專利名稱：質(zhì)粒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含編碼復(fù)制蛋白的基因，對(duì)于制造外 源蛋白有用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，積極開展了基因工程研究，報(bào)道了很多使用重組微生物大規(guī)模生產(chǎn)有用 蛋白質(zhì)的技術(shù)。作為一個(gè)大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)的例子，可以提及具有高生產(chǎn)率的質(zhì)粒載體的發(fā) 展。例如，一種包括涉及胞外酶生成例如淀粉酶、蛋白酶或果聚糖蔗糖酶的各種基因啟動(dòng)子 區(qū)，以及包括編碼涉及這些蛋白質(zhì)胞外分泌的信號(hào)肽區(qū)的表達(dá)和分泌載體(專利文獻(xiàn)1和 2)；一種復(fù)制區(qū)被改動(dòng)以增加其拷貝數(shù)的載體(專利文獻(xiàn)3和4)等。然而，按照通常使用的、基于宿主載體系統(tǒng)制造蛋白質(zhì)的方法，蛋白質(zhì)的產(chǎn)量仍不 足。另外，也限制了可以大量生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的種類。專利文獻(xiàn)1 JP-A-01-273591專利文獻(xiàn)2 JP-A-2000-287687專利文獻(xiàn)3 JP-A-06-327480專利文獻(xiàn)4 JP-A-2003-986
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)下列1) 11)。1) 一種質(zhì)粒載體，含有編碼質(zhì)粒復(fù)制蛋白的DNA，其中，所述復(fù)制蛋白包括選自用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b) 位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被下列氨基酸殘基取代而 成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。2) 一種質(zhì)粒載體，含有編碼質(zhì)粒復(fù)制蛋白的DNA，其中，所述復(fù)制蛋白包括與用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列具有至少80%同一性的 氨基酸序列中的選自分別與序列識(shí)別號(hào)2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和 (d)位置198相對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被下列氨基酸殘基 取代而成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。
3)上述1)或2)的質(zhì)粒載體進(jìn)一步包含基因的啟動(dòng)子區(qū)和分泌信號(hào)區(qū)的核苷酸序 列，其中，所述基因編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶。4)上述3)的質(zhì)粒載體，其中，編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶的基因 的啟動(dòng)子區(qū)和分泌信號(hào)區(qū)的核苷酸序列是具有由用序列識(shí)別號(hào)13表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 659號(hào)堿 基的核苷酸序列；具有由用序列識(shí)別號(hào)14表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 696號(hào)堿基的核苷酸序列；與前述任意一個(gè)核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序 列；或前述核苷酸序列中部分被刪除的核苷酸序列。5) 一種轉(zhuǎn)化體，其含有上述4)的質(zhì)粒載體。6)上述5)的轉(zhuǎn)化體，其中，載體的宿主是微生物。7) 一種制備多肽的方法，其包括如下步驟構(gòu)建質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含編碼目標(biāo)多肽的DNA和編碼質(zhì)粒復(fù)制蛋白的 DNA，所述復(fù)制蛋白包括選自用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b) 位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被下列氨基酸殘基取代而 成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主微生物；以及培養(yǎng)宿主微生物，并收集由此生成的目標(biāo)多肽。8) 一種制備多肽的方法，其包括如下步驟構(gòu)建質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含編碼目標(biāo)多肽的DNA和編碼質(zhì)粒復(fù)制蛋白的 DNA，其中，所述復(fù)制蛋白包括與用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列具有至少80%同一 性的氨基酸序列中的選自分別與序列識(shí)別號(hào)2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149 和(d)位置198相對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被下列氨基酸殘 基取代而成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主微生物；以及培養(yǎng)宿主微生物，并收集由此生成的目標(biāo)多肽。9)上述7)或8)的方法，其中，所述質(zhì)粒載體進(jìn)一步包含基因的啟動(dòng)子區(qū)和分泌信 號(hào)區(qū)的核苷酸序列，其中，所述基因編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶。10)上述9)的方法，其中，編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶的基因的 啟動(dòng)子區(qū)和分泌信號(hào)區(qū)的核苷酸序列是
具有由用序列識(shí)別號(hào)13表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 659號(hào)堿 基的核苷酸序列；具有由用序列識(shí)別號(hào)14表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 696號(hào)堿基的核苷酸序列；與前述任意一個(gè)核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序 列；或前述核苷酸序列中部分被刪除的核苷酸序列。11) 一種多肽，其按照上述7)或8)的方法制備而成。


圖1表示構(gòu)建本發(fā)明質(zhì)粒載體的一個(gè)例子。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種質(zhì)粒載體以及利用該質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化體，其中，該質(zhì)粒載體對(duì)于 在工業(yè)上有價(jià)值和有用的蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)具有高生產(chǎn)效率。本發(fā)明者們研究通過(guò)質(zhì)粒改性來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)在ρΑΜα 1的復(fù)制 蛋白中引入某個(gè)突變，其通常被用作質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)域(Rep)，從而質(zhì)粒中包括的目標(biāo) 蛋白結(jié)構(gòu)基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)胞外分泌量增加，這樣的質(zhì)粒對(duì)于蛋白質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)是有用 的。根據(jù)本發(fā)明質(zhì)粒載體，質(zhì)粒中包括的目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)基因所產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白質(zhì)的胞 外分泌量增加。從而通過(guò)使用本發(fā)明的質(zhì)粒載體，可以高效地制造目標(biāo)蛋白質(zhì)。在本發(fā)明質(zhì)粒載體中包括并編碼質(zhì)粒復(fù)制蛋白的DNA編碼下列蛋白質(zhì)(i)或 (ii)。(i)蛋白質(zhì)，包含用下列(a) (d)的氨基酸殘基取代選自用序列識(shí)別號(hào)2表示的 氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個(gè)或多個(gè)氨
基酸殘基，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。(ii)蛋白質(zhì)，包含用下列(a) (d)的氨基酸殘基取代與用序列識(shí)別號(hào)2表示的 氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，其中，所述一 個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基選自分別與序列識(shí)別號(hào)2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149 和(d)位置198相對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸殘基，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。至于具有用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，可以提及糞腸球菌的質(zhì)粒 ρΑΜα 1的復(fù)制蛋白。至于由與用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸殘基 組成的質(zhì)粒復(fù)制蛋白，可以提及其所具有的氨基酸序列不同于用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中，該氨基酸序列與用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列具有至少80%、 優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、特別優(yōu)選至少98%的同一性。質(zhì)粒復(fù)制蛋白的例子包括那些相對(duì)于用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列，一個(gè) 或多個(gè)氨基酸被刪除、取代或添加的質(zhì)粒復(fù)制蛋白。具體例子包括來(lái)自腐生葡萄球菌 (Staphylococcus saprophyticus)的復(fù)制蛋白。其中，優(yōu)選那些具有自身克隆能力的質(zhì)粒 復(fù)制蛋白，例如用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列組成的質(zhì)粒復(fù)制蛋白。本發(fā)明質(zhì)粒復(fù)制蛋白是具有用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或與其 有至少80%同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中選自(a)位置48或?qū)?yīng)位置、(b)位置262 或?qū)?yīng)位置、(c)位置149或?qū)?yīng)位置，和(d)位置198或?qū)?yīng)位置的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘 基，可以用其它氨基酸殘基取代。本發(fā)明質(zhì)粒復(fù)制蛋白可以是天然型、或其自然變異體或人 為突變變異體。另外，氨基酸的序列同一性是基于Lipman-Pearson法(Science, 227，1435， (1985))計(jì)算得到。具體說(shuō)，通過(guò)使用基因信息處理軟件GenetyxWin(版本5. 1. LSoftware Development, Co.，Ltd.)的同源性檢索程序，ktup (比較的單元大小)設(shè)定為2，進(jìn)行計(jì)算 分析。因而，本發(fā)明質(zhì)粒復(fù)制蛋白包括具有氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中用序列識(shí)別號(hào)2 表示的氨基酸序列的位置48 (賴氨酸殘基)的氨基酸殘基被丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨 酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺殘基取代，位置262 (天冬氨酸殘基)的氨基酸殘基被甘氨 酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸取代，位置149(賴氨酸殘基)的氨基酸殘基被天冬 酰胺殘基取代，或位置198 (賴氨酸殘基)的氨基酸殘基被谷氨酸殘基取代；以及具有與用 序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中與用序 列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列的位置48相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基被丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精 氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺殘基取代，與位置262相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基被甘氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸取代，與位置149相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基被天冬酰胺殘基 取代，或與位置198相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基被谷氨酸殘基取代。另外，至于(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198，可以進(jìn)行單 個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。這里，關(guān)于識(shí)別“與(某個(gè))位置相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基”的方法，用例如 Lipman-Pearson法的公知算法將氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，，然后通過(guò)給出對(duì)于每個(gè)質(zhì)粒復(fù)制 蛋白的氨基酸序列中存在的保守氨基酸殘基的最高同源性，從而可以進(jìn)行識(shí)別。另外，對(duì)于 按照該方法對(duì)質(zhì)粒復(fù)制蛋白中所包含的氨基酸序列進(jìn)行排列，無(wú)論在氨基酸序列中進(jìn)行插 入或刪除，都可以根據(jù)每個(gè)質(zhì)粒復(fù)制蛋白的序列來(lái)確定具有同一性的每個(gè)氨基酸殘基的位 置。確信同源性位置存在于三維結(jié)構(gòu)的相同位點(diǎn)上，并且根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制蛋白的特定功能推 測(cè)具有類似的效果?；谕ǔＫ玫亩c(diǎn)突變，通過(guò)在編碼質(zhì)粒復(fù)制蛋白的DNA中引入突變，可以構(gòu) 建本發(fā)明質(zhì)粒載體。更具體地說(shuō)，可以通過(guò)使用定點(diǎn)突變系統(tǒng)的Mutan-Super Express Km 試劑盒(Takara Bio Inc.)等進(jìn)行。另外，通過(guò)使用重組聚合酶鏈反應(yīng)(聚合酶鏈反應(yīng)，聚 合酶鏈反應(yīng)方法，Academic Press, New York，1990)，基因中的任意序列可以用其它基因中 與該任意序列相對(duì)應(yīng)的序列來(lái)取代。
隨著拼接DNA片段，其中，所述DNA片段所述包括DNA復(fù)制起始區(qū)、抗生素抗性基 因、DNA區(qū)域(包括復(fù)制區(qū)、用于啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)、和分泌信號(hào)區(qū))、和將外源基因的目 標(biāo)產(chǎn)物編碼到編碼本發(fā)明的質(zhì)粒復(fù)制蛋白的DNA上的基因，從而可以構(gòu)建重組質(zhì)粒，該重 組質(zhì)?？捎糜诖笠?guī)模生產(chǎn)目標(biāo)基因產(chǎn)物，例如蛋白質(zhì)、多肽等?！巴庠椿颉卑ň幋a酶的基因和編碼生理活性肽的基因，其中，酶可以列舉出淀 粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、果膠酶、支鏈淀粉酶、過(guò)氧化物酶、加氧酶、過(guò)氧化氫酶等； 生理活性肽可以列舉出胰島素、人生長(zhǎng)激素、干擾素、降鈣素、白細(xì)胞介素等，但不限于此?！坝糜趩?dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)、和分泌信號(hào)區(qū)”是調(diào)控區(qū)的核苷酸序列，其涉及外源 基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌?！坝糜趩?dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)”的例子包括包含啟動(dòng)和轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn) 錄起始調(diào)控區(qū)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、包括起始密碼子的翻譯起始區(qū)、及其組合?！胺置谛盘?hào)區(qū)” 的例子包括分泌信號(hào)肽區(qū)域。在本發(fā)明的質(zhì)粒載體中，目標(biāo)外源基因與涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌的調(diào)控區(qū)通過(guò)手 術(shù)相互拼接(例如，調(diào)控區(qū)被置于外源基因的上游區(qū)域)。調(diào)控區(qū)優(yōu)選含有三個(gè)區(qū)域，包 括轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)、翻譯起始調(diào)控區(qū)和分泌信號(hào)區(qū)。更優(yōu)選分泌信號(hào)區(qū)來(lái)源于微生物芽 孢桿菌的纖維素酶基因，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和翻譯起始區(qū)為相應(yīng)的纖維素酶基因的上游0.6 lkb。特別優(yōu)選調(diào)控區(qū)是來(lái)源于均屬于芽孢桿菌的菌株KSM-S237(FERM BP-7875)或菌株 KSM-64(FERM BP-2886)纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)、翻譯起始區(qū)和分泌信號(hào)肽區(qū)。特 別更優(yōu)選調(diào)控區(qū)是序列識(shí)別號(hào)13表示的核苷酸序列的1 659號(hào)堿基的核苷酸序列，序 列識(shí)別號(hào)14表示的核苷酸序列的1 696號(hào)堿基的核苷酸序列，與相應(yīng)的核苷酸序列具有 至少70 %、優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至少90 %、特別優(yōu)選至少95 %、特別更優(yōu)選至少98 %的同 一性的核苷酸序列，或刪除上述核苷酸序列任意部分的核苷酸序列。關(guān)于刪除上述核苷酸 序列任意部分的核苷酸序列，是指序列缺少上述核苷酸序列的部分，但仍保留涉及基因轉(zhuǎn) 錄、翻譯和分泌的功能。以下，描述從芽孢桿菌菌株KSM-KP43構(gòu)建用于生產(chǎn)KP43蛋白酶的本發(fā)明的質(zhì)粒 載體的一個(gè)例子(如圖1)。來(lái)源于芽孢桿菌菌株KSM-KP43的KP43蛋白酶基因被拼接到芽孢桿菌菌株 KSM-64(FERM BP-2886)纖維素酶的啟動(dòng)子區(qū)和分泌信號(hào)區(qū)的下游區(qū)域。另外，作為復(fù)制區(qū) WpAMa 1和作為抗生素抗性基因的四環(huán)素抗性基因也被拼接在其上。在這樣構(gòu)建的重組 質(zhì)粒載體中，制備正反方向上的引物，從而在兩者之間出現(xiàn)一個(gè)位于KP43基因下游區(qū)(例 如，圖1中引物a和d)的限制性酶切位點(diǎn)(Xba I )。另外，制備正反方向上的其它引物， 從而在Ori-ρΑΜα 1基因下游區(qū)(例如，圖1中引物b和c)形成一個(gè)新的限制性酶切位點(diǎn) (Nhe I )。加入由PCR所得到的兩個(gè)片段(即，包括Tc和KP43的區(qū)域，和包括ρΑΜα 1的 區(qū)域)，以便在Xba I和Nhe I消化后將其拼接。在圖1中，對(duì)于通過(guò)引物b和d擴(kuò)增的包 括ρΑΜα 1的區(qū)域，通過(guò)促進(jìn)擴(kuò)增過(guò)程中錯(cuò)誤的發(fā)生，可以構(gòu)建復(fù)制蛋白區(qū)域中具有隨機(jī)突 變的質(zhì)粒載體。通過(guò)用上述方法獲得的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主微生物，可以生產(chǎn)本發(fā)明的重組微生 物。進(jìn)一步，通過(guò)培養(yǎng)該重組微生物并從培養(yǎng)物中收集目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽，可以大規(guī)模生產(chǎn) 目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽。關(guān)于用于轉(zhuǎn)化的宿主微生物，可以列舉出葡萄球菌、腸球菌、李斯特氏 菌、芽孢桿菌等。其中，優(yōu)選芽孢桿菌。
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用于培養(yǎng)重組微生物的培養(yǎng)基的類型沒有特別限定，只要重組微生物可以生長(zhǎng)， 并可以從中生產(chǎn)出酶即可。另外，對(duì)于培養(yǎng)基，以適當(dāng)濃度混合氮源和碳源，并加入適當(dāng)濃 度的無(wú)機(jī)鹽、金屬鹽等。培養(yǎng)基的PH值和溫度沒有特別限制，只要重組微生物可以在其中 生長(zhǎng)即可。另外，可以按照一般方法分離所產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽。如果需要，也可以進(jìn)行 純化、結(jié)晶和造粒。實(shí)施例實(shí)施例1 R印48位置的突變效應(yīng)基于具有提高的分泌特性或特定活性的突變蛋白酶的生產(chǎn)效率，該突變蛋白酶來(lái) 源于 JP-A-2002-218989、JP-A-2002-306176 或 JP-A-2004-122 所述芽孢桿菌菌株 KSM-KP43 的堿性蛋白酶(堿性蛋白酶具有序列識(shí)別號(hào)3或序列識(shí)別號(hào)4的核苷酸序列，其中位置46 的苯丙氨酸被亮氨酸取代，位置65的蘇氨酸被脯氨酸取代，位置195的酪氨酸被組氨酸取 代，位置273的纈氨酸被異亮氨酸取代，位置359的蘇氨酸被絲氨酸取代，位置369的天冬 氨酸被天冬酰胺取代，位置387的絲氨酸被丙氨酸取代。以下稱為“KP43H2”)，測(cè)定R印48 位置的突變效應(yīng)。Rep的突變通過(guò)使用pHA64_KP43H2作為模板在Takara熱循環(huán)儀480型中進(jìn)行聚 合酶鏈反應(yīng)而引入。PHA64-KP43H2是質(zhì)粒載體，其中KP43H2的結(jié)構(gòu)基因和終止子被拼接在 表達(dá)載體PHA64的BamH I和Xba I位置；表達(dá)載體pHA64是質(zhì)粒載體，包括質(zhì)粒ρΑΜ α 1 或PUBllO的復(fù)制區(qū)域、復(fù)制蛋白(Itep)和抗生素抗性基因(JP-A-03-259086)，還具有芽孢 桿菌菌株KSM-64的堿性纖維素酶K-64的啟動(dòng)子區(qū)和分泌信號(hào)區(qū)(JP-A-2000-287687)。具 體說(shuō)，向0. 1 0. 5ng的作為模板的環(huán)型質(zhì)粒中，加入20pmol的每個(gè)引入突變的引物對(duì)(例 如，序列識(shí)別號(hào)5和序列識(shí)別號(hào)9，或序列識(shí)別號(hào)7和序列識(shí)別號(hào)10)、20nmol的每個(gè)dNTPs、 5 μ LTakara Pyrobest DNA聚合酶的緩沖液和2U Pyrobest DNA聚合酶，來(lái)制備反應(yīng)溶液 (50 μ L)。作為聚合酶鏈反應(yīng)條件，94°C下變性1分鐘后，以94°C下1分鐘、55°C下1分鐘、 72°C下4分鐘的周期，重復(fù)30次(S卩，30個(gè)周期)。作為最后的反應(yīng)，混合物在72°C下孵育 10分鐘。所得到的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物用高純聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒(Roche)純化， 用100 μ L無(wú)菌水洗，單個(gè)片段用引物(序列識(shí)別號(hào)5和序列識(shí)別號(hào)7)擴(kuò)增，每個(gè)引物位于 單個(gè)片段的尾端。具體說(shuō)，將第一次聚合酶鏈反應(yīng)所得到的兩個(gè)片段的每一個(gè)100倍稀釋、 混合，然后用上述相同條件進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。擴(kuò)增的DNA片段用電泳法鑒定，用Nhe I 和Xba I消化。再通過(guò)使用DNA拼接試劑盒第2版(Takara Bio Inc.)，拼接到Nhe I和 Xba I消化得到的片段上。該片段是通過(guò)用PHA64-KP43H2作為模板，按照上述方法用序列 識(shí)別號(hào)6和序列識(shí)別號(hào)8的引物擴(kuò)增后用Nhe I和Xba I消化所得到的，其中包括四環(huán)素 抗性基因和KP43H2基因。。所得到的反應(yīng)溶液用高純聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒(Roche)純化，用100 μ L 無(wú)菌水洗。基于電穿孔法，使用基因脈沖試管(Biorad)將得到的DNA溶液用于芽孢桿菌菌 株KSM-KP43的轉(zhuǎn)化。在包含脫脂牛奶的堿性瓊脂培養(yǎng)基[1% (w/v)脫脂牛奶(Difco)、
細(xì)菌用胰蛋白胨(Difco)、0. 5%酵母提取物(Difco)、0. 5%氯化鈉、1.5%瓊脂、0. 05% 無(wú)水碳酸鈉、15ppm四環(huán)素]中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。再通過(guò)觀察脫脂牛奶裂解標(biāo)志的形成，來(lái)測(cè)定細(xì)胞中蛋白酶基因的出現(xiàn)或消失。選擇包含質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，該質(zhì)粒具有插入PHA64的 蛋白酶基因，將該轉(zhuǎn)化體用于進(jìn)一步培養(yǎng)。對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)化體，確定單個(gè)菌落形成和暈形成。之后，在含5mL起子培養(yǎng)基試管 中[6.0% (w/v)多聚蛋白胨S(Nihon Seiyaku)、0. 1 %酵母提取物、1. 0%麥芽糖、0. 02% 七水硫酸鎂、0. 磷酸二氫鉀、0. 3%無(wú)水碳酸鈉、30ppm四環(huán)素]中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，30°C下過(guò) 夜，320rpm下離心。在含有20mL主要介質(zhì)[8% (w/v)多聚蛋白胨S、0. 3 %酵母提取物、 10%麥芽糖、0. 04%七水硫酸鎂、0. 2%磷酸二氫鉀、1. 5%無(wú)水碳酸鈉、30ppm四環(huán)素]的 500mLSakaguChi燒瓶中培養(yǎng)(1% (ν/ν))得到的起始培養(yǎng)溶液，30°C下培養(yǎng)3天，121rpm下 離心。離心得到的培養(yǎng)物，上清液用于測(cè)定蛋白酶活性。用酪蛋白法測(cè)定蛋白酶活性。通 過(guò)使用蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(Wako Pure Chemicals)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比 于對(duì)照物(在相同條件下培養(yǎng)的PHA64-KP43H2轉(zhuǎn)化體)，用具有突變Rep基因的質(zhì)粒產(chǎn)生 的堿性蛋白酶KP43H2的活性提高了 8 12%的量(見表1)。另外，在培養(yǎng)物上清液中蛋 白質(zhì)的量幾乎與蛋白酶活性同比例增加，表明所得到的突變體含有提高蛋白質(zhì)的分泌所需 的突變。另外，從選擇的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，通過(guò)測(cè)序來(lái)測(cè)定其核苷酸序列。結(jié)果證實(shí)，生 成的質(zhì)粒與所想要突變體相符。表 1
Rep48位置KP43H2活性賴氨酸(天然)100丙氨酸112甘氨酸111蘇氨酸109精氨酸109谷氨酸111天冬酰胺108谷氨酰胺110除了在轉(zhuǎn)化體中酶分泌得到提高，由上述突變得到的堿性蛋白酶仍然保留了親代 堿性蛋白酶的性質(zhì)，例如氧化劑抗性和通過(guò)高濃度脂肪酸(由聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定的 分子量為43，000士2，000)抑制酪蛋白降解活性抗性，以及在堿性條件下的活性。實(shí)施例2 R印262位置的突變效應(yīng)與實(shí)施例1相似的方法，基于來(lái)源于芽孢桿菌菌株KSM-KP43的突變堿性蛋白酶的 生產(chǎn)效率，測(cè)定R印262位置的突變效應(yīng)。具體說(shuō)，通過(guò)使用0. 1 0. 5ng的pHA64_KP43H2作為模板，用引物對(duì)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，引入突變(例如，序列識(shí)別號(hào)5和序列識(shí)別號(hào)11，或序列識(shí)別號(hào)7和序列識(shí)別號(hào) 12)，用實(shí)施例1相似的方法得到兩個(gè)擴(kuò)增的片段。兩個(gè)片段在作為單個(gè)片段用引物(例如， 序列識(shí)別號(hào)5和序列識(shí)別號(hào)7)擴(kuò)增，每個(gè)引物位于單個(gè)片段的尾端。獲得的DNA片段用電 泳法鑒定，用Nhe I和Xba I消化。再通過(guò)使用DNA拼接試劑盒第2版(Takara Bio Inc.)， 將DNA片段拼接到Nhe I和Xba I消化得到的片段上。該片段是通過(guò)用pHA64_KP43H2作 為模板，按照上述方法用序列識(shí)別號(hào)6和序列識(shí)別號(hào)8的引物擴(kuò)增后用Nhe I和Xba I消 化所得到的，其中包括四環(huán)素抗性基因和KP43H2基因。接著，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過(guò)觀察從培養(yǎng)在包含脫脂牛奶的堿性瓊脂介質(zhì)的轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生的脫脂牛奶裂 解標(biāo)志的形成(實(shí)施例1)，來(lái)測(cè)定細(xì)胞中蛋白酶基因的出現(xiàn)或消失。質(zhì)粒具有插入PHA64的 蛋白酶基因，選擇含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，以實(shí)施例1相似的方法，再將其用于進(jìn)一步培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照物(在相同條件下培養(yǎng)的PHA64-KP43H2轉(zhuǎn)化體)，用具有 突變R印基因的質(zhì)粒產(chǎn)生的堿性蛋白酶KP43H2的活性增加了 3 13%的量(見表2)。另 外，在培養(yǎng)物上清液中蛋白質(zhì)的量幾乎與蛋白酶活性同比例增加，可以說(shuō)明所得到的突變 體含有提高蛋白質(zhì)的分泌所需的突變。另外，從選擇的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，通過(guò)測(cè)序來(lái)測(cè)定 其核苷酸序列。結(jié)果證實(shí)，生成的質(zhì)粒與所想要突變體相符。表 2
權(quán)利要求
一種質(zhì)粒載體，含有編碼質(zhì)粒復(fù)制蛋白的DNA，其中，所述復(fù)制蛋白包括選自用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被下列氨基酸殘基取代而成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。
2.一種質(zhì)粒載體，含有編碼質(zhì)粒復(fù)制蛋白的DNA，其中，所述復(fù)制蛋白包括與用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基 酸序列中的選自分別與序列識(shí)別號(hào)2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d) 位置198相對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被下列氨基酸殘基取 代而成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的質(zhì)粒載體，其中，所述質(zhì)粒載體進(jìn)一步包含基因的啟動(dòng)子區(qū)和分泌信號(hào)區(qū)的核苷酸序列，其中，所述基 因編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶。
4.如權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒載體，其中，編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)和分泌信號(hào)區(qū)的核苷 酸序列是具有由用序列識(shí)別號(hào)13表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 659號(hào)堿基的 核苷酸序列；具有由用序列識(shí)別號(hào)14表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 696號(hào) 堿基的核苷酸序列；與前述任意一個(gè)核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列；或前 述核苷酸序列中部分被刪除的核苷酸序列。
5.一種轉(zhuǎn)化體，其含有權(quán)利要求3或4所述的質(zhì)粒載體。
6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述質(zhì)粒載體的宿主是微生物。
7.一種制備多肽的方法，其包括如下步驟構(gòu)建質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含編碼目標(biāo)多肽的DNA和編碼質(zhì)粒復(fù)制蛋白的DNA，其中，所述復(fù)制蛋白包括選自用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b) 位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被下列氨基酸殘基取代而 成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主微生物；以及培養(yǎng)宿主微生物，并收集由此生成的目標(biāo)多肽。
8.一種制備多肽的方法，其包括如下步驟構(gòu)建質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含編碼目標(biāo)多肽的DNA和編碼質(zhì)粒復(fù)制蛋白的DNA，其中，所述復(fù)制蛋白包括與用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列具有至少80%同一性的 氨基酸序列中的選自分別與序列識(shí)別號(hào)2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和 (d)位置198相對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被下列氨基酸殘基 取代而成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主微生物；以及培養(yǎng)宿主微生物，并收集由此生成的目標(biāo)多肽。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述質(zhì)粒載體進(jìn)一步包含基因的啟動(dòng)子區(qū)和分泌信號(hào)區(qū)的核苷酸序列，其中，所述基 因編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)和分泌信號(hào)區(qū)的核苷 酸序列是具有由用序列識(shí)別號(hào)13表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 659號(hào)堿基的 核苷酸序列；具有由用序列識(shí)別號(hào)14表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 696號(hào) 堿基的核苷酸序列；與前述任意一個(gè)核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列；或前 述核苷酸序列中部分被刪除的核苷酸序列。
11.一種多肽，其按照權(quán)利要求7或8所述的方法制備而成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種質(zhì)粒載體以及提供使用該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，其中該質(zhì)粒載體具有高生產(chǎn)效率，可將其用于工業(yè)上有價(jià)值和有用的蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)。該質(zhì)粒載體具有編碼質(zhì)粒復(fù)制蛋白的DNA，其中，選自用序列識(shí)別號(hào)2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基分別被(a)丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)天冬酰胺和(d)谷氨酸所取代。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101978056SQ20098010983
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2009年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日
發(fā)明者伊澤啟文, 住友伸行, 瀧村靖 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社