專利名稱：一種生產(chǎn)去甲萬古霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說，涉及一種生產(chǎn)去甲萬古霉素的方法。
背景技術(shù)：
如圖1所示，N端去甲萬古霉素是萬古霉素的類似物，僅在一位氨基酸的氨基上比 萬古霉素少一個甲基。其抗菌譜與萬古霉素基本相同，但體外活性比萬古霉素高約20%。 主要用于葡萄球菌屬(包括甲氧西林耐藥菌)引起的內(nèi)膜炎，肺炎，骨髓炎，敗血癥和軟組 織感染等的治療。 華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司曾通過傳統(tǒng)的菌種選育的方法篩選得到生產(chǎn)去甲萬
古霉素的菌株。但是傳統(tǒng)的菌種選育方法隨機(jī)性強(qiáng)，工作量大，很難重復(fù)獲得預(yù)期效果，因
此，有必要提供一種通過定向的基因改造得到產(chǎn)去甲萬古霉素的菌株。 而本發(fā)明的申請人在申請?zhí)枮?00710036861.5的中國發(fā)明專利申請中，公開了
萬古霉素生物合成基因簇中的26個基因。根據(jù)基因序列比對所得到的信息，其中的vcml2
基因編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶，該酶是萬古霉素生物合成途徑中的一個重要的后修飾酶，它主要
負(fù)責(zé)催化甲基轉(zhuǎn)移到萬古霉素七肽骨架的第一個氨基酸亮氨酸的N端氮原子上。 雖然根據(jù)基因序列比對得到的信息，^!1112基因編碼^甲基轉(zhuǎn)移酶，但不
能確定在敲除vcml2基因后是否表達(dá)得到去甲萬古霉素，例如，在Balhimycin的生
物合成基因簇中，根據(jù)基因序列比對，就發(fā)現(xiàn)有兩個與鹵化作用相關(guān)的鹵化酶基因，
bhaA(FADH2_dependent halogenase)禾口 bhp(haloperoxidase/perhydrolase)，Oliver Puk
等在2002年通過基因敲除的方法發(fā)現(xiàn)bhaA被敲除后的菌株可產(chǎn)生無氯Balhimycin，而
bhp被敲除后的菌株則不產(chǎn)生Balhimycin。因此，在敲除vcml2基因是否能獲得萬古霉素
的衍生物，以及所獲得的萬古霉素的衍生物是否為所預(yù)想的去甲萬古霉素，則無法確定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種產(chǎn)去甲萬古霉素的方法。 本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種構(gòu)建產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌的方法。
本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌。
本發(fā)明提供的生產(chǎn)去甲萬古霉素的方法，包括以下步驟 (i)阻斷產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌中編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因，構(gòu)建產(chǎn)去甲 萬古霉素的基因工程菌； (ii)發(fā)酵產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌，以生產(chǎn)去甲萬古霉素。 本發(fā)明提供的構(gòu)建產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌的方法，包括以下步驟 A)構(gòu)建重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含基因vcml2的左側(cè)同源臂_抗性基因_基因
vcml2的右側(cè)同源臂片段，其中，基因vcml2為產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌中編碼N-甲基
轉(zhuǎn)移酶的基因； B)將步驟A中獲得的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化東方擬無枝酸菌，獲得阻斷突變株基因工程菌。 本發(fā)明提供的基因工程菌是基因vcml2被阻斷的東方擬無枝酸菌，其中，基因 vcml2為產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌中編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因。 本發(fā)明提供了一種產(chǎn)去甲萬古霉素方法，以及一種產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程 菌，所述基因工程菌可用于發(fā)酵生產(chǎn)去甲萬古霉素。同時，本發(fā)明提供的基因工程菌是通過 定向的基因改造得到的，所以能夠重復(fù)獲得，同時，也有利于對該菌株的進(jìn)一步改造。


圖1是萬古霉素及去甲萬古霉素結(jié)構(gòu)圖，其中，當(dāng)R為CH3時，該化合物為萬古霉 素，當(dāng)R為H時，該化合物為去甲萬古霉素。 圖2是阻斷突變株Amycolatopsis orientalis dNMT的鑒定結(jié)果，其中，泳道1為 以PND1和PND2為引物對的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；泳道2為PNE1和PNE2為引物對的PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果。 圖3是Amycolatopsis orientalis dNMT及其出發(fā)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析圖 譜，其中，圖(1)是萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析圖譜；圖(2)是東方擬無枝酸菌ATCC 43491 發(fā)酵液上清的HPLC分析圖譜；圖(3)是去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析圖譜；圖(4)是阻 斷突變株Amycolatopsis orientalis dNMT發(fā)酵液上清的HPLC分析圖譜。
圖4是去甲萬古霉素的質(zhì)譜圖。 圖5去甲萬古霉素的NMR圖譜，其中，圖5a去甲萬古霉素的tfNMR圖譜，圖5b去 甲萬古霉素的C13NMR圖譜。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實
驗室手冊》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行，
或參考Kieser等《Practical Str印tomyces Genetics》(Norwich, United Kingdom :The
John InnesFoundation，2000)中所述的條件進(jìn)行，或按照制造廠商所建議的條件。 本發(fā)明的下述實施例中使用的菌株和質(zhì)粒分別為 pUC18 :Ampr， LacZ，購于Takara公司。 pHP45omega-aac :Aprr， ATCC保藏號87628。 pMD18-T Simple Vector :Ampr，購于TaKaRa公司。 大腸桿菌E. coli DH5a ，購于TaKaRa公司。 大腸桿菌E.coli JM110，購于Stratagene。 本發(fā)明的下述實施例中使用的培養(yǎng)基配方如下 LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物10g/L， NaCl 5g/L， pH7. 4。 向LB培養(yǎng)基中加入20g/L瓊脂粉即得LB固體培養(yǎng)基。 TSB培養(yǎng)基胰蛋白胨20g/L，葡萄糖2. 5g/L， NaCl 5g/L， K2HP042. 5g/L。 R2T20培養(yǎng)基蔗糖200g/L，蛋白胨4g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母提取物6. 5g/L， K2S040. 25g/L，瓊脂20g/L，加水至860ml 。滅菌后加入50 %葡萄糖5ml， lmol/L MgCl2 6H2012. 5ml，2mol/L Tris-HCl (pH7. 0) 3. 125ml，微量元素溶液0. 5ml， 0. 5 % KH2P04 1. 25ml， lmol/L NaOH 0. 625ml， lmol/L CaCl2 2H20 12. 5ml。其中微量元素溶液ZnCl2 40mg/L， FeCl3 6H20 200mg/L， CuCl2 2H20 10mg/L， MnCl2 4H20 10mg/L， Na2B407 10H20 10mg/L， (NH4)6Mo7024 4H20 10mg/L。 高氏一號斜面培養(yǎng)基可溶性淀粉20g/L， NaCl 0. 5g/L， K2HP04 3H20 0. 5g/L， KN031. 0g/L， MgS04 7H20 0. 5g/L， FeS04 7H20 0. 01g/L，瓊脂20g/L， pH7. 2-7. 4。
種子培養(yǎng)基可溶性淀粉40g/L，去脂黃豆粉20g/L，甘油20g/L，葡萄糖15g/L， KN03 6g/L， KH2P040. 2g/L， MgCl2 6H20 0. 4g/L。 發(fā)酵培養(yǎng)基甘油60g/L，去脂黃豆粉20g/L， KN036g/L， KH2P040. 2g/L， MgCl2 6H200. 4g/L， CaC03 3g/L。 本發(fā)明的下述實施例中使用的緩沖液配方如下 BufferI :蔗糖40g， K2S04 0 . 05g， lmol/L MgCl2 6H20 lml，微量元素溶液0. 4ml， 加水至178ml 。 滅菌后加入0. 5 % KH2P042ml， lmol/L CaCl2 2H20 40 ii 1，0. 25mol/L TES(pH8. 0)20ml。 本發(fā)明的下述實施例中使用的酶制劑購自TaKaRa公司；DNAMarker均為
Fermentase的GeneRuler lkb DNA ladder ;胰蛋白胨，酵母抽提物購自0xoid公司；
PEG1000購于上海醫(yī)藥集團(tuán)。 實施例1、重組質(zhì)粒pLY01D的構(gòu)建 1. 1、引物的設(shè)計與合成 根據(jù)東方擬無枝酸菌ATCC 43491的基因序列，設(shè)計兩對引物對PNA1和PNA2及 PNBl和PNB2，分別用于左側(cè)同源臂和右側(cè)同源臂片段的擴(kuò)增。根據(jù)pHP45omega-aac的序 列，設(shè)計引物對PNC1和PNC2用于安普霉素(Apr)抗性基因片段的擴(kuò)增，上述序列及其酶切 位點分別如下所示 PNA1 :TCTAGA AAGATCAAGGAAGACCTG ;
Xbal PNA2 :CTGCAG CAGGACAACCTCCAGGTC ;
Pstl PNBl :CTGCAGTGAGCGCGGCGAGCCTGC ;
Pstl PNB2 :AAGCTT CATCATCGCCGACATCATCGCC ;
Hindi11 PNC1:CTGCAG GGAACTTATGAGCTCAGCCAATCGACT ;
Pstl PNC2 :CTGCAG CTGACGCCGTTGGATACACCA。
Pstl 1.2、PCR擴(kuò)增 分別以東方擬無枝酸菌ATCC 43491染色體組或質(zhì)粒pHP45omega-aac為模板，以
步驟1. 1中獲得的相應(yīng)的引物為引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體如下
PCR反應(yīng)體系(50iiL)為0.5iimol/L每條引物，lXBuffer，50iimol/L dNTPs， 5%DMS0，2.5U Ex Taq聚合酶，Mg2+1. 5mmol/L。 PCR反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性2min ;95。C變性45s， 55。C退火50s， 72。C延伸90s， 30 個循環(huán)；72"C延伸5min。 取上述PCR產(chǎn)物，然后參考使用手冊，使用杭州維特潔生化技術(shù)有限公司的純化 試劑盒純化，然后將純化獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，確定獲得的純化的PCR產(chǎn)物分別為左側(cè) 同源臂(1. 2kb)，右側(cè)同源臂(1. Okb)及安普霉素抗性基因片段(1. lkb)。
1. 3、質(zhì)粒pLY01A， pLY01B及pLY01C的構(gòu)建 將左側(cè)同源臂基因片段與酶切質(zhì)粒pMD18-T Simple Vector連接，經(jīng)測序驗證，獲
得含左側(cè)同源臂的重組質(zhì)粒pLY01A，其中左側(cè)同源臂序列如SEQ ID NO :1所示。 將右側(cè)同源臂基因片段與酶切質(zhì)粒pMD18-T Simple Vector連接，經(jīng)測序驗證，獲
得含右側(cè)同源臂的重組質(zhì)粒pLY01B，其中右側(cè)同源臂序列如SEQ ID NO :2所示。 將安普霉素抗性基因片段與酶切質(zhì)粒pMD18-T Simple Vector連接，經(jīng)測序驗證，
獲得含安普霉素抗性基因片段的重組質(zhì)粒PLY01C。 1. 4、重組質(zhì)粒pLY01D的構(gòu)建 分別使用Xbal/Pstl酶切pLY01A質(zhì)粒獲得左側(cè)同源臂、使用Pstl/Hind111酶切 pLY01B質(zhì)粒獲得右側(cè)同源臂、使用Pstl/Pstl酶切pLY01C質(zhì)粒獲得安普霉素抗性基因片 段。 將左側(cè)同源臂片段與右側(cè)同源臂片段克隆到經(jīng)Xbal/HindlII酶切的載體pUC18 中，再于兩個同源臂之間的PstI位點插入安普霉素抗性基因片段，獲得包含外源片段的重 組質(zhì)粒pLY01D。 實施例2、阻斷突變株Amycolatopsis orientalis dNMT的獲得
2. 1、東方擬無枝酸菌ATCC 43491原生質(zhì)體的制備 將東方擬無枝酸菌ATCC 43491的菌絲液接種到20ml TSB液體培養(yǎng)基中，并添加 甘氨酸至終濃度為2%。然后于28t:振蕩培養(yǎng)36 60hr，離心收集菌體，并使用Buffer I 緩沖液洗滌。用過濾除菌后的10ml溶菌酶溶液(lmg/ml，使用Buffer I緩沖液配制)懸浮菌絲 體，置于2『C保溫15分鐘，再用裝有脫脂棉花的無菌漏斗連續(xù)過濾兩次除去菌絲體。離心 收集沉淀，經(jīng)Buffer I緩沖液洗兩次，再懸浮于lml Buffer I緩沖液中，獲得東方擬無枝 酸菌ATCC 43491原生質(zhì)體。
2.2、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化用DNA的制備 將重組質(zhì)粒pLY01D轉(zhuǎn)化到甲基化缺陷型大腸桿菌E. coli JM110中，再抽提質(zhì)粒， 經(jīng)Xbal/Hindl11酶切，獲得用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的線形DNA(左側(cè)同源臂-安普霉素抗性基
因-右側(cè)同源臂)。 2. 3、重組菌株制備 取待轉(zhuǎn)化DNA至原生質(zhì)體溶液中，立即加入200 ii 1 PEG溶液，混合，涂布于R2T20 再生平板。28t:培養(yǎng)24 36h，用lml 2. 5mg/ml安普霉素溶液覆蓋平板的表面，待平板表 面溶液被完全吸收后，將平板重新置于28t:繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，收獲重組菌株。
2.4、重組菌株鑒定
根據(jù)東方擬無枝酸菌ATCC 43491的基因序列，于基因vcml2內(nèi)設(shè)計引物對PND1和PND2，用于驗證vcml2是否被敲除。根據(jù)東方擬無枝酸菌ATCC 43491的基因序列及質(zhì)粒pHP45omega-aac的序列，于基因vcml2上游及安普霉素抗性基因片段內(nèi)設(shè)計引物對PNEl和PNE2，用于驗證安普霉素抗性基因片段的插入位置是否在原vcml2的位置，上述序列分別如下所示PND1 :TATCGGGATTTGATCCAGGACG
PND2 :ATCTCCTGGAGCTCCTCCGA
PNE1 :AGTACCGGCACAGCCGGT
PNE2 :TGAATGGGTTCATGTGCAGC 以重組菌株染色體組為模板，分別以PND1和PND2為一對引物對、PNE1和PNE2為一對引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對其進(jìn)行檢測，具體如下 PCR反應(yīng)體系(50iiL)為:引物對各0. 5 ii mol/L， 1 XBuffer， 50 ii mol/LdNTPs， 5%DMS0，2.5U Ex Taq聚合酶，Mg2+1. 5mmol/L。 PCR反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性2min ;95。C變性45s， 55。C退火50s， 72。C延伸90s， 30個循環(huán)；72"C延伸5min。 將獲得的PCR產(chǎn)物，分別進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。
圖2的結(jié)果顯示，PND1和PND2為引物對未擴(kuò)增出片斷，表示該質(zhì)粒上已沒有基因vcml2 ;而PNE1和PNE2為引物對，能擴(kuò)增出1. 5kb的片段，說明安普霉素抗性基因片段的插入位置在原vcml2的位置。根據(jù)圖2的結(jié)果，安普霉素抗性基因已插入上述質(zhì)粒，且替換了基因vcml2。將該重組菌株命名為阻斷突變株Amycolatopsis orientalis dNMT。
實施例3、 Amycolatopsis orientalis dNMT菌株發(fā)酵培養(yǎng) 將東方擬無枝酸菌ATCC 43491及Amycolatopsis orientalis dNMT分別經(jīng)過自然分離，獲得單一菌落。 挑取單菌落涂布于高氏一號斜面培養(yǎng)基上，28t:培養(yǎng)5天，在無菌條件下，刮取一定量的孢子，接入種子培養(yǎng)基中，于28°C ， 220rpm培養(yǎng)40 48h。然后，在無菌條件下以8%接種量，將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵搖瓶中，于28t:，220rpm振蕩培養(yǎng)115 120h。
取發(fā)酵液，于12000rpm離心10min，取上清，進(jìn)行HPLC檢測，檢測條件如下
流動相配制用0. 2%的三乙胺溶液，磷酸調(diào)pH至3. 2作為緩沖液。緩沖液與乙睛和四氫呋喃按92 : 7 : 1的比例混合搖勻，作為A液；緩沖液與乙睛和四氫呋喃按70 : 29 : 1的比例混合，搖勻，作為B液，A液和B液的加入方式如表l所示。
色譜條件色譜柱DiamonsilTM C 18， 0DS， ID 4. 6*200mm 柱溫40。C 檢測器DAD(HP1100)檢測器 檢測波長240nm 流速lml/min 進(jìn)樣量5ul 洗脫方法梯度洗脫。 表1、 A液和B液的加入方式
洗脫時間(min)01322262735
A (%)10010000100100
B (%)0010010000 檢測結(jié)果如圖3所示。根據(jù)圖3的結(jié)果，萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品在8min左右開始出峰，去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品在6分鐘左右開始出峰，出發(fā)菌株發(fā)酵液上清在8min左右開始出峰，基因工程菌株的發(fā)酵液上清則除了在8min左右出峰外，同時還在6分鐘左右出峰。
實施例4、發(fā)酵液純化及所得化合物結(jié)構(gòu)確認(rèn) 參考中國專利ZL 200410012146. 4中提供的方法，對實施例3中獲得的發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，獲得純化后的化合物，并對所得化合物進(jìn)行質(zhì)譜和NMR檢測，檢測結(jié)果分別如圖4和圖5所示。 根據(jù)圖4的結(jié)果，所得化合物的分子量為1433，與去甲萬古霉素的分子量相同。
根據(jù)圖4的質(zhì)譜檢測結(jié)果和圖5的tfNMR圖譜和C13NMR圖譜的結(jié)果，并參考圖3，可以確定本發(fā)明所得的化合物為去甲萬古霉素。 綜上所述，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)去甲萬古霉素方法，以及一種產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌，所述基因工程菌可用于發(fā)酵生產(chǎn)去甲萬古霉素。同時，本發(fā)明提供的基因工程菌是通過定向的基因改造得到的，所以能夠重復(fù)獲得，同時，也有利于對該菌株的進(jìn)一步改造。序列表〈110〉上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠 [o川]〈120〉 一種生產(chǎn)去甲萬古霉素的方法 〈130>P5091024〈150>200810201906. 4〈151>2008-10-29〈160>2〈170>PatentIn version 3. 1〈210>1〈211>1211〈212>DNA〈213〉東方擬無枝酸菌ATCC 43491〈400>1朋gatc朋gg朋gacctgat cgcgctgctgaccaagctcc gcgccgagggcaagcgcgtc60gtcggctecg gcgcgacggc caagagcgccacggtgacca acttctgtggcatteccccg120gatctggtgg agttcatctc ggacaccaccccggccaagc agggcaggctcagccccgga180cagcacatcc cggttcgcga gtaccaggcgttcgccggcg accacccggactacgcgctg240ctgttcgcct ggaaccacgc cgacgagatcatgaacgcgg agcaggccttccgcgacgcc300ggcgggcagt ggatccggta cgtgccgaacgtgcacgtga gctgatcgcc3tg3CCCg3g360
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權(quán)利要求
一種生產(chǎn)去甲萬古霉素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(i)阻斷產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌中編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因，構(gòu)建產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌；(ii)發(fā)酵產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌，以生產(chǎn)去甲萬古霉素。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)建產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌包括以下步驟A) 構(gòu)建重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含基因vcml2的左側(cè)同源臂-抗性基因-基因vcml2的右側(cè)同源臂片段，其中，基因^!1112為產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌中編碼^甲基轉(zhuǎn)移酶的基因；B) 將步驟A中獲得的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化東方擬無枝酸菌，獲得阻斷突變株基因工程菌。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化東方擬無枝酸菌采用原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化包括以下步驟A) 制備東方擬無枝酸菌原生質(zhì)體；B) 酶切重組質(zhì)粒，制備酶切片段，所述酶切片段包含所述vcml2基因的左側(cè)同源臂-抗性基因-右側(cè)同源臂片段基因；C) 將步驟B獲得的酶切片段，轉(zhuǎn)化步驟A獲得的原生質(zhì)體。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟B后還包括篩選的步驟。
6 如權(quán)利要求2或4所述的方法，其特征在于，所述左側(cè)同源臂序列如SEQ ID NO:l所示。
7. 如權(quán)利要求2或4所述的方法，其特征在于，所述右側(cè)同源臂序列如SEQ ID N0:2所示。
8. 如權(quán)利要求2-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述東方擬無枝酸菌為東方擬無枝酸菌ATCC 43491。
9. 一種構(gòu)建產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A) 構(gòu)建重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含基因vcml2的左側(cè)同源臂-抗性基因-基因vcm12的右側(cè)同源臂片段，其中，基因^!1112為產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌中編碼^甲基轉(zhuǎn)移酶的基因；B) 將步驟A中獲得的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化東方擬無枝酸菌，獲得阻斷突變株基因工程菌。
10. —種生產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是基因vcml2被阻斷的東方擬無枝酸菌，其中，基因^!1112為產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌中編碼^甲基轉(zhuǎn)移酶的基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)去甲萬古霉素的方法。本發(fā)明提供的生產(chǎn)去甲萬古霉素的方法包括以下步驟(i)阻斷產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌中編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因，構(gòu)建產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌；(ii)發(fā)酵產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌，以制備去甲萬古霉素。本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌的方法以及通過該方法獲得的基因工程菌。本發(fā)明為去甲萬古霉素的制備開辟了一條新途徑。
文檔編號C12N1/21GK101724644SQ20091014892
公開日2010年6月9日 申請日期2009年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日
發(fā)明者夏興, 姜衛(wèi)紅, 戈梅, 朱麗, 李航, 楊志鈞, 楊晟, 殷瑜, 王天嬌, 羅敏玉, 金文翔, 阮林高, 陳代杰, 魏維, 黃鶴, 齊曉丹 申請人:上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司;浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠