專(zhuān)利名稱(chēng)：一種耐鹽堿基因去除標(biāo)記重組質(zhì)粒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明構(gòu)建了一種安全的植物抗逆表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)含有目的基因(SKCl)的該 載體在植物中的耐鹽性表達(dá)。本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自從1983年世界上誕生第一例轉(zhuǎn)基因植株以來(lái)，轉(zhuǎn)基因作物的安全性曾經(jīng)在全 球范圍引起很大爭(zhēng)議，一個(gè)主要的原因足在轉(zhuǎn)基因操作過(guò)程中的初期，為了篩選轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞，用于植物表達(dá)的載體往往含有抗生素基因和除草劑基因，而當(dāng)篩選得到目的細(xì)胞后，抗 生素基因就沒(méi)有用途了，但它在轉(zhuǎn)基因材料中的存在會(huì)特來(lái)環(huán)境和食品上的安全隱患。因 此，近些年來(lái)植物轉(zhuǎn)基因研究的熱點(diǎn)之一就是實(shí)現(xiàn)安全性標(biāo)記，其中位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng) 研究得最多也最深入，Cre/Loxp系統(tǒng)是這類(lèi)之一。Cre/loxp位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)是Steinberg等首先在大腸桿菌噬菌體pi中發(fā)現(xiàn) 的，由Cre重組酶和Ioxp位點(diǎn)兩部分組成。Cre重組酶是噬菌體pi編碼的分子量為38. 5kD 蛋白質(zhì)，由1029個(gè)核營(yíng)酸序列編碼，能識(shí)別并催化Ioxp位點(diǎn)的分子內(nèi)(切除、倒位)和分 子間(易位)的特異性重組。在研究Cre重組酶的結(jié)構(gòu)與功能過(guò)程中，Guo等發(fā)現(xiàn)該酶由折疊成較小的N —末 端和較大的C 一末端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，結(jié)構(gòu)域間通過(guò)一個(gè)較短的分隔區(qū)相連。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域 在結(jié)合位點(diǎn)周?chē)纬伞皧A子”結(jié)構(gòu)，以和DNA分子的大小溝部位充分接觸。N —末端和序列 的識(shí)別有關(guān)，由第20-120個(gè)氨基酸組成，包含5個(gè)a-螺旋(A，B，C，D，E)。其中螺旋C，D，E 形成反平行束，A，B螺旋垂直于3個(gè)反向平行束。螺旋B，D與DNA的大溝相連，螺旋A，E與 Cre重組酶四聚體的形成有關(guān)。C 一末端和DNA的結(jié)合及DNA鏈的切割有關(guān)，由第132-341 氨基酸組成，包含9個(gè)a-螺旋(F，G，H，I，J，K，L，M，N)，螺旋間有2個(gè)小的β —折疊片結(jié) 構(gòu)。C末端和DNA的接觸面復(fù)雜，大部分的螺旋和連接環(huán)均與DNA分子的大小溝及主鏈部位 相互作用。M和L形成一個(gè)疏水區(qū)，是Cre重組酶的主要活性中心。螺旋N遠(yuǎn)離其他螺旋， 有助于Cre亞基間相互接觸。在重組反應(yīng)中，與2個(gè)Ioxp位點(diǎn)結(jié)合的不同Cre亞基N —端 結(jié)構(gòu)相似，而分子間C 一末端構(gòu)象有很明顯的差異，這說(shuō)明不同Cre亞基在重組過(guò)程中所起 的作用不同。Ioxp位點(diǎn)是Cre重組酶介導(dǎo)重組反應(yīng)時(shí)的識(shí)別位點(diǎn)，長(zhǎng)34bp，包括8bp的間隔序 列及兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列。8bp間隔序列是Ioxp位點(diǎn)中唯一的不對(duì)稱(chēng)部位，其中8bp 的不對(duì)稱(chēng)間隔區(qū)是一段重要的核營(yíng)酸序列，重組過(guò)程中DNA鏈中DNA的切割和連接均在此 部位進(jìn)行。8bp的間隔區(qū)從功能上可分為以下3個(gè)部分6，7位是第一次鏈的交換和連接所 必需的；2，5位的4個(gè)堿基是第二次鏈的交換所必需的；1，8位的堿基改變后，如果與野生 型Ioxp位點(diǎn)組合，不會(huì)影響重組反應(yīng)的效率；如果2個(gè)Ioxp位點(diǎn)均為突變型，重組效率將 大大降。Cre重組酶與Loxp位點(diǎn)的反應(yīng)機(jī)制已做了非常深入的研究，其作用機(jī)制是一個(gè)識(shí) 別、切割、重組、連接、分離的過(guò)程，重組反應(yīng)是在DNA的兩個(gè)Ioxp位點(diǎn)間，過(guò)程中沒(méi)有DNA
3的合成和丟失，既可以發(fā)生在體內(nèi)、體外的細(xì)胞中，也可以在無(wú)細(xì)胞體系進(jìn)行。發(fā)生反應(yīng)時(shí) 每分子的Cre重組酶結(jié)合一個(gè)Ioxp位點(diǎn)的反向重復(fù)區(qū)，即4個(gè)Cre重組酶與2個(gè)Ioxp位 點(diǎn)結(jié)合，形成一個(gè)聯(lián)會(huì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，其中2個(gè)Cre重組酶分子具有重組活性，另外2個(gè)沒(méi)有 重組活性。Cre重組酶先和DNA結(jié)合，但開(kāi)始結(jié)合力較弱，當(dāng)遇到Ioxp位點(diǎn)時(shí)結(jié)合力大大增 強(qiáng)，當(dāng)有2個(gè)Ioxp時(shí)結(jié)力更強(qiáng)。然后C末端保守的酪氨酸(Tyr-324)與DNA分子的3’_P04 結(jié)合形成3’ 一磷酸酪氨酸，導(dǎo)致DNA鏈的切割；切割后產(chǎn)生的5' -OH既可與同一斷裂部 位的3’_P04結(jié)合恢復(fù)為原來(lái)的構(gòu)型，也可與另一切割部位的3’_P04結(jié)合發(fā)生鏈的交換，形 成一個(gè)“Holliday結(jié)構(gòu)”的中間產(chǎn)物；繼而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)的異構(gòu)化，這時(shí)第一次切割的2個(gè)Cre 酶不再起切割作用，而是由另外2個(gè)Cre酶進(jìn)行第二次鏈的切割和交換，去掉中間產(chǎn)物發(fā)生 重組，這樣便完成了基因的插入或刪除。Ioxp位點(diǎn)的8bp非對(duì)稱(chēng)間隔區(qū)決定了重組反應(yīng)的模式，位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)根 居識(shí)別位點(diǎn)方向和位置的不同，能夠產(chǎn)生3種效應(yīng)，分別為①當(dāng)一對(duì)反向識(shí)別位點(diǎn)位于目的基因的兩端時(shí)，在對(duì)應(yīng)重組酶的作用下，識(shí)別位 點(diǎn)間的所有基因?qū)l(fā)生倒置，即倒位(Inversion)。②當(dāng)一對(duì)同向識(shí)別位點(diǎn)位于目的基因的兩端時(shí)，其相應(yīng)的重組酶將刪除識(shí)別位點(diǎn) 之間的所有外源基因和一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，最后在基因組中只留下一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，這就是重組 (Recombination) 0③如果識(shí)別位點(diǎn)分別位于細(xì)胞中不同的染色體上，那么在對(duì)應(yīng)重組酶的作用下， 兩條染色體可以在識(shí)別位點(diǎn)的位置發(fā)生染色體片段的互換，產(chǎn)生雜合的染色體，這種作用 就叫作位置互換(Translocation)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)一種安全的植物抗逆表達(dá)載體，目的是為培育環(huán)境安全、抗逆性?xún)?yōu)良 的轉(zhuǎn)基因植物提供一種有效的表達(dá)載體。用該載體轉(zhuǎn)化植物，可以有效剔除選擇標(biāo)記，篩選 獲得耐鹽堿轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的安全性植物抗逆表達(dá)載體，其特征是用SKCl及35S啟動(dòng)子替換了基礎(chǔ)載體PX6-GFP的GFP序列而構(gòu)建成的，這個(gè) 基因位于載體T-DNA左邊界LB和右邊界RB序列之間，它含有的XVE雜合蛋白與誘導(dǎo)物 17- β -雌二醇結(jié)合后可啟動(dòng)重組酶CRE的表達(dá)，從而剔除選擇標(biāo)記，啟動(dòng)子為人工啟動(dòng)子 G10-35S，目的基因是耐鹽性基因SKCl。本載體中的啟動(dòng)子是35S，這個(gè)啟動(dòng)子克隆于ΡΒΙ121。本發(fā)明的安全性耐鹽堿植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，獲得含有該載體的大 腸桿菌轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的安全性耐鹽堿植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌ΕΗΑ105，獲得含有該載體的農(nóng)桿 菌轉(zhuǎn)化子，利用該轉(zhuǎn)化子，可以獲得環(huán)境安全耐鹽堿的轉(zhuǎn)基因植物。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化率較高；并且本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因玉米具有較好的 耐鹽堿特性。
具體實(shí)施例方式為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實(shí)施例。其作用被理解為是對(duì)本發(fā)明的闡釋而 非對(duì)本發(fā)明的任何形式的限制。實(shí)施例1 安全性植物抗逆表達(dá)載體PX6-35S-SKC1的構(gòu)建首先將質(zhì)粒PX6-GFP中的GFP替換成啟動(dòng)子35S(啟動(dòng)子片段來(lái)源于PBI121 其 構(gòu)建過(guò)程是PCR法擴(kuò)增出PBI121中的35S的核苷酸序列，連接入PX6-GFP載體得到的。) 用SpeI、XhoI雙酶切除PX6-GFP的GFP啟動(dòng)子，在切除的GFP位置連接入35S啟動(dòng)子，獲得 中間載體PX6-35S。用SpeI單酶切載體PSK-SKCl，獲得兩端帶有SpeI酶切位點(diǎn)的SKCl基因。再用SpeI單酶切中間載體PX6-35S。載體構(gòu)建的最后一步將兩個(gè)反應(yīng)連接。表1. 1、表1. 2和表1. 3是上述實(shí)驗(yàn)涉及到的酶切反應(yīng)體系，電泳條件和連接反應(yīng) 體系。表1. 1 HindIII和KpnI雙酶切反應(yīng)和電泳體系 37°C 反應(yīng)過(guò)夜，然后用 1XTAE(0. 04mol/L Tris-乙酸，0. OOlmol/LEDTA)配制 0. 8%瓊脂糖凝膠，在瓊脂糖凝膠內(nèi)加入EB (溴化乙錠)至終濃度為0. 5 μ g/ml，在5V/cm的 電壓下電泳。表1. 2連接反應(yīng)體系 16°C反應(yīng)1小時(shí)。表1.3 SpeI單酶切反應(yīng)和電泳體系 37°C 反應(yīng)過(guò)夜，然后用 1XTAE(0. 04mol/L Tris-乙酸，0. OOlmol/LEDTA)配制 0. 8%瓊脂糖凝膠，在瓊脂糖凝膠內(nèi)加入EB (溴化乙錠)至終濃度為0. 5 μ g/ml，在5V/cm的 電壓下電泳。實(shí)施例2 含PX6-35S-SKC1的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的獲得
大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞的制備取存于_70°C的菌種在LB(配制方法見(jiàn)表 2. 1)平板上劃線(xiàn)活化，37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)；挑取單菌落在5ml LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；取200 μ 1培養(yǎng)過(guò)夜的菌液加入到20ml LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培 養(yǎng)3-4小時(shí)，至0D_值在0. 3-0. 4之間，將菌液分裝于1. 5ml離心管中，冰浴10分鐘，4°C 4000rpm(約1600g)離心10分鐘；棄上清，用Iml冰預(yù)冷的0. IMCaCl2溶液重懸，冰浴30分 鐘，4°C 4000rpm離心10分鐘，重復(fù)此步驟一次；棄上清，用100 μ 1冰預(yù)冷的0. IM CaCl2和 100 μ 1甘油重懸菌體，即得到感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞可立即凍存于-70備用。0. IM CaCl2 和甘油使用前均經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘。取實(shí)施例1中的連接產(chǎn)物(含有目的基因SKC1) 10 μ 1加入到感受態(tài)細(xì)胞DH5 α 懸液中，冰浴30分鐘，之后42°C熱激90秒，然后迅速插入冰中，并于2-4分鐘，隨后加入 800 μ 1的LB培養(yǎng)基，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)1. 5-2. 0小時(shí)。4000rpm離心5分鐘，倒出上清， 用剩余的上清重懸菌體，均勻涂布在含50 μ g/ml kanamycin的LB平板上37°C培養(yǎng)過(guò)夜。 挑取長(zhǎng)出的菌落2-3個(gè)，接種于5ml LB培養(yǎng)液中(含50 μ g/mlkanamycin)，37°C 200rpm振 蕩培養(yǎng)過(guò)夜，用堿裂解法小量制備質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切檢測(cè)后，挑出陽(yáng)性克隆，其所對(duì)應(yīng)菌 落即為轉(zhuǎn)化子，保存于-70°C。表2. ILB液體培養(yǎng)基的成分 溶解后pH值用NaOH調(diào)到為7. 0。若為固體培養(yǎng)基，則加入1. 5%的瓊脂粉。實(shí)施例3 含載體PX6-35S-SKC1的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的獲得農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞的制備取保存于_70°C的EHA105菌種在含50 μ g/ml rifampicin的LB (配制方法見(jiàn)表2. 1)平板上劃線(xiàn)活化，28°C培養(yǎng)36-48小時(shí)；挑取單菌落 在5ml含50 μ g/ml的rifampicin的LB培養(yǎng)基中，于28°C在200rpm條件下振蕩培養(yǎng)24小 時(shí)。按1 100大比例將菌液轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，于28°C在200rpm條件下振蕩培養(yǎng)6-7 小時(shí)，至OD6c 值為0.6。收集菌液分裝于1.5mL離心管中，然后13000rpm離心30s，棄上 清。用800 μ 1的250mM的CaCl2重懸菌體沉淀，13000rpm離心30s，棄上清。用100 μ 1的 250m的CaCl2溶液重懸沉淀，冰上放置4小時(shí)，即為感受態(tài)細(xì)胞，保存于_70°C備用。250mM 的CaCl2溶液使用前經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘。取實(shí)施例2中含PX6-35S-SKC1的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子提取的質(zhì)粒 (PX6-35S-SKCl)6y 1于100 μ 1體積的農(nóng)桿菌ΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞懸液中，立即于冰上放置 30min,然后從冰上取出迅速浸入液氮中5min，再37°C水浴5min。最后加入800 μ 1體積的 LB液體培養(yǎng)基，28°C溫育3-5小時(shí)后，4000rm離心5分鐘，倒出上清，用剩余的上清重懸菌 體，均勻涂布在含50 μ g/ml的kanamycin、50 μ g/ml的rifampicin的LB平板上28°C培養(yǎng) 36-48小時(shí)。挑取長(zhǎng)出的菌落2-3個(gè)作PCR檢測(cè)，陽(yáng)性菌落即為轉(zhuǎn)化子，保存于-70°C。實(shí)施例4 利用含PX6-35S-SKC1的農(nóng)桿菌獲得轉(zhuǎn)基因玉米
a.外植體準(zhǔn)備已經(jīng)獲得的玉米胚性愈傷組織(自交系為H99和JYQ22)。b.菌液準(zhǔn)備。將帶有PX6-35S-SKC1的EHA105農(nóng)桿菌分別涂在含有50 μ g/ml的 kanamycin、50y g/ml的rifampicin, pH7. 0的YEB (見(jiàn)表4. 2)平板上活化，挑取單菌落，用 YEB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至0D_值在0. 6-1. 0之間，收集菌體，用MSZ液體培養(yǎng)基重懸至0D_ 值為1. 0，溫育4小時(shí)左右備用。c.轉(zhuǎn)化、共培養(yǎng)。將胚性愈傷組織在上述菌液中浸泡30min，吸干菌液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基 I中共培養(yǎng)3天。d.抑菌、篩選。共培養(yǎng)后經(jīng)過(guò)含有頭孢霉素(400mg/L)溶液的洗滌、去菌，轉(zhuǎn)入篩 選培養(yǎng)基II中，連續(xù)繼代兩次(約7天一次)。待農(nóng)桿菌被抑制住之后(約3周)存活的 愈傷組織轉(zhuǎn)到恢復(fù)培養(yǎng)基III中，繼代1-2次后將愈傷組織移到再生培養(yǎng)基IV中，繼代2 次后，待綠苗約2-3cm時(shí)將綠苗轉(zhuǎn)到含有β -雌二醇的生根培養(yǎng)基V中，綠苗在培養(yǎng)基V中 生根且β-雌二醇誘導(dǎo)去除卡那霉素標(biāo)記基因。e.根系發(fā)育完好后移栽到溫室。上述玉米轉(zhuǎn)化所需的培養(yǎng)基見(jiàn)表4. 1。表4. 1玉米轉(zhuǎn)化所需的培養(yǎng)基(pH6. 0)
7 表4. 2 YEB培養(yǎng)基的成分 滅菌后加IOOmM MgSO4至終濃度為2mM ； IOOmM MgSO4溶液，高溫滅菌后用。實(shí)施例5 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以此DNA作為PCR檢測(cè)的模板，設(shè)計(jì)引物 對(duì)SKCl是否轉(zhuǎn)入玉米進(jìn)行檢測(cè)。PCR引物為上游引物5‘ -ATGAGTTCTCTGGATGCCACT-3 ‘下游引物5‘ -TTATTCTATCTTCCATGCCTGACC-3 ‘PCR程序?yàn)槭紫?4°C變性2min ；然后30個(gè)循環(huán)循環(huán)步驟為94°C變性30s，56°C 退火45s，72°C延伸90s ；最后72°C補(bǔ)充延伸IOmin0PCR檢測(cè)結(jié)果表明目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入玉米中。Kan標(biāo)記基因的PCR檢測(cè)引物為5' CTCTGATGCCGCCGTGTT 3'5' CCCTGATGCTCTTCGTCCA 3'PCR反應(yīng)程序?yàn)槭紫?4°C變性5min ；然后30個(gè)循環(huán)循環(huán)步驟為94°C變性lm， 55°C退火lm，72°C延伸lm30s ；最后72°C補(bǔ)充延伸IOmin0 PCR檢測(cè)結(jié)果表明部分Kan標(biāo)
記基因已經(jīng)去除。實(shí)施例6 利用PX6-35S-SKC1獲得的轉(zhuǎn)基因玉米的耐鹽堿性后代轉(zhuǎn)基因植株在花盆中經(jīng)過(guò)耐鹽堿性試驗(yàn)，表現(xiàn)出比對(duì)照較好的耐鹽堿性。
權(quán)利要求
一種耐鹽堿基因去除標(biāo)記重組質(zhì)粒載體，其特征是用SKC1及35S啟動(dòng)子替換了基礎(chǔ)載體PX6 GFP的GFP序列而構(gòu)建成的，這個(gè)基因位于載體T DNA左邊界LB和右邊界RB序列之間，它含有的XVE雜合蛋白與誘導(dǎo)物17 β 雌二醇結(jié)合后可啟動(dòng)重組酶CRE的表達(dá)，從而剔除選擇標(biāo)記，啟動(dòng)子為人工啟動(dòng)子G10 35S，目的基因是耐鹽性基因SKC1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征是載體中的啟動(dòng)子是35S，這個(gè)啟動(dòng)子克 隆于 ΡΒΙ121。
全文摘要
一種耐鹽堿基因去除標(biāo)記重組質(zhì)粒載體，屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，是用SKC1及35S啟動(dòng)子替換了基礎(chǔ)載體PX6-GFP的GFP序列而構(gòu)建成的，這個(gè)基因位于載體T-DNA左邊界LB和右邊界RB序列之間，它含有的XVE雜合蛋白與誘導(dǎo)物17-β-雌二醇結(jié)合后可啟動(dòng)重組酶CRF的表達(dá)，從而剔除選擇標(biāo)記，啟動(dòng)子為人工啟動(dòng)子G10-35S，目的基因是耐鹽性基因SKC1。本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化率較高；并且本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因玉米具有較好的耐鹽堿特性。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101921803SQ201010132540
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者于志晶, 李淑芳, 林秀峰, 馬瑞 申請(qǐng)人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院