專利名稱：抗原特異性細(xì)胞毒性t細(xì)胞的制備試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在抗原特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphoc yte 以下也稱為“CTL”)的制備中利用的試劑盒及其使用。本申請基于2008年10月31日申請的日本國專利申請第2008-280786號和2009年7月15日申請的日本國專利申請第2009-166630 號主張優(yōu)先權(quán)，這些專利申請的全部內(nèi)容通過參照來援引。
背景技術(shù)：
抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞療法(CTL療法)作為下一代的免疫療法而被期待。 CTL療法中，在生物體外制備抗原特異性CTL。以往，抗原特異性CTL的制備伴隨著復(fù)雜且繁雜的操作，不得不依靠開放體系培養(yǎng)系統(tǒng)。因此，必須在醫(yī)療用等級的培養(yǎng)細(xì)胞加工中心(CPC)內(nèi)配備、管理用于保持等級100 (class 100)級別的清潔環(huán)境的設(shè)施，需要巨大的費用。另外，以往的方法中，使用各種細(xì)胞因子，制備時所需要的費用也相當(dāng)可觀。進(jìn)而，雖說在保持等級100級別的設(shè)施中制備，但是利用開放體系的培養(yǎng)伴隨安全方面的風(fēng)險。這樣，以往的抗原特異性CTL制備方法中操作性、經(jīng)濟(jì)性和安全性成為實用化的很大障礙，只能在有限的設(shè)施中實施。應(yīng)予說明，本申請人中的一人在在先專利申請(專利文獻(xiàn)1)中，提出了兼?zhèn)浜啽阈院桶踩?，而且能夠以低成本實施的病毒特異性CTL培養(yǎng)系統(tǒng)。該培養(yǎng)系統(tǒng)的主要特征是在抗原特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的誘導(dǎo)、增殖中不利用樹突狀細(xì)胞，在誘導(dǎo)的CTL的分離中使用⑶137抗原。專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 國際公開第2008/023786號小冊子

發(fā)明內(nèi)容
專利文獻(xiàn)1中提出的上述培養(yǎng)系統(tǒng)與以往的系統(tǒng)相比帶來了飛躍性的進(jìn)步。但是，對于各工序中的細(xì)胞的操作，沒有采用特有的手段、方法，在操作性方面還有改善的余地。另外，雖然指出了不在開放體系、而在封閉體系中培養(yǎng)的重要性，但是沒有提供具體的對策。因此，本發(fā)明的課題是謀求抗原特異性CTL的制備中的操作性、經(jīng)濟(jì)性和安全性的進(jìn)一步的改善，促進(jìn)CTL療法的實用化。本申請人以在先專利申請(專利文獻(xiàn)1)中報告的培養(yǎng)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，為了解決上述課題而反復(fù)進(jìn)行了研究。其結(jié)果，通過重新研究各工序，并對培養(yǎng)基、培養(yǎng)容器等的形態(tài)、操作方法等獨自地進(jìn)行鉆研，從而發(fā)現(xiàn)了對抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的制備極其有用的試劑盒的構(gòu)成。這樣，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行深入研究，最終完成了本發(fā)明，本發(fā)明如下。[1] 一種制備試劑盒，其特征在于，是用于抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞制備方法的制備試劑，上述抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞制備方法包括誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第1工序；制備抗原呈遞用活化T細(xì)胞的第2工序；和使用通過上述第1工序誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞和通過第2工序制備的抗原呈遞用活化T細(xì)胞，使抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖的第3工序；作為用于上述第1工序的構(gòu)成要素，具備(1-1)容納在注入容器中的含抗原肽培養(yǎng)基，(1-2)至少2個容納在注入容器中的含IL-2培養(yǎng)基，和(1-3)密封型培養(yǎng)容器，具備用于注入另外制備的外周血單核細(xì)胞的第1 口，用于注入上述含抗原肽培養(yǎng)基的第2 口，與上述含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入上述含IL-2培養(yǎng)基的第3 口，和用于移出誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第4 Π ；作為用于上述第2工序的構(gòu)成要素，具備(2-1)容納在注入容器中的含抗⑶3抗體培養(yǎng)基，(2-2)至少2個容納在注入容器中的含IL-2培養(yǎng)基，(2-3)容納在注入容器中的含抗原肽培養(yǎng)基，和(2-4)密封型培養(yǎng)容器，具備用于注入另外制備的外周血單核細(xì)胞的第1 口，用于注入上述含抗CD3抗體培養(yǎng)基的第2 口，與上述含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入上述含IL-2培養(yǎng)基的第3 口，用于注入上述含抗原肽培養(yǎng)基的第4 口，和用于移出所制備的抗原呈遞用活化T細(xì)胞的第5 口 ；作為用于上述第3工序的構(gòu)成要素，具備(3-1)容納在注入容器中的用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基，(3-2)容納在注入容器中的用于分離抗原呈遞用活化T細(xì)胞的培養(yǎng)基，(3-3)第1密封型分離容器，具備用于移入誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基的第 3 口，和用于移出分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第4 口，(3-4)第2密封型分離容器，具備用于移入制備的抗原呈遞用活化T細(xì)胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分離抗原呈遞用活化T細(xì)胞的培養(yǎng)基的第3 口，和用于移出分離后的抗原呈遞用活化T細(xì)胞的第4 口，(3-5)至少2個容納在注入容器中的增殖用培養(yǎng)基，上述增殖用培養(yǎng)基含有IL-2 或IL-15或這兩者，和(3-6)密封型培養(yǎng)容器，具備用于移入分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第 1 口，用于移入分離后的抗原呈遞細(xì)胞的第2 口，用于注入另外制備的血清或血漿的第3 口， 與上述增殖用培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入上述增殖用培養(yǎng)基的第4 口，和用于移出增殖的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第5 口。[2]根據(jù)[1]所述的制備試劑盒，其中，上述(1-2)的含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量為3 5。[3]根據(jù)[1]或[2]所述的制備試劑盒，其中，上述0-2)的含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量為3 6。[4]根據(jù)[1] [3]中任一項所述的制備試劑盒，其中，上述(3-1)的用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基和上述(3-2)的用于分離抗原呈遞用活化T細(xì)胞的培養(yǎng)基是含IL-2培養(yǎng)基。
[5]根據(jù)[1] [4]中任一項所述的制備試劑盒，其中，對于上述(1-3)的密封型培養(yǎng)容器的第1 口 第3 口、上述0-4)的密封型培養(yǎng)容器的第1 口 第4 口、以及上述 (3-6)的密封型培養(yǎng)容器的第3 口和第4 口而言分別具備2種帽，該2種帽包括未使用時安裝的帽和使用后安裝的帽，上述使用后安裝的帽可與未使用時安裝的帽辨別開。[6]根據(jù)[1] [5]中任一項所述的制備試劑盒，其中，上述(1-3)的密封型培養(yǎng)容器的第3 口、上述(2-4)的密封型培養(yǎng)容器的第3 口、和上述(3-6)的密封型培養(yǎng)容器的第4 口分別為分支型口。[7]根據(jù)[1] W]中任一項所述的制備試劑盒，其中，上述(1-3)的密封型培養(yǎng)容器、上述0-4)的密封型培養(yǎng)容器和上述(3-6)的密封型培養(yǎng)容器分別具備預(yù)備用口。[8]根據(jù)[1] [7]中任一項所述的制備試劑盒，其中，還具備容納在容器中的用于制備外周血單核細(xì)胞的培養(yǎng)基。[9]根據(jù)[8]所述的制備試劑盒，其中，還具備用于制備外周血單核細(xì)胞的容器。[10]根據(jù)[1] [9]中任一項所述的制備試劑盒，其中，還具備用于分離利用第3 工序而增殖的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的分離容器。[11]根據(jù)[10]所述的制備試劑盒，其中，還具備用于凍結(jié)保存使用上述分離容器分離的細(xì)胞的保存容器。[12] 一種制備試劑盒，其特征在于，是用于抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞制備方法的制備試劑，上述抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞制備方法包括誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第1工序；制備抗原呈遞細(xì)胞的第2工序；和使用通過上述第1工序誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞和通過第2工序制備的抗原呈遞細(xì)胞，使抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖的第3工序；作為用于上述第1工序的構(gòu)成要素，具備(1-1)容納在注入容器中的含抗原肽培養(yǎng)基，(1-2)至少2個容納在注入容器中的含IL-2培養(yǎng)基，和(1-3)密封型培養(yǎng)容器，具備用于注入另外制備的外周血單核細(xì)胞的第1 口，用于注入上述含抗原肽培養(yǎng)基的第2 口，與上述含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入上述含IL-2培養(yǎng)基的第3 口，和用于移出誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第4 Π ；作為用于上述第2工序的構(gòu)成要素，具備容納在容器中的凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞；作為用于上述第3工序的構(gòu)成要素，具備(3-1)容納在注入容器中的用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基，(3-2)第1密封型分離容器，具備用于移入誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基的第 3 口，和用于移出分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第4 口 ；(3-3)至少2個容納在注入容器中的增殖用培養(yǎng)基，上述增殖用培養(yǎng)基含有IL-2 或IL-15或這兩者，和(3-4)密封型培養(yǎng)容器，具備用于移入分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第 1 口，用于移入制備的抗原呈遞細(xì)胞的第2 口，用于注入另外制備的血清或血漿的第3 口，與
7上述增殖用培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入上述增殖用培養(yǎng)基的第4 口，和用于移出增殖的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第5 口。[13] 一種抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，使用[1] [12] 中任一項所述的制備試劑盒。利用本發(fā)明的制備試劑盒，能以簡便的操作制備抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。另外，制備所需要的時間也變得非常短。另一方面，本發(fā)明的制備試劑盒使在封閉體系內(nèi)進(jìn)行所有的培養(yǎng)工序成為可能。由此還能夠帶來安全性的提高。通過確保高安全性，設(shè)備所需要的級別降低，能夠以低成本制備抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。


圖1是抗原特異性CTL制備試劑盒的一個例子。 于抗原特異性CTL的誘導(dǎo)工序的構(gòu)成要素。圖2是抗原特異性CTL制備試劑盒的一個例子。 于抗原呈遞細(xì)胞的制備工序的構(gòu)成要素。圖3是抗原特異性CTL制備試劑盒的一個例子。 于抗原特異性CTL的增殖工序的構(gòu)成要素。圖4是抗原特異性CTL制備試劑盒的一個例子。 于抗原特異性CTL的增殖工序的構(gòu)成要素。圖5是表示細(xì)胞的移入用管、移出用管和分注用管的圖。圖6是表示抗原特異性CTL誘導(dǎo)工序的流程圖。圖7是表示抗原呈遞細(xì)胞制備工序的流程圖。圖8是表示抗原特異性CTL增殖工序的流程圖。圖9是表示抗原特異性CTL增殖工序以后的各工序的流程圖。圖10是流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。在圖6 (抗原特異性CTL誘導(dǎo)工序的流程)所示的第0天、第7天和第14天，以及圖8 (抗原特異性CTL增殖工序的流程)所示的第21天進(jìn)行取樣，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析(上段)。下段是表示總細(xì)胞數(shù)和四聚體陽性細(xì)胞數(shù)的經(jīng)時變化的曲線圖。圖11是流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。在圖6 (抗原特異性CTL誘導(dǎo)工序的流程)所示的第0天、第7天和第14天、圖8 (抗原特異性CTL增殖工序的流程)所示的第21天、以及進(jìn)一步增殖4天的時刻(第25天)進(jìn)行取樣，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析(上段)。下段左是表示總細(xì)胞數(shù)和四聚體陽性細(xì)胞數(shù)的經(jīng)時變化的曲線圖。下段右是表示細(xì)胞毒性試驗的結(jié)果的曲線圖。細(xì)胞毒性試驗中，將由供體制備的EBV(愛潑斯坦巴爾病毒)感染LCL(淋巴母細(xì)胞)作為靶細(xì)胞，將其與效應(yīng)細(xì)胞(四聚體陽性細(xì)胞)以規(guī)定的比率(效應(yīng)細(xì)胞/ 靶細(xì)胞=10)混合后，以各濃度添加抗原肽進(jìn)行孵育。由伴隨細(xì)胞的溶解而檢測到的51Cr 的量來評價細(xì)胞毒性。作為抗原肽，使用了 QYD(HLA-AM402限制性CMV pp65表位肽)和 TYG(HLA-A*2402限制性^V LMP2a表位肽)(對照組)。圖12是流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。在圖6 (抗原特異性CTL誘導(dǎo)工序的流程)所示的第0天、第7天和第14天、圖8 (抗原特異性CTL增殖工序的流程)所示的第21天、以及進(jìn)一步增殖3天的時刻(第24天)進(jìn)行取樣，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析(上段)。下段是表
試劑盒的構(gòu)成要素中，表示了用試劑盒的構(gòu)成要素中，表示了用試劑盒的構(gòu)成要素中，表示了用試劑盒的構(gòu)成要素中，表示了用示總細(xì)胞數(shù)和四聚體陽性細(xì)胞數(shù)的經(jīng)時變化的曲線圖。圖13是流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。在圖6 (抗原特異性CTL誘導(dǎo)工序的流程)所示的第0天、第7天和第14天、圖8 (抗原特異性CTL增殖工序的流程)所示的第21天、以及進(jìn)一步增殖7天的時刻(第28天)進(jìn)行取樣，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析(上段)。下段左是表示總細(xì)胞數(shù)和四聚體陽性細(xì)胞數(shù)的經(jīng)時變化的曲線圖。下段右是表示細(xì)胞毒性試驗的結(jié)果的曲線圖。細(xì)胞毒性試驗中，將由供體制備的EBV(愛潑斯坦巴爾病毒)感染LCL(淋巴母細(xì)胞)作為靶細(xì)胞，將其與效應(yīng)細(xì)胞(四聚體陽性細(xì)胞)以規(guī)定的比率(效應(yīng)細(xì)胞/ 靶細(xì)胞=10)混合后，以各濃度添加抗原肽進(jìn)行孵育。由伴隨細(xì)胞的溶解而檢測到的51Cr 的量來評價細(xì)胞毒性。作為抗原肽，使用了 QYD(HLA-A*2402限制性CMV pp65表位肽)和 TYG(HLA-A*2402限制性^V LMP2a表位肽)(對照組)。圖14是流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。在圖6 (抗原特異性CTL誘導(dǎo)工序的流程)所示的第0天、第7天和第14天、圖8 (抗原特異性CTL增殖工序的流程)所示的第21天、以及進(jìn)一步增殖4天的時刻(第25天)進(jìn)行取樣，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析(上段)。下段左是表示總細(xì)胞數(shù)和四聚體陽性細(xì)胞數(shù)的經(jīng)時變化的曲線圖。下段右是表示細(xì)胞毒性試驗的結(jié)果的曲線圖。細(xì)胞毒性試驗中，將由供體制備的EBV(愛潑斯坦巴爾病毒)感染LCL(淋巴母細(xì)胞)作為靶細(xì)胞，將其與效應(yīng)細(xì)胞(四聚體陽性細(xì)胞)以規(guī)定的比率(效應(yīng)細(xì)胞/ 靶細(xì)胞=10)混合后，以各濃度添加抗原肽進(jìn)行孵育。由伴隨細(xì)胞的溶解而檢測到的51Cr 的量來評價細(xì)胞毒性。作為抗原肽，使用了 NLV(HLA-A*0201限制性CMV pp65表位肽)和 CLG(HLA-A*0201限制性^V LMP2a表位肽)(對照組)。圖15是利用了凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原特異性CTL制備試劑盒的一個例子。試劑盒的構(gòu)成要素中，表示了用于抗原特異性CTL的誘導(dǎo)工序的構(gòu)成要素。圖16是利用了凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原特異性CTL制備試劑盒的一個例子。試劑盒的構(gòu)成要素中，表示了用于抗原呈遞細(xì)胞的制備工序的構(gòu)成要素。圖17是利用了凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原特異性CTL制備試劑盒的一個例子。試劑盒的構(gòu)成要素中，表示了用于抗原特異性CTL的增殖工序的構(gòu)成要素。圖18是利用了凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原特異性CTL制備試劑盒的一個例子。試劑盒的構(gòu)成要素中，表示了用于抗原特異性CTL的增殖工序的構(gòu)成要素。圖19是凍結(jié)干燥抗原呈遞細(xì)胞時的條件的例子。
具體實施例方式本發(fā)明的第1方面涉及用于抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(抗原特異性CTL)的制備的制備試劑盒?！翱乖禺愋訡TL”是指對特定的抗原特異性高的CTL?？乖禺愋訡TL 是特異性地識別不表達(dá)對應(yīng)的抗原而進(jìn)行呈遞的細(xì)胞，并發(fā)揮細(xì)胞毒性?？乖禺愋訡TL 通過生物體具有的防御機(jī)構(gòu)在生物體內(nèi)也能被誘導(dǎo)，但本發(fā)明中“抗原特異性CTL”是在生物體外被誘導(dǎo)。本發(fā)明的制備試劑盒具備用于實施抗原特異性CTL的誘導(dǎo)(第1工序)、抗原呈遞用活化T細(xì)胞的制備(第2工序)和抗原特異性CTL的增殖(第3工序)所必需的要素。 對每個工序、本發(fā)明的制備試劑盒所包括的要素進(jìn)行說明。(第1工序CTL的誘導(dǎo))
該工序中利用外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)對特定的抗原具有特異性的CTL。為了實施該工序，本發(fā)明的制備試劑盒至少包括以下的要素(1-1) (1-3)。(1-1)容納在注入容器中的含抗原肽培養(yǎng)基，(1-2)至少2個容納在注入容器中的含IL-2培養(yǎng)基，和(1-3)密封型培養(yǎng)容器，具備用于注入另外制備的外周血單核細(xì)胞的第1 口，用于注入上述含抗原肽培養(yǎng)基的第2 口，與上述含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用
于注入上述含IL-2培養(yǎng)基的第3 口，和用于移出誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第4□。以下，對各要素的詳情進(jìn)行說明。應(yīng)予說明，在以下的說明中，只要沒有特別的說明，“含抗原肽培養(yǎng)基”表示“容納在注入容器中的含抗原肽培養(yǎng)基”。同樣地，“含IL-2培養(yǎng)基”表示“容納在注入容器中的含IL-2培養(yǎng)基”。(1-1)含抗原肽培養(yǎng)基注入容器的形態(tài)，只要是能夠保持培養(yǎng)基的同時，能夠?qū)⒆鳛槭杖菸锏呐囵B(yǎng)基注入后述的密封型培養(yǎng)容器中，就沒有特別的限定。例如，將能夠塞嚴(yán)的注射器(syringe)作為注入容器來利用即可。注入容器中容納有含抗原肽培養(yǎng)基。含抗原肽培養(yǎng)基是指根據(jù)目的含有特定的抗原肽的培養(yǎng)基。作為抗原肽，可以例示病毒(巨細(xì)胞病毒、愛潑斯坦巴爾病毒、腺病毒等)、 腫瘤抗原(WT1、hTERT、MN/CA9、gp 100、MART 1、TRP1、TRP2、酪氨酸酶、MAGE1、MAGE2、MAGE3、 MAGE6、NY-ES0-1、MUMl、BAGE、GAGEl、GAGE2、CEA、PSA 等)的 HLA 結(jié)合肽。通常只使用 1 種抗原肽，但不阻止使用2種以上的抗原肽?？梢酝ㄟ^在適合T細(xì)胞的培養(yǎng)的培養(yǎng)基(例如 RPMI1640、AIM-V、達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' s modified eagle medium) 等)中添加抗原肽來制備含抗原肽培養(yǎng)基。還可以添加血清、血漿、血清白蛋白、抗生素、 L-谷氨酰胺等。培養(yǎng)基中的抗原肽的量例如為0.01yg/mL 100yg/mL。對于含抗原肽培養(yǎng)基的量，例如為5mL 50mL。根據(jù)含抗原肽培養(yǎng)基的量決定注入容器的大小即可。例如，如果使用5mL的含抗原肽培養(yǎng)基，則將5mL用的注射器作為注入容器來采用即可。(1-2)含 IL-2 培養(yǎng)基注入容器的構(gòu)成與(1-1)的情況相同，因此省略其說明。注入容器中容納有含 IL-2培養(yǎng)基?？梢酝ㄟ^在適合T細(xì)胞的培養(yǎng)的培養(yǎng)基(例如RPMI1640、AIM-V、達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium)、X_VIV0(BioWhittaker 公司)、 ALyS505N((株)細(xì)胞科學(xué)研究所)等)中添加IL-2來制備含IL-2培養(yǎng)基。還可以添加血清、血漿、血清白蛋白、抗生素、L-谷氨酰胺等。作為IL-2，優(yōu)選使用重組人IL-2(例如 Chiron 公司提供的 PR0LEUKIN)。IL-2 的含量例如為 10IU/mL 1000IU/mL。本發(fā)明中，至少使用2個容納在注入容器中的含IL-2培養(yǎng)基。優(yōu)選地，含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量為3以上。具體來說，例如含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量為3 5。如果增加含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量，則在CTL誘導(dǎo)工序中能夠追加的培養(yǎng)基的次數(shù)增加。由此可以謀求誘導(dǎo)效率的提高和/或誘導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)的增加。培養(yǎng)基組成(IL-2的含量、其它成分的含量等)、液體量等不需要對所有的含IL-2 培養(yǎng)基進(jìn)行統(tǒng)一。例如，可以進(jìn)行如下的各種組合將液體量少的含IL-2培養(yǎng)基(例如 IOmL)和液體量多的含IL-2培養(yǎng)基(例如20mL)進(jìn)行組合，或?qū)L-2含量少的含IL-2培養(yǎng)基(例如100IU/mL)和IL-2含量多的含IL-2培養(yǎng)基(例如1000IU/mL)進(jìn)行組合。前者的組合的情況下，考慮到操作性和效率性，優(yōu)選將液體量少的含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量作為 1，將液體量多的含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量作為2 4。再者，還可以將含IL-2培養(yǎng)基的一部分作為預(yù)備用來使用。(1-3)密封型培養(yǎng)容器密封型培養(yǎng)容器至少具備4種口(第1 第4 口)。第1 口是另外制備的外周血單核細(xì)胞的注入用口。同樣地，第2 口是含抗原肽培養(yǎng)基的注入用口，第3 口是含IL-2培養(yǎng)基的注入用口，第4 口是用于移出誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的注入用口。對于第2 口，具備與含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量至少相同的數(shù)量。即，第2 口的數(shù)量是與含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量相同或其以上。設(shè)有比含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量多的第2 口的情況下， 可以將一部分的口作為預(yù)備的口來利用。第1 口、第3 口和第4 口的數(shù)量原則上為1。但是，還可以設(shè)有應(yīng)對操作失誤的預(yù)備口。預(yù)備口可以設(shè)置在每個口、或設(shè)置成與2個以上的口(例如第2 口和第3 口)共通的形式。各口的形態(tài)沒有特別的限定?？梢圆捎美?，Luer鎖緊接口類型、針刺口(針刺一卜)或膜管等。其中，優(yōu)選采用Luer鎖緊接口類型的口。這是因為通過確實的固定
可以防止漏液。沒有必要所有的口為相同的形態(tài)。例如，將第1 口制成能夠利用注射針進(jìn)行注入的口(例如，具有由橡膠等彈性體構(gòu)成的注入口的情形)，將其它的口制成Luer鎖緊接口類型的口。在優(yōu)選的一方式中，將所有的口制成Luer鎖緊接口類型。利用該結(jié)構(gòu)可以防止各注入操作中的漏液，同時操作方法共通化，因此，提高操作性。還可以將第1 第4 口的一部或全部制成分支型口。如果采用分支型口，則口和容器本體的連接部的數(shù)量變少，構(gòu)造簡化。因而，制造和操作變得容易，而且還可以防止使用時的狀態(tài)不佳的發(fā)生。這樣，利用分支型口是需要在密封型容器中具備相當(dāng)數(shù)量的口的本發(fā)明中有利的結(jié)構(gòu)。分支型口的分支數(shù)沒有特別的限定。例如，可以使用分支數(shù)為2 4的分支型口。 優(yōu)選地，至少將含IL-2培養(yǎng)基(1-2)用的第3 口制成分支型口。應(yīng)予說明，本說明書中，分支型口的情況下，將分支的數(shù)量作為口數(shù)。例如，3分支口視為3個口。本發(fā)明的密封型培養(yǎng)容器中特有的結(jié)構(gòu)是各口。因而，本發(fā)明的密封型培養(yǎng)容器的結(jié)構(gòu)除了與各口相關(guān)的部分以外，按照公知的結(jié)構(gòu)(例如能夠利用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種袋)制造即可。從操作容易等理由考慮，優(yōu)選由柔軟的材質(zhì)構(gòu)成的袋的形態(tài)。(第2工序抗原呈遞用活化T細(xì)胞的制備)在該工序中，利用外周血單核細(xì)胞來制備抗原呈遞用活化T細(xì)胞。為了實施該工序，本發(fā)明的制備試劑盒至少包括以下的要素(2-1) (2-4)。應(yīng)予說明，“抗原呈遞用活化T細(xì)胞”是指通過對外周血單核細(xì)胞施加特定的刺激，在細(xì)胞表面表達(dá)副刺激因子的細(xì)胞，是能夠發(fā)揮作為促進(jìn)抗原特異性CTL的增殖的抗原呈遞細(xì)胞的功能的細(xì)胞。使用了本發(fā)明的制備試劑盒的情況下，通過使用抗CD3抗體，可以制備抗原呈遞用活化T細(xì)胞。應(yīng)予說明，從說明的便利上，以下將“抗原呈遞用活化T細(xì)胞”簡稱為“抗原呈遞細(xì)胞”。(2-1)容納在注入容器中的含抗⑶3抗體培養(yǎng)基，(2-2)至少2個容納在注入容器中的含IL-2培養(yǎng)基，(2-3)容納在注入容器中的含抗原肽培養(yǎng)基，和
(2-4)密封型培養(yǎng)容器，具備用于注入另外制備的外周血單核細(xì)胞的第1 口，用于注入上述含抗CD3抗體培養(yǎng)基的第2 口，與上述含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入上述含IL-2培養(yǎng)基的第3 口，用于注入上述含抗原肽培養(yǎng)基的第4 口，和用于移出制備的抗原呈遞用活化T細(xì)胞的第5 口。以下，對各要素進(jìn)行詳情說明，但對于沒有特別言及的事項(注入容器的結(jié)構(gòu)、除了與口相關(guān)的部分之外的密封型培養(yǎng)容器的結(jié)構(gòu)等)，與第1工序中使用的對應(yīng)的要素相同，援引其說明。另外，在以下的說明中，只要沒有特別地言及，“含抗CD3抗體培養(yǎng)基”就表示“容納在注入容器中的含抗CD3抗體培養(yǎng)基”。同樣地，“含IL-2培養(yǎng)基”表示“容納在注入容器中的含IL-2培養(yǎng)基”，“含抗原肽培養(yǎng)基”表示“容納在注入容器中的含抗原肽培養(yǎng)
其”
難 ο(2-1)含抗CD3抗體培養(yǎng)基用于含抗⑶3抗體培養(yǎng)基的抗⑶3抗體可以通過⑶3分子或使用了其一部分的免疫學(xué)方法來制備。也可以使用市售的抗CD3抗體。市售的抗CD3抗體的例子是0KT-3抗體 (Janssen Pharmaceutical公司)。從安全性方面考慮，優(yōu)選使用獲得藥品批準(zhǔn)的0KT-3抗體。應(yīng)予說明，抗CD3抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。但是，如果從特異性、 效率方面考慮，優(yōu)選使用單克隆抗體的抗CD3抗體。還可以并用2種以上的抗CD3抗體。通過在適合T細(xì)胞的培養(yǎng)的培養(yǎng)基(例如RPMI1640、AIM_V、達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco，s modified eagle medium)等)中添加抗CD3抗體，可以制備含抗 CD3抗體培養(yǎng)基。還可以添加血清、血漿、血清白蛋白、抗生素、L-谷氨酰胺等。培養(yǎng)基中的抗CD3抗體的量是例如0. 01 μ g/mL 10 μ g/mL。對于含抗⑶3抗體培養(yǎng)基的量，是例如 5mL 5 OmL ο(2- 含 IL-2 培養(yǎng)基與(1- 的含IL-2培養(yǎng)基同樣具備2個以上的含IL-2培養(yǎng)基。優(yōu)選含IL_2培養(yǎng)基的數(shù)量為3以上。進(jìn)一步優(yōu)選含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量為4以上。具體來說，例如含IL-2 培養(yǎng)基的數(shù)量為3 6。如果含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量增加，則抗原呈遞細(xì)胞的制備工序中能夠追加培養(yǎng)基的次數(shù)增加。由此，可以謀求制備效率的提高和/或制備的細(xì)胞數(shù)的增加。培養(yǎng)基組成(IL-2的含量、其它成分的含量等)、液體量等不需要對所有的含IL-2 培養(yǎng)基進(jìn)行統(tǒng)一。例如，可以進(jìn)行如下的各種組合將液體量少的含IL-2培養(yǎng)基(例如 IOmL)和液體量多的含IL-2培養(yǎng)基(例如20mL)進(jìn)行組合，或?qū)L-2含量少的含IL-2培養(yǎng)基(例如100IU/mL)和IL-2含量多的含IL-2培養(yǎng)基(例如1000IU/mL)進(jìn)行組合。優(yōu)選將IL-2含量和液體量少的含IL-2培養(yǎng)基(例如液體量為10mL，IL-2含量為100IU/mL) 與IL-2含量和液體量多的含IL-2培養(yǎng)基(例如液體量為20mL，IL-2含量為1000IU/mL) 組合使用。這種情況下，考慮到操作性和效率性，優(yōu)選例如將前者的數(shù)量作為1，將后者的數(shù)量作為3 5。再者，還可以將含IL-2培養(yǎng)基的一部分作為預(yù)備用來使用。(2-3)含抗原肽培養(yǎng)基對于該含抗原肽培養(yǎng)基，由于與(1-1)的含抗原肽培養(yǎng)基相同，因此省略其說明。(2-4)密封型培養(yǎng)容器該密封型容器至少具備5種口(第1 第5 口)。第1 口是另外制備的外周血單核細(xì)胞的注入用口。同樣地，第2 口是含抗⑶3抗體培養(yǎng)基注入用的口，第3 口是含IL-2培養(yǎng)基的注入用口，第4 口是含抗原肽培養(yǎng)基的注入用口，第5 口是所制備的抗原呈遞用活化T細(xì)胞的移出用口。對于第3 口，具備與含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量至少相同的數(shù)量。即，第2 口的數(shù)量是與含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量相同或其以上。設(shè)有比含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量多的第2 口的情況下， 可以將一部分的口作為預(yù)備的口來利用。第1 口、第3 口、第4 口和第5 口的數(shù)量原則上為 1。但是，還可以設(shè)有應(yīng)對操作失誤的預(yù)備口。預(yù)備口可以設(shè)置在每個口、或設(shè)置成與2個以上的口(例如第3 口和第4 口)共通的形式。與(1-3)的密封型培養(yǎng)容器的情況相同，各口的形態(tài)沒有特別的限定。如果表示各口的結(jié)構(gòu)的一個例子，則將第1 口制成能夠利用注射針的注入的口(例如，具有由橡膠等彈性體構(gòu)成的注入口的情形)，將其它的口制成Luer鎖緊接口類型的口。優(yōu)選地，根據(jù)與 (1-3)的密封型培養(yǎng)容器的情況相同的理由，將所有的口制成Luer鎖緊接口類型。另一方面，與(1-3)的密封型培養(yǎng)容器的情況相同，還可以將第1 第5 口的一部分或全部制成分支型口。優(yōu)選地，至少將含IL-2培養(yǎng)基(2-2)用的第3 口制成分支型口。(第3工序CTL的增殖)在該工序中，使用通過第1工序誘導(dǎo)的抗原特異性CTL和通過第2工序制備的抗原呈遞細(xì)胞使抗原特異性CTL增殖。為了實施該工序，本發(fā)明的制備試劑盒至少包括以下的要素(3-1) (3-6)。(3-1)容納在注入容器中的用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的培養(yǎng)基，(3-2)容納在注入容器中的用于分離抗原呈遞細(xì)胞的培養(yǎng)基，(3-3)第1密封型分離容器，具備用于移入誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基的第 3 口，和用于移出分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第4 口，(3-4)第2密封型分離容器，具備用于移入制備的抗原呈遞細(xì)胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分離抗原呈遞用細(xì)胞的培養(yǎng)基的第3 口，和用于移出分離后的抗原呈遞細(xì)胞的第4 口，(3-5)至少2個容納在注入容器中的增殖用培養(yǎng)基，上述增殖用培養(yǎng)基含有IL-2 或IL-15或這兩者，(3-6)密封型培養(yǎng)容器，具備用于移入分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第 1 口，用于移入分離后的抗原呈遞細(xì)胞的第2 口，用于注入另外制備的血清或血漿的第3 口， 與上述增殖用培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入上述增殖用培養(yǎng)基的第4 口和用于移出增殖的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第5 口。(3-1)用于分離抗原特異性CTL的培養(yǎng)基和(3-2)用于分離抗原呈遞細(xì)胞的培養(yǎng)
基用于分離抗原特異性CTL的培養(yǎng)基和用于分離抗原呈遞細(xì)胞的培養(yǎng)基都只要是適合τ細(xì)胞的培養(yǎng)的培養(yǎng)基(例如RPMI1640、AIM-V、達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基 (Dulbecco's modified eagle medium)、X_VIVO(BioWhittaker 公司)、ALyS505N((株)細(xì)胞科學(xué)研究所)等)即可。優(yōu)選使用添加有IL-2或IL-15的培養(yǎng)基。還可以使用添加有 IL-2和IL-15這兩者的培養(yǎng)基。添加IL-2的情況下，其含量是例如10IU/mL 1000IU/ mL。添加IL-15的情況下，其含量是例如lOng/mL lOOng/mL。作為IL-15，優(yōu)選使用重組人IL-15(例如CellGenix公司提供的CellGro IL-15)。還可以使用添加有血清、血漿、血清白蛋白、抗生素、L-谷氨酰胺等的培養(yǎng)基。用于分離抗原特異性CTL的培養(yǎng)基和用于分離抗原呈遞細(xì)胞的培養(yǎng)基的組成沒有必要相同。典型的是，各準(zhǔn)備一個用于分離抗原特異性 CTL的培養(yǎng)基和用于分離抗原呈遞細(xì)胞的培養(yǎng)基，但是如后述的那樣，分離時進(jìn)行清洗工序的情況下，與其相應(yīng)地準(zhǔn)備所需數(shù)量的培養(yǎng)基。(3-3)第1密封型分離容器第1密封型分離容器用于誘導(dǎo)的抗原特異性CTL的分離。第1密封型分離容器至少具備4種口(第1 第4 口)。第1 口是誘導(dǎo)的抗原特異性CTL的移入用口。同樣地， 第2 口是排液用的口，第3 口是用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基的注入用口， 第4 口是分離后的CTL的移出用口。各口的形態(tài)等沒有特別的限定。例如，將第3 口制成 Luer鎖緊接口類型的口。這里的“分離”是指從通過第1工序得到的細(xì)胞含有培養(yǎng)液回收細(xì)胞。本發(fā)明中的 “分離”由包括利用離心處理的細(xì)胞的沈降(離心)、不要的培養(yǎng)基的廢棄(排液)、培養(yǎng)基中的細(xì)胞的重懸(培養(yǎng)基的注入)、細(xì)胞懸液的回收(細(xì)胞的移出)的一系列的操作構(gòu)成。 也可以不設(shè)置用于排液操作的專用口(第2 口)，將CTL的移出用口也用于排液。在細(xì)胞的移出操作前，還可以進(jìn)行再次的離心處理以及接下來的排液操作和培養(yǎng)基的注入操作。即， 還可以編入細(xì)胞的清洗工序。還可以重復(fù)進(jìn)行這樣的清洗工序(例如2次 4次)。(3-4)第2密封型分離容器第2密封型分離容器用于制備的抗原呈遞細(xì)胞的分離。第2密封型分離容器至少具備4種口(第1 第4 口)。第1 口是制備的抗原呈遞細(xì)胞的移入用口。同樣地，第2 口是排液用的口，第3 口是用于分離抗原呈遞細(xì)胞的培養(yǎng)基的注入用口，第4 口是分離后的抗原呈遞細(xì)胞的移出用口。與第1密封型分離容器同樣，各口的形態(tài)等沒有特別的限定。例如，將第3 口作為Luer鎖緊接口類型的口。應(yīng)予說明，對于這里的“分離”，與第1密封型分離容器的情況相同，因此省略其說明。(3-5)增殖用培養(yǎng)基具備2個以上的增殖用培養(yǎng)基。優(yōu)選該培養(yǎng)基的數(shù)量為3以上。具體來說，例如該培養(yǎng)基的數(shù)量為5 7。如果培養(yǎng)基的數(shù)量增加，則能夠在CTL增殖工序中追加的培養(yǎng)基的次數(shù)增加。由此可以謀求增殖效率的提高和/或回收的細(xì)胞的數(shù)量的增加。增殖用培養(yǎng)基含有IL-2或IL-15或它們兩者。IL-2的含量是例如10IU/mL 1000IU/mL。另一方面， IL-15的含量是例如10ng/mL 100ng/mL。(3-6)密封型培養(yǎng)容器該密封型容器至少具備5種口(第1 第5 口)。第1 口是分離后的抗原特異性 CTL的移入用口。同樣地，第2 口是分離后的抗原呈遞細(xì)胞的移入用口，第3 口是另外制備的血清或血漿的注入用口，第4 口是增殖用培養(yǎng)基的注入用口，第5 口是增殖的抗原特異性 CTL的移出用口。對于第4 口，具備與增殖用培養(yǎng)基的數(shù)量至少相同的數(shù)量。即，第4 口的數(shù)量是與增殖用培養(yǎng)基的數(shù)量相同或其以上。設(shè)有比增殖用培養(yǎng)基的數(shù)量多的數(shù)目的第4 口的情況下，可以將一部分的口作為預(yù)備的口來利用。第1 口、第2 口、第3 口和第5 口的數(shù)量原則上為1。但是，還可以設(shè)有用于應(yīng)對操作失誤的預(yù)備口。預(yù)備口可以設(shè)置在每個口、或設(shè)置成與2個以上的口(例如第3 口和第4 口)共通的形式。 與(1-3)的密封型培養(yǎng)容器的情況相同，各口的形態(tài)等沒有特別的限定。如果表示各口的結(jié)構(gòu)的一個例子，則將第3 口制成能夠利用注射針的注入的口(例如，具有由橡膠等彈性體構(gòu)成的注入口的情形)，將其它的口制成Luer鎖緊接口類型的口。優(yōu)選地，根據(jù)與 (1-3)的密封型培養(yǎng)容器的情況相同的理由，至少將第4 口制成Luer鎖緊接口類型。另一方面，與(1-3)的密封型培養(yǎng)容器的情況相同，可以將第1 第5的一部分或全部制成分支型口。優(yōu)選地，至少將第4 口制成分支型口。 本發(fā)明的制備試劑盒中，對所有的培養(yǎng)容器((1-3)、(2-4)、(3-6))，其具備的各口僅用于1次操作。也就是說，使用過一回的口在其后的操作中不再使用。通過進(jìn)行這樣的操作，可以盡量避免污染的發(fā)生。對分離容器((3-4)、(3-5))也進(jìn)行相同的操作，也可以防止分離操作時的污染。本發(fā)明的制備試劑盒所含有的各要素通常將每個要素、或二個以上的要素以集中的狀態(tài)進(jìn)行包裝。優(yōu)選為密封包裝。優(yōu)選的一方式中，對(1-3)的密封型培養(yǎng)容器的第1 口 第3 口、(2-4)的密封型培養(yǎng)容器的第1 口 第4 口、以及(3-6)的密封型培養(yǎng)容器的第3 口和第4 口而言分別具備2種帽。一個帽安裝在未使用狀態(tài)的口。另一個帽安裝在使用完的口。通過使用這樣的 2種帽，可以容易地掌握各口是未使用還是使用完了。由此可以防止污染。另外，還可以防止操作失誤。這2種帽的結(jié)構(gòu)(顏色、形狀等)只要是能夠辨別開兩者，沒有特別的限定。 例如是顏色不同的2種帽。或形狀相同的2種帽。作為能夠在本發(fā)明的制備試劑盒中追加的要素，可以舉出用于外周血單核細(xì)胞的制備的培養(yǎng)基、容器等，用于外周血單核細(xì)胞的注入的容器，用于血漿的制備的培養(yǎng)基、容器等，用于血漿的注入的容器，用于分離通過第3工序增殖的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的分離容器，用于凍結(jié)保存使用該分離容器分離的細(xì)胞的保存容器，用于細(xì)胞的移入、移出或分注的管。例如，如果還具備用于外周血單核細(xì)胞的制備的培養(yǎng)基和/或用于外周血單核細(xì)胞的制備的容器，則成為能夠用于外周血單核細(xì)胞的制備的試劑盒，其方便性乃至利用價值高。同樣地，如果具備用于分離通過第3工序增殖的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的分離容器(和用于凍結(jié)保存使用該分離容器分離的細(xì)胞的保存容器)，則成為第3工序以后的操作也可以利用的試劑盒。用于外周血單核細(xì)胞的制備的培養(yǎng)基和容器采用制備外周血單核細(xì)胞時通常使用的即可。作為這里的培養(yǎng)基的一個例子，可以舉出含有血清白蛋白和抗生素的RPMI1640 培養(yǎng)基，作為容器的一個例子，可以舉出一次性類型的離心管。另一方面，作為上述的分離容器，可以采用與(3-1)或(3-2)的分離容器相同結(jié)構(gòu)的分離容器，或能夠用于細(xì)胞的分離的市售的分離用袋(例如分離袋A(NIPR0株式會社))。另外，有市售的用于細(xì)胞的凍結(jié)的各種袋(例如Froze bag(NIPR0株式會社))，可以將這些中的任意一種作為上述保存容器來使用。以下，對使用了本發(fā)明的制備試劑盒的、抗原特異性CTL的制備方法(本發(fā)明的第 2方面)進(jìn)行說明。該制備方法大致由抗原特異性CTL的誘導(dǎo)工序、抗原呈遞細(xì)胞的制備工序和抗原特異性CTL的增殖工序這3個工序構(gòu)成。前2者的實施順序沒有限定。S卩，可以將任意一個先實施。還可以將兩者同時實施。
(1)抗原特異性CTL的誘導(dǎo)工序在該工序中，最初從第1 口將外周血單核細(xì)胞、從第2 口將含抗原肽培養(yǎng)基(1-1) 分別注入密封型培養(yǎng)容器(1- 中。該操作后，將密封型培養(yǎng)容器移到設(shè)定在適合T細(xì)胞培養(yǎng)的條件(典型的是37°C、5%C02)的培養(yǎng)箱內(nèi)。經(jīng)過規(guī)定時間(例如1天 4天)后，從培養(yǎng)箱取出密封型培養(yǎng)容器，從第3 口中的一個口注入含IL-2培養(yǎng)基(1- 。在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)規(guī)定時間(例如2 7天)后，第3 口中的一個口(其中未使用的口)再次注入含IL-2 培養(yǎng)基(1- 到密封型培養(yǎng)容器中。然后，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。使用包括2個含IL-2培養(yǎng)基的制備試劑盒的情況下，此后，移到后述的抗原特異性CTL的增殖工序。使用包括3個以上含IL-2培養(yǎng)基的制備試劑盒的情況下，在移到抗原特異性CTL的增殖工序前，重復(fù)規(guī)定次數(shù)(根據(jù)含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量，為1次或2次以上)的含IL-2培養(yǎng)基的注入操作和接下來的培養(yǎng)。從進(jìn)行含IL-2培養(yǎng)基的注入操作后至進(jìn)行下次含IL-2培養(yǎng)基的注入操作的間隔是例如1天 6天。就如第1次注入操作和第2次注入操作的間隔為5天、第2次注入操作和第3次注入操作的間隔是3天的例子這樣，這里的間隔沒有必要必須統(tǒng)一。應(yīng)予說明，外周血單核細(xì)胞的制備按照常用方法進(jìn)行即可。但是，包括用于制備外周血單核細(xì)胞的要素的試劑盒的情況下，在制備外周血單核細(xì)胞時也利用試劑盒。(2)抗原呈遞細(xì)胞的制備工序在該工序中，最初從第1 口將外周血單核細(xì)胞、從第2 口將含抗CD3抗體培養(yǎng)基 (2-1)分別注入密封型培養(yǎng)容器0-4)。該操作后，將密封型培養(yǎng)容器移到設(shè)定在適合T細(xì)胞培養(yǎng)的條件(典型的是37°C、5%C02)的培養(yǎng)箱內(nèi)。經(jīng)過規(guī)定時間(例如1天 4天) 后，從培養(yǎng)箱取出密封型培養(yǎng)容器，從第3 口中的一個口將含IL-2培養(yǎng)基0-2)注入到密封型培養(yǎng)容器。優(yōu)選地，在這里的注入操作中，相比于后面使用的含IL-2培養(yǎng)基，使用IL-2 濃度低的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)規(guī)定時間(例如2 7天)后，第3 口中的一個口(其中未使用的口)再次注入含IL-2培養(yǎng)基0-2)。然后，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。使用包括2 個含IL-2培養(yǎng)基的制備試劑盒的情況下，此后，使用第4 口進(jìn)行含抗原肽培養(yǎng)基的注入操作。該注入操作后，將密封型培養(yǎng)容器放置規(guī)定時間(例如30分鐘 2小時)。在此期間， 優(yōu)選通過將密封型培養(yǎng)容器傾斜等以規(guī)定間隔(例如每隔15分鐘)進(jìn)行攪拌。此后，移到后述的抗原特異性CTL的增殖工序。使用包括3個以上含IL-2培養(yǎng)基的制備試劑盒的情況下，在含抗原肽培養(yǎng)基的注入操作前，重復(fù)規(guī)定次數(shù)(根據(jù)含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量，為1次或2次以上)的含IL-2培養(yǎng)基的注入操作和接下來的培養(yǎng)。應(yīng)予說明，進(jìn)行含IL-2培養(yǎng)基的注入操作后至進(jìn)行下次含IL-2培養(yǎng)基的注入操作的間隔是例如1天 6天。就如第1 次注入操作和第2次注入操作的間隔為3天、第2次注入操作和第3次注入操作的間隔為 2天的例子這樣，這里的間隔沒有必要必須統(tǒng)一。(3)抗原特異性CTL的增殖工序在該工序中，最初分別回收在抗原特異性CTL的誘導(dǎo)工序中誘導(dǎo)的抗原特異性 CTL和在抗原呈遞細(xì)胞的制備工序中制備的抗原呈遞細(xì)胞。在抗原特異性CTL的回收中使用密封型培養(yǎng)容器(1- 的第4 口。通常是利用管等將該第4 口與第1密封型分離容器 (3-3)的第1 口連接，直接在第1密封型分離容器內(nèi)回收抗原特異性CTL。使用第4 口附帶有管的密封型培養(yǎng)容器(1-3)的情況下，不需要另外準(zhǔn)備管就可以進(jìn)行抗原特異性CTL的回收。
抗原呈遞細(xì)胞的回收也進(jìn)行相同的操作。即，通常是利用管等將密封型培養(yǎng)容器 (2-4)的第5 口與第2密封型分離容器(3-4)的第1 口連接，直接在第2密封型分離容器內(nèi)回收抗原呈遞細(xì)胞。接著，將回收到第1密封型分離容器的抗原特異性CTL進(jìn)行分離。S卩，將第1密封型分離容器提供到離心處理，除去不需要的培養(yǎng)液。然后，將用于分離抗原特異性CTL的培養(yǎng)基從第3 口注入到第1密封型分離容器中，使細(xì)胞懸浮。接下來，利用管等將第1密封型分離容器的第4 口與密封型培養(yǎng)容器(3-6)的第1 口連接，從第1密封型分離容器向密封型培養(yǎng)容器(3-6)輸送細(xì)胞。另一方面，將回收到第2密封型分離容器的抗原呈遞細(xì)胞按照與抗原特異性CTL 的分離時相同的程序進(jìn)行分離。然后，利用管等將第2密封型分離容器的第4 口和密封型培養(yǎng)容器(3-6)的第2 口連接，從第2密封型分離容器向密封型培養(yǎng)容器(3-6)輸送細(xì)胞。 應(yīng)予說明，不考慮抗原特異性CTL的分離及輸送、和抗原呈遞細(xì)胞的分離及輸送的順序。接著，將血清或血漿從第3 口注入到密封型培養(yǎng)容器(3-6)后，將密封型培養(yǎng)容器移到設(shè)定在適合T細(xì)胞培養(yǎng)的條件(典型的是37°C、5%C02)的培養(yǎng)箱內(nèi)。但是，也可以在抗原特異性CTL的輸送和/或抗原呈遞細(xì)胞的輸送之前，進(jìn)行血清或血漿的注入操作。經(jīng)過規(guī)定時間(例如1天 4天)后，從培養(yǎng)箱取出密封型培養(yǎng)容器，從第4 口中的一個口將增殖用培養(yǎng)基(3-5)注入到密封型培養(yǎng)容器。在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)規(guī)定時間(例如2 7天) 后，第4 口中的一個口(其中未使用的口)再次注入增殖用培養(yǎng)基(3-5)。然后，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。使用包括2個增殖用培養(yǎng)基的制備試劑盒的情況下，此后，移到細(xì)胞的回收操作。使用包括3個以上增殖用培養(yǎng)基的制備試劑盒的情況下，在回收操作前，重復(fù)規(guī)定次數(shù) (根據(jù)增殖用培養(yǎng)基的數(shù)量，為1次或2次以上)的增殖用培養(yǎng)基的注入操作和接下來的培養(yǎng)。進(jìn)行增殖用培養(yǎng)基的注入操作后至進(jìn)行下次增殖用培養(yǎng)基的注入操作的間隔是例如 1天 6天。就如第1次注入操作和第2次注入操作的間隔為3天、第2次注入操作和第3 次注入操作的間隔為2天的例子這樣，這里的間隔沒有必要必須統(tǒng)一。在回收操作中，使用密封型培養(yǎng)容器(3-6)的第5 口。即，利用第5 口移出通過以上的操作增殖的抗原特異性CTL。本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面(第3方面)是，提供利用了凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原特異性CTL制備試劑盒。本發(fā)明的制備試劑盒具備用于實施抗原特異性CTL的誘導(dǎo)(第1工序)、抗原呈遞細(xì)胞的制備(第2工序)、和抗原特異性CTL的增殖(第3工序)所必需的要素。對每個工序、本發(fā)明的制備試劑盒所包括的要素進(jìn)行說明。但是，第1 工序用的要素與第1方面的發(fā)明情況相同，因此省略其說明。另外，對于沒有特別言及的事項，援引第1內(nèi)容中對應(yīng)的記載。(第2工序抗原呈遞細(xì)胞的制備)在該工序中，將凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞恢復(fù)到浸潤狀態(tài)。在本說明書中將該處理也稱為“重構(gòu)”。為了實施該工序，本發(fā)明的制備試劑盒至少包括凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞?！皟鼋Y(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞”是指利用規(guī)定的抗原通過誘導(dǎo)化獲得抗原呈遞能力的細(xì)胞，該細(xì)胞處于凍結(jié)干燥狀態(tài)。“凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞”可以通過抗原呈遞細(xì)胞的制備和接下來的凍結(jié)干燥處理來制備。例如，可以利用樹突狀細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞根據(jù)常用方法制備抗原呈遞細(xì)胞。另外，還可以利用K562細(xì)胞等制備抗原呈遞細(xì)胞。優(yōu)選地，將規(guī)定的表達(dá)HLA (例如HLA-AM)、⑶80、⑶83和⑶86的K562細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞來使用?？乖蔬f細(xì)胞的凍結(jié)干燥處理優(yōu)選在細(xì)胞懸液中存在海藻糖的條件下進(jìn)行。 將抗原呈遞細(xì)胞的制備和凍結(jié)干燥處理的具體例表示在后述的實施例的欄。凍結(jié)干燥處理的一個例子記載于美國專利5，059，518。還可以按照該處理方法實施凍結(jié)干燥處理。應(yīng)予說明，該文獻(xiàn)的內(nèi)容通過參照編入本說明書。(第3工序CTL的增殖)在該工序中，使用通過第1工序誘導(dǎo)的抗原特異性CTL和通過第2工序制備的抗原呈遞細(xì)胞使抗原特異性CTL增殖。為了實施該工序，本發(fā)明的制備試劑盒至少包括以下的要素(3-1) (3-4)。(3-1)容納在注入容器中的用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基，(3-2)第1密封型分離容器，具備用于移入誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基的第 3 口，和用于移出分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第4 口，(3-3)至少2個容納在注入容器中的增殖用培養(yǎng)基，上述增殖用培養(yǎng)基含有IL-2 或IL-15或這兩者，(3-4)密封型培養(yǎng)容器，具備用于移入分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第 1 口，用于移入制備的抗原呈遞細(xì)胞的第2 口，用于注入另外制備的血清或血漿的第3 口，與上述增殖用培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入上述增殖用培養(yǎng)基的第4 口，和用于移出增殖的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第5 口。(3-1)與第1方面的(3-1)相同，(3-2)與第1方面的(3-3)相同，(3-3)與第1 方面的(3-5)相同，因此省略其說明。(3-4)對應(yīng)第1方面的(3-6)。唯一的不同點是第2 口用于移入制備的抗原呈遞細(xì)胞。該第2 口的結(jié)構(gòu)沒有特別的限定。例如，只要是與第1 方面的(3-6)中的第2 口相同的結(jié)構(gòu)即可。與第1方面的制備試劑盒同樣可以追加各種要素(用于外周血單核細(xì)胞的制備的培養(yǎng)基、容器，用于外周血單核細(xì)胞的注入的容器，用于血漿的制備的培養(yǎng)基、容器，用于血漿的注入的容器，用于抗原呈遞細(xì)胞的重構(gòu)的培養(yǎng)基、容器，用于分離通過第3工序增殖的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的分離容器，用于凍結(jié)保存使用該分離容器分離的細(xì)胞的保存容器，用于細(xì)胞的移入、移出或分注的管等)。使用了本發(fā)明的制備試劑盒的、抗原特異性CTL的制備方法(本發(fā)明的第4方面) 除了第2工序以外，與使用了本發(fā)明的第1方面的制備試劑盒的情況相同。在該方面的第 2工序中，將凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞重構(gòu)。重構(gòu)的方法典型的是包括細(xì)胞的浸潤、清洗(和懸浮)。表示具體例，則如下首先，對凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞添加足量的溶媒(去離子水、蒸餾水、生理鹽水等)，暫時放置(浸潤工序)。添加培養(yǎng)基后，提供到離心處理(清洗工序)。吸除上清后，再次加入培養(yǎng)基，使細(xì)胞懸浮(懸浮工序)。以下，利用實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。實施例1將本發(fā)明的實施例(抗原特異性CTL制備試劑盒)的構(gòu)成要素(構(gòu)成品)示于圖 1 4。應(yīng)予說明，圖1表示抗原特異性CTL的誘導(dǎo)工序中使用的一套構(gòu)成要素(抗原特異性CTL誘導(dǎo)用要素)，圖2表示抗原呈遞細(xì)胞的制備工序中使用的一套構(gòu)成要素(抗原呈遞
18細(xì)胞制備用要素)，圖3和4表示抗原特異性CTL的增殖工序中使用的一套構(gòu)成要素(抗原特異性CTL增殖用要素)?？乖禺愋訡TL誘導(dǎo)用要素(圖1)的詳細(xì)內(nèi)容如下。培養(yǎng)用袋1··1個容納在Luer鎖緊接口注射器中的含抗原肽培養(yǎng)基10 (含有0. 01%人血清白蛋白和 2 μ g/mL CMVpp65 (抗原肽)的 H印es 緩沖 RPMI1640) 5mL · · 1 瓶容納在Luer鎖緊接口注射器中的含IL-2培養(yǎng)基11 (含有0. 01 %人血清白蛋白和 100IU/mL IL-2 的 H印es 緩沖 RPMI1640) IOmL · · 1 瓶容納在Luer鎖緊接口注射器中的含IL-2培養(yǎng)基12(含有100IU/mL IL-2的 ALyS505N ((株)細(xì)胞科學(xué)研究所))20mL · · 3瓶培養(yǎng)用袋1具備Luer鎖緊接口類型的口 2、Luer鎖緊接口類型的3分支口(3、4)、 塑料針(參照圖5)用的口 5?？?2用于注入另外制備的外周血單核細(xì)胞。另外，3分支口 (3,4)是用于含抗原肽培養(yǎng)基10的注入和含IL-2培養(yǎng)基11、12的注入的兼用口?？?5用于移出誘導(dǎo)的抗原特異性CTL。除了口 5以外的所有的口是Luer鎖緊接口類型。口 2、3分支口(3、4)在未使用時安裝有帽6。符號7所示的是使用后的口(2、3、4)安裝的帽，與未使用時安裝的帽6顏色不同。在該例子中，帽6為藍(lán)色、帽7為無色透明。未使用時的口 5也安裝有帽8。培養(yǎng)用袋1的材質(zhì)是聚乙烯?？乖蔬f細(xì)胞制備用要素(圖2)的詳細(xì)內(nèi)容如下。培養(yǎng)用袋21·· 1個容納在Luer鎖緊接口注射器中的含抗⑶3抗體培養(yǎng)基30 (含有0. 01%人血清白蛋白和 2 μ g/mL 0KT-3 (抗 CD3 抗體)的 H印es 緩沖 RPMI1640) 5mL · · 1 瓶容納在Luer鎖緊接口注射器中的含IL-2培養(yǎng)基31(含有100IU/mL IL_2的H印es 緩沖 RPMI1640) IOmL · · 1 瓶容納在Luer鎖緊接口注射器中的含抗原肽培養(yǎng)基32 (含有0. 01%人血清白蛋白和 2 μ g/mL CMVpp65 (抗原肽)的 H印es 緩沖 RPMI1640) IOmL · · 1 瓶容納在Luer鎖緊接口注射器中的含IL-2培養(yǎng)基33(含有1000IU/mL IL-2的 ALyS505N ((株)細(xì)胞科學(xué)研究所))20mL · · 4瓶培養(yǎng)用袋21具備Luer鎖緊接口類型的口 22、Luer鎖緊接口類型的3分支口(23、 24)、塑料針用的口 25?？?22用于注入另外制備的外周血單核細(xì)胞。另外，3分支口(23、 24)是用于含抗CD3抗體培養(yǎng)基30的注入、含IL-2培養(yǎng)基(31、33)的注入、和含抗原肽培養(yǎng)基32的注入的兼用口?？?25用于移出制備的抗原呈遞細(xì)胞。除了口 25以外的所有的口是Luer鎖緊接口類型?？?22、3分支口(23、24)在未使用時安裝有帽26。符號27所示的是使用后的口(22、23、24)安裝的帽，與未使用時安裝的帽26顏色不同。在該例子中，帽 26為藍(lán)色、帽27為無色透明。未使用時的口 25也安裝有帽28。培養(yǎng)用袋21的材質(zhì)是聚乙火布ο抗原特異性CTL增殖用要素(圖3、4)的詳細(xì)內(nèi)容如下。分離用袋(41a、41b)· · 2 個容納在Luer鎖緊接口注射器中的含IL-2培養(yǎng)基50(含有100IU/mL IL_2的 ALyS505N ((株)細(xì)胞科學(xué)研究所))20mL · · 2瓶
培養(yǎng)用袋51·· 1個容納在Luer鎖緊接口注射器中的增殖用培養(yǎng)基61(含有1000IU/mL IL_2的 ALyS505N ((株)細(xì)胞科學(xué)研究所))20mL · · 3瓶分離用袋Gla、41b)具備通過管與塑料針連接的口 Gh、42b)、Luer鎖緊接口類型的2分支口 G3a、4;3b)、塑料針用的口 G^、44b)。分離用袋的一只41a用于分離誘導(dǎo)的抗原特異性CTL。該分離用袋中，口 4 用于移入誘導(dǎo)的抗原特異性CTL。2分支口 43a用于排液和含IL-2培養(yǎng)基50的注入?？?4 用于處理后的細(xì)胞的移出。另一方面，分離用袋41b用于分離制備的抗原呈遞細(xì)胞。該分離用袋中，口 42b用于移入制備的抗原呈遞細(xì)胞。2分支口 4 用于排液和含IL-2培養(yǎng)基50的注入。口 44b用于移出處理后的細(xì)胞。分離用袋Gla、41b)的材質(zhì)是聚乙烯。培養(yǎng)用袋51具備Luer鎖緊接口類型的口 52、Luer鎖緊接口類型的3分支口 53、 通過管與塑料針連接的2分支口 54、塑料針用的口 55?？?52用于注入另外制備的血漿。 另外，3分支口 53用于注入增殖用培養(yǎng)基61?？?M用于移入分離的抗原特異性CTL和抗原呈遞細(xì)胞?？陉栍糜谝瞥鲈鲋车目乖禺愋訡TL。口 52、3分支口 53在未使用時安裝有帽56。符號57所示的是使用后的口(52、53)安裝的帽，與未使用時安裝的帽56顏色不同。在該例子中，帽56為藍(lán)色、帽57為無色透明。未使用時的口 55也安裝有帽58。培養(yǎng)用袋51的材質(zhì)是聚乙烯。使用以上構(gòu)成的制備試劑盒，通過以下的工序來制備HLA-AM限制性CMV pp65抗原特異性CTL。各工序的詳情參照圖6 8進(jìn)行說明。(I)CTL誘導(dǎo)工序(圖6)(a)外周血單核細(xì)胞(PBMC)的分離使用加入有少量肝素的注射筒，從HLA-AM陽性健康人采取外周血50mL，用 Ficoll密度離心分離法分離PBMCGX IO7)。(b)血漿的采取分離PBMC時，采取血漿，在56°C加熱處理20分鐘后，以2500rpm離心處理10分鐘。(C) RPMI1640培養(yǎng)基中的PBMC的懸浮按照圖示，使用袋培養(yǎng)基(含有0.01%人血清白蛋白和10yg/mL慶大霉素(Y > 夕* > )的Ifepes緩沖RPMI1640培養(yǎng)基)清洗PBMC后，采取袋培養(yǎng)基4mL，與PBMC進(jìn)行懸浮。進(jìn)而，加入自體血漿ImL (PBMC濃度6 X 106/mL)。(d) CTL 的誘導(dǎo)使用Luer鎖緊接口注射器，將懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基的PBMC從口 2注入培養(yǎng)用袋1 (參照圖1)。接下來，將含抗原肽培養(yǎng)基10通過3分支口 3 (或3分支口 4)的任一口 注入培養(yǎng)用袋1后，將培養(yǎng)用袋1移到37°C、5% CO2的(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)(培養(yǎng)開始)。應(yīng)予說明，對于使用過一回的口，代替帽6安裝帽7，不會再次使用。2天后取出培養(yǎng)用袋1。接著，將含IL-2培養(yǎng)基11從3分支口 3 (或3分支口 4) 的任一口(其中，使用完的口除外)注入培養(yǎng)用袋1。在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5天后，將含IL-2 培養(yǎng)基12從3分支口 3 (或3分支口 4)的任一口(其中，使用完的口除外)注入培養(yǎng)用袋 1。然后，按照培養(yǎng)(3天)、含IL-2培養(yǎng)基12的注入、培養(yǎng)0天)、含IL-2培養(yǎng)基12的注入、和培養(yǎng)0天)的順序進(jìn)行。通過以上的操作，用從培養(yǎng)開始至14天(其中，PBMC和血漿的制備所需的時間除外)這樣短時間誘導(dǎo)了抗原特異性CTL。應(yīng)予說明，還可以將PBMC的制備時使用的備用培養(yǎng)基添在制備試劑盒中。對于 Ficoll分離所使用的管、PBMC的清洗所使用的管、PBMC的重懸所使用的管來說也相同。(2)抗原呈遞細(xì)胞的制備工序(圖7)(a) RPMI1640培養(yǎng)基中的PBMC的懸浮在(1)的(a)準(zhǔn)備的PBMC (0. 5mL)中添加袋培養(yǎng)基3. 6mL和自體血漿0. 9mL (PBMC 濃度 6X105/mL)。(b)抗原呈遞細(xì)胞的制備使用Luer鎖緊接口注射器，將懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基的PBMC從口 22注入培養(yǎng)用袋21 (參照圖2、。接下來，將含抗⑶3抗體培養(yǎng)基30通過3分支口 23 (或3分支口 24) 的任一口注入培養(yǎng)用袋21后，將培養(yǎng)用袋21移到37°C、5% CO2的(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)(培養(yǎng)開始)。應(yīng)予說明，對于使用過一回的口，代替帽沈安裝帽27，不會再次使用。2天后取出培養(yǎng)用袋21。接著，將含IL-2培養(yǎng)基31從3分支口 23(或3分支口 24)的任一口(其中，使用完的口除外)注入培養(yǎng)用袋21。在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天后，將含IL-2培養(yǎng)基33從3分支口 23(或3分支口 24)的任一口(其中，使用完的口除外)注入培養(yǎng)用袋21。然后，按照培養(yǎng)0天)、含IL-2培養(yǎng)基33的注入、培養(yǎng)0天)、含IL-2培養(yǎng)基33的注入、培養(yǎng)O天)、含IL-2培養(yǎng)基33的注入、和培養(yǎng)(1天)的順序進(jìn)行。通過以上的操作，用從培養(yǎng)開始至14天這樣短時間制備了抗原呈遞細(xì)胞。應(yīng)予說明，在該實施例中，將抗原呈遞細(xì)胞的制備工序(2)與CTL誘導(dǎo)工序(1) 一并進(jìn)行。因而，用合計14天 (其中，PBMC和血漿的制備所需的時間除外)得到了抗原特異性CTL和抗原呈遞細(xì)胞這兩者ο(c)對抗原呈遞細(xì)胞的肽脈沖將含抗原肽培養(yǎng)基32從3分支口 23(或3分支口 24)中任一口(其中，使用完的口除外)注入培養(yǎng)用袋21。然后，在室溫下孵育1小時。(3)抗原特異性CTL增殖工序(圖8)(a)抗原呈遞細(xì)胞與抗原特異性CTL的分離將與分離用袋41b的口 42b連接的塑料針插入培養(yǎng)用袋21的口 25，培養(yǎng)用袋21 的內(nèi)容物移到分離用袋41b(參照圖3)。關(guān)閉口 42b的夾子后(還可以將管用密封器等熔接)，將分離用袋41b供離心處理。以打開2分支口 4 的夾子的狀態(tài)擠壓袋，從2分支口的排液口 4 廢棄上清后，將含IL-2培養(yǎng)基50從2分支口的注入口 46b注入分離用袋41b 中。另一方面，將與分離用袋41a的口 4 連接的塑料針插入經(jīng)過上述工序(1)后的培養(yǎng)用袋1的口 5中，將培養(yǎng)用袋1的內(nèi)容物移到分離用袋41a后，進(jìn)行與上述操作相同的操作 (離心處理、排液、含IL-2培養(yǎng)基50的注入)。(b)抗原呈遞細(xì)胞與抗原特異性CTL的混合、培養(yǎng)將與培養(yǎng)用袋51的口 M連接的塑料針的其中一只59插入分離用袋41a的口 4 中，將分離用袋41a的內(nèi)容物移到培養(yǎng)用袋51 (參照圖3和4)。同樣地，將塑料針60插入分離用袋41b的口 44b中，將分離用袋41b的內(nèi)容物移到培養(yǎng)用袋51中。接下來，使用 Luer鎖緊接口注射器，將工序⑴的(b)準(zhǔn)備的自體血漿通過口 52注入培養(yǎng)用袋51中后，將培養(yǎng)用袋51移到37°C、5% CO2的(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)(培養(yǎng)開始)。1天后取出培養(yǎng)用袋51。 接著，將增殖用培養(yǎng)基61通過3分支口 53中任一口注入培養(yǎng)用袋51中。應(yīng)予說明，對于使用過一回的口，代替帽56安裝帽57，不會再次使用。在(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天后，將增殖用培養(yǎng)基61通過3分支口 53中任一口(其中，使用完的口除外)注入培養(yǎng)用袋51中。然后，按照培養(yǎng)O天)、增殖用培養(yǎng)基61的注入、和培養(yǎng)(1天)的順序進(jìn)行。通過以上的操作，用從工序⑴和⑵中的培養(yǎng)開始至21天這樣短時間得到了抗原特異性CTL。將得到的細(xì)胞供流式細(xì)胞儀分析。其結(jié)果，可知得到了純度74. 39%的HLA-AM限制性CMV pp65 抗原特異性CTL 3J6X108個(圖10)。即，盡管是21天(其中，PBMC和血漿的制備所需的時間除外)這樣短時間，但在高純度的抗原特異性CTL的制備上獲得了成功。從別的供體(3名)以同樣的方法嘗試了抗原特異性CTL的制備(圖11 圖14)。 對供體1名(HLA-AM陽性)在相同條件下制備了 2次(圖11、圖12)。只有圖14的例子的供體的HLA型(HLA-A2陽性)不同。如圖11 14所示，可以再現(xiàn)性良好地制備高純度的抗原特異性CTL。另外，所制備的抗原特異性CTL顯示了高細(xì)胞毒性(圖11下段右，圖 13下段右，圖14下段右)。將制備抗原特異性CTL后的操作的一個例子示于圖9。首先，利用培養(yǎng)用袋51的口陽將制備袋的內(nèi)容物(即抗原特異性CTL)分別注入到分離用袋(參照圖4)。該操作可以利用例如圖5所示的3分支管63來進(jìn)行。接著，離心分離后，廢棄上清(培養(yǎng)液)，注入凍結(jié)保存液(8%人血清白蛋白加CP-I (極東制藥工業(yè)株式會社)等)來懸浮細(xì)胞。接下來，將細(xì)胞懸液移入凍結(jié)保存用的袋，進(jìn)行凍結(jié)保存(例如-130°C -150°C)。使用時進(jìn)行融解，使用分離用袋(例如以分離用袋41為標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu))清洗細(xì)胞后，給患者輸注細(xì)胞。實施例2將本發(fā)明的實施例(含有凍結(jié)干燥抗原呈遞細(xì)胞的抗原特異性CTL制備試劑盒) 的構(gòu)成要素(構(gòu)成品)示于圖15 圖18。圖15表示抗原特異性CTL的誘導(dǎo)工序中使用的一套構(gòu)成要素(抗原特異性CTL誘導(dǎo)用要素)，圖16表示抗原呈遞細(xì)胞的制備工序中使用的一套構(gòu)成要素(抗原呈遞細(xì)胞制備用要素)，圖17和18表示抗原特異性CTL的增殖工序中使用的一套構(gòu)成要素(抗原特異性CTL增殖用要素)。應(yīng)予說明，對與實施例1相同的要素標(biāo)注相同的符號?？乖禺愋訡TL誘導(dǎo)用要素(圖15)的詳細(xì)內(nèi)容如下。應(yīng)予說明，各要素的構(gòu)成與實施例1的情況相同，因此省略其說明。培養(yǎng)用袋1 · · 1個容納在Luer鎖緊接口注射器中的含抗原肽培養(yǎng)基10(含有0. 01%人血清白蛋白和 2 μ g/mL CMVpp65 (抗原肽)的 H印es 緩沖 RPMI1640) 5mL · · 1 瓶容納在Luer鎖緊接口注射器中的含IL_2培養(yǎng)基11 (含有0. 01 %人血清白蛋白和 100IU/mL IL-2 的 H印es 緩沖 RPMI1640) IOmL · · 1 瓶容納在Luer鎖緊接口注射器中的含IL-2培養(yǎng)基12(含有100IU/mL IL_2的 ALyS505N ((株)細(xì)胞科學(xué)研究所))20mL · · 3瓶抗原呈遞細(xì)胞制備用要素(圖16)的詳細(xì)內(nèi)容如下。容納在容器(在該例子中是小瓶)中的凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞70 · · 1瓶使用根據(jù)目的具有抗原呈遞能力的抗原呈遞細(xì)胞。以下，表示凍結(jié)干燥的抗原呈遞細(xì)胞的制備方法的一個例子。應(yīng)予說明，作為抗原呈遞細(xì)胞一般使用樹突狀細(xì)胞，但這里將活性化T細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞來制備。(1)外周血單核細(xì)胞的分離使用加入有少量肝素的注射筒，從HLA-AM陽性健康人采取外周血。然后，用 Ficoll密度離心分離法分離外周血單核細(xì)胞。(2)培養(yǎng)開始用IOmL的RPMI1640清洗3次后，將外周血單核細(xì)胞重懸在IOmL的RPMI1640 (含有10%自體血漿和1 μ g/mL 0KT-3)中，使外周血單核細(xì)胞為4 X 105/mL，并注入培養(yǎng)袋中。 在(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)以37 °C開始培養(yǎng)。(3) IL-2 的添加2 天后，注入 IOmL 的 RPMI1640 (含有 1 μ g/mL 的 100IU/mL IL-2)，在 CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)(37°C )培養(yǎng)3天。G)ALyS505N(含有 1000IU/mL 的 IL-2)培養(yǎng)基的添加添加ALyS505N(含有1000IU/mL的IL-2)培養(yǎng)基20mL后，每隔3天加入 ALyS505N(含有1000IU/mL的IL-2)培養(yǎng)基(20mL)，并在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37 °C )培養(yǎng)9天 (總培養(yǎng)天數(shù)14天)。(5)細(xì)胞數(shù)的測定測定細(xì)胞數(shù)的結(jié)果，得到了 1.53X 108個的細(xì)胞。
(6) CD8O、⑶86 的檢測檢查細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，結(jié)果80%的細(xì)胞是⑶80陽性，85%的細(xì)胞是⑶86陽性 (結(jié)果未圖示)。(7)表位肽脈沖將上述制備的抗原呈遞細(xì)胞用PRMI1640重懸，使抗原呈遞細(xì)胞為2 X 106/mL，然后添加HLA-AM限制性CMV pp65抗原表位肽(QYDPVLAALF)，使其達(dá)到10 μ g/mL。在室溫下孵育30分鐘后，用IOmL的RPMI1640清洗3次。(8)凍結(jié)干燥將肽脈沖的細(xì)胞重懸于含有10%海藻糖的IS0T0N(注冊商標(biāo))111中，使細(xì)胞達(dá)到 2X 106/mL。按照ImL分別注入到凍結(jié)干燥用小瓶中后，以圖19所示的條件實施凍結(jié)干燥?？乖禺愋訡TL增殖用要素(圖17、18)的詳細(xì)內(nèi)容如下。應(yīng)予說明，各要素的構(gòu)成與實施例1的情況相同，因此省略其說明。分離用袋41a · · 1個容納在Luer鎖緊接口注射器中的含IL-2培養(yǎng)基50(含有100IU/mL IL_2的 ALyS505N ((株)細(xì)胞科學(xué)研究所))20mL · · 1瓶培養(yǎng)用袋71 · · 1個容納在Luer鎖緊接口注射器中的增殖用培養(yǎng)基61 (含有1000IU/mL的IL_2的 ALyS505N ((株)細(xì)胞科學(xué)研究所))20mL · · 3瓶培養(yǎng)用袋71具備2個Luer鎖緊接口類型的52。一只用于注入另外制備的血漿， 另一只用于注入抗原呈遞細(xì)胞。另一方面，通過管連接有塑料針的口 72是分離的抗原特異性CTL的移入用口。
在使用該實施例的抗原特異性CTL制備試劑盒時，使用抗原特異性CTL誘導(dǎo)用要素誘導(dǎo)抗原特異性CTL的同時，使用抗原呈遞細(xì)胞制備用要素來重構(gòu)抗原呈遞細(xì)胞。將這樣得到的2種細(xì)胞在抗原特異性CTL增殖用要素的培養(yǎng)用袋71內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)，得到了目標(biāo)抗原特異性CTL。再者，抗原呈遞細(xì)胞的制備(重構(gòu))例如如下進(jìn)行。(1)去離子水的添加在小瓶70中加入ImL的去離子水，在室溫下放置5分鐘。(2)清洗移到裝入有ImL的RPMI 1640(0. 05% HSA)的15mL離心管中，以1200rpm在室溫下離心10分鐘。吸除上清后，添加ImL的RPMI1640 (5%自體血漿)，使細(xì)胞懸浮。產(chǎn)業(yè)上的利用可能性作為目標(biāo)的抗原特異性CTL的制備所需要的時間當(dāng)然對治療目的、患者的狀態(tài)等造成影響，但使用本發(fā)明的試劑盒，則利用分離的外周血單核細(xì)胞可以用大概20天 2月左右制備治療所需量的抗原特異性CTL。該發(fā)明并不受到上述發(fā)明的實施方式和實施例的說明的任何限制。在不超出所要求保護(hù)的范圍的記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易想到的范圍的各種變形方式也包含在該發(fā)明中。本說明書中明示的論文、公開專利公報和專利公報等內(nèi)容通過將其所有內(nèi)容援引來引用。符號說明1培養(yǎng)用袋2 Luer 鎖緊接口3、4 3分支Luer鎖緊接口5移出用口6、7、8 帽10含抗原肽培養(yǎng)基(5mL)11 含 IL-2 培養(yǎng)基(IOmL)12 含 IL-2 培養(yǎng)基(20mL)21培養(yǎng)用袋22 Luer 鎖緊接口23、24 3 分支 Luer 鎖緊接口25移出用口26、27、28 帽30含抗CD3抗體培養(yǎng)基(5mL)31 含 IL-2 培養(yǎng)基(IOmL)32含抗原肽培養(yǎng)基(IOmL)33 含 IL-2 培養(yǎng)基(20mL)41a、41b 分離用袋42a,42b 移入用口43a,43b 2 分支 Luer 鎖緊接口
24
44a、44b 移出用口50含IL-2培養(yǎng)基51培養(yǎng)用袋61增殖用培養(yǎng)基62移入·移出用管63分注用3分支管70小瓶(含有凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞)
權(quán)利要求
1.一種制備試劑盒，其特征在于，是用于抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞制備方法的制備試劑盒，所述抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞制備方法包括誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第1工序；制備抗原呈遞用活化T細(xì)胞的第2工序；和使用通過所述第1工序誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞和通過所述第2工序制備的抗原呈遞用活化T細(xì)胞，使抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖的第3工序；作為用于所述第1工序的構(gòu)成要素，具備(1-1)容納在注入容器中的含抗原肽培養(yǎng)基，(1-2)至少2個容納在注入容器中的含IL-2培養(yǎng)基，和(1-3)密封型培養(yǎng)容器，具備用于注入另外制備的外周血單核細(xì)胞的第1 口，用于注入所述含抗原肽培養(yǎng)基的第2 口，與所述含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入所述含IL-2培養(yǎng)基的第3 口，和用于移出誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第4 口 ； 作為用于所述第2工序的構(gòu)成要素，具備 (2-1)容納在注入容器中的含抗CD3抗體培養(yǎng)基， (2-2)至少2個容納在注入容器中的含IL-2培養(yǎng)基， (2-3)容納在注入容器中的含抗原肽培養(yǎng)基，和(2-4)密封型培養(yǎng)容器，具備用于注入另外制備的外周血單核細(xì)胞的第1 口，用于注入所述含抗CD3抗體培養(yǎng)基的第2 口，與所述含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入所述含IL-2培養(yǎng)基的第3 口，用于注入所述含抗原肽培養(yǎng)基的第4 口，和用于移出制備的抗原呈遞用活化T細(xì)胞的第5 口 ；作為用于所述第3工序的構(gòu)成要素，具備(3-1)容納在注入容器中的用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基， (3-2)容納在注入容器中的用于分離抗原呈遞用活化T細(xì)胞的培養(yǎng)基， (3-3)第1密封型分離容器，具備用于移入誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第 1 口，排液用的第2 口，用于注入所述用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基的第3 口，和用于移出分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第4 口，(3-4)第2密封型分離容器，具備用于移入制備的抗原呈遞用活化T細(xì)胞的第1 口， 排液用的第2 口，用于注入所述用于分離抗原呈遞用活化T細(xì)胞的培養(yǎng)基的第3 口，和用于移出分離后的抗原呈遞用活化T細(xì)胞的第4 口，(3-5)至少2個容納在注入容器中的增殖用培養(yǎng)基，所述增殖用培養(yǎng)基含有IL-2或 IL-15或這兩者，和(3-6)密封型培養(yǎng)容器，具備用于移入分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第1 口，用于移入分離后的抗原呈遞細(xì)胞的第2 口，用于注入另外制備的血清或血漿的第3 口， 與所述增殖用培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入所述增殖用培養(yǎng)基的第4 口，和用于移出增殖的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第5 口。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備試劑盒，其中，所述(1-2)的含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量為3 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備試劑盒，其中，所述(2-2)的含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量為3 6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項所述的制備試劑盒，其中，所述(3-1)的用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基和所述(3-2)的用于分離抗原呈遞用活化T細(xì)胞的培養(yǎng)基是含IL-2培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項所述的制備試劑盒，其中，對于所述(1- 的密封型培養(yǎng)容器的第1 口 第3 口、所述(2-4)的密封型培養(yǎng)容器的第1 口 第4 口、以及所述(3-6) 的密封型培養(yǎng)容器的第3 口和第4 口而言分別具備2種帽，該2種帽包括未使用時安裝的帽和使用后安裝的帽，所述使用后安裝的帽可與未使用時安裝的帽辨別開。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項所述的制備試劑盒，其中，所述(1-3)的密封型培養(yǎng)容器的第3 口、所述0-4)的密封型培養(yǎng)容器的第3 口、和所述(3-6)的密封型培養(yǎng)容器的第 4 口分別為分支型口。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項所述的制備試劑盒，其中，所述(1-3)的密封型培養(yǎng)容器、所述(2-4)的密封型培養(yǎng)容器、和所述(3-6)的密封型培養(yǎng)容器分別具備預(yù)備用口。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項所述的制備試劑盒，其中，還具備容納在容器中的用于制備外周血單核細(xì)胞的培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備試劑盒，其中，還具備用于制備外周血單核細(xì)胞的容器。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項所述的制備試劑盒，其中，還具備用于分離通過第3 工序增殖的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的分離容器。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備試劑盒，其中，還具備用于凍結(jié)保存使用所述分離容器分離的細(xì)胞的保存容器。
12.—種制備試劑盒，其特征在于，是用于抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞制備方法的制備試劑，所述抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞制備方法包括誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第 1工序；制備抗原呈遞細(xì)胞的第2工序；和使用通過所述第1工序誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞和通過所述第2工序制備的抗原呈遞細(xì)胞，使抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖的第3工序；作為用于所述第1工序的構(gòu)成要素，具備(1-1)容納在注入容器中的含抗原肽培養(yǎng)基，(1-2)至少2個容納在注入容器中的含IL-2培養(yǎng)基，和(1-3)密封型培養(yǎng)容器，具備用于注入另外制備的外周血單核細(xì)胞的第1 口，用于注入所述含抗原肽培養(yǎng)基的第2 口，與所述含IL-2培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入所述含IL-2培養(yǎng)基的第3 口，和用于移出誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第4 口 ；作為用于所述第2工序的構(gòu)成要素，具備容納在容器中的凍結(jié)干燥狀態(tài)的抗原呈遞細(xì)胞；作為用于所述第3工序的構(gòu)成要素，具備(3-1)容納在注入容器中的用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基，(3-2)第1密封型分離容器，具備用于移入誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第 1 口，排液用的第2 口，用于注入所述用于分離抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的培養(yǎng)基的第3 口，和用于移出分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第4 口，(3-3)至少2個容納在注入容器中的增殖用培養(yǎng)基，所述增殖用培養(yǎng)基含有IL-2或 IL-15或這兩者，和(3-4)密封型培養(yǎng)容器，具備用于移入分離后的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第1口，用于移入制備的抗原呈遞細(xì)胞的第2 口，用于注入另外制備的血清或血漿的第3 口，與所述增殖用培養(yǎng)基的數(shù)量至少是相同數(shù)量的、用于注入所述增殖用培養(yǎng)基的第4 口，和用于移出增殖的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第5 口。
13. 一種抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1 12中任一項所述的制備試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明的課題是謀求抗原特異性CTL的制備中的操作性、經(jīng)濟(jì)性和安全性的進(jìn)一步的改善。本發(fā)明提供用于抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞制備方法的制備試劑盒，其中，作為誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的第1工序用的要素，具備容納在注入容器的培養(yǎng)基、密封型培養(yǎng)容器等；作為制備抗原呈遞用活化T細(xì)胞的第2工序用的要素，具備容納在注入容器的培養(yǎng)基、密封型培養(yǎng)容器等；作為使抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖的第3工序用的要素，具備容納在注入容器的培養(yǎng)基、密封型分離用容器、密封型培養(yǎng)容器等。
文檔編號C12M3/02GK102203240SQ200980143470
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者小島勢二, 直江知樹, 鈴木進(jìn) 申請人:國立大學(xué)法人名古屋大學(xué), 株式會社醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所, 株式會社淋巴細(xì)胞技術(shù)