌醇，是一種有用的方法。對于鯊肌醇在阿耳茨海默氏病中的治療效果，迄今為止已經(jīng)進(jìn)行了各種研究。例如，據(jù)報(bào)道，在神經(jīng)細(xì)胞中，鯊肌醇抑制被認(rèn)為是阿耳茨海默氏病的原因的β淀粉樣蛋白的凝集，而且沒有發(fā)現(xiàn)鯊肌醇對神經(jīng)細(xì)胞有毒性(McLaurin J. et al. , J Biol Chem. Vol. 275, p. 18495-18502 (2000) ；Sun Y. , et al. , Bioorg Med Chem. Vol. 16, p. 7177-7184(2008))。而且，發(fā)現(xiàn)，在阿耳茨海默氏病模型小鼠中，通過口服鯊肌醇，腦內(nèi)的
14β淀粉樣蛋白的凝集被抑制，這表明鯊肌醇使阿耳茨海默氏病中的認(rèn)知癥狀得到緩和，抑制壽命的縮短(Fenili D. et al.，J Mol Med. Vol. 85，603-611 (2007) ；Townsend M. et al.， Ann Neurol. Vol. 60，p.668-676(2006))。 我們認(rèn)為鯊肌醇比其它化合物的安全性高，與免疫反應(yīng)無關(guān)，不引發(fā)過敏癥。而且，由于鯊肌醇容易通過血腦屏障，能夠到達(dá)腦內(nèi)，因此可以通過口服給生物體施用，在阿耳茨海默氏病的預(yù)防和治療中是一種實(shí)用性極高的物質(zhì)。本發(fā)明的細(xì)胞可以高效且高純度地制作這種鯊肌醇。
權(quán)利要求
1.一種鯊肌醇產(chǎn)生細(xì)胞，至少具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，具有2-酮肌肉肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能和肌醇代謝類基因簇的阻遏蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞，具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能發(fā)生缺損或降低是通過人為破壞編碼具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因所致。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，鯊肌醇脫氫酶活性是將鯊肌醇的2位羥基脫氫的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)是由選自以下的(a) (c)中的任意一個(gè)DNA編碼的蛋白質(zhì)(a)由序列號1表示的堿基序列構(gòu)成的DNA；(b)由在序列號1表示的堿基序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個(gè)以上的核苷酸的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ；(c)與由序列號1表示的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交，且編碼具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)是選自以下的(a) (c)中的任意一個(gè)蛋白質(zhì)(a)由序列號2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；(b)由在序列號2表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加了一個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)；(c)由與序列號2表示的氨基酸序列具有40%以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)依賴于 NAD+發(fā)揮作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)是由選自以下的(a) (c)中的任意一個(gè)DNA編碼的蛋白質(zhì)(a)由序列號3表示的堿基序列構(gòu)成的DNA;(b)由在序列號3表示的堿基序列中取代、缺失、插入和/或添加了1個(gè)以上的核苷酸的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ；(c)與由序列號3表示的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交，且編碼具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)是選自以下(a) (c)中的任意一個(gè)蛋白質(zhì)(a)由序列號4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；(b)由在序列號4表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加了一個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)；(c)由與序列號4表示的氨基酸序列具有40%以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有2-酮肌肉肌醇酮還原酶活性的蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞是屬于芽孢桿菌屬的菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求1 11中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞是保藏編號為FERM ABP-11185的枯草桿菌TM030株，國內(nèi)保藏編號FERM P-21700、國內(nèi)保藏日2008年10月8曰。
13.根據(jù)權(quán)利要求1 12中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，具有青蟹肌糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的功能也降低或缺損了。
14.一種鯊肌醇制造方法，包括在肌肉肌醇的存在下培養(yǎng)權(quán)利要求1 13中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞的工序。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的鯊肌醇制造方法，其還包括從進(jìn)行所述培養(yǎng)的工序中獲得的培養(yǎng)濾液中除去細(xì)胞的工序，和從除去了細(xì)胞的培養(yǎng)濾液中分離鯊肌醇的工序。
全文摘要
本發(fā)明的課題提供能夠由肌肉-肌醇有效且簡便地制造鯊肌醇的細(xì)胞，和使用該細(xì)胞的鯊肌醇制造方法。該課題通過以下方式得到解決，即首次發(fā)現(xiàn)在枯草桿菌中存在具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，和具有2-酮肌酮還原酶功能的蛋白質(zhì)，枯草桿菌中具有鯊肌醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的功能缺失的細(xì)胞和使用該細(xì)胞制造鯊肌醇。
文檔編號C12N5/10GK102203238SQ20098014327
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者吉田健一, 蘆田均 申請人:國立大學(xué)法人神戶大學(xué)