專利名稱：一種手足口病單、雙價(jià)基因工程亞單位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種疫苗及其制備方法，特別涉及一種手足口病
單、雙價(jià)基因工程亞單位疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
手足口病是由小RNA病毒科，腸道病毒屬病毒引起的，現(xiàn)已成為危害嬰幼兒健康 和公共衛(wèi)生安全的重要傳染病。手足口病主要由腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16 型(Cox.A16)引起。感染EV71和Cox.A16所引起的臨床癥狀難于區(qū)別。感染EV71常常并 發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)炎癥，包括病毒性腦膜炎，腦炎，以及類似小兒麻痹的癱瘓，引起的肺水腫、肺 出血經(jīng)常導(dǎo)致嬰幼兒的快速死亡。Cox. A16是引起心肌炎、心包炎、心肌病及其它嚴(yán)重疾病 的重要病原。手足口病從感染到出現(xiàn)癥狀通常為3-6天。病人常在口中出現(xiàn)瘡，手掌、腳底 出現(xiàn)皮膚紅疹。有些病例，主要是小于3歲的嬰幼兒，會出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，短期發(fā)燒后突 然惡化，并快速死亡。 目前尚無有效的疫苗或藥物可防治手足口病。 自1974年首次報(bào)道EV71以來，EV71已在世界范圍內(nèi)引起多次爆發(fā)流行。近10年 來，EV71病毒的流行在亞太地區(qū)猖獗，不僅發(fā)病人數(shù)多，而且死亡病例多。中國大陸地區(qū)于 1981年由上海首次報(bào)道手足口病，此后，北京、山東、廣東等十幾個(gè)省份均有本病暴發(fā)流行 的報(bào)道。2007年山東臨沂等地區(qū)發(fā)生手足口病流行，發(fā)病39606例，死亡14例。2008年， 中國內(nèi)地共報(bào)告手足口病病例488955例，死亡126例。自2008年5月2日起，衛(wèi)生部將手 足口病納入丙類法定傳染病管理。2009年手足口病疫情仍在中國大陸蔓延。
流行病學(xué)資料顯示，Cox. A16 —般和EV71相伴流行，在流行過程中，考慮到Cox. A16多導(dǎo)致無癥狀感染，可能在流行中所占實(shí)際比例更高。2008年安徽阜陽手足口病疫情 發(fā)生后，中國疾病預(yù)防控制中心在全國范圍內(nèi)病例標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果顯示，在582個(gè) 手足口病病例陽性標(biāo)本中，EV71占54. 5%， Cox. A16占17. 4%。 由EV71或Cox.A16引起的手足口病反復(fù)爆發(fā)可能是新的基因型在世界范圍內(nèi)傳 播所致。對1970-2004年全球EV71分離株的分子流行病學(xué)分析顯示，EV71病毒分為3個(gè) 基因型，即A， B， C型，8個(gè)基因亞型，即B1-B4和C1-C4亞型。對1983-2003年福島地區(qū) (Fukushima， Japan) Cox. A16分離株進(jìn)行遺傳重建顯示，Cox. A16分離株形成了 3個(gè)不同的 遺傳簇(A， B， C)。對1999-2004年中國深圳地區(qū)EV71和Cox. A16分離株進(jìn)行遺傳重建分 析，表明EV71病毒主要流行C4亞型，Cox. A16病毒主要流行C型。進(jìn)幾年從中國大陸手足 口病輕癥病例和重癥病例標(biāo)本中分離到的EV71病毒主要為C4亞型，Cox. A16病毒主要為C 型。 EV71和Cox. A16病毒顆粒均為二十面體立體對稱的球形結(jié)構(gòu)，無包膜和突起。病 毒粒子的衣殼由60個(gè)亞單位構(gòu)成，后者又是由4種衣殼蛋白(VP1-VP4)拼裝成的五聚體樣 結(jié)構(gòu)?？乖瓫Q定簇基本上位于VP1-VP3上，而VP4包埋在病毒外殼的內(nèi)側(cè)。EV71和Cox. A16病毒基因組均為7400-7420個(gè)核苷酸的單股正鏈RNA，基因組中僅有一個(gè)開放閱讀框，編碼含約2190-2200個(gè)氨基酸的多聚蛋白，在其兩側(cè)為5'和3'-非編碼區(qū)(UTRs)，在其 3' -UTRs區(qū)的末端含有一個(gè)長度可變的poly-A。多聚蛋白可進(jìn)一步被水解成P1、P2、P3前 體蛋白。PI前體蛋白編碼VP1、VP2、VP3、VP4病毒外殼蛋白；P2和P3前體蛋白編碼7個(gè)非 結(jié)構(gòu)蛋白(2A-2C和3A-3D)。 在脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗和減毒活疫苗的啟發(fā)下，已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)室開展手足口病滅活 疫苗和減毒活疫苗的研究，取得了一些進(jìn)展，但距離臨床應(yīng)用仍有一段距離。曾有EV71福 爾馬林滅活疫苗成功地控制EV71在保加利亞傳播的報(bào)道，但未見再次使用滅活疫苗的報(bào) 道。中國臺灣何美鄉(xiāng)篩選了一株適于制備EV71滅活疫苗的病毒株YN3-4a，病毒產(chǎn)生量高、 免疫原性強(qiáng)、交叉保護(hù)譜廣、子代病毒穩(wěn)定性高。在弱毒活疫苗的研制方面，中國臺灣余俊 強(qiáng)使用EV71和Cox. A16弱毒株免疫小鼠獲得了對EV71強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)，表明具有交叉 保護(hù)功能。日本Minetaro Arita采用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救弱毒株EV71 (Sl-3')，免疫短尾 猴后，神經(jīng)毒力降低，而具有廣譜的交叉保護(hù)活性。弱毒活疫苗，由于EV71和Cox.A16毒力 決定基團(tuán)至今不清， 一段時(shí)間內(nèi)難以研究成功。 在傳統(tǒng)疫苗研究的同時(shí)，亞單位疫苗的實(shí)驗(yàn)室研究取得了可喜的進(jìn)展。采用畢赤 酵母、大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、沙門氏菌、百日咳細(xì)菌等表達(dá)了 EV71和Cox.A16的結(jié)構(gòu)蛋白 VP1，并利用病人陽性血清證實(shí)表達(dá)的VP1蛋白具有免疫原性。昆蟲細(xì)胞和沙門氏菌表達(dá)的 VP1結(jié)構(gòu)蛋白以及使用VP1基因研制的DNA疫苗免疫小鼠后能夠誘導(dǎo)對EV71或Cox. A16感 染的保護(hù)。 病毒樣顆粒(VLP)是由病毒衣殼蛋白組成的不含病毒核酸的病毒粒子空殼。由 于VLP表面的病毒抗原和多肽表位與真正的病毒幾乎沒有區(qū)別，因此能引起強(qiáng)的免疫反 應(yīng)，且不具有潛在的副作用，是目前認(rèn)為最有潛力的疫苗研究方向。乙肝病毒VLP疫苗 (Recombivax HB， Merck)和乳頭瘤病毒VLP疫苗(Gardisil， Merck)已經(jīng)上市。臺灣學(xué)者 胡育誠表達(dá)、純化了 EV71 VLP，并免疫小鼠，表明VLP疫苗比滅活疫苗、VP1蛋白疫苗、VP1 DNA疫苗能夠剌激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫保護(hù)，展示了較好的應(yīng)用前景。 盡管進(jìn)行了有關(guān)EV71和Cox.A16疫苗的開發(fā)工作，但是目前仍然未開發(fā)出有醫(yī)藥 商業(yè)應(yīng)用價(jià)值的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防手足口病的腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒 A16型(Cox.A16)的單、雙價(jià)基因工程亞單位疫苗；本發(fā)明的目的還在于公開上述疫苗的制 備方法。 本發(fā)明目的是通過如下方案實(shí)現(xiàn)的。 本發(fā)明單價(jià)亞單位疫苗由EV71 VLP抗原或Cox. A16 VLP抗原與Al (0H)3佐劑按 下述重量百分比含量配制而成EV71 VLP抗原或Cox. A16 VLP抗原 0. 0015-0. 003重量份 Al (0H) 3佐劑 0.25-0.5重量份。 本發(fā)明雙價(jià)亞單位疫苗由EV71VLP抗原和Cox. A16VLP抗原與Al (0H)3佐劑按下 述重量百分比含量配制而成EV71VLP抗原和Cox. A16VLP抗原 0. 0015-0. 002重量份
5
Al (OH) 3佐劑 0. 25-0. 5重量份； 其中EV71VLP抗原和Cox.A16VLP抗原的比例為1 : 1。
本發(fā)明單、雙價(jià)疫苗的制備方法包括如下步驟 a，通過基因工程手段分別獲得重組桿狀病毒Bac-EV71-Pl-3CD和Bac-Cox. A16-P1-3CD，分別在昆蟲細(xì)胞中高效共表達(dá)類似SeQ ID NO. 1EV71P1、 SeQ IDNO. 2Cox. A16P1和3CD蛋白，并分別自組裝成EV71VLP和Cox. A16VLP ;
b，建立并檢定疫苗株三級種子批庫； c，采用無血清培養(yǎng)基高密度懸浮培養(yǎng)來自Sf-9/Hi-5細(xì)胞系的昆蟲細(xì)胞； d，在細(xì)胞長成1. 5-2X106細(xì)胞/ml時(shí)，接種重組桿狀病毒； e，病毒在細(xì)胞中增殖并高效共表達(dá)Pl和3CD蛋白，產(chǎn)生VLP ; f，裂解昆蟲細(xì)胞并收集細(xì)胞所產(chǎn)生的懸液，澄清過濾，去除昆蟲細(xì)胞殘?jiān)?g，超濾濃縮病毒VLP懸液； h，超濾濃縮后的病毒懸液，通過凝膠過濾層析和離子交換層析純化病毒VLP，或者
通過蔗糖密度梯度離心純化病毒VLP，得純化的病毒原液，即抗原； i，配制及檢定疫苗半成品及成品，測量疫苗的安全性、有效性及穩(wěn)定性。 其中，a步驟中Pl和3CD基因序列采用RT-PCR方法擴(kuò)增手足口病病毒株獲得SeQ
IDNO. 1 EV71 Pl和3CD基因序列利用RT-PCR方法擴(kuò)增EV71(H13-Henan-08)病毒RNA獲得，
SeQ ID NO. 2Cox. A16P1和3CD基因序列利用RT-PCR方法擴(kuò)增Cox. A16 (S10-shandong-08)
病毒RNA獲得，基因均克隆入pMD18-T載體后測序表明正確；P1和3CD基因序列也可采用
全基因合成的方式獲得，并根據(jù)昆蟲偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化。 b步驟中建立并檢定疫苗株三級種子批庫，即原始種子批、主種子批和工作種子批 的方法為原始種子批為經(jīng)過噬斑純化的Sf-9細(xì)胞上的4代毒種；驗(yàn)明原始種子批的記 錄、歷史、來源和生物學(xué)特性；從原始種子批在Sf-9細(xì)胞上傳至第5代為主種子批；主種子 批在Sf-9細(xì)胞上繼續(xù)傳代總次數(shù)不超過12代制備工作種子批。 f步驟中收獲細(xì)胞裂解所產(chǎn)生的懸液后通過濾器進(jìn)行澄清過濾，濾器孔徑優(yōu)選為 0. 45 li m 。 g步驟中超濾濃縮病毒VLP懸液的超濾膜的截留分子量優(yōu)選100-300KD，濃縮倍數(shù) 優(yōu)選100倍。 h步驟中病毒液純化的具體步驟為 凝膠過濾層析和離子交換層析純化進(jìn)行凝膠過濾層析，介質(zhì)采用合適的凝膠過 濾介質(zhì)，如德國Merk公司生產(chǎn)的Fractolgel，平衡液優(yōu)選pH6. 5_7. 5的PBS ;再進(jìn)行離 子交換層析，優(yōu)選使用弱陰離子交換介質(zhì)，例如Merck公司生產(chǎn)的Fractogel EMD DEAE， 緩沖鹽溶液優(yōu)選磷酸鹽緩沖系統(tǒng)，平衡緩沖液優(yōu)選鹽濃度范圍0. 05-0. 1M， pH6. 5-7. 5，含 0. 06-0. 12M的氯化鈉；洗脫緩沖液優(yōu)選鹽濃度0. 05-0. 1M， p朋.5_7. 5，含0. 2_0. 4M的氯化 鈉； 或蔗糖密度梯度離心純化優(yōu)選使用不連續(xù)蔗糖密度梯度為15%、30%和65%， 30000g超速離心3小時(shí)后，收集15-35%蔗糖界面上的乳白色條帶； 經(jīng)過上述純化后，細(xì)胞殘余DNA含量低于100pg/ml，得純化的EV71VLP病毒原液或 Cox. A16VLP病毒原液，即EV71VLP抗原或Cox. A16VLP抗原。
i步驟中的疫苗半成品和成品是指將上述純化的VLP病毒原液配制成藥學(xué)接受的 載體標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液，穩(wěn)定劑，稀釋劑，防腐劑，增溶劑；或配制成便于緩釋的劑型，或添加 鋁鹽吸附佐劑，或注射劑型；優(yōu)選將上述純化的EV71VLP病毒原液和Cox.A16VLP病毒原液， 按常規(guī)比例混合制備成二價(jià)的形式。
其中，本發(fā)明疫苗的使用劑量為 單價(jià)一人份為0. 5ml，含EV71VLP抗原或Cox.A16VLP抗原1. 5-3 y g， Al (OH) 3佐 劑0. 25-0. 5mg ; 雙價(jià)一人份為0. 5ml，含EV71VLP抗原和Cox. A16VLP抗原共1. 5-3 ii g， A1(0H)3 佐劑0. 25-0. 5mg。 下述實(shí)驗(yàn)例或?qū)嵤├M(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :制備本發(fā)明手足口病亞單位疫苗 1、重組桿狀病毒Bac-EV71-Pl-3CD和Bac-Cox. A16-P1-3CD的制備
細(xì)胞采用非洲綠猴腎傳代細(xì)胞系(Vero細(xì)胞系)和昆蟲細(xì)胞系Sf_9。
病毒毒株EV71使用H13-Henan-08，毒株Cox. A16使用S10-Shandong-08。
細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇細(xì)胞，將一只安瓶的細(xì)胞復(fù)蘇到一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)4-6天 后，按照l : 4的分種比例傳出4個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。 病毒接種細(xì)胞培養(yǎng)3至5天后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，接種手足口病病毒。病毒接 種量為0. 1M0I，培養(yǎng)溫度37°C ，培養(yǎng)時(shí)間30-40小時(shí)，病毒維持液為含2%胎牛血清的DMEM 收獲病毒當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，通過常規(guī)方法收集，凍融3次，收獲病毒。
純化病毒RNA :使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA Extraction Kit Ver. 3. 0試劑
盒純化病毒RNA。 擴(kuò)增EV71及Cox. A16P1禾口 3CD基因 取上述提取的RNA模板5iil，加入引物各liil，2. 5mM dNTPs liU，65。C變性5分 鐘，冰浴1-3分鐘，然后加入5 XBuffer 4iU、RNasin lyl、AMV RT 1 ii 1 (9U) ;DEPC水補(bǔ)至 20iil，然后42。C反應(yīng)60分鐘，95。C反應(yīng)10分鐘，再加入RNasin 1 yl， 37。C反應(yīng)20分鐘，反 應(yīng)產(chǎn)物立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為10XExtaq Buffer 10 ii 1， dNTP(2. 5mM)8 ii 1， 各基因上下游引物各2iil，Extaq酶4ia(20U)，cDNA 1 yl，用去離子水補(bǔ)至100 iU。所使 用的引物如下 EV71plu :gcgcgcatgggttcgcaagtgtctacaca
Ev71pld :aagcttttaaagagtggtgatcgctgtgcgact
Ev713cdu :ctcgagatgggcccgagccttgactttgctctc
Ev713cdd :gcatgcttaaaataactcgagcca
Coxal6plu :gcgcgcatggggtcacaagtctc
Coxal6pld :aagcttttacaatgttgttatcttgtc
Coxal63cdu :ctcgagatggaccgagcttagactttgc
Coxal63cdd :gcatgcttaaaataattcgagccaatt
將擴(kuò)增產(chǎn)物分別膠回收后連接于pMD18-T載體，獲得pTEV71-Pl、 pTEV71-3CD、pTCA16-Pl、pTCA16-3CD，測序表明正確(見序列表SeQ ID NO. 1和SeQ ID NO. 2)。
將pTEV71-Pl、pTEV71-3CD、pTCA16-Pl、pTCA16-3CD、pFastBacTM DUAL分別雙酶切，并利用TaKaRa凝膠回收試劑盒回收目的片段，利用T4連接酶分別將回收片段連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌，獲得轉(zhuǎn)移載體pDual-EV71-Pl-3CD和pDual-Cox. A16-P1-3CD，經(jīng)酶切和PCR鑒定正確。 按照Invitrogen公司Bac_to_Bac Baculovirus Expression Systems操作說明書，將pDual-EV71-Pl-3CD和pDual-Cox. A16-P1-3CD分別轉(zhuǎn)化DH10BAC感受態(tài)細(xì)菌，42t:熱激60移，將感受態(tài)細(xì)胞加入lmlLB中37t:震蕩培養(yǎng)4小時(shí)，取100 yl涂布于含卡那霉素(50ii g/ml)、慶大霉素(7ii g/ml)和四環(huán)素(10y g/ml)的三抗平板，37。C培養(yǎng)24小時(shí)以上。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取重組的白色菌落重新劃線培養(yǎng)進(jìn)行表型鑒定，確認(rèn)為白色的菌落接種培養(yǎng)，挑取單個(gè)白色菌落接菌培養(yǎng)24小時(shí)，PCR鑒定獲得了正確的重組菌。
收菌提取Bacmid，取1. 5ml菌液，離心去上清，加入0. 3mlSolution 1[15mMTrisHCl(pH 8. 0) ， 10mM EDTA， 100 ii g/mlRNase A];加入O. 3mlSolution11 (0. 2M Na0H，l%SDS)，輕輕混勻，室溫放置5分鐘；慢慢加入0. 3ml3M醋酸鉀，冰浴5-10分鐘；13000rpm離心10分鐘，上清吸到另一管，加0. 8ml異丙醇；冰浴5-10分鐘；13000rpm離心15分鐘；倒掉上清，加lml70X乙醇，顛倒數(shù)次，室溫離心5分鐘，吸棄上清，室溫放置5-10分鐘，加入30 ii 1TE溶解沉淀，溶解后凍存于_20°C ，或者采用Invitrogen公司桿粒提取試劑盒提取桿粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、PCR鑒定、分光光度計(jì)測定確定Bacmid的正確性、純度、濃度。
用CellFECTIN試劑將重組Bacmid分別轉(zhuǎn)染3ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的Sf9昆蟲細(xì)胞(70% _80%的覆蓋率)。在3ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種大約1Xl(f個(gè)細(xì)胞，室溫貼壁培養(yǎng)1小時(shí)以上；Bacmid DNA用最高速度離心5分鐘；取5 yl質(zhì)粒加入到100 y 1無血清無雙抗Grace (以下簡稱雙無Grace)培養(yǎng)液中輕輕混勻；取6 iU脂質(zhì)體加入到100 ii 1雙無Grace培養(yǎng)液中輕輕混勻，將含質(zhì)粒的培養(yǎng)液加入到含脂質(zhì)體的培養(yǎng)液中，輕輕混勻，37t:放置30分鐘；將細(xì)胞用雙無Grace洗三次，室溫感作15分鐘；將lipichDNA復(fù)合物加入0. 8ml雙無Grace中，將上述lml培養(yǎng)液加入3ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，28。C培養(yǎng)12-16小時(shí)，加入3ml新鮮的培養(yǎng)液，72小時(shí)可見明顯的細(xì)胞病變，收集病變細(xì)胞上清和細(xì)胞沉淀，分別凍存于-8(TC備用，重組病毒命名為Bac-EV71-Pl-3CD和Bac-Cox. A16-P1-3CD。收集的重組病毒可直接感染Sf9昆蟲細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增和VLP產(chǎn)物表達(dá)。
2、病毒種子批的建立和檢定 疫苗生產(chǎn)用毒種應(yīng)以病毒種子批系統(tǒng)為基礎(chǔ)進(jìn)行三級管理，即原始種子批、主種子批和工作種子批。原始種子批為Sf-9上的4代毒種。原始種子批應(yīng)驗(yàn)明其記錄、歷史、來源和生物學(xué)特性。從原始種子批在Sf-9細(xì)胞上傳至第5代為主種子批，進(jìn)行全面檢定，主種子批在Sf-9細(xì)胞上繼續(xù)傳代制備工作種子批，在Sf-9細(xì)胞上傳代總次數(shù)不得超過12代。毒種保存在-6(TC以下。種子批檢定包括鑒別試驗(yàn)、無菌試驗(yàn)、病毒滴定、病毒外源因子檢查、免疫原性檢查等項(xiàng)目，檢定合格后備用。
3、 EV71和Cox. A16 VLP的制備 高密度懸浮培養(yǎng)來自Sf-9細(xì)胞系的昆蟲細(xì)胞，在細(xì)胞長成1.5-2乂106細(xì)胞/ml時(shí)，接種重組桿狀病毒，病毒在細(xì)胞中增殖并共表達(dá)P1和3CD蛋白，自發(fā)裝配產(chǎn)生VLP，裂解
8昆蟲細(xì)胞并收集所產(chǎn)生的懸液。 澄清過濾用0. 45 m的濾器過濾所有收獲上清。 超濾濃縮病毒用截留分子量200KD超濾膜，濃縮倍數(shù)100倍。 蔗糖密度梯度離心使用不連續(xù)蔗糖密度梯度(15%，30%，65%蔗糖密度梯度)，
30000g超速離心3小時(shí)后，收集15-35X蔗糖界面上的乳白色條帶，超速離心去除蔗糖并濃
縮回收病毒。 凝膠過濾層析用p朋.5-7. 5的PBS平衡S印harose6FFTM介質(zhì)進(jìn)行病毒純化，收集外水體積流穿峰。雜蛋白去除可達(dá)95%以上。 離子交換層析采用DEAE-S印haroseFF"1介質(zhì)，平衡液為p朋.5-7. 5、含有0. 05-0. 15M氯化鈉的PBS，洗脫液為含0. 2-0. 5M氯化鈉、pH6. 5-7. 5的PBS。雜蛋白去除可達(dá)99%以上，純化后的VLP病毒原液，即為VLP抗原。 配制取純化后的EV71和Cox. A16VLP病毒原液，再加入佐劑，配制注射劑型，兩種VLP病毒原液的配制比例為1 : 1。
4、疫苗純度分析 根據(jù)《中國藥典(第3版)》及《中國生物制品規(guī)程》關(guān)于《傳代細(xì)胞作為生物制品細(xì)胞基質(zhì)規(guī)程》的要求，測定疫苗成品的外觀，無菌試驗(yàn)，DNA含量，蛋白質(zhì)含量，pH值等。(見表1) 表1疫苗成品檢定結(jié)果
項(xiàng)目EVCAyLP2009040501EVCAVLP200恥42001
外觀透明液體透明液體
無菌試驗(yàn)隱陰性
鑒別試驗(yàn)EV71+C。x. A16EV71+Co，. A16
DNA含量〈100pg/劑 .
內(nèi)*素含量<100叨/劑《鵬HI/翻
效力試驗(yàn)通過邏it
異常毒性試驗(yàn)通過
蛋白質(zhì)含童
7.137.13 5、疫苗效力分析 采用Reed&Muench法測定血清中和效價(jià)。 將待測抗血清56°C 30分鐘滅活，以不含牛血清的199培養(yǎng)基稀釋1_2"倍。將稀釋后樣品加入含有100TCIDs。病毒(64-160TCID5。/0. lml) ， 2%胎牛血清，相同體積的199培養(yǎng)基中4t:孵育12小時(shí)。 將孵育后的混合液加入單層Vero細(xì)胞的96孔組織培養(yǎng)板中(2X 104細(xì)胞/孔)，37"C孵育1小時(shí)。 移除培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，加入100ii L2X胎牛血清的新鮮199培養(yǎng)基，5% C02，37°C培養(yǎng)。 以顯微鏡觀察，當(dāng)培養(yǎng)至板中Vero細(xì)胞病變不增加時(shí)(第7天)，采用Reed&Muench法計(jì)算抗血清中和效價(jià)。 將本發(fā)明的疫苗免疫SPF小鼠和恒河猴，每只每次小鼠0. lmL，恒河猴0. 5mL，間隔
914天免疫3次，末次免疫后15天采血，分離血清。于56°C 30分鐘滅活后進(jìn)行中和試驗(yàn)，測定血清中和效價(jià)(見表2)。 表2疫苗成品免疫恒河猴產(chǎn)生的血清對腸道病毒臨床分離株的中和抗體效價(jià)
魔 鵬攄體效掛《末次JBttBlS^k清》
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念 6、安全性分析 按照《中國藥典(第3版)》及《中國生物制品規(guī)程》對制備的亞單位疫苗進(jìn)行異常毒性試驗(yàn)。 使用清潔級標(biāo)準(zhǔn)的小鼠和豚鼠進(jìn)行異常毒性試驗(yàn)(見表3)。 表3疫苗成品異常毒性試驗(yàn)結(jié)果
動物接種動物編號接種劑4觀察時(shí)間觀察結(jié)果
小鼠10. 5mL14健存，無異常反應(yīng)，體重增加
214鏈存，無異常反應(yīng)，體重增加
30.M健存,無異常反應(yīng)，體重增加
. 414健存,無異常反應(yīng)，體重增加
S0, ^iLM鏈存，無異常反應(yīng)，體豕增加
豚鼠114鏈存,無異常反應(yīng)，體重増加
5. (fciL14鏈存，無異常反應(yīng)，體重增加
35. OhL"健存，無異常反應(yīng)，體重增加
45. OhL健存，無異常反;仏體重增加
55. OaLM健存，無異常反沖-,體重增加
結(jié)論 合格 取體重18-22g小鼠，注射前稱取每只小鼠體重。每批樣品用5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0. 5mL測試疫苗，觀察14天。 取體重250-350g豚鼠，注射前稱取每只豚鼠體重。每批樣品用5只豚鼠，每只豚鼠腹腔注射5. OmL測試疫苗，觀察14天。 進(jìn)行過敏原性試驗(yàn)(見表4)，以牛血清為過敏試驗(yàn)的陽性對照，生理鹽水為陰性對照。每組5只豚鼠，分別于腹部皮下注射0.5mL。隔日一次，共3次，第3次注射后24天，耳靜脈給予相同物質(zhì)0. 5mL，立即觀察注射后反應(yīng)。
表4疫苗成品過敏原性試驗(yàn)結(jié)果
纖纖藤鼠號30分鐘內(nèi)表現(xiàn)3天縫暴
咳嗽抓耳 抽筋 #寬死亡
牛愈溝1+_ + —死亡
2+— + ++死t:
++ + +—
生邏翁求1—— — ——存鏡
2_— — ——逸竊 贊糊
3—— — —_旌條
疫菌i—— — ——#S
2— — —一詹^g
—— — ■—曾徴
袖論疫苗合格，無致敏原 7、疫苗穩(wěn)定性分析
0101] 將疫苗成品長期放于4t:，室溫(20-25°C ) ，37t:，觀察效力穩(wěn)定性、抗原穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、外觀穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明疫苗在4t:下存放穩(wěn)定。手足口病滅活疫苗4t:的效
力穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表5。表5疫苗成品4t:的效力穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
瘦菌抵號存放時(shí)間(月)
爾萣中親效餘《病》 23
l:l腦
(Beijing08-1)
Cta, A誘l:i醒1:2048
EfttfLP漏04薩,11:20^l:,l:鵬
l:鵬 。 序列表 SeQ ID NO. 1 :EV71 Pl和3CD基因序歹lj : Pl : atgggttcgcaagtgtctacacagcgctccggttctcacgaaaactcaaactcagccactgagggttct
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12
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3CD : ggcccgagccttgactttgctctctccctactgagaaggaacatcaggcaagtccaaacagaccagggg catttcaccatgttggg tgttagggatcgcttagcagtcctcccacgccactcacaacctggcaaaactatttggattgagcacaa actcgtgaacgtccttg atgcagttgaactggtggatgagcaaggagtcaacctggaattaaccctcatcactcttgacaccaacg accaaattcatcccagaaaatattagcactgctagtgatgccaccctagtgatcaacacggagcacatg ccatcaatgtttgtccc ggtgggtgacgttgtgcagtatggctttttgaatctcagtggtaagcctacccatcgcaccatgatgta caactttcctactaaag c3gg3C3gtgtgg3ggagtggtg3C3tctgttggg^ggttgtcggtettc3C3ttggtggc^tggC3 gacaaggtttttgcgca ggcctc^肌gg3gttectttgctegtg^c^gggg3gatcc3gtgggtt肌gccc^te肌g3^ct gg^gactc^catc^ tggaccaacccgcaccaagttagaacctagtgtattccatgacatcttcgagggaaataaagaaccagc tgtcttgcacagtaaag acccccgacttgaggtagattttgaacaggccctgttctctaagtatgtgggaaacacactacatgagc ctgacgagtecatc^g
13
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SeQ ID NO. 2 :Cox. A16P1和3CD基因序列:
PI : atggggtcacaagtctcaacccaacgatcgggttcccacgaaaattcgaactcagcatcagaaggatct catcaactattacaaggatgcatatgctgccagcgcgggtcgccaagatatgtctcaggaccctaagaa atttacagaccctgtga tggatgtcatacacgagatggctcctcccttgaaatcacccagtgctgaagcttgtggttatagtgate gagttgcccaactcaca 3ttgg3^ctcc3c^tc3ctec3c^g^gctgc^3C3ttete3tegc3tetgggg^tggcccg3g tettge^ggaegctga tgccacagctgttgacaagcccaccagacccgatgtgtcggtaaataggttcttcacccttgatactaa atcgtgggcte^gact
14
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3CD : ggcccaagtcttgattttgctctctcattgcttaggaggaacatcagacaagtccagacagaccaaggc cacttcactatgctagg tgttagagatcgcttggctgtcctcccgcgacactcgcagcctgggaagacaatatgggtagaacacaa gcttataaacatcttag atgctgttgagttggtggatgaacaaggggtcaacttagaactgaccctggttactcttgataccaatg accaagttcatcccagaaaacattagcgctgccagtgatgccaccctagtgatcaacacagagcacatg ccctccatgttcgtgcc agtgggtgacgttgtgcaatacggtttcctaaacctcagcggaaaacccacccatcgtaccatgatgta caactttcccactaagg ctgg3c^tgtggtgg3gtggtg3C3tctgttgg^3ggttetcggc3tecatettggtggc^tggc3 ggcagggcttttgtgca ggactc^g3gg3gttettttgcc3gtg3gc^gg3g3g3tcc3gtgggtc肌gccc^te肌g3g3C3 ggc3gactc^catc^ tgggccgactcgcactaagctcgaacccagtgtgttccatgatgtctttgaggggaacaaagaaccagc acccacgccttgaagtggactttgagcaggctttattctccaagtatgtagggaacacactgcatgagc gaggcggccctccactatgcaaatcagttgaagcaactggacatcaacacttctcaaatgagtatggag gaagcttgctatggtac tgagaaccttgaggccattgatctccacaccagcgcgggctacccctacagtgctctgggaataaagaa ccactaccagagatgtgagtaagatgaaattctatatggacaagtatggccttgaccttccttactcta cctetgtc^ggatgag ctccgctcgatagataagattaagaaaggaaaatcccgcctgatcgaggctagtagtctaaatgactca gtgtacctcagaatggc
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SEQ ID NO :1. txt
SEQUENCE LISTING 〈110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行
病研究所 〈120〉 一種手足口病單、雙價(jià)基因工程亞單位疫苗
及其制備方法
〈130〉000
〈160〉2 〈170〉Patentln version 3.3 〈210〉1 〈211〉2586 〈212〉DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 1 atgggttcgc aagtgtctac acagcgctcc ggttctcacg aaaactcaaa ctcagccact 60 gagggttcta ccataaacta caccaccatt aattactaca aagactccta tgctgccaca 120 gcaggC3^c 3g3gtctc33 gC3ggatcca g3C33gtttg caaatcctgt taaagacatc 180
17
ttcactgaaatggcagcgccactgaagtccccatccgctgaggcatgtggatecagtgat240SEQ ID NO :1. txtcgagtggcgcaattaactattggcaactcc3CC3tC3CC3cgc朋g朋gcggctaatatc300atagtcggttatggtgagtggccttcctactgctcagattctgacgctac3603朋CC33CgCgcccggatgtttcagtgaacaggttttacacattggacacte^ttgtgg420gag朋3tcgtCC33ggg3tggtectgg卿ttcccggatgtgttaactga咖tggggtt■tttgggca朋atgcacaattccactacctctaccgatcagggttctgcatccacgtgcag540tgcaatgccagtaaattccaCC^gg3gC3ctcctagtcgctgtcctacc600ElttgggElCElgtggc鄉(xiāng)cggtecagggacgg朋gatecccaccccccttac^gcagact660caacccggcgccgatggcttcacccgtacgtgcttgatgctggcatccca720atatcacagtCCC3C3CC3gtggattaatttg3gg3CC朋caactgtgct780tgccatacattaacgcactgccttttgattctgccttgaaccattgcaac840SEQ ID NO :1. txttttggcctgttggttgtgcctattagcccactagactacg3CC33gg3gCgacgccagte■atccctataactatcacattggccccaatgtgttctgaattcgcaggtctteggcaggca960gtcacgc朋gggttccccaccctggcacaaatcaatttttaaccaccgat1020gatggcgtttcagcacctattctaccgaacttccaccccaccccgtgtatccacatacct1080ggtg朋gtteggaacttgctC3ggtgg卿ccattctgga1140gtgcccacgaatgccactagagactgcgcttcccggtctc3gC3C^gC31200ggg朋Elggtgagctgtgtgcggtgttt卿gccgatcctgggCg朋Eltgg3CC3tggC^1260tccaccttactgggtcagttgtgcgggtactacacccaat
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agaagtttgt gagcacaatt I860 aggtctgtcc cagtaggaag agcgttggct atcccaaatt atgaaaatct tagacgcaat 1920 tggctcgagt tattt 1935 SEQ ID NO :2. txt SEQUENCE LISTING 〈110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行 病研究所 〈120〉 一種手足口病單、雙價(jià)基因工程亞單位疫苗 及其制備方法 〈130>000 〈160>2 〈170〉Patentln version 3. 3 〈210>1 〈211>2586 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400〉 1 atggggtcac aagtctcaac ccaacgatcg ggttcccacg aaaattcgaa ctcagcatca 60 gaaggatcta ctataaacte caccaccatc aactettaca aggatgcata tgctgccagc 120 gcgggtcgcc aagatatgtc tcaggaccct aagaaattta cagaccctgt gatggatgtc 180 atacacgaga tggctcctcc cttgaaatca cccagtgctg aagcttgtgg ttatagtgat 240 SEQ ID NO :2. txt cgagttgccc aactcacaat tggaaactcc acaatcacta cacaagaagc tgcaaacatt 300 ￡lt￡l￡ltagC￡lt ￡ltgggg￡l￡ltg gCCCg￡lgt￡lt tgC朋gg3Cg ctgatgccac agctgttgac 360 aagcccacca gacccgatgt gtcggtaaat aggttcttca cccttgatac taaatcgtgg 420 gctaaagact cgaagggatg gtactggaaa ttcccggacg ttttgacgga ggtgggcgtg 480 tttgggcaga atgcgcaatt ccattatctg tatagatccg gattctgtgt gcacgtgcag 540 tgcaatgcca gcaaattcca ccagggtgct ctcttggttg
ccatactgcctgagtecgtg600ctgggcacc3ttgccgggggcgstggtaacgagaactcacatcccccgtacgtcaccacc660C3gCC3gg3C郷tgggtgctgtacttacaaatccttatgttttggatgctggggteccc720cttagtcaattgacggtgtgtccgcatcagtggattaacctecg^ccaacaactgtgcg780accatcatagtaccatacatccattcgattcggccctaaaccattgcaac840SEQ ID NO ::2. txttttggcttaattgtagtgcccgtagtaccactcgactttaiacgctggagc■ctgtcaccatcgcacccatgtgcgctgaatttgcaggtttgCg^lCflggC3960ggatacctaccg恥ttg卿cccggtactaatcagtttctcactactgat1020gatggtgtctcagctcccattttgcccggattccaccctactccagccatacacatacct1080ggtg卿tgcgcaatctgttgg卿tttgcElgggt卿gElccatattggaggtg^c^t1140ccccatgcaacgactatgcttccctgtctcggtgc卿gt1200a卿cgggggaattgtgtgctgtttttagggccgaccctggtegg^tggaccgtggcag1260tcgactatttteggacagttgtgteggtectatactcaatggtctggatctctggaagtc1320actttcatgtttgctggatcgttcatggcaacagg肪3gatgctaatcgcatacacacct1380ccggggggtggggtcccagcagatcggctcactgcaatgctggg^CCC3tgtg^itetgg1440gattttggcctccaatcctcagtcacgctagttataccatSEQ ID NO :2. t xtggateagc^cacacactat1500鄉(xiāng)'gcgcacgcc肌ggacggttattttgattattacaccactggcacgatcactatatgg1560attatgtcgtacctattggagCCCCC3C朋cagcctatattgtggccctc1620gcagccgctcctgtgcaaagacactgaggfitattgagc肌1680
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ggcccaagtcttgattttgctctctcattgCtt￡lgg￡lgg￡l60g3CC33ggCCacttcactatgcteggtgttagagatcgcttggctgtcctcccgcgacac120tcgcagcctggg^gac^tatgggt卿acacaagcttataaacatcttagatgctgtt180gagttggtggatg^c^ggggtcaacttagaactgaccctggttactcttgataccaat240gag^gttcacaagttcatcttagcgctgccagtgatgcc300accctagtgagcacatgccctccatgttcgtgccagtgggtgacgttgtg360caatacggtttcctaaacctcagcgg^^cccacccatcgtaccatgatgtacaacttt420cccactaaggtggtggagtggtgacatctgttgg3卿gttatcggcata■catattggtggC33tggC3ggcagggcttttgtgcaggacttattttgcc540SEQ ID NO :2. txtgagagatccagtgggtc卿3g3C3ggC3gactcaacatc600■tgggccgactcgcactaagctcgaacccagtgtgttccatgatgtctttg鄉(xiāng)gg咖660■ag^ccagcagtcttgcategcagagacccacgccttg■gtggactttgagc鄉(xiāng)ct720ttattctccaagtetgteggg^C3C3CtgcatgagcctgacgagtecatC^3g3ggCg780gccctccactgttg^gc^ctggacatcaacacttctca840gctatggtactgagaaccttgaggccattgatctccacaccagcgcgggc■tacccctacagtgctctgggagagatettttagatcccacteccagagat960tgaaattctatatggccttgaccttccttactctacctat1020gtC卿g3tgagctccgctcg^^tcccgcctgatcgag1080gctagtagtctaaatgactcagtgtacctcag朋tggcctttggtcacttgtecgagact1140
ttccacgcaaatccaggaaccataactggctcagctgtggSEQ ID NO ::2. txtgatgcaacccggatacsttc1200tggagtaaactaccaatcctgcttccaggttcactctttgcatttgattactcaggctat1260gatgctagtctcagtccagtctggtttagagcactggagctggtcctcaggg鄉(xiāng)tgggc1320tatagtgaggaggcagtctcccttatagaggggatteacctgtataccgc1380actgtgtacttggtgg肌tgccctcaggctgttcagg肌catccattttc1440acattgctcac^gggcatt1500gatttggscgggtcgcctacgggg￡ltg￡ltgtgcttgctagttatcctttc1560ccaatcgattgcctggaattggc^g肌caggC333g3gtatggtttgactatgactcct1620ctccttgcttc^tgaggte朋ttggggcaatgcaacctt1680ggcttcttgcccgatgagcaattccctttcttgatccatcctaccatgcc1740ctattcgatgg3CC肌gg3Cgcacg朋3cactcaagatcacgtacgatcc1800SEQ ID NO :2. txtctgtgtcttttggcgtggcacaggagtatg1860aggtctgtccagctttggctataccgaattgagacgc肌t1920tggctcgaattattt193權(quán)利要求
一種預(yù)防手足口病的單、雙價(jià)亞單位疫苗，其特征在于該單價(jià)亞單位疫苗由EV71 VLP抗原或Cox.A16 VLP抗原與Al(OH)3佐劑按下述重量百分比含量配制而成EV71 VLP抗原或Cox.A16 VLP抗原0.0015-0.003重量份Al(OH)3佐劑 0.25-0.5重量份；該雙價(jià)亞單位疫苗由EV71 VLP抗原和Cox.A16 VLP抗原與Al(OH)3佐劑按下述重量百分比含量配制而成EV71 VLP抗原和Cox.A16 VLP抗原0.0015-0.002重量份Al(OH)3佐劑 0.25-0.5重量份；其中EV71 VLP抗原和Cox.A16 VLP抗原的比例為1∶1。
2. 如權(quán)利要求1所述的單、雙價(jià)亞單位疫苗的制備方法，其特征在于該方法包括如下 步驟a，通過基因工程手段分別獲得重組桿狀病毒Bac-EV71-Pl-3CD和Bac-Cox. A16-Pl-3CD，分別在昆蟲細(xì)胞中高效共表達(dá)類似SeQ ID NO. 1 EV71 Pl、 SeQ IDN0. 2 Cox. A16 PI和3CD蛋白，并分別自組裝成EV71 VLP和Cox. A16 VLP ;b，建立并檢定疫苗株三級種子批庫；c，采用無血清培養(yǎng)基高密度懸浮培養(yǎng)來自Sf-9/Hi-5細(xì)胞系的昆蟲細(xì)胞； d，在細(xì)胞長成1.5-2Xl()6細(xì)胞/ml時(shí)，接種重組桿狀病毒； e，病毒在細(xì)胞中增殖并高效共表達(dá)PI和3CD蛋白，產(chǎn)生VLP ; f，裂解昆蟲細(xì)胞并收集細(xì)胞所產(chǎn)生的懸液，澄清過濾，去除昆蟲細(xì)胞殘?jiān)?g，超濾濃縮病毒VLP懸液；h，超濾濃縮后的病毒懸液，通過凝膠過濾層析和離子交換層析純化病毒VLP，或者通過 蔗糖密度梯度離心純化病毒VLP，得純化的病毒原液，即抗原；i，配制及檢定單、雙價(jià)疫苗半成品及成品，測量疫苗的安全性、有效性及穩(wěn)定性。
3. 如權(quán)利要求2所述的單、雙價(jià)亞單位疫苗的制備方法，其特征在于其中a步驟中PI和3CD基因序列采用RT-PCR方法擴(kuò)增手足口病病毒株獲得 SeQ IDN0. 1 EV71 PI和3CD基因序列利用RT-PCR方法擴(kuò)增EV71 (H13-Henan_08)病 毒RNA獲得，SeQ ID NO. 2 Cox. A16 PI禾P 3CD基因序列利用RT-PCR方法擴(kuò)增Cox. A16(S10-shandong-08)病毒RNA獲得，基因均克隆入pMD18_T載體后測序表明正確；P1和 3CD基因序列也可采用全基因合成的方式獲得，并根據(jù)昆蟲偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的單、雙價(jià)亞單位疫苗的制備方法，其特征在于其中b步驟中建立并檢定疫苗株三級種子批庫，即原始種子批、主種子批和工作種子 批的方法為原始種子批為經(jīng)過噬斑純化的Sf-9細(xì)胞上的4代毒種；驗(yàn)明原始種子批的記 錄、歷史、來源和生物學(xué)特性；從原始種子批在Sf-9細(xì)胞上傳至第5代為主種子批；主種子 批在Sf-9細(xì)胞上繼續(xù)傳代總次數(shù)不超過12代制備工作種子批。
5. 如權(quán)利要求2-4任一所述的單、雙價(jià)亞單位疫苗的制備方法，其特征在于其中f步驟中收獲細(xì)胞裂解所產(chǎn)生的懸液后通過濾器進(jìn)行澄清過濾，濾器孔徑為 0. 45 li m。
6. 如權(quán)利要求2-5任一所述的單、雙價(jià)亞單位疫苗的制備方法，其特征在于其中g(shù)步驟中超濾濃縮病毒VLP懸液的超濾膜的截留分子量為100-300KD，濃縮倍數(shù)為 100倍。
7. 如權(quán)利要求2-5任一所述的單、雙價(jià)亞單位疫苗的制備方法，其特征在于 其中h步驟中病毒液純化的具體步驟為凝膠過濾層析和離子交換層析純化進(jìn)行凝膠過濾層析，介質(zhì)采用合適的凝膠過濾介 質(zhì)，平衡液為pH6. 5-7. 5的PBS ;再進(jìn)行離子交換層析，使用弱陰離子交換介質(zhì)，緩沖鹽溶液 為磷酸鹽緩沖系統(tǒng)，平衡緩沖液為鹽濃度范圍0. 05-0. 1M， p朋.5-7. 5，含0. 06-0. 12M的氯 化鈉；洗脫緩沖液為鹽濃度0. 05-0. 1M， p朋.5_7. 5，含0. 2_0. 4M的氯化鈉;或蔗糖密度梯度離心純化使用的不連續(xù)蔗糖密度梯度為15%、30%和65%，30000g 超速離心3小時(shí)后，收集15-35%蔗糖界面上的乳白色條帶；經(jīng)過上述純化后，細(xì)胞殘余DNA含量低于100pg/ml，得純化的EV71 VLP病毒原液或 Cox. A16 VLP病毒原液，S卩EV71 VLP抗原或Cox. A16 VLP抗原。
8. 如權(quán)利要求2-7任一所述的單、雙價(jià)亞單位疫苗的制備方法，其特征在于其中i步驟中的疫苗半成品和成品是指將上述純化的VLP病毒原液配制成包括藥學(xué)可 接受的載體標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液，穩(wěn)定劑，稀釋劑，防腐劑，增溶劑；或配制成便于緩釋的劑型， 或添加鋁鹽吸附佐劑，或注射劑型；將上述純化的EV71 VLP病毒原液和Cox.A16 VLP病毒原液，按常規(guī)比例混合制備成二 價(jià)的形式。
9. 如權(quán)利要求l-8任一所述的單、雙價(jià)亞單位疫苗在制備預(yù)防手足口病藥物中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于該疫苗的使用劑量為單價(jià)一人份為0. 5ml，含EV71 VLP抗原或Cox. A16 VLP抗原1. 5-3 y g， Al (OH) 3佐劑 0. 25-0. 5mg ;雙價(jià)一人份為0. 5ml，含EV71 VLP抗原和Cox. A16 VLP抗原共1. 5-3 y g， Al (OH) 3佐 劑0. 25-0. 5mg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防手足口病的腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(Cox.A16)的單、雙價(jià)基因工程亞單位疫苗及其制備方法，本發(fā)明疫苗首先通過基因工程手段分別獲得重組桿狀病毒Bac-EV71-P1-3CD和Bac-Cox.A16-P1-3CD，分別在昆蟲細(xì)胞中高效共表達(dá)類似SeQ ID NO.1 EV71 P1、SeQ ID NO.2 Cox.A16 P1和3CD蛋白，并分別自組裝成EV71 VLP和Cox.A16 VLP；建立并檢定疫苗株三級種子批庫；培養(yǎng)細(xì)胞；接種并增殖病毒；裂解細(xì)胞，超濾并純化病毒懸液；進(jìn)一步配制成本發(fā)明單、雙價(jià)疫苗。本發(fā)明疫苗對于預(yù)防手足口病具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/866GK101695569SQ200910236590
公開日2010年4月21日 申請日期2009年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月3日
發(fā)明者劉鑫, 李敏, 李曉楠, 楊鵬輝, 段越強(qiáng), 王希良, 羅德炎, 趙忠鵬, 邢麗, 高嘯 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所;