專利名稱：合成磷酸二酯寡核苷酸及其治療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及范圍從40mer至65mer的名為Nmer的合成磷酸二酯寡核苷酸混合物， 特別是使用這些寡核苷酸治療疾病，包括癌癥。磷酸二酯寡核苷酸優(yōu)選的為雜聚物，在其各 個位置可由A、G、C和T之一組成，但也可為同聚物，即寡核苷酸的各個位置可為相同的堿基。
背景技術(shù)：
術(shù)語去纖維蛋白多核苷酸(defibrotide)定義了從動物和/或植物組織，特 別是從豬或牛的腸中(US 3，770，720和US 3，899，481)通過抽提得到的單鏈寡核苷 酸(15-80mer，平均45mer)的復(fù)雜混合物。具有16. 5士2. 5kDa平均分子量的去纖維蛋 白多核苷酸通常以堿金屬(一般為鈉)鹽的形式使用。去纖維蛋白多核苷酸主要以其 抗血栓活性使用(US3，829，567)，但也可用于其他應(yīng)用如，例如，急性腎功能不全的治療 (US4, 694, 134)和急性心肌缺血的治療(US 4，693，995)。其他去纖維蛋白多核苷酸的文獻 引用如下。US 5，081，109公開了去纖維蛋白多核苷酸在治療高級階段(I I I和IV階段)的 外周動脈病中的用途。US 5，116，617公開了強化人毛細血管的方法，包含局部施用包括去纖維蛋白多核 苷酸的組合物。US 5，977，083公開了通過應(yīng)答觀察到的常規(guī)、疾病和修復(fù)標記的波動(例如，增 加、減少、出現(xiàn)、消失)修飾去纖維蛋白多核苷酸的劑量可治療多種病情。US 6，046，172公開了具有4000-10000道爾頓分子量的動物來源寡脫氧核糖核苷 酸，其可通過多聚脫氧核糖核苷酸分級分餾得到，或通過高分子量脫氧核糖核酸的化學(xué)或 酶促解聚得到。US 6，699，985和US 5，624，912公開了使用去纖維蛋白多核苷酸治療各種病癥 (包括HIV感染)的方法。US 7，338，777公開了測定去纖維蛋白多核苷酸生物學(xué)活性的方法。EP1276497公開了通過去纖維蛋白多核苷酸與至少一種具有動員造血祖細胞能力 的造血因子(例如G-CSF)組合或相繼施用，提高哺乳動物外周血中的干細胞和祖細胞的量 的方法。W02005023273公開了去纖維蛋白多核苷酸的抗腫瘤作用。W02006094916公開了去纖維蛋白多核苷酸在治療血管生成依賴性腫瘤中的用途。此外，Kornblum等人的一篇綜述文章“Defibrotide，a PolydisperseMixture of Single Stranded Phosphodiester Oligonucleotides withLifesaving Activity in Severe Hepatic Veno-occlusive Disease :Clinical Outcomes and Potential Mechanisms of Action, "(Oligonucleotides, 16 :105_114(2006))討論了去纖維蛋白多核 苷酸及其在治療靜脈閉塞病(VOD)中的用途。1998年，馬薩諸塞州波士頓市Dana-Farber癌癥研究所的PaulRichardson博士開始將去纖維蛋白多核苷酸用于骨髓移植后的嚴重肝VOD(靜脈阻塞性疾病)的治療。藥物 經(jīng)靜脈給藥，幾乎沒有毒性并治愈了約40%-50%的患者，而該病迄今的致死率為95%。之 后，美國和歐洲多個機構(gòu)的實驗確認了去纖維蛋白多核苷酸的效力，盡管其作用機制未知。US 4，985，552和US 5，223，609描述了制備去纖維蛋白多核苷酸的方法，該方法 得到的產(chǎn)物具有穩(wěn)定和非常確定的物化特征，并且不具有任何不期望的副作用。EP1325162公開了測定去纖維蛋白多核苷酸生物學(xué)活性的方法。幾十年來人們認定磷酸二酯寡核苷酸由于核酸酶的消化不能作為藥物使用，但是 人們忽略了由于其低毒性可以對患者以大劑量施用。去纖維蛋白多核苷酸的臨床經(jīng)驗明確 指示了可以使用這些種類的分子，且具有治療效力。然而，因為去纖維蛋白多核苷酸為自然 產(chǎn)物，就其是否可被同一的再生產(chǎn)而言目前仍存在疑問。因此，在本領(lǐng)域內(nèi)需要發(fā)展出一種 組合物，其具有和去纖維蛋白多核苷酸相同的效用但可以被同一的再生產(chǎn)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療疾病或病癥的方法，包含施用合成磷酸二酯寡核苷酸混合物，所 述合成磷酸二酯寡核苷酸長度為約40堿基至約65堿基，優(yōu)選的為約40堿基至約60堿基， 更優(yōu)選的為約45堿基至約60堿基，約45堿基至約55堿基或約50堿基至約55堿基。本發(fā)明也包括藥物組合物，所述藥物組合物基本上由具有上述平均長度的合成磷 酸二酯寡核苷酸和藥物載體(和任選的可藥用的賦形劑和/或佐劑)組成，并不含有其他 實質(zhì)影響合成的磷酸二酯寡核苷酸活性的成分。 在本發(fā)明的方法中，所述寡核苷酸可為單鏈的；所述寡核苷酸序列可為DNA和/或 RNA序列；所述寡核苷酸序列也可為隨機序列。在本發(fā)明的方法中，所述寡核苷酸的嘌呤堿基可選自鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和次 黃嘌呤，嘧啶堿基可選自胞嘧啶、胸腺嘧啶、甲基胞嘧啶和尿嘧啶；所述寡核苷酸的糖可選 自核糖和脫氧核糖。在本發(fā)明的方法中，疾病或病癥可為靜脈閉塞病、血栓性血小板減少性紫癜、腫 瘤、血管生成依賴性腫瘤或使用抗凝血劑導(dǎo)致的疾病或病癥；所述方法也可用于通過去纖 維蛋白多核苷酸與至少一種具有動員造血祖細胞能力的造血因子組合或相繼施用，以提高 哺乳動物外周血中的干細胞和祖細胞的量。本發(fā)明的這些方面和其他方面在參考下面的詳述和附圖之后將是顯而易見的。此 處引用的所有出版物、專利和專利申請，無論是上述或下述的，在此以其整體引入作為參考。詳細說明定義為了更好的理解本發(fā)明，給出下述定義核苷酸是由3部分組成的化學(xué)化合物雜環(huán)堿基、糖和一或多個磷酸基團。在最常 見的核苷酸中，堿基是嘌呤或嘧啶的衍生物，糖是戊糖(5碳糖)脫氧核糖或核糖。核苷酸 是核酸例如DNA或RNA的單體。寡核苷酸是短序列的核苷酸，一般為20或更少堿基。自動化合成儀能合成長達 160至200堿基的寡核苷酸。合成堿基的長度通常以“mer”表示(來自“希臘語”meros “部 分”)。例如，25個堿基的片段稱為25-mer。
磷酸二酯鍵是在磷酸基團中的磷原子和2個其他分子間以2個酯鍵連接的一組強 共價鍵。磷酸二酯鍵構(gòu)成DNA和RNA鏈的骨架。DNA和RNA是稱為核苷酸的簡單單元的長多聚體，具有經(jīng)磷酸二酯鍵連接的糖和 磷酸基團構(gòu)成的骨架。每個糖上連接有4種堿基分子中的一種。在DNA和RNA中，磷酸二 酯鍵連接核糖的3'碳原子和5'碳原子。DNA通常為雙鏈的，通常包括2種嘌呤堿基，鳥嘌呤和腺嘌呤，和2種嘧啶堿基，胞 嘧啶和胸腺嘧啶。在一些情況下，嘌呤和嘧啶堿基可被其突變形式替換鳥嘌呤和腺嘌呤可 分別被黃嘌呤和次黃嘌呤替換，而胞嘧啶可被甲基胞嘧啶替換。RNA和DNA非常類似，但是 在一些重要的結(jié)構(gòu)細節(jié)存在差異RNA —般是單鏈，而DNA—般為雙鏈。并且，RNA核苷酸包 括核糖，而DNA包括脫氧核糖；此外，RNA包含尿嘧啶而不是存在于DNA中的胸腺嘧啶。隨機核苷酸序列是基本上包括等量的2種不同嘌呤堿基和2種不同嘧啶堿基的混 合物的核苷酸序列，其中在序列的各個位置，各個嘌呤或嘧啶堿基具有25% 士5的出現(xiàn)概 率，優(yōu)選的25% 士2的出現(xiàn)概率，更優(yōu)選的25% 士 1的出現(xiàn)概率。如此處使用的，術(shù)語“分離的”是指提及的物質(zhì)已從其天然被發(fā)現(xiàn)的環(huán)境中移除， 表征為在特定的樣品中有足夠的量確立存在?？赏ㄟ^任意標準技術(shù)進行這些表征，如，例如 測序、雜交、免疫實驗、功能性實驗、表達、大小測定等等。因此，如果一種生物學(xué)物質(zhì)不具有 細胞組分(即發(fā)現(xiàn)或自然產(chǎn)生所述物質(zhì)的細胞組分)，則可為“分離的”。分離的細胞器、細胞或組織是指已從其被發(fā)現(xiàn)的來源生物的解剖位點(細胞、組 織或生物)去除的細胞器、細胞或組織。分離的物質(zhì)可為“純化的”或非“純化的”。如此處 使用的，術(shù)語“純化的”是指在可檢測的減少或消除其他污染物質(zhì)的條件下分離得到的物質(zhì) (例如，核酸分子或蛋白質(zhì))。污染物可能或可能不包括得到所述純化物質(zhì)的天然物質(zhì)。純 化的物質(zhì)優(yōu)選的包括少于約90%、少于約75%、少于約50%、少于約25%、少于約10%、少 于約5%或少于約2%的以重量計的其他與所述物質(zhì)本來相關(guān)的組分。除非特別提出反例，本發(fā)明的實施將應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的分子生物學(xué)、細 胞生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)的傳統(tǒng)方法，為了說明的目的以下詳細描述。這些技術(shù)在文獻中 充分解釋。見，例如，Sambrook，等人，“MolecularCloning :A Laboratory Manual”(第 二 片反，1989) ； "DNA Cloning =APractical Approach, ^ I&I I，， (D. Glover % )； "OligonucleotideSynthesis" (N. Gait 編，1984) ；"Nucleic Acid Hybridization" (B. Hames&S. Higgins編，1985) ；Perbal,"A Practical Guide to MolecularCloning，，(1984)； Ausubel 等人，"Current protocols in MolecularBiology" (New York, John Wiley and Sons, 1987) ；Bonifacino 等人，"Current Protocols in Cell Biology" (New York, John ffiley&Sons,1999)。術(shù)語“約”是指特定數(shù)值在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員測定的可接受誤差范圍內(nèi)，其部分 取決于所述數(shù)值是如何測量或確定的，即測量系統(tǒng)的限制。例如，“約”可表示在本領(lǐng)域每次 實施的可接受標準差內(nèi)。或者，“約”可表示給定數(shù)值的多至士20%、優(yōu)選的多至士 10%、更 優(yōu)選的多至士5%和更優(yōu)選的多至士 的范圍?；蛘?，特別是就生物學(xué)系統(tǒng)或方法而言， 所述術(shù)語可表示在數(shù)值范圍的數(shù)量級范圍內(nèi)，優(yōu)選的在2倍內(nèi)。當(dāng)在本申請和權(quán)利要求書 中描述特定數(shù)值時，除非另外說明，術(shù)語“約”是隱含的，在此上下文中的意思是特定數(shù)值在 可接受的誤差范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的上下文范圍中，當(dāng)涉及任意此處列舉的疾病病癥時，術(shù)語“治療 (treat) ”、“治療(treatment)，，或類似用語是指預(yù)防、緩解或減輕至少一種與所述病癥相 關(guān)的癥狀，或減慢或逆轉(zhuǎn)所述病癥的進程。例如，在本發(fā)明的意圖內(nèi)，術(shù)語“治療(treat)” 也表示阻止、延緩發(fā)病(即，疾病的臨床顯現(xiàn)之前的時期)和/或降低疾病發(fā)展或惡化的風(fēng) 險。此處使用的術(shù)語“保護”是指預(yù)防、延緩、治療或以上全部，視受試者疾病的發(fā)展、持續(xù) 或加重情況而定。和本發(fā)明組合物相連使用的詞組“可藥用的”是指所述組合物的分子實體和其他 成分當(dāng)施用于如哺乳動物(例如人)的動物時為生理學(xué)可容許的，并且一般不引起不利反 應(yīng)。優(yōu)選的，如此處使用的，術(shù)語“可藥用的”是指被聯(lián)邦管理機構(gòu)或州政府認可的，或列于 美國藥典或其他公認的藥典中用于哺乳動物，更具體的用于人的組合物。如此處使用的，措辭“合成磷酸二酯寡核苷酸混合物”是指具有相同和/或不同序 列的合成磷酸二酯寡核苷酸的混合物。根據(jù)第一個實施方案，所述混合物可包括具有相同 序列的寡核苷酸和具有不同序列的寡核苷酸兩者；其中，所述具有不同序列的寡核苷酸可 具有相同或不同的長度。根據(jù)第二個實施方案，所述混合物可由具有不同序列但相同長度 的寡核苷酸組成。術(shù)語“施用(administering)，，或“施用(administration)，，旨在包含將化合物直 接或間接遞送至其預(yù)期作用位點的所有方法。術(shù)語“動物”是指任意動物，包括哺乳動物，特別是人。附圖簡述包括的附圖僅僅是用于說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，不以任何方式限制本發(fā)明， 其中圖IA為條帶強度，顯示了對于ClRNH32P-OdT18與bFGF的結(jié)合，去纖維蛋白多核苷 酸和具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分對其的競爭。圖IB為標準化的條帶強度對去纖維蛋白多核苷酸或具去纖維蛋白多核苷酸分子 量的部分的濃度log值作圖。圖2為圖表，表中顯示了在ClRNH32P-OdT18與bFGF的結(jié)合中，去纖維蛋白多核苷 酸、具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer競爭物的K。值比較。圖3A為條帶強度，顯示了烷化寡脫氧核苷酸ClRNH32P-OdT18對PDGF BB的修飾。圖3B為相對條帶強度對具反應(yīng)性的寡脫氧核苷酸濃度的作圖。圖3C為圖3B中數(shù)據(jù)的雙倒數(shù)作圖。圖4為圖表，表中顯示了在ClRNH32P-OdT18與bFGF的結(jié)合中，去纖維蛋白多核苷 酸、具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer競爭物的K。值比較。圖5為圖表，表中顯示了在ClRNH32P-OdT18與VEGF的結(jié)合中，Nmer和Tmer競爭物 的K。值比較。圖6為圖表，表中顯示了在ClRNH32P-OdT18與層粘連蛋白的結(jié)合中，Nmer和Tmer 競爭物的K。值比較。圖7為圖表，表中顯示了在ClRNH32P-OdT18與層粘連蛋白的結(jié)合中，Nmer和Tmer 競爭物的K。值比較。圖8A為圖表，顯示了去纖維蛋白多核苷酸對bFGF介導(dǎo)的HMEC-I增殖的抑制。
圖8B為圖表，顯示了去纖維蛋白多核苷酸在bFGF不存在的情況下對細胞生長的 抑制作用。圖9A為圖表，顯示了 Nmer對bFGF介導(dǎo)的HMEC-I增殖的抑制。圖9B為圖表，顯示了 Nmer在bFGF不存在的情況下對細胞生長的抑制作用。

圖10為圖表，顯示了去纖維蛋白多核苷酸和Nmer對部分凝血致活酶時間(PTT) 的影響。圖IlA為圖表，顯示了將HMEC-I細胞暴露于濃度漸增的去纖維蛋白多核苷酸24 小時后，TFPI的劑量依賴性釋放至條件培養(yǎng)液中。圖IlB為圖表，顯示了在用5μΜ去纖維蛋白多核苷酸誘導(dǎo)下，TFPI釋放至條件培 養(yǎng)基中的時程。圖IlC為圖表，顯示了將HMEC-I細胞暴露于濃度漸增的去纖維蛋白多核苷酸30 分鐘后，TFPI的劑量依賴性釋放至條件培養(yǎng)液中。圖12Α為圖表，顯示了將HMEC-I細胞暴露于濃度漸增的具去纖維蛋白多核苷酸分 子量的部分后，TFPI的劑量依賴性釋放至條件培養(yǎng)液中。圖12Β為圖表，顯示了在用5μΜ去纖維蛋白多核苷酸誘導(dǎo)下，TFPI釋放至條件培 養(yǎng)基中的時程。圖13為圖表，顯示了在用bFGF+肝素刺激的、FGFR2轉(zhuǎn)染的Cll細胞的增殖中，去 纖維蛋白多核苷酸和Nmer替代肝素的能力。發(fā)明詳述寡核苷酸，如去纖維蛋白多核苷酸，可以結(jié)合與肝素結(jié)合的蛋白質(zhì)。如此處使用 的，術(shù)語肝素是指低親和性肝素。可以制備與天然產(chǎn)物具有相當(dāng)或更高活性的去纖維蛋白 多核苷酸的合成類似物，并且這些類似物具有抗癌活性，因為它們能夠與結(jié)合肝素的生長 因子結(jié)合。3種對癌癥細胞具有重要作用的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)包括堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和層粘連蛋白；本發(fā)明的組合物可以納摩爾的親和力與 這些蛋白質(zhì)結(jié)合，然而這種結(jié)合不是序列特異性的。本發(fā)明組合物以下述驚人發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)具有約40mer至約65mer長度的合成磷酸 二酯寡核苷酸混合物可重現(xiàn)去纖維蛋白多核苷酸的特性，因此可作為此活性成分的合成替 代物使用。本發(fā)明的寡核苷酸可優(yōu)選的具有約40-60mer的長度，優(yōu)選的約45-60mer ；根據(jù) 本發(fā)明較好的實施方案，所述寡核苷酸可具有約45-55mer的長度，優(yōu)選的約50-55mer。本發(fā)明寡核苷酸的嘌呤堿基優(yōu)選的選自鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤，嘧啶 堿基選自胞嘧啶、胸腺嘧啶、甲基胞嘧啶和尿嘧啶。根據(jù)一個實施方案，寡核苷酸序列由各 遺傳堿基(A、G、C和T)在各個位置混合組成；優(yōu)選的為隨機序列。根據(jù)另一個實施方案，寡 核苷酸序列的各個位置由相同的堿基(如胸腺嘧啶，即Tx)組成(稱為Tm系列，或Tmer)。 根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明寡核苷酸的糖選自核糖和脫氧核糖。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明寡核苷酸由DNA和/或RNA序列組成。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明寡核苷酸為單鏈。在實驗部分顯而易見，本發(fā)明者令人驚訝的發(fā)現(xiàn)去纖維蛋白多核苷酸的低分子量 級分，特別是低于40kDa分子量的級分與肝素結(jié)合生長因子的結(jié)合能力較低。由此，這一發(fā) 現(xiàn)使選擇定義明確的寡核苷酸混合物成為可能，所述寡核苷酸可被容易和同一的復(fù)制，并能夠模擬去纖維蛋白多核苷酸的效果。因此，本發(fā)明混合物可用于治療患有可施用去纖維蛋白多核苷酸治療的疾病的哺 乳動物患者，優(yōu)選的為人，所述疾病如V0D、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、腫瘤、血管生 成依賴性腫瘤(如多發(fā)性骨髓瘤或乳腺癌)；這些混合物也可作為抗凝血劑使用，或當(dāng)與至 少一種具有動員造血祖細胞能力的造血因子組合或相繼施用時，用于提高哺乳動物外周血 中的干細胞和祖細胞的量。本發(fā)明的寡核苷酸混合物可以與去纖維蛋白多核苷酸相同的方式施用；優(yōu)選的， 其可通過注射施用，優(yōu)選的靜脈內(nèi)注射，通過水溶液進行。所述水溶液的寡核苷酸可具有從 5至60微摩爾/升的濃度，優(yōu)選的從10至50微摩爾/升。
實施例通過參考以下的非局限性實施例，可更好的理解本發(fā)明。材料與方法合成磷酸二酯寡核苷酸的生成為生成一系列Nmer，使用了 DNA測序儀(通常可購買到，例如從ABI或Millipore 公司)。在測序反應(yīng)中使用等量的(通過摩爾濃度測定)各種堿基(腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌 呤和胸腺嘧啶)。將儀器的程序設(shè)定為生成隨機長度的單鏈DNA，長度從25堿基至200堿 基，其中每個堿基從4種遺傳堿基中隨機選擇。細胞培養(yǎng)SV40轉(zhuǎn)化的HMEC-I細胞從Atlanta，GA的⑶C獲得。細胞培養(yǎng)于添加10%熱失活 的胎牛血清(FBS)、10ng/ml EGF、1 μ g/mL氫化可的松、100U/ml青霉素G鈉和100 μ g/mL硫 酸鏈霉素的MCDB 131培養(yǎng)液中。無支原體的人黑色素瘤細胞系518A2從Austria Vienna 大學(xué)的Volker Wacheck博士處獲得。細胞培養(yǎng)于添加10%熱失活FBS、100U/ml青霉素 G鈉和100 μ g/mL硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。人肝臟星狀細胞LX2細胞系由SV40T抗 原在低血清條件下自發(fā)永生化生成，由紐約的Mount Sinai School ofMedicine的Scott L. Friedman博士提供。LX2細胞培養(yǎng)于添加1 %熱失活FBS、100U/ml青霉素G鈉和100 μ g/ mL硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。原種培養(yǎng)物于濕潤的5% CO2培養(yǎng)箱中于37°C維持培養(yǎng)。去纖維蛋白多核苷酸、具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分和合成磷酸二酯寡核 苷酸的生成去纖維蛋白多核苷酸，一種由單鏈磷酸二酯多聚脫氧核糖核酸(分子量為 16. 5士2. 25kDa)組成的高度復(fù)雜的多分散物質(zhì)，是通過從豬腸組織提取的DNA的受控解聚 制備得到，由GentiunKComo，Italy)提供。具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分是從豬腸 組織分離的去纖維蛋白多核苷酸經(jīng)分餾得到(A2、E2、G2、12和L2，分別具有分子量9，353、 12，258、16，761,21, 840和26，190道爾頓)，也由Gentium提供。Nmer (—系列具有多種確 定長度的合成磷酸二酯寡核苷酸)和Tmer (—系列具有確定長度的胸腺嘧啶均聚體的合 成磷酸二酯寡核苷酸)通過上述詳細步驟合成和純化，由Trilink Biotechnologies (San Diego, CA)提供。重組蛋白質(zhì)和細胞培養(yǎng)材料重組人bFGF和VEGF165，血小板來源的生長因子_BB(PDGF BB)和結(jié)合肝素的表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)購自R&D Systems (Minneapolis, MN)。層粘連蛋白購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。DMEM、MCDB 131、M199 培養(yǎng) 液和FBS購自Invitrogen (Carlsbad, CA)。纖維連接蛋白包被的板和基質(zhì)膠購自 BD Bioscience(Bedford, ΜΑ) IMUBIND Total TFPI ELISA 試劑盒購自 American Diagnostica(Stanford, CT)。烷基化寡脫氧核苷酸探針ClRNH32P-OdT18的合成100D U的OdT18經(jīng)5 ‘-多核苷酸激酶反應(yīng)在5 ‘端用[32P]磷酸標記。多余的ATP 通過在0. IM高氯酸鋰中的S印hadex G25層析從反應(yīng)產(chǎn)物中分離。之后加入2% LiClO4/ 丙酮沉淀寡核苷酸，并將寡核苷酸以2000D U/ μ 1濃度溶解于水中。之后加入8%溴化十六 烷基三甲銨的水溶液沉淀寡核苷酸并干燥。之后在干燥的寡核苷酸中依次加入6. 5mg溶 于20 μ 1 二甲基甲酰胺中的P-(芐氨基)-N-氯乙基-N-甲胺(ClRNH2)、8mg 二硫聯(lián)吡啶和 9. 5mg三苯基膦。2小時后，加入2% LiClO4/丙酮沉淀寡核苷酸，溶解于25 μ IlMNaCl，用 乙醇沉淀并干燥。終產(chǎn)物再次溶解于水中，并于-80°C貯存。肝素結(jié)合蛋白的ClRNH32P-OdT18修飾使用 Yakubov 等人(Oligonucleotides interact with recombinantCD4at multiple sites. J. Biol. Chem. 1993268 :19918-18823)的方法進行肝素結(jié)合蛋白的 ClRNH32P-OdT18 修飾。起初，將 bFGF(50nM 濃度)、PDGF BB (500nM)、VEGF(150nM)、層粘連蛋 白(50nM)或 HB-EGF(400nM)在包含 10-20μΜ ClRNH32P-OdT18 的 0. IM Tris-HCl ρΗ 7.4 中孵育。去纖維蛋白多核苷酸、具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分、Tmer或Nmer以遞 增的濃度作為探針磷酸二酯寡核苷酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合競爭物使用。在37°C孵育1小時后， 加入1體積的包含10%甘油、4% β-巰基乙醇、4% SDS和0. 2%溴酚藍的緩沖液，并進行 SDS-PAGE。將凝膠干燥并在Kodak X光膠片上曝光直至條帶顯現(xiàn)。將膠片顯影，通過激光 密度測定法定量條帶強度。增殖實驗匯合的HMEC-I細胞在原位用包含2. 5% FBS的M199培養(yǎng)液處理24小時，之后接 種(2x IO4細胞/孔)于纖維連接蛋白包被的96孔板中(在添加2. 5% FBS的M199培養(yǎng) 液中)。之后，將培養(yǎng)液替換為僅包含20ng/mLbFGF的新鮮培養(yǎng)液，或包含去纖維蛋白多核 苷酸或Nmer及包含或不包含bFGF的新鮮培養(yǎng)液。在37°C處理3天后，通過磺基羅丹明B 染色評價細胞生長。所有實驗一式4份進行。組織因子途徑抑制劑(TFPI)釋放的測定HMEC-細胞以IOxlO4細胞/孔密度接種于24孔板中，使用包含2. 5% FBS的M199 培養(yǎng)液。細胞用去纖維蛋白多核苷酸、具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分或Nmer處理不 同時間。之后，收集經(jīng)條件細胞培養(yǎng)液，在10，OOOg離心10分鐘以去除細胞碎片，使用ELISA 實驗按照制造商的描述測量培養(yǎng)液中組織因子途徑抑制劑(TFPI)的濃度。結(jié)果具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer對于肝素結(jié)合蛋白的相互作用類似去纖維蛋白多核苷酸、具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer與肝素結(jié)合 蛋白相互作用，肝素結(jié)合蛋白在腫瘤生長、存活、腫瘤血管生成和遷移中起重要作用。通過 競爭實驗對去纖維蛋白多核苷酸、具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer與肝素結(jié)合蛋白的結(jié)合能力進行評估。首先，合成烷基化的32P-標記的磷酸二酯ISmer胸腺嘧啶 同聚物(ClRNH32P-OdT18)。將此分子與bFGF、PDGF BB、BB、VEGF、層粘連蛋白或HB-EGF混 合，在包含10-20 μ M標記探針和遞增濃度的去纖維蛋白多核苷酸、具去纖維蛋白多核苷 酸分子量的部分或Nmer的0. IM Tris-HCl ρΗ7. 4中孵育。之后將混合物經(jīng)凝膠電泳分 離并放射自顯影。去纖維蛋白多核苷酸、具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer是 ClRNH32P-OdT18結(jié)合的競爭物，因此是蛋白質(zhì)被放射性標記的寡核苷酸烷基化的競爭物。 ClRNH32P-OdUi這些蛋白質(zhì)的Kd值以前已被測定對bFGF的平均Kd為0. 5 μ M(Guvakova, 等 人， “Phosphorothioate oligodeoxynucIeotides bindto basic fibroblast growth factor, inhibit its binding to cellsurface receptors, and remove it from low affinity binding sites onextracellular matrix" , J. Biol. Chem. ,1995, (270) 2620-2627)，對層粘連蛋白的平均 Kd 為 14 μ M(Khaled，等人〃 Multiple mechanisms maycontribute to the cellular antiadhesive effects of phosphorothioateoligodeo xynucleotides"，Nucl.Acids Res.，1996，(24) 737-745)。為測定對 VEGF165 的 Kd，檢測了 ClRNH32P-OdT18對VEGF修飾的濃度依賴性(圖3A)。這些結(jié)果描述于圖3B，其中修飾寡脫 氧核苷酸的濃度作為凝膠條帶強度的函數(shù)作圖。VEGF與修飾寡脫氧核苷酸的結(jié)合展示了近 似飽和結(jié)合，并可通過Michaelis-Menton型的單位點結(jié)合方程描述。圖3C描述了圖3B中 數(shù)據(jù)的雙倒數(shù)重新作圖。這些數(shù)據(jù)為線性的(R2 = 0. 98)，直線與橫坐標的交點對應(yīng)于明顯 的33. 9 μ M的Kd值。對PDGF BB和HB-EGF進行了類似的實驗。Kd分別為4. 5和8. 7 μ Μ。Kc通過Cheng和Prusoff描述的方程1計算方程IKc = IC50/ (1+ [ClRNH32P-OdT18] /Kd在圖IA中顯示了與bFGF結(jié)合的競爭。按照方程1，凝膠條帶的標準化強度對競爭 物濃度的作圖為線性的(圖1B)。經(jīng)觀察測定IC5(I。也測定了不同競爭物對所有目的蛋白 質(zhì)的類似競爭結(jié)合。按照同樣的方法測定K。值，并總結(jié)于圖2、4、5、6和7的表中。Nmer (以長度依賴方式)和去纖維蛋白多核苷酸抑制肝素結(jié)合生長因子對于組織 培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)化了 SV40的HMEC-I細胞生長的最大刺激能力細胞因子刺激的細胞生長通過使用磺基羅丹明B(SRB)測定。這些實驗在SV40轉(zhuǎn) 化的HMEC-I細胞中進行，用bFGF刺激其生長。細胞在用包含2. 5% FBS的M199培養(yǎng)液中 用bFGF處理前，在O%血清中培養(yǎng)24小時，以上調(diào)bFGF細胞表面受體，之后在包含20ng/ mL bFGF及包含或不包含遞增濃度的去纖維蛋白多核苷酸或Nmer的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天。 如圖8和9顯示，兩種Nmer以長度依賴方式(長度約45核苷酸或更多的有作用)和去纖 維蛋白多核苷酸引起了 bFGF誘導(dǎo)的最大細胞增殖的小幅降低(在Nmer的情況下，為長度 依賴性的)。與未刺激組和bFGF對照相比，HMEC-I細胞的增殖率在用bFGF處理后增長了 60-70%。在加入bFGF之前1小時加入去纖維蛋白多核苷酸的抑制作用和二者同時加入觀 察到的抑制作用相比沒有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。去纖維蛋白多核苷酸和Nmer毒性的評估去纖維蛋白多核苷酸和Nmer的主要毒性，凝血病和出血，是由于寡核苷酸與凝血 級聯(lián)中的肝素結(jié)合成員結(jié)合并抑制其功能的結(jié)果。通過部分凝血致活酶時間(PTT)評估抗 凝血作用。將健康志愿者的血漿與各種濃度的去纖維蛋白多核苷酸或Nmer混合，進行標準 PTT實驗。如圖10顯示，去纖維蛋白多核苷酸和Nmer沒有引起顯著的PTT升高。僅在高濃度的去纖維蛋白多核苷酸N50或N60( 100 iiM)存在時觀察到PTT的延長(與對照相比 為1. 5-1. 7倍，圖10)。對較長的Nmer，N80，這一作用甚至在25 yM濃度時觀察到。去纖維蛋白多核苷酸、具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer提高組織因 子途徑抑制劑(TEPI)的合成和從HMEC-1細胞中的釋放為研究去纖維蛋白多核苷酸如何影響TEPI的急性和長期釋放，進行了濃度和時 程研究，TEPI為HMEC-1細胞中減弱凝血病的蛋白質(zhì)。在選定的時間間隔內(nèi)收集HMEC-1細胞 的條件培養(yǎng)液，根據(jù)制造商的描述使用ELISA實驗測定TEPI水平。如圖11A顯示，12.5PM 去纖維蛋白多核苷酸引起了培養(yǎng)液中TEPI的時間依賴性增加，在20-30分鐘后引起了大量 釋放(與對照細胞相比為5-6倍的增加)。在急性期(30分鐘)，遞增濃度的去纖維蛋白多 核苷酸對HMEC-1的刺激引起了 TEPI釋放的濃度依賴性增加，在12. 5 y M的去纖維蛋白多 核苷酸濃度下達到平臺(圖11C)。細胞與12. 5PM具去纖維蛋白多核苷酸分子量的部分或Nmer孵育24小時后，與未刺激的細胞 相比引起了培養(yǎng)液中TEPI的7-8倍增加。C11細胞有絲分裂發(fā)生的測定C11克隆是經(jīng)基因改造過表達成纖維細胞生長因子受體l(FGFR-l)的BAF3小鼠 淋巴樣細胞，bFGF與成纖維細胞生長因子受體1的結(jié)合具有高(pM)親和力。這些細胞來 自 D. Ornitz (Washington University, St. Louis)。bFGF 對這些細胞的增殖是絕對必需 的；此外，早就知道肝素對bFGF的活性是必需的。早已證明DF和Nmer可將bFGF從其細 胞外基質(zhì)的低親和力(nM)位點去除(Guvakova，等人，“Phosphorothioateoligodeoxynu cleotides bind to basic fibroblast growth factor, inhibit its binding to cell surface receptors,and remove it fromlow affinity binding siteson extracellular matrix"，J. Biol. Chem.，1995，(270)2620-2627)。本發(fā)明者現(xiàn)在想確定 DF 和 Nmer 是否可 影響bFGF與其高親和力結(jié)合位點的結(jié)合。由此，將C11細胞用缺乏IL-3的RPMI培養(yǎng)液清 洗2次。以每孔2. 2xl04細胞接種于48孔板中。加入bFGF (終濃度InM)和DF或Nmer (終 濃度10 u M)或肝素(1 u g/mL)至終體積為200 u L。將細胞(每個實驗n = 3)培養(yǎng)2_3 天，用磺基羅丹明藍(SRB)染色。將細胞數(shù)標準化至對照水平(不存在bFGF、肝素或寡核 苷酸情況下的增殖)。如圖13所示，bFGF或肝素本身在3天后對細胞增殖具有很少或沒有 作用。肝素和DF均加強bFGF的活性，證明DF可替代肝素的作用。然而，DF沒有影響bFGF 與其高親和力結(jié)合位點的結(jié)合。Nmer,以長度依賴方式，也可替代DF或肝素的作用，但是在 達到約80mer長度之前，其活性不如DF顯著。結(jié)論本發(fā)明的合成磷酸二酯寡核苷酸(Nmer)事實上可重現(xiàn)去纖維蛋白多核苷酸的特 性。評估和比較了 Nmer和去纖維蛋白多核苷酸在與肝素結(jié)合蛋白(包括bFGF、PDGF BB、VEGF165、層粘連蛋白和HB-EGF)的結(jié)合能力以及引起HMEC-1細胞釋放TEPI的能力。 Nmer可經(jīng)普通鹽水或5%葡萄糖水溶液的靜脈內(nèi)輸注施用于患有癌癥或V0D(或可通過施 用去纖維蛋白多核苷酸治療的其他疾病)的患者，以10mg/kg至60mg/kg體重的劑量每日1 次劑量或分幾次劑量施用約14天。取決于個體患者對治療的具體療程的反應(yīng)可調(diào)整劑量。bFGF、PDGF和各種長度Nmer的K。值(圖2、4、5、6和7)證明了約至少40mer長度的Nmer就足以達到最大Nmer活性。這些K。值也證明更長的Nmer對總體肝素結(jié)合蛋白 的親和力增加很少；因此，基于其更高的重量/劑量比和合成的困難程度，具有長度約大于 65mer的Nmer作為去纖維蛋白多核苷酸的替代物似乎是沒有必要的。因此可使用具有長度從約40mer至約65mer的合成磷酸二酯寡核苷酸作為去纖維 蛋白多核苷酸的替代物，具體的，它們可用于上述題為“發(fā)明背景”的章節(jié)中公開的所有治 療的應(yīng)用，所述章節(jié)在此處以其整體引用作為參考。本發(fā)明的優(yōu)點之一是相關(guān)藥物制劑的劑量可作為合成磷酸二酯寡核苷酸的濃度 函數(shù)確定，而不是生物學(xué)活性函數(shù)，目前使用的抽提來源的寡核苷酸混合物即為后者情況。本發(fā)明的另一個優(yōu)點體現(xiàn)在下述事實本發(fā)明提供了僅活性序列的施用；因此， 如果與例如抽提來源的寡核苷酸混合物相比的話，本發(fā)明提供了每劑量更少的寡核苷酸的 施用，就效力、安全性和副作用而言均具有明顯優(yōu)勢。本發(fā)明至此描述完畢，顯而易見的，可以對上述實施方案進行各種改變和修改而 不背離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
具有長度為約40堿基至約65堿基的合成磷酸二酯寡核苷酸混合物。
2.權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸具有約40堿基至約60堿基的長度。
3.權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸具有約45堿基至約60堿基的長度。
4.權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸具有約45堿基至約55堿基的長度。
5.權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸具有約50堿基至約55堿基的長度。
6.權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸為單鏈。
7.權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸序列為DNA和/或RNA序列。
8.權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸序列為隨機序列。
9.權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸的嘌呤堿基選自鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和 次黃嘌呤，嘧啶堿基選自胞嘧啶、胸腺嘧啶、甲基胞嘧啶和尿嘧啶。
10.權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸的糖選自核糖和脫氧核糖。
11.權(quán)利要求1至10的混合物，作為藥物使用。
12.權(quán)利要求1至10的混合物，用于治療和/或預(yù)防靜脈閉塞病。
13.權(quán)利要求1至10的混合物，用于治療和/或預(yù)防血栓性血小板減少性紫癜。
14.權(quán)利要求1至10的混合物，用于治療腫瘤。
15.權(quán)利要求1至10的混合物，用于治療血管發(fā)生依賴性腫瘤。
16.權(quán)利要求1至10的混合物，當(dāng)與至少一種具有動員造血祖細胞能力的造血因子組 合或相繼施用時，用于提高哺乳動物外周血中的干細胞和祖細胞的量。
17.權(quán)利要求1至10的混合物，作為抗凝血劑使用。
18.包含權(quán)利要求1至10的混合物的藥物制劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物制劑，其特征在于所述藥物制劑為水溶液。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物制劑，其特征在于所述藥物制劑經(jīng)靜脈內(nèi)施用。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物制劑，其特征在于對哺乳動物施用所述藥物制劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的藥物制劑，其特征在于所述哺乳動物為人。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的水溶液，其特征在于具有5至60微摩爾/升的寡核苷酸濃度。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的水溶液，其特征在于具有10至50微摩爾/升的寡核苷酸濃度。
25.治療疾病或病癥的方法，包含施用具有長度為約40堿基至約65堿基的合成磷酸二 酯寡核苷酸混合物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述寡核苷酸具有約40堿基至約60堿基的長度。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述寡核苷酸具有約45堿基至約60堿基的長度。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述寡核苷酸具有約45堿基至約55堿基的長度。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述寡核苷酸具有約50堿基至約55堿基的長度。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述寡核苷酸為單鏈。
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述寡核苷酸序列為DNA和/或RNA序列。
32.權(quán)利要求25的方法，其中所述寡核苷酸序列為隨機序列。
33.權(quán)利要求25的方法，其中所述寡核苷酸的嘌呤堿基選自鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和 次黃嘌呤，嘧啶堿基選自胞嘧啶、胸腺嘧啶、甲基胞嘧啶和尿嘧啶。
34.權(quán)利要求25的方法，其中所述寡核苷酸的糖選自核糖和脫氧核糖。
35.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病或病癥為靜脈閉塞病。2
36.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病或病癥為血栓性血小板減少性紫癜。
37.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病或病癥為腫瘤。
38.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病或病癥為血管發(fā)生依賴性腫瘤。
39.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病或病癥為使用抗凝血劑導(dǎo)致的疾病或病癥。
40.提高哺乳動物外周血中的干細胞和祖細胞的量的方法，所述方法包含具有約40堿 基至約65堿基長度的合成磷酸二酯寡核苷酸混合物與至少一種具有動員造血祖細胞能力 的造血因子組合或相繼施用。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述寡核苷酸具有約40堿基至約60堿基的長度。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述寡核苷酸具有約45堿基至約60堿基的長度。
43.權(quán)利要求40的方法，其中所述寡核苷酸具有約45堿基至約55堿基的長度。
44.權(quán)利要求40的方法，其中所述寡核苷酸具有約50堿基至約55堿基的長度。
45.權(quán)利要求40的方法，其中所述寡核苷酸為單鏈。
46.權(quán)利要求40的方法，其中所述寡核苷酸序列為DNA和/或RNA序列。
47.權(quán)利要求40的方法，其中所述寡核苷酸序列為隨機序列。
48.權(quán)利要求40的方法，其中所述寡核苷酸的嘌呤堿基選自鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和 次黃嘌呤，嘧啶堿基選自胞嘧啶、胸腺嘧啶、甲基胞嘧啶和尿嘧啶。
49.權(quán)利要求40的方法，其中所述寡核苷酸的糖選自核糖和脫氧核糖。
全文摘要
本發(fā)明生成了模擬去纖維蛋白多核苷酸作用的各種確定長度的磷酸二酯寡核苷酸組合物。所述組合物基本上由包含范圍從40mer至60mer的Nmer的合成磷酸二酯寡核苷酸混合物組成。磷酸二酯寡核苷酸優(yōu)選的為雜聚物，在其各個位置可由A、G、C和T之一組成，但也可為同聚物，即寡核苷酸的各個位置可為相同的堿基。這些混合物在治療癌癥及其他疾病中有作用。
文檔編號C12N15/117GK101978059SQ200980109725
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月19日
發(fā)明者A·C·施泰因, M·亞科貝利 申請人:真蒂奧姆有限公司