專利名稱：含有順磁性肌醇磷酸鹽復(fù)合物的磁共振成像造影劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及一種新的磁共振成像造影劑，更特別地，涉及一種新的具有至少兩個與至少一種順磁物質(zhì)配位的磷酸基的磁共振成像造影劑。而且，本發(fā)明涉及使用其的成像方法。
背景技術(shù)：
植酸鹽是大量植物組織中磷的主要貯存形式，所述植物組織特別是谷類比如大米、小麥、玉米、豆類等，植酸鹽占谷類總重量的1_5%，占谷類總含磷量的約70-80%。植酸鹽，一種植酸的鹽形式，是具有至多六個磷酸鹽的肌醇，所述磷酸鹽結(jié)合礦物離子比如Ca2+、Mg2+、Fe2+和Si2+，形成通常個體動物比如人類、小雞、豬、小鼠等生物可利用的不溶性復(fù)合物，因為這些動物缺少從該不溶性復(fù)合物中分離磷需要的消化酶(Reddy等人， 1982)。然而，未消化的植酸鹽起抑制腸吸收礦物離子比如Ca2+、Mg2+、Fe2+和Si2+的抗?fàn)I養(yǎng)因子作用。因此，已知礦物質(zhì)-植酸鹽復(fù)合物引起飲食依賴高含量植酸鹽食物的人體中礦物質(zhì)不足(Torre等人，1991)。最新研究表明從植物種子中純化的植酸鹽具有各種的有利的作用，包括起抗癌劑作用(Kennedy 1995 ；Kennedy & Manzone 1995)和抗氧劑作用(Graf & Eaton 1990)，并且與心臟病的預(yù)防有關(guān)(Thompson 1994)。植酸鹽也可參與阻止小泡礦化的軟骨內(nèi)骨化，這是一種被認(rèn)為由酶催化的植酸鹽水解調(diào)節(jié)的過程(Caffrey等人，1999)。尿液中的植酸通過以非常低濃度預(yù)防腎鈣化的發(fā)展而對于一些病理過程比如鈣尿石病具有重要的有益作用。報道了低濃度的植酸鹽降低了鈣腎結(jié)石復(fù)發(fā)的風(fēng)險(Grases等人，2000a)，而高數(shù)量的植酸鹽提高了發(fā)展為尿鈣結(jié)石的風(fēng)險(Grases等人，2000b)。最新研究也提出植酸作為進(jìn)行DNA修復(fù)的酶的活化劑(Hanakahi等人，2000)、作為L-型Ca2+通道的活化劑(TJ等人， 1997)和作為mRNA排出的調(diào)節(jié)劑Work等人，1999)參與調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞功能。自從1973年以來，在核醫(yī)學(xué)中，用锝-99 (99mTc)膠體標(biāo)記的植酸膠體，即，Tc-植酸鹽膠體廣泛地用作正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)中肝和脾的放射性核素顯像劑。肝、脾和骨髓中吸收的Tc-植酸鹽放射性膠體的水平和分布是測定慢性肝病的發(fā)展和預(yù)后和監(jiān)測肝臟功能的一個重要標(biāo)準(zhǔn)。例如，當(dāng)給藥Tc-植酸鹽時，患有慢性肝衰竭的患者顯示出肝臟中Tc-植酸鹽的水平顯著地低于健康人，這可能是由肝巨噬細(xì)胞功能衰竭引起(Hoefs等人，1995a ；Hoefs 等人，1997 ；Hoefs 等人，1995b ；Huet 等人，1980)。除了肝功能試驗之外，Tc-植酸鹽也用作定位患有各種不同類型的癌癥乳腺癌 (Hino 等人，2008 ；Ichihara 等人，2003 ；Ikeda 等人，2004 ；Kinoshita 2007 ；Koizumi 等人， 2006 ；Koizumi 等人，2004a ；Koizumi 等人，2004b ；Masiero 等人，2005 ；Morota 等人，2006 ； Noguchi 2001 ；Ohta 等人，2004 ；Ohtake 等人，2005 ；Takei 等人，2006 ；Takei 等人，2002 ； Tavares 等人，2001 ；Tozaki 等人，2003 ；Tsunoda 等人，2002 ；Wada 等人，2007 ；Yoshida 等人，2002)，惡性黑色素瘤(Tavares等人，2001)，外陰癌(Tavares等人，2001)，頭部和頸部的鱗狀細(xì)胞癌(SCC) (Kosuda等人，2003 ;0hno等人，200 ，子宮內(nèi)膜癌(Nakayama等人，2004 ；Niikura 等人，2004b ；Niikura 和 Yaegashi 2004)，宮頸癌(Nakayama 等人，2004 ； Niikura 等人，2004a ；Silva 等人，2005)，咽癌(Ohno 等人，2005)，前列腺癌(Nakayama 等人，2004 ；Niikura等人，200 ;Silva等人，2005)的患者中前哨淋巴結(jié)(SLN)的放射性藥物。其中特異性吸收和/或蓄積Tc-植酸鹽的淋巴結(jié)可以被鑒定出，這使能夠經(jīng)由活組織檢查來檢查接近腫瘤區(qū)域的那些淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，從而檢查癌癥轉(zhuǎn)移。在SLN鑒定技術(shù)的優(yōu)點中，第一個且最重要的唯一地靶向轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，對于良性淋巴結(jié)具有最小的不必要的解剖，從而減少了淋巴水腫的風(fēng)險，淋巴水腫是一種外科手術(shù)的常見并發(fā)癥。在這點上，Tc-植酸鹽與PET成像的組合已經(jīng)成為一種用于顯影癌癥患者中SLN的選擇方法。然而，為了監(jiān)測患有癌癥的患者需要多次暴露于PET顯然是該方法的一個限制。另外，PET可以得到有關(guān)癌癥轉(zhuǎn)移的信息，但是由于其分辨率低不能指出轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的正確位置。磁共振成像(MRI)是一種快速發(fā)展的顯像方式，其中通過低電磁能照射到樣品中首先檢測出主要來自水質(zhì)子的核磁共振(NMR)信號。迄今，MRI的圖像模式被認(rèn)為是最適合在具有成像期之間短時間隔的多個時間點診斷和監(jiān)測患者，因為它需要激發(fā)水質(zhì)子的能量低，從而MR圖像可以以無創(chuàng)方式獲得，且具有高空間分辨率(比PET高> 10倍)。NMR的信號強度主要通過水質(zhì)子的量來測定。MRI造影劑通常用于增加圖像對比度。典型地，根據(jù)其縮短位于附近的質(zhì)子的Tl或T2弛豫時間，將MRI造影劑分類為順磁性試劑和超順磁性試劑。順磁性的MRI造影劑減少Tl弛豫時間，得到較亮的組織/器官圖像，而超順磁性的MRI造影劑減少Tl弛豫時間引起圖像變暗。超順磁性氧化鐵(SPIO) 是改變T2弛豫時間的MRI造影劑的代表(Lowl997)。已知因為其攝取巨噬細(xì)胞蓄積在器官中(Stoll等人，2004)，從而提高了器官圖像的對比度，但是引起器官的圖像變暗。因為正反差(亮成像)通常較好地限定了感興趣的區(qū)域，需要比負(fù)反差(暗成像)較短的MRI時間，所以發(fā)展Tl試劑無庸置疑是有價值的。釓(Gd)試劑是廣泛地用于臨床實踐的Tl試劑的代表。大多數(shù)目前使用的釓試劑是與配體的螯合物形式，因為釓本身是高毒性的。例如，Gd與二乙三胺五乙酸(DTAP)螯合， 得到陽性MRI造影劑(Gd-DTAP) 0另外，金屬比如Mn2+和Gd3+的螯合物由于其作為MRI Tl 造影劑的潛在應(yīng)用而受到特別地關(guān)注。該工作導(dǎo)致同時分布在血管和血管外間隙中的細(xì)胞外 MRI 造影劑的發(fā)展(Modo 和 BulteAime J. W. M. 2007)。迄今為止，開發(fā)的大多數(shù)的Tl試劑起顯影組織血管的作用，但是對于特定的組織或細(xì)胞沒有特異性。嘗試通過混合造影劑與組織-或細(xì)胞-特異性抗體開發(fā)組織-或細(xì)胞-特異性MRI造影劑。例如，組織特異性MRI造影劑是通過用Gd-DTAP標(biāo)記組織的單克隆抗體制備的(Unger 等，1985. Investigative Radiol 20(7) :693-700)。然而，不僅 Gd 在抗體上的負(fù)載水平非常低(1. 5Gd3+/抗體分子)，而且由體內(nèi)模型觀察到抗體-DTPA-Gd對圖像沒有任何改善。因而，將靶分子比如抗體直接與成像造影劑結(jié)合通常具有必須將造影劑保持在低水平的缺點；另外，抗體的特異性受到不利地影響。以少量遞送的MRI造影劑得到的期望圖像的對比度低。通常，通過使用作為造影劑載體的聚合物延長圖像造影劑的保留時間。例如，將載體比如人白蛋白和聚賴氨酸與DTPA結(jié)合，隨后DTPA用于在其中浸漬MRI造影劑的金屬(例如，聚賴氨酸-結(jié)合的 Gd-DTAP (Gerhard 等人，(1994)，MRM 32 :622-628)) 用 DTPA 和 Gd 標(biāo)記牛血清白蛋白或牛免疫球蛋白(Lauffer等人，(1985)Magnetic Resonance Imaging3(1) :11-16) 0聚-L-賴氨酸主鏈-基多肽與DTPAa反應(yīng)，該復(fù)合物用于螯合111^i以用于 MR成像(Pimm等人，(1992)，Eur J Nucl Med 19:449-452)。在這些研究中，發(fā)現(xiàn)與載體結(jié)合的MRI造影劑增加了血液池中的保留時間。然而，單獨的載體與造影劑的結(jié)合很麻煩，而且需要額外的費用。因此，需要一種組織-或細(xì)胞-特異性、在體內(nèi)保持延長的時間、保持熱力學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性且能夠使Tl圖像清楚(明反差)的MRI造影劑。為進(jìn)行本發(fā)明，本發(fā)明人對有效MRI造影劑進(jìn)行了充分深入的研究，最終發(fā)現(xiàn)了其中具有至少兩個磷酸基的螯合分子以二齒-或多齒-方式與順磁性物質(zhì)結(jié)合的造影劑更穩(wěn)定，且顯示出比目前使用的釓(Gd)復(fù)合物更大的Tl造影效應(yīng)，此外還是細(xì)胞-或組織-特異性的，因此，其可以在臨床上用于各種疾病的診斷和臨床研究。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種MRI造影劑，其包含具有至少兩個與至少一種順磁性金屬陽離子配位的磷酸基的螯合分子。本發(fā)明的另一個目的是提供一種通過將所述MRI造影劑施加給需要其的對象和使所述對象的器官或組織成像來在磁共振圖像上顯影所述對象的器官或組織的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測磁共振圖像上感興趣的器官或組織中巨噬細(xì)胞活性的方法，其包括將所述MRI造影劑施加給需要其的對象，并使所述器官或組織成像， 借此能夠診斷出所述器官或組織的感染或炎癥。本發(fā)明的另一目的是提供一種非侵入性地監(jiān)測磁共振圖像上浸潤到炎癥部位的巨噬細(xì)胞的方法，其包括將所述MRI造影劑施加給需要其的對象，并使該部位成像。本發(fā)明另一個目的是提供一種顯影磁共振圖像上顯影體內(nèi)移植細(xì)胞的存在的方法，其包括將所述MRI造影劑插入細(xì)胞中；并將該細(xì)胞移植到對象的部位；和使用磁共振成像使該部位成像。問題的解決方案本發(fā)明提供一種細(xì)胞-特異性MRI造影劑，其被巨噬細(xì)胞攝取，具有強的弛豫率 (relaxivity)，并且顯影感興趣的目標(biāo)區(qū)域的組織特征。而且，本發(fā)明提供一種MRI造影劑，其可以容易地施加，在體內(nèi)保持相對長的時期(即，具有合理的半衰期的可生物降解)， 并且沒有細(xì)胞毒性。有益效果根據(jù)本發(fā)明的MRI造影劑及使用其的成像方法享有優(yōu)點提供容易可注射的肌醇磷酸鹽復(fù)合物的膠體混懸劑，所述復(fù)合物包含順磁性的或超順磁性的金屬離子，是器官特異性的(例如，肝臟、脾、肺等)，沒有使用可能潛在地引起過敏性反應(yīng)的清潔劑，是熱力學(xué)穩(wěn)定的化合物(例如，比EDTA和DTPA更穩(wěn)定)，其可以使造影劑完整地排泄出(這是一個重要的性質(zhì)，因為這些造影劑的毒性遠(yuǎn)底于單獨金屬離子的毒性)，能夠以相對小的劑量 (例如l-4ymol/kg)注入并仍然獲得良好的MR圖像的能力(因為本發(fā)明的肌醇磷酸鹽金屬離子復(fù)合物集中于靶器官或組織中)。而且，根據(jù)給藥途徑，本發(fā)明的造影劑分布在不同的靶組織或器官，可以用于特異性地診斷器官或組織的疾病。例如，當(dāng)血管內(nèi)(例如靜脈內(nèi)或動脈內(nèi))給藥所述造影劑時，其對特定器官(包括肝臟、脾、淋巴結(jié)、骨髓和肺)發(fā)揮造影效應(yīng)，在這些器官中該試劑被巨噬細(xì)胞攝取。在另一方面，當(dāng)口服給藥所述造影劑時，其可以增強胃腸道的MR圖像的對比度。另外，當(dāng)在包括乳腺癌、前列腺癌和子宮頸癌的不同類型癌癥的區(qū)域中皮下注射所述造影劑時，其可用于定位轉(zhuǎn)移性的前哨淋巴結(jié)，因為它們特異性地蓄積在其中。


圖IA和IB顯示與植酸鹽溶液結(jié)合的Gd3+的等溫滴定量熱法(ITC)分析，其用于分析結(jié)合的親和性、數(shù)量和形式。圖IA為其中Gd3+離子以雙齒配位模式與來自植酸鹽磷酸基的兩個含氧陰離子(oxianion)結(jié)合的Gd-植酸鹽復(fù)合物的圖示。圖IB為與植酸鹽溶液結(jié)合的Gd3+的ITC分析。圖IB的上幅顯示當(dāng)以每次Ιμ 的量間斷性將IOmM Gd3+加入到 0. 5mM植酸鹽溶液(pH 7. 0，37°C )時，獲得的量熱滴定。圖IB的下幅顯示相對于配體總濃度與植酸鹽溶液總濃度的比例而言每摩爾滴定劑交換的熱量。紅色實線為對于兩組位點模型的從數(shù)學(xué)角度計算的最佳擬合。圖2顯示結(jié)合在植酸鹽溶液中的Mn2+的結(jié)合親和力、結(jié)合數(shù)量和結(jié)合形式的ITC 分析。上幅顯示1. 5μ 1的15mM Mn2+加入到0. 5mM植酸鹽溶液(pH 7. 0，37°C )中的量熱滴定。下幅顯示相對于配體總濃度與植酸鹽溶液總濃度的比例而言每摩爾滴定劑交換的熱量。紅色實線為對于兩組連續(xù)結(jié)合位點模型的從數(shù)學(xué)角度計算的最佳擬合。圖3顯示結(jié)合在植酸鹽溶液中的Ca2+的結(jié)合親和力、結(jié)合數(shù)量和結(jié)合形式的ITC 分析。上幅顯示1. 5μ 1的15mM Ca2+加入到0. 5mM植酸鹽溶液(pH 7. 0，37°C )中的量熱滴定。下幅顯示相對于配體總濃度與植酸鹽溶液總濃度的比例而言每摩爾滴定劑交換的熱量。紅色實線為對于兩組位點模型的從數(shù)學(xué)角度計算的最佳擬合。圖4顯示結(jié)合植酸鹽溶液中的Mg2+的結(jié)合親和力、結(jié)合數(shù)量和結(jié)合形式的ITC分析。上幅顯示1. 5 μ 1的30mM Mg2+加入到0. 5mM植酸鹽溶液(pH 7. 0，37°C )中的量熱滴定。下幅顯示相對于配體總濃度與植酸鹽溶液總濃度的比例而言每摩爾滴定劑交換的熱量。紅色實線為對于一組位點模型的從數(shù)學(xué)角度計算的最佳擬合。圖5顯示結(jié)合在肌醇-1，3，4-三磷酸鹽溶液中的Gd3+的結(jié)合親和力、結(jié)合數(shù)量和結(jié)合形式的ITC分析。上幅顯示1.5μ 1的5mM Gd3+加入到0. 2mM肌醇-1，3，4-三磷酸鹽在IOmM HEPES溶液(pH 7.0，25°C)中的量熱滴定。下幅顯示相對于配體總濃度與肌醇_1， 3，4_三磷酸鹽溶液總濃度的比例而言每摩爾滴定劑交換的熱量。紅色實線為對于一組位點模型的從數(shù)學(xué)角度計算的最佳擬合。圖6顯示結(jié)合在肌醇-1，4，5-三磷酸鹽溶液中的Gd3+的結(jié)合親和力、結(jié)合數(shù)量和結(jié)合形式的ITC分析。上幅顯示1.5μ 1的5mM Gd3+加入到0. 2mM肌醇-1，4，5-三磷酸鹽在IOmM HEPES溶液(pH 7.0，25°C)中的量熱滴定。下幅顯示相對于配體總濃度與肌醇_1， 4，5_三磷酸鹽溶液總濃度的比例而言每摩爾滴定劑交換的熱量。紅色實線為對于一組位點模型的從數(shù)學(xué)角度計算的最佳擬合。圖7顯示結(jié)合在肌醇-1，3，4，5-四磷酸鹽溶液中的Gd3+的結(jié)合親和力、結(jié)合數(shù)量和結(jié)合形式的ITC分析。上幅顯示1.5μ1的5mM Gd3+加入到0. 2mM肌醇-1，3，4，5-四磷酸鹽在IOmM HEPES溶液(pH 7.0，25°C )中的量熱滴定。下幅顯示相對于配體總濃度與肌醇-1，3，4，5-四磷酸鹽溶液總濃度的比例而言每摩爾滴定劑交換的熱量。紅色實線為對于兩組位點模型的從數(shù)學(xué)角度計算的最佳擬合。圖8A和8B顯示用于分析結(jié)合親和力、結(jié)合數(shù)量和結(jié)合形式的!^3+結(jié)合植酸鹽溶液的等溫滴定量熱學(xué)(ITC)分析。圖8A為狗3+結(jié)合植酸鹽溶液的ITC分析。圖8A的上幅顯示當(dāng)每次1. 5 μ 1間斷性將5mM Fe3+加入到0. 5mM植酸鹽溶液(pH 7. 0，37°C )時，獲得的溫度滴定。圖8A的下幅顯示相對于配體總濃度與植酸鹽溶液總濃度的比例每摩爾滴定劑交換的熱量。紅色實線為對于兩組位點模型的從數(shù)學(xué)角度計算的最佳擬合。圖8B為其中狗3+離子以雙齒模式結(jié)合來自植酸鹽磷酸基的兩個含氧陰離子的!^e-植酸鹽復(fù)合物的圖
7J\ ο圖9顯示Gd3+結(jié)合EDTA溶液的結(jié)合親和力、結(jié)合數(shù)量和結(jié)合形式的ITC分析。上幅顯示將1. 5 μ 1的5mM GcT加入到0. 4mM EDTA在IOmM MES中的溶液(pH 5. 6，25°C )中的溫度滴定。下幅顯示相對于配體總濃度與EDTA溶液總濃度的比例而言每摩爾滴定劑交換的熱量。紅色實線為對于一組位點模型的從數(shù)學(xué)角度計算的最佳擬合。圖10顯示Gd3+結(jié)合二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)溶液的結(jié)合親和力、結(jié)合數(shù)量和結(jié)合形式的ITC分析。上幅顯示將1. 5 μ 1的5mM GcT加入到0. 2mMDTPA在IOmM乙酸鈉中的溶液(pH 4.8，25°C)中的溫度滴定。下幅顯示相對于配體總濃度與DTPA溶液總濃度的比例而言每摩爾滴定劑交換的熱量。紅色實線為對于兩組位點模型的從數(shù)學(xué)角度計算的最佳擬合。圖11顯示二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)溶液中Gd3+結(jié)合的結(jié)合親和力、結(jié)合數(shù)量和結(jié)合形式的ITC分析。上幅顯示將1. 5 μ 1的5mM GcT加入到0. 2mMDTPA在IOmM Tris 中的溶液(pH 7.8，25°C)中的溫度滴定。下幅顯示相對于配體總濃度與DTPA溶液總濃度的比例而言每摩爾滴定劑交換的熱量。紅色實線為對于兩組位點模型的從數(shù)學(xué)角度計算的最佳擬合。圖12A和12B顯示在9. 4T MRI掃描儀中不同濃度的Mn2+、Gd-DTPA、Mn-植酸鹽和 Gd-植酸鹽復(fù)合物的弛豫率(Rl)的測量。(A)在不同的濃度下，以3000ms的翻轉(zhuǎn)復(fù)原時間 (Tl)，得到的Mn2+、Gd-DTPA、Mn-植酸鹽和Gd-植酸鹽復(fù)合物的M個體模(phantoms)的實例MR圖像。(B)互相比較以秒計的那些體模的弛豫率(Rl)。在該實施例的所有濃度下， Mn-植酸鹽和Gd-植酸鹽的弛豫率(Rl)都高于Mn2+和Gd-DTPA的弛豫率。圖13A和13B顯示在9. 4T下，MR信號隨RAW 264. 7巨噬細(xì)胞細(xì)胞系中Gd-植酸鹽的濃度變化。(A)使用0,0. 125,0. 25,0. 375,0. 5和0. 75mM濃度的Gd-植酸鹽溶液制備包含巨噬細(xì)胞的六個體模的Tl-加權(quán)的MR圖像。信號強度顯然隨Gd-植酸鹽的濃度而升高。(B)示意圖顯示體內(nèi)靶向感興趣區(qū)域的機制。圖14A至14C顯示在9.4T下，在靜脈注射(i. v.)給藥Mn-植酸鹽復(fù)合物之后，大鼠肝臟MR信號的時間依賴性變化。顯示㈧在i.v.給藥Mn-植酸鹽(5mmol/kg)之前、 ⑶其之后40分鐘和(C)其之后1天，正常大鼠肝臟的Tl-加權(quán)的MR圖像。在i. v.給藥 (B)之后40分鐘肝臟實質(zhì)組織的信號強度估計相對于給藥(A)之前肝臟的信號強度增加約 32%。在給藥(C)之后M小時，肝臟的信號強度降低至基線，表明給藥的造影劑在M小時之內(nèi)從大鼠肝臟中消除。圖15顯示在9. 4T下，在i.v.給藥Mn-植酸鹽復(fù)合物之后，大鼠肝臟MR信號的時間依賴性變化。㈧在i. v.給藥Gd-植酸鹽G μ mol/kg)之前、⑶其之后3小時、(C)其之后M小時和(D)其之后5天，正常大鼠肝臟的T2-加權(quán)的MR圖像。在給藥之后!Bhrs(B) 和對小時(C)的肝臟實質(zhì)組織的信號強度估計分別為相對于給藥之前(A)的降低約14% 和沈％。在給藥之后5天，肝臟的降低的信號強度增加至基線的 95%，表明給藥的造影劑在約5天之后從大鼠肝臟中消除。圖16A至16D顯示在1.5和4. 7T下，在i.v.給藥Gd-植酸鹽復(fù)合物之后，大鼠肝臟MR信號的時間依賴性變化。在1.5T(A和B)和4.7T(C和D)下，正常大鼠肝臟的造影前和造影后Tl-加權(quán)的MR圖像。靜脈內(nèi)給藥低劑量的Gd-植酸鹽G μ mol/kg)。Gd-植酸鹽作為陽性造影劑的功效在這些較低的磁場強度下得到良好的證實。圖17顯示原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)解剖的肉眼檢查。植入左前肢的原發(fā)腫瘤的尺寸為約lcm。左腋淋巴結(jié)和臂淋巴結(jié)擴(kuò)大，包含黑斑。但是右腋淋巴結(jié)和臂淋巴結(jié)保持未改變。圖18顯示前哨淋巴結(jié)的Tl-加權(quán)的MR圖像。在造影前(A)、皮下注射Fe-植酸鹽之后4小時⑶、8小時(C)和對小時⑶的臂淋巴結(jié)的圖像。箭頭顯示前哨淋巴結(jié)的低信號(hypointense)區(qū)域。圖19顯示前哨淋巴結(jié)的T2-加權(quán)的MR圖像。在造影前(A)、皮下注射Fe-植酸鹽4小時⑶、8小時(C)和對小時⑶的臂淋巴結(jié)的圖像。箭頭顯示前哨淋巴結(jié)的低信號區(qū)域。箭頭顯示前哨淋巴結(jié)的低信號區(qū)域。圖20顯示從成像的小鼠獲得的左臂淋巴結(jié)的組織病理學(xué)特征。(A)臂淋巴結(jié)的 H&E染色，⑶臂淋巴結(jié)的普魯士藍(lán)染色，(C)A中指示的矩形感興趣區(qū)域的放大圖。(D)原發(fā)腫瘤的放大圖。比例尺(Scale bars) :500ym(A, B) ;100ym(C，D)。
具體實施例方式講行本發(fā)明的最佳方式根據(jù)其一個方面，本發(fā)明涉及磁共振成像造影劑，其包含具有至少兩個與至少一個順磁性物質(zhì)配位的磷酸基的螯合分子。如本文使用的術(shù)語“磁共振成像(MRI) ”指基于血液動力學(xué)的醫(yī)學(xué)顯像模式，其中在低電磁能照射樣品之后檢測來自水質(zhì)子的核磁共振信號。其是基于利用磁共振信號的分子科學(xué)以及血液動力學(xué)，與基于放射性核素的正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)不同。術(shù)語“造影劑”指用于增強體內(nèi)組織比如血管和器官的對比度，從而當(dāng)進(jìn)行磁共振成像時提高其可見度的介質(zhì)。造影劑有助于通過提高感興趣的表面的可見度和對比度而定性和定量地確定疾病和/或損傷。如本文使用的術(shù)語“順磁性物質(zhì)”指當(dāng)對其應(yīng)用外部磁場時形成磁力矩，而在不存在外部應(yīng)用的磁場下不保持磁化的物質(zhì)，這是因為在沒有外部磁場下熱運動引起未成對電子自旋變成隨機方向。通過利用其縮短水分子的磁弛豫時間這一性質(zhì)的優(yōu)點，順磁性物質(zhì)用作MRI造影劑的活性組分。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的順磁性物質(zhì)是過渡元素。更優(yōu)選地，其選自Cr3+、Co2+、Mn2+、 Ni2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+ 和 Cu3+，最優(yōu)選地選自 Fe2+、Fe3+ 和 Mn2+?？蛇x地，順磁性元素是鑭系元素。更優(yōu)選地，所述鑭系元素選自La3+、Gd3+、Ce3+、 Tb3+、ft·3+、Dy3+、Nd3+、Ho3+、Pm3+、Er3+、Sm3+、Tm3+、Eu3+、Yb3+ 和 Lu3+，最優(yōu)選地是 Gd3+。
代替順磁性物質(zhì)，還可以使用同位素，無論是否是放射性或順磁性的。用于本發(fā)明放射性同位素的的實例包括，但不限于"(:、13Ν、18Ρ、123Ι、124Ι、125Ι、99ηιΤ(3、95Τ(3 Jii^K76BIN62Ciu 64Ciu67Ga 禾口 68Ga。根據(jù)本發(fā)明，造影劑引起受試者體內(nèi)接近感興趣區(qū)的Tl或Τ2弛豫時間減少。如本文使用的術(shù)語“螯合分子”或“螯合劑”指能夠經(jīng)由至少一個供電子原子與金屬離子結(jié)合的化合物或化學(xué)殘基。順磁性螯合物復(fù)合物減少Tl磁弛豫時間和穩(wěn)定順磁性物質(zhì)的能力完全依賴于與順磁性物質(zhì)配位的螯合分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在這方面，用于本發(fā)明的螯合分子具有至少兩個磷酸基，如優(yōu)選的示例為植酸鹽、 肌醇磷酸鹽和磷脂酰肌醇磷酸鹽。所述螯合分子的更優(yōu)選的實例包括d-肌醇-1，2，3，4，5， 6-六磷酸鹽、d-肌醇-1，2，3，4，5-五磷酸鹽、d-肌醇-1，3，4，5-四磷酸鹽、d_肌醇-1，4， 5-三磷酸鹽、d-肌醇-1，3，4-三磷酸鹽、磷脂酰肌醇_3，4，5-三磷酸鹽和磷脂酰肌醇_4， 5-二磷酸鹽。為了在生理條件合適地使用，所述螯合分子具有的pH為4至9，最合適地為6至 8。在本發(fā)明的一個實施方案中，MRI造影劑的金屬與螯合分子的摩爾比為0. 5至3， 或螯合分子與金屬的摩爾比為0. 5至3。當(dāng)本發(fā)明的造影劑用于診斷病癥時，不期望螯合分子結(jié)合血管中存在的內(nèi)源性鈣。因此，當(dāng)在受試者中使用造影劑進(jìn)行診斷時，為了最小化造影劑的螯合分子對血液Ca2+ 的螯合，當(dāng)制備其時可以將Ca2+離子包括在造影劑中。只要在診斷MRI或PET成像期間充分地防止造影劑有害地螯合受試者體內(nèi)的內(nèi)源性鈣，可以將任何數(shù)量的鈣與所述造影劑混合。優(yōu)選的Ca2+的量是與造影劑等摩爾濃度。本發(fā)明的造影劑可以使用本領(lǐng)域熟知的方法由順磁性物質(zhì)和螯合分子制備。例如，將具有至少兩個磷酸基的螯合分子溶于無菌水中，調(diào)節(jié)至期望的PH值，并與順磁性離子膠體混合。在另一種方法中，在低溫下，將順磁性植酸鹽復(fù)合物溶液與鈣離子一起干燥，并貯存在容器中。在一起使用之前，可以將順磁性植酸鹽復(fù)合物溶液和鈣離子溶液分別在低溫下干燥，并貯存在單個容器中、或相應(yīng)的獨立容器中?？蛇x地，首先將植酸鹽溶液放置在容器中，接著向其中加入順磁性離子。順磁性植酸鹽復(fù)合物可以是粉末形式和溶液形式。在本發(fā)明的造影劑中，可以任選地將順磁性植酸鹽螯合物與對于一些腫瘤特異性的單克隆抗體軛合。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及一種在磁共振圖像上顯影需要其的受試者的器官或組織的方法，其包括向受試者給藥MRI造影劑和使所述器官或組織成像。如本文使用的術(shù)語“給藥”或“施加給”指經(jīng)由合適的途徑將期望的物質(zhì)引入受試者中的行為。有效量和給藥途經(jīng)取決于各種因素，包括患者的年齡、體重和待治療的位置， 以及使用的造影劑的種類、待考慮的診斷用途和造影劑的制劑形式(例如，混懸劑、乳劑、 微球、脂質(zhì)體等)，其對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言已經(jīng)顯而易見的。典型地，給藥造影劑的量最初很低，逐漸升高至于獲得期望的診斷結(jié)果。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得成像。通常，將造影劑的水溶液以約10至1000微摩爾的造影劑/kg重量的劑量(在該范圍內(nèi)，所有的劑量組合、亞組合和具體劑量都是可能的)靜脈內(nèi)給藥至受試者。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，可以將由Tc-植酸鹽和順磁性陽離子組成的造影劑施用于正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)成像和磁共振成像(MRI)。在顯影的方法中，當(dāng)受試者疑為受到脂肪肝、肝硬化或動脈粥樣硬化影響時，優(yōu)選地靜脈內(nèi)給藥MRI造影劑。為了經(jīng)由前哨淋巴結(jié)圖像測定腫瘤轉(zhuǎn)移，可以皮下給藥MRI造影劑。而且，當(dāng)所述器官或組織疑為腫瘤時，可以給藥MRI造影劑。優(yōu)選地，所述腫瘤可以是乳腺癌、惡性黑色素瘤、外陰癌、頭和頸的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、咽癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌或前列腺癌。而且，MRI造影劑例如Fe-植酸鹽復(fù)合物可以與用于治療各種腫瘤的抗癌藥如多柔比星(商品名阿霉素；也稱為羥基柔紅霉素)一起，其中多柔比星狗-植酸鹽復(fù)合物可以皮下地給藥如下原發(fā)腫瘤乳腺癌、惡性黑色素瘤、外陰癌、頭和頸的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、咽癌、肝癌、胃癌、大腸癌或前列腺癌。與常規(guī)造影劑相比，本發(fā)明的MRI造影劑具有優(yōu)點熱力學(xué)和生物學(xué)都穩(wěn)定的、組織-或細(xì)胞-特異性的、提供清楚的Tl對比效應(yīng)(明反差)與高弛豫度，在體內(nèi)顯示出長的保留時間。第一，由于螯合分子對順磁性物質(zhì)的強結(jié)合親和力，本發(fā)明的造影劑比常規(guī)造影劑更穩(wěn)定。在如下實施例中，進(jìn)行ITC熱力學(xué)測定以測量植酸鹽或肌醇磷酸鹽對順磁性離子的結(jié)合親和力，表明植酸鹽或肌醇磷酸鹽以雙齒配位模式與Gd離子以及錳離子牢固地結(jié)合，以及肌醇磷酸鹽衍生物與Gd離子牢固地結(jié)合。因此，植酸鹽與順磁性物質(zhì)的復(fù)合物很穩(wěn)定，適用作造影劑(參見表1至4)。Gd3+對植酸鹽的結(jié)合親和力比Gd3+對DTPA的結(jié)合親和力高約10倍，比Gd3+對EDTA 的結(jié)合親和力高10至100倍，表明根據(jù)本發(fā)明的Gd-植酸鹽復(fù)合物比常用造影劑Gd-EDTA 和Gd-DTPA更穩(wěn)定和更動力學(xué)惰性(參見下表5)。第二，本發(fā)明的造影劑有效地增強了 MRI中局部位點的圖像對比度。在下述實施例中，Mn-植酸鹽和Gd-植酸鹽的弛豫率(R1 = 1/T1)是在不同濃度下估計的，并且與廣泛地用在MR研究中的Mn2+和Gd-DTPA的弛豫率相比較。據(jù)發(fā)現(xiàn)在幾乎所有測試的濃度下， Mn-植酸鹽和Gd-植酸鹽分別比Mn2+和Gd-DTPA更有效地擾亂局部磁場(參見圖11)。因而，具有高Tl弛豫度的順磁性造影劑甚至在相對低劑量下顯示出與常用造影劑相同的對比效應(yīng)，這引起通常用作順磁性物質(zhì)的重金屬Gd所述總量顯著減少，從而縮減了損害身體的潛在危險。為了保證甚至在少量下的對比度增強，根據(jù)本發(fā)明的造影劑在MRI研究中具有極大的重要性。第三，本發(fā)明的造影劑停留在體內(nèi)較長的時間，并且更快地從體內(nèi)清除。在下述實施例中，觀察到肝臟信號強度的變化，其在給藥Mn-植酸鹽之后約40分鐘達(dá)到最大值(至增強 32% )。然后，本發(fā)明的試劑似乎在約M小時之內(nèi)快速從肝臟清除，其比迄今報道的其它細(xì)胞內(nèi)試劑顯著地更短(例如，SPI0)。因此，本發(fā)明的造影劑比需要單獨的載體以增加保留時間的常用造影劑更有效。最后，本發(fā)明的造影劑允許組織-或細(xì)胞-特異性成像。當(dāng)診斷特定疾病時，巨噬細(xì)胞吞噬本發(fā)明的Gd-植酸鹽復(fù)合物(在下述實施例中證實的)可以用于顯影感興趣的組織或器官。
發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞大量存在于淋巴結(jié)和脾中。巨噬細(xì)胞比如肝臟的肝巨噬細(xì)胞和肌肉組織的組織細(xì)胞負(fù)責(zé)造影劑的攝取。對于本發(fā)明的造影劑，其被來自血管的肝巨噬細(xì)胞攝取，擾亂局部磁場，從而產(chǎn)生圖像對比度。本發(fā)明的造影劑經(jīng)由巨噬細(xì)胞的吞噬作用引入特定組織中，因此，其可以用于診斷各種疾病比如動脈粥樣硬化斑塊、器官移植排斥、多發(fā)性硬化和用于各種類型癌癥的前哨淋巴結(jié)檢測。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及一種檢測磁共振圖像上感興趣的器官或組織中巨噬細(xì)胞活動性的方法，其通過給藥需要其的受試者M(jìn)RI造影劑，和使所述器官或組織成像，借此可以診斷器官或組織的感染或炎癥來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及一種非侵入性監(jiān)測磁共振圖像上巨噬細(xì)胞浸潤到炎癥位點的方法，其通過給藥需要其的受試者M(jìn)RI造影劑和使所述位點成像來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及提供一種顯影磁共振圖像上體內(nèi)移植細(xì)胞的存在的方法，其通過將MRI造影劑插入細(xì)胞中，將該細(xì)胞移植到受試者中的位點，并使用磁共振成像使該位點成像來實現(xiàn)。發(fā)明的實施方式根據(jù)下述實施例可獲得對本發(fā)明的更好的理解，列出下述實施例是用于闡述，而不應(yīng)被看作限制本發(fā)明。實施例1 順磁性離子與植酸鹽或肌醇磷酸鹽的結(jié)合熱力學(xué)在Microcal 200 等溫滴定微熱量計(Microcal，Inc.，Northhampton, MA. USA)中進(jìn)行ITC試驗，以定量順磁性金屬離子比如Gd3+、Mn2+和Ca2+與植酸鹽溶液或肌醇磷酸鹽衍生物的結(jié)合等溫線。借助于Microcal提供的軟件包Origin 7. 0版進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、分析和繪圖。對于順磁性物質(zhì)注射到其中的每個時間點，在微熱量計中的滴定是基于樣品池和參比池之間的差熱。參比池充滿蒸餾水。在一種典型的滴定法中，按照aiiin的定期間隔將 1-5 μ 1等分試樣的5 IOmM順磁性金屬離子溶液注射到不同ρΗ的植酸鹽溶液中，同時測量結(jié)合能的差值。以IOOOrpm攪拌注射管至植酸鹽樣品和順磁性物質(zhì)之間形成穩(wěn)定的結(jié)合。通過熱量計測量在每次注射時吸收或釋放的熱量。將這些滴定等溫線整合，提供每次注射時的焓變。分析等溫線以從數(shù)學(xué)角度擬合兩個不同組的位點模型。經(jīng)由熱量分析，計算參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)(Ka)、焓變(ΔΗ)和結(jié)合的化學(xué)計量(N)。然后，使用如下方程確定自由能變化(Δ G)和熵變(Δ S) : Δ G = -RTln Ka = Δ Η_Τ Δ S，其中R為一般氣體常數(shù)，T為以開氏溫度計的溫度。實施例1. 1 具有釓(Gd3+)的植酸鹽的ITC分析在37°C下，測量作為ρΗ范圍3.0至8.0的函數(shù)的植酸鹽(0. 5mM)與Gd3+溶液 (IOmM)的量熱滴定。結(jié)合等溫線，其相當(dāng)于作為Gd3+/植酸鹽的摩爾比的函數(shù)的熱量積分圖，描述在圖IB中。在該圖中，實線相當(dāng)于從數(shù)學(xué)角度確定的加入兩個不同組中的植酸鹽和釓離子之間數(shù)據(jù)的最佳擬合曲線，表明配體(Gd3+)結(jié)合三個不同的獨立位點。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，獲得解離常數(shù)(Kd)、結(jié)合每個植酸鹽分子的Gd3+數(shù)量(η)和相關(guān)的焓變(ΔΗ)。將相當(dāng)于Gd3+結(jié)合植酸鹽溶液的熱力學(xué)參數(shù)列在表1中。如從表1的數(shù)據(jù)顯而易見的，Gd3+離子以雙齒配位模式強結(jié)合來自植酸鹽磷酸基的兩個含氧陰離子(圖1Α)，形成具有高親和力10_9-10_7Μ的Gd-植酸鹽復(fù)合物。
表 1[表 1][表格]
權(quán)利要求
1.一種磁共振成像(MRI)造影劑，所述造影劑包含具有至少兩個與至少一種順磁性金屬陽離子配位的磷酸基的螯合分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的MRI造影劑，其中所述螯合分子選自植酸鹽、肌醇磷酸鹽和磷脂酰肌醇磷酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的MRI造影劑，其中所述植酸鹽為d-肌醇-1，2，3，4，5，6-六磷酸Τττ . ο
4.根據(jù)權(quán)利要求2的MRI造影劑，其中所述肌醇磷酸鹽選自d-肌醇-1，2，3，4，5-五磷酸鹽、d-肌醇-1，3，4，5-四磷酸鹽、d-肌醇-1，4，5-三磷酸鹽和d_肌醇-1，。3，4-三磷酸Τττ . ο
5.根據(jù)權(quán)利要求2的MRI造影劑，其中所述磷脂酰肌醇磷酸鹽選自磷脂酰肌醇_3，4， 5-三磷酸鹽和磷脂酰肌醇_4，5- 二磷酸鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的MRI造影劑，其中所述順磁性金屬陽離子為過渡元素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的MRI造影劑，其中所述過渡元素選自Cr3+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Fe2+、 Fe3+、Cu2+ 和 Cu3+。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的MRI造影劑，其中所述過渡元素選自狗2+、Fe3+和Mn2+。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的MRI造影劑，其中所述順磁性金屬陽離子為鑭系元素。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的MRI造影劑，其中所述鑭系元素選自La3+、Gd3+、Ce3+，Tb3+、ft·3+、 Dy3+、Nd3+、Ho3+、Pm3+、Er3+、Sm3+、Tm3+、Eu3+、Yb3+ 和 Lu3+。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的MRI造影劑，其中所述鑭系元素為Gd3+。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的MRI造影劑，所述造影劑被設(shè)計用于減小接近受試者體內(nèi)感興趣區(qū)域的Tl或T2弛豫時間。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的MRI造影劑，其中所述順磁性金屬陽離子以順磁性金屬陽離子的放射性形式使用，或者所述順磁性金屬陽離子與99锝離子一起作為PET-MRI造影劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的MRI造影劑，其中所述螯合分子的pH范圍為4至9。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的MRI造影劑，其中所述螯合分子的pH范圍為6至8。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的MRI造影劑，其中所述順磁性金屬離子與所述螯合分子的摩爾比為0. 5至3。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的MRI造影劑，其中所述螯合分子與所述順磁性金屬離子的摩爾比為0. 5至3。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的MRI造影劑，所述造影劑還包含與MRI造影劑等摩爾比例的對應(yīng)量的鈣。
19.一種在磁共振圖像上對需要顯影的受試者的器官或組織進(jìn)行顯影的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1所述的MRI造影劑對受試者進(jìn)行給藥和使所述器官或組織成像。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中當(dāng)目標(biāo)是脂肪肝、肝硬化或動脈粥樣硬化斑塊時，靜脈內(nèi)給藥所述MRI造影劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中當(dāng)目標(biāo)是各種腫瘤的轉(zhuǎn)移性前哨淋巴結(jié)時，皮下地給藥所述MRI造影劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中當(dāng)目標(biāo)是腫瘤時，皮下地給藥所述MRI造影劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述腫瘤選自乳腺癌、惡性黑色素瘤、外陰癌、頭和頸的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、咽癌瘤、肝癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌或前列腺癌。
24.根據(jù)權(quán)利要求M的方法，其中所述MRI造影劑為Fe-植酸鹽復(fù)合物，所述!^e-植酸鹽復(fù)合物附著有抗癌藥物。
25.根據(jù)權(quán)利要求M的方法，其中所述抗癌藥物是多柔比星。
26.一種檢測磁共振圖像上感興趣的器官或組織中巨噬細(xì)胞活性的方法，所述方法包括向需要檢測的受試者給藥根據(jù)權(quán)利要求1的MRI造影劑，并使器官或組織成像，借此能夠診斷出所述器官或組織的感染或炎癥。
27.一種非侵入性監(jiān)測磁共振圖像上浸潤到炎癥部位的巨噬細(xì)胞的方法，所述方法包括向需要檢測的受試者給藥根據(jù)權(quán)利要求1的MRI造影劑，并使所述部位成像。
28.—種在磁共振圖像上對體內(nèi)移植細(xì)胞的存在進(jìn)行顯影的方法，所述方法包括 將根據(jù)權(quán)利要求1的MRI造影劑插入到細(xì)胞中；將該細(xì)胞移植到受試者的部位；和使用磁共振成像使該部位成像。
29.一種共配準(zhǔn)用于PET-MRI掃描儀圖像的造影劑的方法，其包括 將根據(jù)權(quán)利要求13的PET-MRI造影劑插入到細(xì)胞中；將該細(xì)胞移植到受試者的部位；和使用PET-MRI掃描儀使所述部位成像。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的MRI造影劑和使用其的成像方法。該新的MRI造影劑包含具有至少兩個與至少一種順磁性物質(zhì)配位的磷酸基的螯合分子。
文檔編號A61K49/10GK102548585SQ201080016723
公開日2012年7月4日 申請日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月16日
發(fā)明者吳炳哲, 金玄振 申請人:嘉泉醫(yī)科學(xué)大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)