專利名稱：具有乙二醛酶iii活性的多肽、編碼所述多肽的多核苷酸及它們的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的多肽、具有編碼所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸及它們的 用途，所述多肽具有在單一步驟中將甲基乙二醛(methylglyoxal)轉(zhuǎn)化成乳酸的酶活性 (稱為乙二醛酶III活性)。更具體而言，本發(fā)明涉及通過改變編碼所述多肽的多核苷酸的表達水平來調(diào)控 (modulate)微生物中的乙二醛酶III活性。本發(fā)明還涉及通過發(fā)酵微生物(其中它們的乙二醛酶III活性受到調(diào)控)來生產(chǎn) 商品化學品(commodity chemicals)，特別是1，2-丙二醇、丙酮醇和乳酸。
現(xiàn)有技術對葡萄糖的分解代謝可以在數(shù)種微生物中導致乳酸(lactate)形成(一般在發(fā) 酵條件下)。取決于生物體可以形成D-或L-乳酸D-乳酸在混合酸發(fā)酵過程中在大腸桿 菌(E. coli)中與其它產(chǎn)物一起形成，而D-或L-乳酸可以通過乳酸細菌的發(fā)酵來生成。生 成途徑源自從葡萄糖生成丙酮酸的糖酵解途徑。丙酮酸(pyruvate)可以通過單一反應由 可溶性乳酸脫氫酶還原成乳酸，所述可溶性乳酸脫氫酶依賴于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷 酸(NADH)作為輔因子。在大腸桿菌中，由IdhA基因編碼的乳酸脫氫酶對D-乳酸是特異 性的(Clark，1997)。在乳酸細菌中，可找到對D-或L-乳酸特異性的乳酸脫氫酶(對于 德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)為 D-乳酸，對于瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)為 L-乳酸，參見例如 Garvie, 1980)。在數(shù)種生物體中，另一種途徑可以負責乳酸生成。此途徑稱作甲基乙二醛旁路， 因為它能充當糖酵解途徑下游部分的備選，將丙糖甘油醛-3-磷酸(GA3P)轉(zhuǎn)化成丙酮酸 (Cooper, 1984)。甲基乙二醛旁路起始于通過切割果糖_1，6- 二磷酸產(chǎn)生的第二個磷酸丙 糖，即二羥丙酮磷酸(DHAP)。DHAP由甲基乙二醛合酶轉(zhuǎn)化成甲基乙二醛(MG)。然后MG (其 是一種對細胞有毒的化合物)由不同系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成D-或L-乳酸，并且所產(chǎn)生的乳酸可以由 D-或L-乳酸脫氫酶進一步轉(zhuǎn)化成丙酮酸。與發(fā)酵性乳酸脫氫酶相比，這些酶是僅在需氧條 件下激活的黃素連接的膜結(jié)合蛋白(GarVie，1980)。D-和L-乳酸脫氫酶在大腸桿菌中分 別由 did 和 IldD (或 IctD)基因編碼(Rule 等，1985，Dong 等，1993)。已經(jīng)在細菌中研究了甲基乙二醛的分解代謝路徑(Ferguson等，1998)以理解對 此化合物的解毒，而且也為了生成1，2_丙二醇。已經(jīng)在大腸桿菌中鑒定出三種途徑，它們 可以導致從甲基乙二醛生成乳酸-第一種途徑是谷胱甘肽依賴性乙二醛酶I-II系統(tǒng)(由gloA和gloB基因編碼)， 其在兩個步驟中將甲基乙二醛轉(zhuǎn)化成D-乳酸。-第二種是不依賴于谷胱甘肽的乙二醛酶III酶，其在一個步驟中催化甲基乙二 醛向D-乳酸的轉(zhuǎn)化。_第三種系統(tǒng)是甲基乙二醛還原酶對甲基乙二醛的降解，產(chǎn)生丙酮醇或D-或L-乳
4醛(Iactaldehyde)?？梢酝ㄟ^醛脫氫酶的作用(例如通過由aldA或aldB基因編碼的酶) 將L-乳醛進一步轉(zhuǎn)化成L-乳酸(Grabar等，2006)。乙二醛酶III系統(tǒng)不如乙二醛酶I-II系統(tǒng)研究得廣泛。酶乙二醛酶III是由 Misra等于1995年在大腸桿菌中首次提及并純化。此酶與乙二醛酶I顯著不同，因為它具 有不同的特性，而且能夠在單一步驟中催化甲基乙二醛轉(zhuǎn)化為D-乳酸，這不依賴于谷胱甘 肽。隨后,這種酶在數(shù)個報道中提及(MacLean等，1998，Okado-Matsumoto和Fridovich， 2000,Benov等2004)具有比大腸桿菌中的乙二醛酶I或乙二醛酶II更高的活性。在此之 前，還沒有確定乙二醛酶III的氨基酸序列，而且編碼此酶的基因是未知的。1，2_丙二醇或丙二醇(即C3 二醇)是一種廣泛使用的化學品。它是不飽和聚酯 類樹脂、液體洗滌劑、冷卻劑、航空器防凍和消冰液的成分。自1993-1994年以后，已經(jīng)越 來越多地使用丙二醇作為乙烯衍生物的替代，所述乙烯衍生物被認為比丙烯衍生物更具毒 性。目前，通過使用消耗大量水的環(huán)氧丙烷水合過程的化學手段來生成1，2_丙二醇。 可以通過兩種方法之任一種來生成環(huán)氧丙烷(一種使用表氯醇，而另一種使用氫過氧化物 來實現(xiàn))。兩種路徑都使用高毒性物質(zhì)。另外，氫過氧化物路徑產(chǎn)生副產(chǎn)物，如叔丁醇和 1-苯乙醇。為了產(chǎn)生要有利可圖的丙烯，必須為這些副產(chǎn)物找到用途。化學路徑一般產(chǎn)生 外消旋1，2-丙二醇，而兩種立體異構體(R)l，2-丙二醇和(S) 1，2-丙二醇之每一種是某些 應用感興趣的(例如特種化學品和藥物產(chǎn)品的手性起始材料)。丙酮醇或羥丙酮(1-羥基-2-丙酮)是一種C3酮醇。這種產(chǎn)品在紡織工業(yè)的甕 染過程中用作還原劑。它可以有利地替換傳統(tǒng)的含硫還原劑以降低廢水中的硫含量(其對 環(huán)境有害)。丙酮醇還是化學工業(yè)的起始材料，用于例如制備多元醇或雜環(huán)分子。它還擁有 令人感興趣的螯合和溶劑特性。目前，丙酮醇主要是通過對1，2_丙二醇的催化氧化或脫水產(chǎn)生的?，F(xiàn)在提出了新 的方法，其起始于可再生原料，如甘油(參見DE4128692和W02005/095536)。目前，通過化 學方法得到的丙酮醇的生產(chǎn)成本縮小了其工業(yè)應用和市場。用于產(chǎn)生1，2_丙二醇和丙酮醇的化學方法的缺點使生物合成成為有吸引力的備 選。僅在經(jīng)濟上可行的生物學路徑利用一些微生物中存在的1，2_丙二醇自常見糖類(例 如葡萄糖或木糖)的天然生成途徑。經(jīng)由糖酵解途徑，接著為甲基乙二醛旁路來代謝葡萄 糖，并且MG可以還原成乳醛或丙酮醇。然后，這兩種化合物可以經(jīng)歷第二個還原反應，產(chǎn) 生1，2_丙二醇。(R)-1，2-丙二醇的天然生產(chǎn)者，如楔形梭菌(Clostridium sphenoides) 禾口熱角軍糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermosaccharoIyticum)使用此路徑。已 經(jīng)在磷酸鹽受限的條件下使用楔形梭菌以1.58g/l的效價產(chǎn)生1，2-丙二醇(Tran Din 和Gottschalk，1985)。也已經(jīng)研究了熱解糖熱厭氧桿菌的1，2_丙二醇生成(Cameron和 Cooney，1986，Sanchez-Rivera等，1987)。所獲得的最佳性能是9g/l的效價和0. 2g/g自 葡萄糖的得率。然而，以這些生物體獲得的性能改進可能是有限的，這是由于缺乏可用的 遺傳工具。相同的合成路徑在大腸桿菌中是有功能的，并且Cameron小組(Cameron等， 1998，Altaras 禾口 Cameron, 1999，Altaras 禾口 Cameron, 2000)禾口 Bennett 小組(Huang 等， 1999，Berrios-Rivera等，2003)已經(jīng)完成了對此生物體中生成1，2-丙二醇的數(shù)項研究。 Cameron小組獲得的最佳結(jié)果是厭氧燒瓶培養(yǎng)中1. 4g/l 1，2-丙二醇的產(chǎn)量，得率為0. 2g/g所消耗的葡萄糖。當外推至厭氧補料-分批發(fā)酵罐時，產(chǎn)量是4. 5g/l 1，2-丙二醇，自葡 萄糖的得率為0. 19g/g，這遠離Cameron等的理論評估。用相同方法獲得但具有較低效價和 得率的結(jié)果也記載于專利US 6，087，140、US 6，303，352和WO 98/37204。Bennett小組在 厭氧條件下在燒瓶培養(yǎng)中獲得類似的結(jié)果，其中效價為1. 3g/l且得率為0. 12g/g，而微氧 (microaerobic)培養(yǎng)物給出1. 4g/l的效價和0. 13g/g的得率。用于獲得生成1，2-丙二醇和/或丙酮醇的菌株的備選方法是使“初始菌株”的進 化朝向這樣的狀態(tài)，其中“進化的菌株”生成具有更好特征的想要的化合物。用于獲得微生 物的“進化的菌株”以生成1，2_丙二醇的這種方法記載于專利申請WO 2005/073364。優(yōu)先 在厭氧條件下進行這種進化過程和其后的發(fā)酵步驟。此技術是一項明顯超過現(xiàn)有技術的改 進。獲得1.8g/l的1，2_丙二醇效價和0.35g/g所消耗葡萄糖的得率。此方法的改進記載 于專利申請WO 2008/116852和WO 2008/116849，其中此外還修飾根據(jù)上文所描述的方法 獲得的進化的菌株以分別獲得更好的1，2-丙二醇生產(chǎn)者或更好的丙酮醇生產(chǎn)者。憑借此 類方法，可以獲得比Imol 1，2-丙二醇每mol所消耗的葡萄糖(0. 42g/g)更高的得率?？?以通過菌株建造策略來獲得相同的性能，所述菌株建造策略僅依賴于理性代謝工程，如記 載于WO 2008/116848 (對于生成1，2-丙二醇)或WO 2008/116851 (對于生成丙酮醇)。D-或L-乳酸表現(xiàn)為1，2_丙二醇生成過程的常見污染物。競爭途徑已經(jīng)被鑒定為 發(fā)酵性乳酸脫氫酶途徑和乙二醛酶I-乙二醛酶II途徑。已經(jīng)經(jīng)由大腸桿菌中IdhA基因 的缺失(Berrios-Rivera等，2003)或大腸桿菌中IdhA和gloA基因兩者的缺失(Altaras 和CamerondOOO)來靶向這些途徑，并且1，2-丙二醇自葡萄糖的得率顯示相應地升高。WO 2005/073364中已經(jīng)通過除IdhA和gloA基因外aldA和aldB基因的缺失來消除經(jīng)由氧化 L-乳醛來產(chǎn)生L-乳酸的另一種途徑。然而，即使憑借這4個缺失，在某些條件下仍生成乳 酸。乙二醛酶III表現(xiàn)為負責這種生成，影響1，2-丙二醇生成過程的得率和選擇性兩者。乳酸或乳酸鹽及其衍生物在食物、藥物、皮革和紡織品工業(yè)中具有廣泛的應用。近 來，已經(jīng)開發(fā)出聚乳酸(PLA)作為可再生的、可生物降解的且環(huán)境友好的塑料，并且因此， 預期對乳酸的需求擴大?？梢酝ㄟ^化學合成或者通過生物學方法來生成乳酸。然而，僅生 物學方法能產(chǎn)生想要的立體異構體，即具有高光學純度的D-或L-乳酸，這是其許多最終用 途的重要特性?？梢酝ㄟ^操作手性物質(zhì)(即D-和L-乳酸)的比率來控制PLA的物理特性 和生物降解率。因此，用于生成光學純的D-和L-乳酸的生物學方法的可用性是高質(zhì)量聚 合物合成的前提。乳酸細菌是乳酸的天然生產(chǎn)者，并且可以發(fā)現(xiàn)一些對于D-或L-形式是特異性的。 傳統(tǒng)上，已經(jīng)使用這些細菌來生成乳酸作為特種化學品(例如在US2004/0005677中)。然 而，隨著乳酸鹽作為用于PLA合成的商品化學品的出現(xiàn)，需要更有效且成本集約的方法。研 究了能夠在礦物鹽培養(yǎng)基中生長并能夠使用不同糖底物范圍的備選生物催化劑。酵母和大 腸桿菌組合了這些特征及用于代謝工程的廣泛遺傳工具的可用性。用于生成乳酸的這些催 化劑的用途已經(jīng)記載于WO 03102201、WO 03102152和US 2005/0112737 (對于酵母菌株) 及EP 1760156和WO 2005/033324 (對于大腸桿菌菌株)。微生物中的D-或L-乳酸合成依賴于NADH依賴性乳酸脫氫酶還原通過糖分解 代謝產(chǎn)生的丙酮酸。一般在厭氧下達到有效轉(zhuǎn)化的條件，其中大量NADH輔因子是可用 的?？梢詫θ樗峒毦x擇產(chǎn)生乳酸作為唯一發(fā)酵產(chǎn)物的同型發(fā)酵代謝(homofermentativemetabolism)。用酵母或大腸桿菌的情況不是這樣，并且必須除去其它發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇、乙 酸、甲酸或琥珀酸。這可以通過缺失相應基因的基因工程來實現(xiàn)。在近年來，已經(jīng)研究了用于生成光學純的D-乳酸的大腸桿菌的代謝工程。Chang 等(1999)使用乙酸生成途徑中缺陷的pta突變體，而且顯示了可以通過使用天然的乳酸 脫氫酶來使碳流量重定向于D-乳酸生成。然而，碳流量的一部分仍轉(zhuǎn)向副產(chǎn)物(特別是 琥珀酸)的合成。Zhou等(2003a)已經(jīng)開發(fā)出改善的生物催化劑，其中使編碼乙酸激酶 (ackA)、延胡索酸還原酶(frdABCD)、醇/醛脫氫酶(adhE)和丙酮酸甲酸裂合酶(pflAB) 的基因失活以分別阻止乙酸、琥珀酸、乙醇和甲酸的合成。這些修飾產(chǎn)生如下的菌株，其能 夠生成具有98%化學純度和超過99%光學純度的D-乳酸。同一作者(Chang等，1999， Zhou等，2003b)和Dien等(2001)已經(jīng)使用相同的方法來工程化改造大腸桿菌以生成 L-乳酸，其通過另外用來自另一種生物體(干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、牛鏈球菌 (Streptococcus bovis)或乳酸片球菌(Pediococccus acidilactici))且對 L-乳酸的生 成特異性的乳酸脫氫酶基因替換IdhA基因來實現(xiàn)。對于具有ackA、frdAB⑶、adhE和pflAB 基因缺失的菌株，Zhou等(2003b)報告了具有98%化學純度和超過99%光學純度的L-乳 酸的生成。此類策略也記載于EP 1760156。在由Ingram小組開發(fā)的D-和L-乳酸生產(chǎn)者中(Zhou等，2003a和b)，在為更好 的乳酸鹽生成開發(fā)菌株過程中觀察到弱手性污染。顯示了這種污染來自甲基乙二醛旁路中 D-或L-乳酸的生成(Grabar等，2006)，如上文所討論的。可以通過工程化改造具有mgsA 基因缺失的菌株來防止這種污染。此工作突出顯示了甲基乙二醛旁路作為乳酸生成的備選 的非發(fā)酵途徑。目前還沒有使用這種備選生成途徑來建造用于生成乳酸的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種具有乙二醛酶III酶活性的分離的多肽、其片段或同源序列，所 述多肽包含SEQ ID NO 1的序列。本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，其包含編碼所述多肽的序列。發(fā)明人報告了來自 大腸桿菌的編碼具有乙二醛酶III活性的蛋白質(zhì)的基因的鑒定。此基因先前被稱為yedU 基因(又稱為hchA)，其編碼Hsp31，即一種同二聚體蛋白質(zhì)(Sastry等，2002)。隨后已經(jīng) 將此蛋白質(zhì)純化、結(jié)晶，而且其結(jié)構被不同小組解析(Lee等，2003，Quigley等，2003和Zhao 等，2003)。已經(jīng)將數(shù)種功能與Hsp31聯(lián)系起來在管理蛋白質(zhì)錯折疊中有活性的分子伴侶 (Malki等，2003)、寬特異性的氨肽酶(Malki等，2005)和與2-His_l-羧酸鹽基序有關的另 一種潛在功能，所述2-His-l-羧酸鹽基序能夠螯合金屬離子，而且存在于數(shù)種加雙氧酶和 羥化酶中(Zhao等，2003)。文獻中還從未報告Hsp31與乙二醛酶III活性相關。此外，本發(fā)明涉及一種包含所述多核苷酸的表達盒及包含所述盒或所述多核苷酸 的轉(zhuǎn)化載體，所述多核苷酸在宿主細胞中有功能的調(diào)節(jié)元件的控制下。本發(fā)明還提供了一種經(jīng)修飾的微生物，其具有經(jīng)調(diào)控的乙二醛酶III酶活性，其 中本發(fā)明的多核苷酸的活性是減弱或增強的。本發(fā)明的一個目的是使用編碼來自大腸桿菌的乙二醛酶III蛋白的基因的新知 識來設計具有減弱的乙二醛酶III酶活性的微生物。此微生物能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化成1，2-丙 二醇或丙酮醇，與已經(jīng)知道的方法相比具有改善的得率和更好的選擇性(即較少的副產(chǎn) 物)。
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在本發(fā)明的某些實施方案中，對具有減弱的乙二醛酶III活性的根據(jù)本發(fā)明的微 生物進一步修飾以提高1，2_丙二醇和/或丙酮醇的產(chǎn)量。另外，提供了一種用于制備1， 2-丙二醇和/或丙酮醇的方法，其中在合適的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，并回收1， 2_丙二醇和/或丙酮醇。本發(fā)明的目的還在于使用編碼來自大腸桿菌的乙二醛酶III蛋白的基因的新知 識來設計對生成乳酸有用的微生物。編碼乙二醛酶III的所述基因的過表達提供了能夠在 完全需氧條件下生成乳酸的菌株，因此提高所述方法的生產(chǎn)力。提供了一種用于制備乳酸 的方法，其中在合適的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，并回收乳酸。本發(fā)明還涉及一種用于在微生物中調(diào)控乙二醛酶III酶活性的方法，其中在所述 微生物中增強或減弱本發(fā)明的多肽的活性。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種具有乙二醛酶III酶活性的分離的多肽、其片段或同源序列，所 述分離的多肽包含SEQ ID N0 1的序列。如本文中所使用的，下列術語可以用于解釋權利要求書和說明書。根據(jù)本發(fā)明，術語“多肽”指包含用肽鍵連接的兩個或更多個氨基酸的序列的肽或 蛋白質(zhì)。術語“分離的”指從至少一種與其天然相關的成分取出的蛋白質(zhì)或DNA序列。術語“乙二醛酶III”指負責在單一步驟中催化甲基乙二醛向D-乳酸轉(zhuǎn)化的酶活 性的肽。Misra等(1995)在大腸桿菌中描述了此類酶活性，并提供了用于測量這種酶活性 的方法。術語“酶活性”和“酶促活性”可互換使用，指酶催化特定化學反應的能力，例如對 于乙二醛酶III酶活性為甲基乙二醛到D-乳酸的轉(zhuǎn)化。可以從具有乙二醛酶III活性的微生物獲得本發(fā)明的分離的多肽，例如通過使用 純化方法來實現(xiàn)，如下列實施例中所描述的。可以用于分離多肽的微生物包括但不限于大 腸桿菌。術語“包含SEQ ID N° 1的序列”意味著多肽的氨基酸序列可以不嚴格限于SEQ ID N。1，但可以含有別的氨基酸。術語“SEQ ID N° 1的片段”意味著多肽的序列可以包 含比SEQ ID N0 1少的氨基酸，但是仍包含足以賦予乙二醛酶III活性的氨基酸。本領域 中公知的是，可以通過取代、插入、缺失和/或添加一個或多個氨基酸同時保留其酶活性來 修飾多肽。例如，用化學等同的氨基酸取代給定位置處的一個氨基酸是常見的，所述取代不 影響蛋白質(zhì)的功能特性。出于本發(fā)明的目的，取代定義為下組之一內(nèi)的交換■小的脂肪族的、非極性或微極性殘基Ala、Ser, Thr, Pro, Gly■極性、帶負電荷的殘基及它們的酰胺ASp、ASn、Glu、Gln■極性、帶正電荷的殘基HiS、Arg、LyS■大的脂肪族的、非極性殘基Met、Leu、lie, Val, Cys■大的芳香族殘基Phe、Tyr、Trp0如此，可以預期導致用一個帶負電荷的殘基取代另一個(如谷氨酸取代天冬氨 酸)或用一個帶正電荷的殘基取代另一個(如賴氨酸取代精氨酸)的變化產(chǎn)生功能上等同 的產(chǎn)物。
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對氨基酸進行修飾的位置和氨基酸序列中進行修飾的氨基酸數(shù)目沒有特別限制。 本領域技術人員能夠識別可引入而不影響蛋白質(zhì)活性的修飾。例如，預期蛋白質(zhì)的N或C 端部分中的修飾不會改變蛋白質(zhì)的活性。術語“同源的”指進行修飾(如上文所定義)而仍保留初始酶活性的多肽。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本發(fā)明的多肽與SEQ ID N0 1的序列具有至 少70%同一性，優(yōu)選至少80%同一性，并且更優(yōu)選至少90%同一性。用于測定兩種蛋白質(zhì)序列之間的同一性百分比的方法是本領域技術人員已知 的。例如，它可以在序列比對后進行，所述比對通過使用網(wǎng)站http://www. ebi.ac.uk/ clustalw/上可獲得的軟件CLUSTALW，用網(wǎng)站上指明的缺省參數(shù)來進行。自所述比對，可以 容易地通過與殘基的總數(shù)相比記錄同一位置上相同殘基的數(shù)目來進行同一性百分比計算。 或者，可以通過使用例如網(wǎng)站http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/上可獲得的BLAST程 序用網(wǎng)站上指明的缺省參數(shù)來進行自動計算。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，多肽包含至少100個來自SEQ IDN° 1序列的 鄰接氨基酸，優(yōu)選SEQ ID N0 1中所顯示序列的至少150、至少200、至少250或更優(yōu)選至少 280個連續(xù)的氨基酸。在本發(fā)明的另一個實施方案中，多肽具有與SEQ ID N0 1的序列嚴 格相同的多肽序列。本發(fā)明還涉及一種多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明的多肽的序列。術語“多核苷酸”指單鏈或雙鏈的核糖核苷酸的聚合物(或RNA)或脫氧核糖核苷 酸的聚合物(或DNA)，其任選含有合成的、非天然的、或改變過的核苷酸堿基。DNA形式的 分離的多核苷酸可以含有合成的DNA、基因組DNA或cDNA的一個或多個區(qū)段。多核苷酸的起源不必是最初測量酶活性的生物體。本領域技術人員可以使用在不 同嚴格條件下與包含SEQ ID N0 2的核苷酸序列的探針雜交來對基因文庫篩選此類多核苷 酸。用于雜交的詳細方案參見Sambrook等(1989)?？梢允褂美缟衔乃x的BLAST程序并搜索與SEQ ID N0 2的核苷酸序列的同 源性來從數(shù)據(jù)庫提取此類多核苷酸的序列。本發(fā)明優(yōu)選的多核苷酸是與SEQ ID N0 2的核苷酸序列至少80%相同的多核苷 酸。本發(fā)明更優(yōu)選的多核苷酸是與SEQ ID N0 2的核苷酸序列至少90%相同的多核苷酸。 本發(fā)明的甚至更優(yōu)選的多核苷酸是與SEQ ID N0 2的核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸。特別地，本發(fā)明中包括包含SEQ ID N。2的核苷酸序列的多核苷酸。術語“編碼”指多核苷酸經(jīng)由轉(zhuǎn)錄和翻譯機制生成氨基酸序列的過程。此過程被遺 傳密碼所容許，所述遺傳密碼是DNA中堿基序列與蛋白質(zhì)中氨基酸序列之間的關系。遺傳 密碼的一個主要特征是要為簡并的，意味著一個氨基酸可以由超過一個堿基三聯(lián)體(一個 “密碼子”)編碼。直接的后果是同一氨基酸序列可以由不同多核苷酸編碼。作為一個例子， 通過遺傳密碼簡并性得到的源自SEQ ID N0 2的多核苷酸序列也可以編碼SEQ ID N0 1的 多肽序列，并且因此為本發(fā)明所涵蓋。本領域技術人員公知的是，密碼子的使用可以隨生物 體而有所變化。在編碼同一氨基酸的密碼子中，一些可以被給定的微生物優(yōu)先使用。如此， 設計適合于特定微生物的密碼子選擇的多核苷酸可以是感興趣的，以優(yōu)化相應蛋白質(zhì)在此 生物體中的表達。
本發(fā)明還涉及一種表達盒，其包含本發(fā)明的多核苷酸，所述多核苷酸在宿主微生 物中有功能的調(diào)節(jié)元件的控制下。術語“表達”指導致生成相應蛋白質(zhì)(即基因產(chǎn)物)的基因序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。術語“表達盒”指優(yōu)選與調(diào)節(jié)元件(如啟動子、增強子、核糖體結(jié)合位點或終止子) 連接的多核苷酸，所述調(diào)節(jié)元件容許合適宿主生物體內(nèi)部的多核苷酸中含有的基因表達。 此類調(diào)節(jié)元件可以是基因的自身調(diào)節(jié)元件，但也可以是經(jīng)修飾的或合成的元件，以容許基 因的更強表達。例如，可以通過用更強的啟動子替換基因的天然啟動子來獲得更強的表達。 對于大腸桿菌，這些啟動子是例如lac啟動子、tac啟動子、trc啟動子和λ d啟動子。對 于其它生物體，熟練技術人員可以能夠選擇更適合的啟動子。術語“宿主微生物”指能夠接受外來或異源基因或其自身基因的額外拷貝，而且能 夠表達那些基因以生成活性蛋白質(zhì)產(chǎn)物的微生物。本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化載體，其包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或盒。術語“轉(zhuǎn)化”指將新的基因或現(xiàn)有基因的額外拷貝導入宿主生物體中?？梢詫⑺?獲得的基因摻入染色體DNA中或者作為染色體外元件導入。作為一個例子，在大腸桿菌中， 一種用于將DNA轉(zhuǎn)移入宿主生物體中的方法是電穿孔。術語“轉(zhuǎn)化載體”指用于在宿主生物體中導入多核苷酸的任何運載體。例如，此類 運載體可以是根據(jù)所使用的生物體的本領域?qū)I(yè)人員已知的質(zhì)粒、噬菌體或其它元件。除 多核苷酸或表達盒外，轉(zhuǎn)化載體通常還含有其它元件以促進特定宿主細胞的轉(zhuǎn)化。表達載 體包含容許盒攜帶的基因合適表達的表達盒和容許載體進入宿主生物體中復制的其它元 件。表達載體可以以單一拷貝存在于宿主生物體中或者以多拷貝存在。本發(fā)明還提供了具有經(jīng)調(diào)控的乙二醛酶III活性的經(jīng)修飾的微生物，其中本發(fā)明 的多肽的活性是減弱或增強的。術語“減弱酶的活性”指與任何修飾之前相同微生物中觀察到的活性相比，感興趣 的酶的活性降低。本領域技術人員知道許多獲得此結(jié)果的手段，并且例如-將突變引入基因中，其降低此基因的表達水平或編碼蛋白質(zhì)的活性水平。-用低強度啟動子替換基因的天然啟動子，導致較低的表達。-使用使相應的信使RNA或蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的元件。-基因缺失，若根本不需要表達的話。“升高的酶活性”或“增強的酶活性”意味著活性優(yōu)于任何修飾前相同微生物中測 量的初始活性。相應的非修飾微生物是除所考慮的酶活性外具有經(jīng)修飾的微生物的相同特 征的微生物。有利地，與相應的非修飾微生物的天然活性相比，酶活性提高至少50%，優(yōu)選 至少100%。下文實施例1中給出了一種用于測量乙二醛酶III活性的方法。根據(jù)本發(fā)明的微生物選自由細菌、酵母和真菌組成的組。優(yōu)選地，細菌選自由腸桿 菌禾斗(Enterobacteriaceae)、芽抱桿菌禾斗(Bacillaceae)、梭菌禾斗(Clostridiaceae)、鏈霉 菌科(Streptomycetaceae)和棒桿菌科(Corynebacteriaceae)組成的組。更優(yōu)選地，細菌 選自下組大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、丙酮丁醇 梭菌(Clostridium acetobutylicum)禾口谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)。本發(fā)明的目的是提供具有減弱的乙二醛酶III活性的微生物，其中編碼本發(fā)明多 肽的天然基因的表達是減弱的。
根據(jù)本發(fā)明的術語“減弱基因的表達”意為部分或完全抑制基因的表達，然后其被 說成是“減弱的”。對表達的這種抑制可以是抑制基因表達、基因表達必需的所有或部分啟 動子區(qū)域的缺失、或基因編碼區(qū)中的缺失。優(yōu)先地，基因的減弱本質(zhì)上是所述基因的完全缺 失，該基因可以用促進根據(jù)本發(fā)明的菌株的鑒定、分離和純化的選擇標志基因替換。優(yōu)先 地，通過同源重組技術來使基因失活(Datsenko，K. Α.和Wanner，B. L.，2000)。在本發(fā)明的一個實施方案中，對具有減弱的乙二醛酶III活性的微生物進一步修 飾以提高1，2-丙二醇和/或丙酮醇自碳源的生成。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的微生物中，減弱旁路途徑或 副產(chǎn)物形成途徑中牽涉的一些酶活性以提高來1，2_丙二醇和/或丙酮醇自碳源的得率·減弱Entner-Doudoroff途徑中牽涉的、由基因edd和eda編碼的酶活性。 Entner-Doudoroff途徑提供了一種除糖酵解外用于將葡萄糖降解成甘油醛_3_磷酸和丙 酮酸的備選方式。減弱Entner-Doudoroff途徑確保大部分或最多全部葡萄糖經(jīng)由糖酵解 來降解，并且用于生成1，2-丙二醇。·減弱甲基乙二醛轉(zhuǎn)化成乳酸中牽涉的酶由gloA基因編碼的乙二醛酶1(其催 化從甲基乙二醛合成乳酰谷胱甘肽)和由aldA和aldB基因編碼的乳醛脫氫酶(其催化從 (S)乳醛合成(S)乳酸)。減弱這些酶意圖為合成期望的產(chǎn)物節(jié)約前體甲基乙二醛。·減弱副產(chǎn)物(如乳酸、乙醇和甲酸)的合成中牽涉的酶由基因IdhA編碼的乳 酸脫氫酶(其催化從丙酮酸合成乳酸)、由基因adhE編碼的醇_醛脫氫酶(其催化從乙酰 CoA合成乙醇)和由基因pflA和pflB編碼的丙酮酸甲酸裂合酶(其催化從丙酮酸合成乙 酰CoA和甲酸)。優(yōu)先地，減弱這些中至少一個基因。在本發(fā)明的另一個具體的實施方案中，減弱丙糖磷酸異構酶活性。優(yōu)先地，通過減 弱tpiA基因的表達來達到此結(jié)果。更優(yōu)先地，缺失tpiA基因。tpiA基因編碼酶“丙糖磷 酸異構酶”，其催化DHAP向甘油醛-3-磷酸的轉(zhuǎn)化。減弱此基因的表達確保所代謝葡萄糖 的一半被轉(zhuǎn)化成1，2_丙二醇和/或丙酮醇。在本發(fā)明的另一個具體的實施方案中，減弱甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性。甘油 醛-3-磷酸脫氫酶(又稱作GAPDH)是將葡萄糖糖酵解轉(zhuǎn)化成丙酮酸中牽涉的關鍵酶之一。 減弱所述酶導致GA3P的一部分重定向于1，2_丙二醇和/或丙酮醇的合成。然后，1，2-丙 二醇相對于葡萄糖的得率可以大于1摩爾/摩爾。有利地，甘油醛-3-磷酸脫氫酶的活性 是野生型GADPH的通常活性的約小于30%，更優(yōu)選小于10%。優(yōu)先地，減弱編碼GAPDH的 gapA基因的表達。在本發(fā)明的另一個實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的微生物中，提高糖輸入的效率。導 致GAPDH反應中碳流量降低超過50%的gapA基因表達的強烈減弱導致合成小于1摩爾PEP 每摩爾輸入的葡萄糖。PEP是通常用于將單糖輸入細胞中的糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)所 需要的，因為輸入與從PEP至葡萄糖的磷酸轉(zhuǎn)移偶聯(lián)，這產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸。如此，降低 PEP的量會消極地影響糖輸入。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，可以通過不依賴于磷酸烯醇丙酮酸的糖輸 入系統(tǒng)將糖輸入微生物中?？梢岳糜苫騡alP編碼的半乳糖酶-質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運體 (symporter)，其不牽涉磷酸化。在此情況中，輸入的葡萄糖必須通過由glk基因編碼的葡萄糖激酶活性來磷酸化。為了促進這種途徑，提高選自galP和glk的至少一個基因的表達。 因此，PTS變?yōu)椴槐匾?，它可以通過減弱選自ptSG、ptSH、ptSI或err的至少一個基因來 消除。這四種基因編碼PTS復合物的不同功能域ptsG編碼酶II的兩個亞基C和B，ptsH 編碼HPr蛋白，ptsl編碼酶I，而err編碼酶II的亞基A。在本發(fā)明的另一個具體的實施方案中，通過提高代謝物磷酸烯醇丙酮酸的可用性 來提供糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)的效率。由于gapA活性的減弱和朝向丙酮酸的碳流量較 低，本發(fā)明的經(jīng)修飾菌株中的PEP量可以為有限的，導致轉(zhuǎn)運入細胞中的葡萄糖的量較低。存在可以用于提高微生物菌株中PEP可用性的多種手段。特別地，一種手段是減 弱反應PEP—丙酮酸。優(yōu)先地，在所述菌株中減弱選自pykA和pykF的至少一個基因(其 編碼丙酮酸激酶)以獲得此結(jié)果。另一種提高PEP可用性的方式是促進由磷酸烯醇丙酮酸 合酶催化的反應丙酮酸一PEP，其通過提高此酶的活性來實現(xiàn)。此酶由ppsA基因編碼。因 此，優(yōu)先在微生物中，優(yōu)先提高PPsA基因的表達。兩種修飾都可以同時存在于微生物中。在本發(fā)明的另一個具體的實施方案中，可以通過如下方式阻止副產(chǎn)物乙酸的合 成減弱其合成中牽涉的至少一種酶。優(yōu)選地，避免所述乙酸合成以優(yōu)化1，2_丙二醇的生 成。為了阻止乙酸的生成，有利地，減弱選自ackA、pta和poxB的至少一個基因。這些 基因均編碼不同乙酸生物合成途徑中牽涉的酶。特別對于1，2_丙二醇的生成，提高比酶活性可以為有利的，這導致此化合物的形 成甲基乙二醛合酶、甲基乙二醛還原酶和1，2-丙二醇脫氫酶。有利地，與相應的非修飾微 生物的天然活性相比，將酶活性提高至少50%，優(yōu)選至少100%。為了獲得比酶活性的升高，優(yōu)先過表達編碼這些活性的基因mgsA基因(編碼甲 基乙二醛合酶)、yqhD、yafB、ydhF、ycdW、yqhE、yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG、和 ydbC (均編 碼甲基乙二醛還原酶)、gldA或fucO (編碼1，2-丙二醇脫氫酶)。優(yōu)先使用mgsA、yqhD和gldA基因的過表達的組合。為了獲得感興趣基因的過表達，本領域技術人員知道不同的方法，且例如1-用誘導感興趣的基因更強水平的表達的啟動子替換基因的天然啟動子。2-將攜帶和表達所述感興趣基因的表達載體導入微生物中。3-將感興趣基因的額外拷貝導入微生物的染色體中。另一種獲得升高的酶活性的方式是將特定的突變引入感興趣的基因中，所述特定 的突變?nèi)菰S比天然蛋白質(zhì)呈現(xiàn)更高活性的基因產(chǎn)物的翻譯。在厭氧或微氧條件下，有利地，提高用于將前體還原成1，2-丙二醇的NADH的可用 性。這通過減輕對由全局調(diào)節(jié)物ArcA(由arcA基因編碼)介導的三羧酸循環(huán)的阻抑來獲 得。也可以通過使由基因ndh編碼的NADH脫氫酶II失活來提高細胞中的NADH濃度。因 此，優(yōu)選地，減弱選自arcA和ndh的至少一個基因。特別在厭氧或微氧條件下，丙酮酸脫氫酶復合物(PDC)(其將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰 CoA)對NADH的抑制具有低敏感性是有利的。較低的敏感性參照野生型酶的敏感性定義。 可以通過Ipd基因(編碼PDC的亞基硫辛酰胺脫氫酶)中特定的突變(其導致用殘基纈氨 酸替換酶的蛋白質(zhì)序列中的丙氨酸55)來獲得此類特征。優(yōu)先地，設計用于主要生成1，2-丙二醇 微生物選自細菌、酵母或真菌。更優(yōu)先地，微生物選自腸桿菌科、芽孢桿菌科、梭菌科、鏈霉菌科和棒桿菌科。甚至更優(yōu)先地，微生 物是大腸桿菌或丙酮丁醇梭菌。特別對于丙酮醇的生成，提高比酶活性可以是有利的，其導致此化合物的形成甲 基乙二醛合酶和甲基乙二醛還原酶。有利地，與相應的非修飾微生物的天然活性相比，將酶 活性提高至少50%，優(yōu)選至少100%。為了獲得比酶活性的升高，優(yōu)先過表達編碼這些活性的基因mgsA基因(編碼甲 基乙二醛合酶)、yqhD、yafB、ydhF、ycdW、yqhE、yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG 和 ydbC (均編
碼甲基乙二醛還原酶)。優(yōu)先使用mgsA和yqhD基因的過表達的組合。另外，對于丙酮醇的生成，阻止從丙酮醇形成1，2_丙二醇是有利的。此結(jié)果可以 通過減弱至少一種在將丙酮醇轉(zhuǎn)化成1，2_丙二醇中牽涉的酶的活性來實現(xiàn)。優(yōu)先地，減弱 gldA基因的表達，更優(yōu)先地，缺失gldA基因。可以有利地減弱其表達的其它基因如下ptsG、ptsH、ptsl、err、edd、eda、gloA、 aldA、aldB、ldhA、pflA、pflB、adhE、tpiA、gapA、pykA、pykF、ackA、pta、poxB。可以有利地增強其表達的其它基因如下galP、glk、ppsA。優(yōu)先地，設計用于主要生成丙酮醇的微生物選自細菌、酵母或真菌。更優(yōu)先地，微 生物選自腸桿菌科、芽孢桿菌科、鏈霉菌科和棒桿菌科。甚至更優(yōu)先地，微生物是大腸桿菌 或月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。本發(fā)明的目的還在于提供具有增強的乙二醛酶III活性的微生物，其中本發(fā)明的 多核苷酸是過表達的。優(yōu)先地，通過用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化生物體或者通過將本發(fā)明的多核苷酸或盒整合 入生物體的染色體中來獲得過表達?？梢詫氡磉_載體攜帶的或整合入染色體中的一個單拷貝或多個拷貝的基因以 調(diào)控過表達。另外，可以使用不同種類的啟動子，其誘導基因的不同水平的表達。本領域?qū)I(yè)人員可以選擇染色體上適合于插入新基因的位置。此位置(或基因 座)不應影響宿主生物體的本質(zhì)功能。用于將基因整合入宿主生物體的染色體中的方法披 露于例如Sambrook等(1989)。本發(fā)明的目的是提供具有增強的乙二醛酶III活性的微生物，其中編碼本發(fā)明多 肽的天然基因的表達是增強的。優(yōu)先地，這通過在天然基因的編碼序列上游引入強啟動子 來獲得。另外，可以修飾基因的其它調(diào)節(jié)元件。例如，基因的上游區(qū)域(起始密碼子、核糖 體結(jié)合位點)中本領域?qū)I(yè)人員可選擇的合適突變可以導致表達升高。另外，可以導入誘 導型啟動子以在想要時開啟/關閉基因的表達。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，強啟動子存在于編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的天 然基因的編碼序列的上游。本發(fā)明還涉及具有增強的乙二醛酶III活性的微生物，對其進一步修飾以提高乳
酸的產(chǎn)量。如本文中所使用的，術語“乳酸”指D-乳酸(鹽)和L-乳酸(鹽)及其混合物， 包括不同比例(如50/50 (外消旋混合物),75/25,90/10和100/0)的混合物。
在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，將修飾引入微生物(如先前所描述)以特別
提高乳酸的產(chǎn)量。優(yōu)先地，提高甲基乙二醛合酶活性。優(yōu)選的方法是mgsA基因的過表達。另外，可以 在mgsA基因中導入一個或數(shù)個突變以在所使用的培養(yǎng)條件下提高甲基乙二醛合酶活性?？梢杂欣卦鰪娖浔磉_的其它基因如下galP、glk、ppsA。在本發(fā)明的另一個實施方案中，減弱Entner-Doudoroff途徑的由基因edd和 eda編碼的至少一種酶活性。優(yōu)先地，減弱基因edd或eda中至少一種。如已經(jīng)提及的， Entner-Doudoroff途徑可以發(fā)揮糖酵解途徑不想要的旁路的功能。關于1，2_丙二醇和/或丙酮醇的生成，使碳流量重定向于甲基乙二醛旁路是有利 的。因此，優(yōu)先引入GAPDH的減弱及相關特征(工程化改造糖輸入或工程化改造PEP再循 環(huán))。優(yōu)先地，在根據(jù)本發(fā)明的微生物中，減弱副產(chǎn)物形成途徑中牽涉的一些酶活性以 提高乳酸的得率·由基因pflA和pflB編碼的丙酮酸甲酸裂合酶活性，其負責從丙酮酸合成乙酰 CoA和甲酸?！び刹倏v子frdABCD編碼的延胡索酸還原酶活性，其負責從延胡索酸合成琥珀酸?！び苫騛dhE編碼的醇-醛脫氫酶活性，其負責從乙酰CoA合成乙醇?！し謩e由基因pta和ackA編碼的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和乙酸激酶活性，它們負責在兩個 步驟中從乙酰CoA合成乙酸。·由基因poxB編碼的丙酮酸氧化酶活性，其負責在一個步驟中從丙酮酸合成乙 酸。優(yōu)先地，通過減弱這些中至少一種基因來獲得活性的減弱。源自甲基乙二醛旁路的其它潛在副產(chǎn)物是丙酮醇、乳醛和1，2-丙二醇。為了阻止 這些副產(chǎn)物的形成，減弱至少一種甲基乙二醛還原酶活性。優(yōu)先地，這通過減弱至少一種編 碼甲基乙二醛還原酶活性的基因來實現(xiàn)，所述基因選自下組yqhD、yafB、yqhE、ydhF、yCdW、 yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG、ydbC 禾口 gldA。所生成的D-乳酸鹽不被進一步代謝是有利的。因此，在本發(fā)明的另一個實施方案 中，減弱利用D-乳酸的至少一種酶活性。優(yōu)先地，減弱did基因。阻止L-乳酸的進一步代謝也是有利的。優(yōu)先地，減弱利用L-乳酸的至少一種酶 的表達或活性。更優(yōu)先地，減弱IldD基因?？梢杂欣販p弱其表達以促進乳酸生成的其它基因如下ptsG、ptsH、ptsl、err, gloA、aldA、aldB、gapA、pykA、pykF、tpiA。優(yōu)先地，設計用于生成乳酸鹽的微生物選自細菌、酵母或真菌。更優(yōu)先地，微生物 選自腸桿菌科、芽孢桿菌科、鏈霉菌科和棒桿菌科。甚至更優(yōu)先地，微生物來自大腸桿菌、枯 草芽孢桿菌或谷氨酸棒桿菌菌種。本發(fā)明提供了一種用于在微生物中調(diào)控乙二醛酶III酶活性的方法，其中在所述 微生物中增強或減弱本發(fā)明的多肽的活性。優(yōu)先地，在所述方法中，通過過表達本發(fā)明的多核苷酸來增強乙二醛酶III酶活 性。
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優(yōu)先地，在所述方法中，通過減弱本發(fā)明的多核苷酸的表達來減弱乙二醛酶III 酶活性。本發(fā)明還涉及一種用于制備1，2_丙二醇和/或丙酮醇的方法，其中在包含碳源的 合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的微生物，并回收所生成的1，2-丙二醇和/或丙酮醇。在需 氧、微氧或厭氧條件下進行1，2_丙二醇的生成。在需氧或微氧條件下，優(yōu)先在需氧條件下 進行丙酮醇的生成。術語“碳底物”或“碳源”意味著能夠被微生物代謝的任何碳源，其中底物含有至少 一個碳原子。作者特別指可再生的、便宜的且可發(fā)酵的碳源，如單糖、寡糖、多糖、單碳底物 (single carbon substrate)和多元醇，如甘油。式(CH2O)n的糖類也稱作糖(ose)或“單 糖”;單糖包括果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖。其它碳源是二糖、三糖、寡糖和多糖。二糖包 括蔗糖、乳糖和麥芽糖。淀粉和半纖維素是多糖，也稱為“復合糖”。有利地，此外，純化所回收的1，2_丙二醇和/或丙酮醇。本發(fā)明還涉及一種用于制備乳酸的方法，其中在包含碳源的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)根 據(jù)本發(fā)明的微生物，并回收乳酸。在需氧、微氧或厭氧條件下，優(yōu)先在需氧條件下進行乳酸 的生成。有利地，此外，純化所回收的乳酸。本領域技術人員可以容易地限定用于發(fā)酵方法的培養(yǎng)條件。具體地，于 200C -550C，優(yōu)選25°C -40°C，并且優(yōu)選于約35°C (對于丙酮丁醇梭菌)和于約37°C (對于 大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌)的溫度使微生物發(fā)酵。可以在分批方法中、在補料-分批方法中或在連續(xù)方法中進行此方法?！霸谛柩鯒l件下”意味著向培養(yǎng)物提供氧，其通過將氣體溶解入液相中來實現(xiàn)。這 可以通過如下方式來獲得(1)將含氧氣體(例如空氣)噴射入液相中或者(2)搖動含有 培養(yǎng)基的容器以將頂部空間中含有的氧轉(zhuǎn)移入液相中。在替代厭氧條件的需氧條件下發(fā)酵 的優(yōu)點在于氧作為電子受體的存在改善菌株為細胞過程生成更多ATP形式的能量的能力。 因此，菌株使其一般代謝改善。微氧條件定義為如下的培養(yǎng)條件，其中將低百分比的氧(例如使用含有0. 1-10% 的氧的氣體混合物，用氮完成到100% )溶解入液相中。厭氧條件定義為如下的培養(yǎng)條件，其中不向培養(yǎng)基提供氧。通過將惰性氣體(如 氮)噴射入培養(yǎng)基中以除去其它氣體的痕跡來獲得嚴格厭氧條件?？梢允褂孟跛?鹽)作 為電子受體以改善菌株的ATP生成，并改善其代謝。根據(jù)本發(fā)明的術語“合適的生長培養(yǎng)基”指適合于微生物生長的已知分子組成的 培養(yǎng)基。例如，使用適合于細菌的已知固定組成的礦物培養(yǎng)基，其包含至少一種碳源。具體 地，如此用于大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌的礦物生長培養(yǎng)基可以與M9培養(yǎng)基(Anderson， 1946,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32 120-128)、M63 培養(yǎng)基(Miller，1992 ；A Short Course in Bacterial Genetics :A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)或如Schaefer等.(1999，Anal. Biochem. 270 :88_96)定義的培養(yǎng)基具有相同或類似 組成。優(yōu)先地，用于大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌培養(yǎng)物的碳源是簡單碳源，并且可以是
15阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖或木糖。特別優(yōu)選的簡單碳源是葡萄 糖。本發(fā)明在上文、下文和實施例中關于大腸桿菌進行描述。如此，主要使用來自大腸 桿菌的基因的命名來定義可對根據(jù)本發(fā)明的初始的和進化的菌株減弱、缺失或過表達的基 因。然而，根據(jù)本發(fā)明，此名稱具有更一般的意義，而且涵蓋其它微生物中的相應基因。使 用來自大腸桿菌的基因的GenBank參照，本領域技術人員可以測定不同于大腸桿菌的生物 體中的等同基因。鑒定同源序列及其百分比同源性的手段是本領域技術人員公知的，并且特別包括 BLAST程序，其可以在網(wǎng)站http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/上用所述網(wǎng)站上指明的 缺省參數(shù)來使用。可以使用例如程序CLUSTALW(http://www. ebi. ac. uk/clustalw/)，用這 些網(wǎng)站上指明的缺省參數(shù)來利用(比對)所獲得的序列。PFAM數(shù)據(jù)庫(比對和隱馬爾可夫樽型的蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫httD://VWW. Sanger. ac.uk(/Software/Pfam/)是蛋白質(zhì)序列的比對的大集合。每個PFAM有可能顯現(xiàn)多個比對， 觀察蛋白質(zhì)結(jié)構域，評估生物體間的分布，訪問(gain access to)其它數(shù)據(jù)庫，并顯現(xiàn)已知 的蛋白質(zhì)結(jié)構。通過比較源自66個完全測序的單細胞基因組的蛋白質(zhì)序列來獲得COG(蛋白質(zhì)的 盲向同源組的簇httD://www. ncbi. nlm. nih. gov/COG/),所沭單細胞基因組代表14個主要 的種族發(fā)育譜系(phylogenetic line)。從至少三個品系定義每個C0G，這有可能鑒定古老 的保守結(jié)構域。文本中按引用次序的參考文獻1.Bunch PK, Mat-Jan F, Lee N, Clark DP(1997)，Microbiology 143 :187—1952. Garvie EI (1980)，Microbiol. Rev. 44 :106_1393. Cooper RA(1984) ， Annu. Rev. Microbiol. 38 49-68 Arch. Microbiol. 170 209-2194. Rule GS, Pratt EA, Chin CCQ, Wold F, Ho C(1985), J. Bacteriol. 161 1059-10685.Dong JM, Taylor JS, Latour DJ, Iuchi S, Lin ECC(1993)，J. Bacteriol. 175 6671-66786. Ferguson GP, Toetmeyer S, MacLean MJ, Booth IR (1998)，Arch ; Microbiol. · 170 :209_2197. Grabar TB,Zhou S,Shanmugam KT,Yomano LP, Ingram LO (2006),Biotechnol. Lett. 28 1527-15358. Misra K, Banerjee AR, Ray S, Ray M(1995)，Biochem. J. 305 999-10039. MacLean MJ, Ness LS, Ferguson GP, Booth IR(1998), Mol. Microbiol. 27 563-57110.Okado-Matsumoto A 和 Fridovich I(2000)，J. Biol. Chem. 275 :34853_4385711. Benov L, Sequeira F, Beema A (2004), Acta Biochimica Polonica 51 857-86012.Tran Din K 和 Gottschalk G(1985)，Arch. Microbiol. 142 :87_92
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圖1 :SDS 4-15% -梯度聚丙烯酰胺凝膠第1道含有乙二醛酶活性的凝膠過濾柱的級分，第2道分子重量標志物
實施例實施例1 大腸桿菌PG0016中乙二醛酶III活性的純化和編碼基因的鑒定1.PG0016 菌株構建1.1.經(jīng)修飾的菌株大腸桿菌 MG1655 lpd*、AtpiA, ApflAB, Δ adhE、IdhA: km、 AgloA、AaldA、AaldB、Aedd 的構建。根據(jù)方案1，在菌株大腸桿菌 MG1655 lpd*、AtpiA, ApflAB、Δ adhE、IdhA km、 AgloA、AaldA、AaldB、△ edd: : Cm 中消除氯霉素抗性盒(參見 W02005073364)。方案1 抗件念(FRT系統(tǒng))的消除根據(jù)下列技術，消除氯霉素和/或卡那霉素抗性盒。通過電穿孔將攜帶FLP重組 酶的質(zhì)粒pCP20導入菌株中，所述FLP重組酶在氯霉素和/或卡那霉素抗性盒的FRT位點 處起作用。于42°C系列培養(yǎng)后，用表1中給出的寡核苷酸通過PCR分析來檢查抗生素抗性 盒的喪失。使用表1中給出的寡核苷酸來檢查先前在菌株中建造的修飾的存在。所獲得的菌株命名為大腸桿菌MG1655 lpd*、AtpiA, ApflAB、AadhE.ldhA: :Km、 Δ gloA> AaldA、AaldB、Δ edd。表1 用于檢查抗性盒的插入或抗性盒的喪失的寡核苷酸
18
權利要求
一種具有乙二醛酶III酶活性的分離的多肽、其片段或同源序列，所述多肽包含SEQ ID NO 1的序列。
2.權利要求1的多肽，其包含與SEQID NO 1的序列具有至少70%同一性的序列。
3.權利要求1的多肽，其包含至少100個來自SEQID NO 1序列的鄰接氨基酸。
4.權利要求1的多肽，其由SEQID NO 1的序列組成。
5.一種多核苷酸，其包含編碼權利要求1至4之一的多肽的序列。
6.權利要求5的多核苷酸，其包含SEQID NO 2的序列。
7.—種表達盒，其包含權利要求5或6之一的多核苷酸，所述多核苷酸在進入宿主微生 物中有功能的調(diào)節(jié)元件的控制下。
8.一種轉(zhuǎn)化載體，其包含權利要求7的盒或權利要求5或6之一的多核苷酸。
9.一種經(jīng)修飾的微生物，其具有經(jīng)調(diào)控的乙二醛酶III酶活性，其中權利要求1至4之 一的多肽的活性是減弱或增強的。
10.權利要求9的微生物，其選自下組細菌、酵母和真菌。
11.權利要求10的微生物，其中所述細菌選自下組腸桿菌科、芽孢桿菌科、鏈霉菌科 和棒桿菌科。
12.權利要求11的微生物，其選自下組大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、丙酮丁醇梭菌和谷 氨酸棒桿菌。
13.權利要求9至12之一的微生物，其具有減弱的乙二醛酶III酶活性，其中編碼權利 要求1至4之一的多肽的天然基因的表達是減弱的。
14.權利要求13的微生物，其中對其進一步修飾以提高1，2-丙二醇和/或丙酮醇的產(chǎn)量。
15.權利要求14的微生物，其中它包含下列修飾中的至少一個或其組合以提高1，2_丙二醇產(chǎn)量 減弱至少一個下列基因的表達ptsG、ptsH、ptsl、err、edd、eda、gloA、aldA、aldB、 ldhA、pflA、pflB、adhE、tpiA、gapA、pykA、pykF、ackA、pta、poxB、arcA 禾口 ndh ； 增強至少一個下列基因的表達galP、glk、ppsA、mgsA、yqhD、yafB、ydhF、ycdW、yqhE、 yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG、ydbC、gldA、fucO ； 修飾基因lpd，使得它具有在由所述基因編碼的蛋白質(zhì)中導致用纈氨酸替換丙氨酸 55的點突變。
16.權利要求14的微生物，其中它包含下列修飾中的至少一個或其組合以提高丙酮醇產(chǎn)量 減弱至少一個下列基因的表達ptsG、ptsH、ptsl、err、edd、eda、gloA、aldA、aldB、 ldhA、pflA、pflB、adhE、tpiA、gapA、pykA、pykF、ackA、pta、poxB 禾口 gldA ； 增強至少一個下列基因的表達galP、glk、ppsA、mgsA、yqhD、yafB、ydhF、ycdW、yqhE、 yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG、ydbC。
17.權利要求9至12之一的微生物，其具有增強的乙二醛酶III酶活性，其中權利要求 5或6之一的多核苷酸是過表達的。
18.權利要求17的微生物，其用權利要求8的載體轉(zhuǎn)化。
19.權利要求17的微生物，其中權利要求5或6之一的多核苷酸或權利要求7的盒整合入其染色體中。
20.權利要求9至12之一的微生物，其具有增強的乙二醛酶III活性，其中編碼權利要 求1至4之一的多肽的天然基因的表達是增強的。
21.權利要求20的微生物，其中它包含編碼權利要求1至4之一的多肽的天然基因的 編碼序列上游的強啟動子。
22.權利要求17至21之一的微生物，其中對其進一步修飾以提高乳酸鹽產(chǎn)量。
23.權利要求22的微生物，其中它包含下列修飾中的至少一個或其組合以提高乳酸鹽 產(chǎn)量 減弱至少一個下列基因的表達ptsG、ptsH、ptsl、err、edd、eda、gloA、aldA、aldB、 pflA、pflB、frdABCD、adhE、gapA、pykA、pykF、ackA、pta、poxB、yqhD、yafB> ydhF、ycdff> yqhE、yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG、ydbC、gldA、lldD、did 禾口 tpiA ； 增強至少一個下列基因的表達galP、glk、ppsA和mgsA。
24.一種用于在微生物中調(diào)控乙二醛酶III酶活性的方法，其中在所述微生物中增強 或減弱權利要求1至4之一的多肽的活性。
25.權利要求24的方法，其中通過過表達權利要求5或6之一的多核苷酸來增強所述 乙二醛酶III酶活性。
26.權利要求24的方法，其中通過減弱權利要求5或6之一的多核苷酸的表達來減弱 所述乙二醛酶III酶活性。
27.一種用于制備1，2_丙二醇和/或丙酮醇的方法，其中在包含碳源的合適培養(yǎng)基中 培養(yǎng)權利要求13至16之一的微生物，并回收1，2-丙二醇和/或丙酮醇。
28.權利要求27的方法，其中純化所回收的1，2-丙二醇和/或丙酮醇。
29.一種用于制備乳酸鹽的方法，其中在包含碳源的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求17至 23之一的微生物，并回收乳酸鹽。
30.權利要求29的方法，其中純化所回收的乳酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的多肽、具有編碼所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸及其用途，所述多肽具有在單一步驟中將甲基乙二醛轉(zhuǎn)化成乳酸的酶活性(稱為乙二醛酶III活性)。本發(fā)明涉及通過改變編碼所述多肽的多核苷酸的表達水平來調(diào)控微生物中的乙二醛酶III活性。本發(fā)明還涉及通過發(fā)酵微生物(其中它們的乙二醛酶III活性受到調(diào)控)來生產(chǎn)大宗化學品，特別是1，2-丙二醇、丙酮醇、和乳酸。
文檔編號C12P7/18GK101978052SQ200980109847
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月16日 優(yōu)先權日2008年3月18日
發(fā)明者弗朗索瓦·沃爾克, 菲利普·索凱爾 申請人:代謝探索者公司