專(zhuān)利名稱(chēng)：供hplc分析的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵液的前處理方法，尤其涉及一種供HPLC分析的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液前處理方法。
背景技術(shù)：
萬(wàn)古霉素屬于糖肽類(lèi)抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抗菌作用，尤其是對(duì)MRSA有較好的療效，故萬(wàn)古霉素的生產(chǎn)與研發(fā)日益受到重視。最早研究萬(wàn)古霉素是國(guó)外Micormick等從一株?yáng)|方鏈霉菌的發(fā)酵液中分離得到；國(guó)內(nèi)的研究主要有東方擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis orientalis SIPI-43491)(見(jiàn)申請(qǐng)?zhí)朇N01132048.6的專(zhuān)利申請(qǐng))及其突變株?yáng)|方擬無(wú)枝酸菌CGMCCNo.1183(見(jiàn)申請(qǐng)?zhí)朇N200410067197.7的專(zhuān)利申請(qǐng))，它們的發(fā)酵液中都可以分離出萬(wàn)古霉素。很顯然，萬(wàn)古霉素發(fā)酵液?jiǎn)挝坏臋z測(cè)在萬(wàn)古霉素的生產(chǎn)與研發(fā)中也日益突出。目前最常用的發(fā)酵液?jiǎn)挝坏臋z測(cè)是高效液相色譜法(HPLC)，相對(duì)于生物檢測(cè)或其他方法，高效液相色譜儀(HPLC)法具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，所以其應(yīng)用也日益廣泛。在應(yīng)用HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液?jiǎn)挝恢?，發(fā)酵液前處理方法的優(yōu)劣對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及色譜儀色譜柱的損傷程度影響較大，因而對(duì)發(fā)酵液前處理方法的改進(jìn)與提高很有意義。
現(xiàn)有技術(shù)中，萬(wàn)古霉素發(fā)酵液前處理技術(shù)(陳代杰等，萬(wàn)古霉素的研究開(kāi)發(fā)，中國(guó)抗生素雜志，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁(yè))是將萬(wàn)古霉素發(fā)酵液用4mol/L HCL調(diào)pH至4.5，于3500r/min離心10min，去除菌絲體與固體雜質(zhì)，吸取1mL上清液，在12000r/ml條件下離心10min，上清液樣品供HPLC檢測(cè)，該HPLC柱在分析完50個(gè)上清液樣品后，柱壓上升15％，目的峰的理論塔板數(shù)下降10％。此萬(wàn)古霉素發(fā)酵液前處理方法缺點(diǎn)在于所用酸的酸性過(guò)強(qiáng)易使萬(wàn)古霉素降解，從而影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。這樣處理后的上清液中還可能有雜蛋白甚至菌體和其他微小顆粒殘留，對(duì)HPLC分析及儀器不利。當(dāng)進(jìn)行多個(gè)發(fā)酵液樣品分析后，部分雜蛋白會(huì)黏附在色譜柱的柱頭，有些黏附是不可逆的，會(huì)縮短柱壽命，且會(huì)使柱壓升高，對(duì)高效液相色譜儀的泵不利，同時(shí)雜質(zhì)會(huì)影響柱的分離效果，以致影響目的物與雜質(zhì)的分離度，從而影響分析的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提高HPLC分析萬(wàn)古霉素發(fā)酵液?jiǎn)挝坏臏?zhǔn)確性，提高高效液相色譜柱的分離效果和使用壽命，提供一種供HPLC分析的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液前處理方法。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下列技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的供HPLC分析的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液前處理方法包括如下步驟1)用有機(jī)弱酸將萬(wàn)古霉素發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)至4.0～4.5，過(guò)濾得濾液或離心分離得上清液，以去除菌絲體與固體雜質(zhì)。在本發(fā)明中使用有機(jī)弱酸處理萬(wàn)古霉素發(fā)酵液不會(huì)破壞萬(wàn)古霉素的結(jié)構(gòu)，從而確保發(fā)酵液?jiǎn)挝粶y(cè)定的準(zhǔn)確性。
2)將上述的濾液或上清液與甲醇以1∶0.5～2的體積比，較佳地是1∶1的體積比混合均勻，離心，離心后的清液即可作為樣品用于高效液相色譜儀(HPLC)分析其萬(wàn)古霉素單位。將步驟1)得到的濾液或上清液進(jìn)一步使用甲醇處理在確保萬(wàn)古霉素不會(huì)降解的同時(shí)可以除去很大一部分雜質(zhì)，減少含萬(wàn)古霉素的樣品影響HPLC柱的性能，提高柱的使用壽命。
其中，較佳地是在步驟2)離心后的上清液用孔徑為0.22～0.6μm，較佳地是0.45μm的偏氟膜過(guò)濾，以進(jìn)一步除去微小的顆粒雜質(zhì)。
步驟1)中所述的有機(jī)弱酸較佳地為C1～3的有機(jī)弱酸，更佳地為醋酸、草酸、或者醋酸和草酸的混合酸，該混合酸可以以任何比例混合。
步驟1)中所述的離心較佳地是在3500～4000r/min下離心8～20分鐘，較佳地是15分鐘。
步驟2)中所述的離心較佳地是在10000～12000r/min條件下離心8～20分鐘，較佳地是10分鐘。
在本發(fā)明中，所述的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液是指任何產(chǎn)萬(wàn)古霉素的菌株在適當(dāng)?shù)臈l件下發(fā)酵產(chǎn)生出來(lái)的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液；較佳地是東方擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)在可發(fā)酵產(chǎn)生萬(wàn)古霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，正常發(fā)酵條件下發(fā)酵出來(lái)的發(fā)酵液，如東方擬無(wú)枝酸菌Amycolatopsis orientalisSIPI-43491(見(jiàn)申請(qǐng)?zhí)朇N01132048.6的專(zhuān)利申請(qǐng))和其突變株CGMCCNo.1183(見(jiàn)申請(qǐng)?zhí)朇N200410067197.7的專(zhuān)利申請(qǐng))產(chǎn)生的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液；也可以是現(xiàn)有技術(shù)(如陳代杰等，萬(wàn)古霉素的研究開(kāi)發(fā)，中國(guó)抗生素雜志，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁(yè))中提到的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液。
本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于用本發(fā)明的發(fā)酵液前處理方法處理萬(wàn)古霉素發(fā)酵液后，供HPLC分析的樣品中的雜質(zhì)大大降低，連續(xù)進(jìn)行上百個(gè)樣品分析，未見(jiàn)柱壓升高，分析效果良好。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取一定量萬(wàn)古霉素發(fā)酵液(同現(xiàn)有技術(shù)“陳代杰等，萬(wàn)古霉素的研究開(kāi)發(fā)，中國(guó)抗生素雜志，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁(yè)”)，用HAC調(diào)pH至4.0，于4000r/min離心15min，去除菌絲體與固體雜質(zhì)；吸取一定量的上清液，按體積比1∶1加入甲醇，混合均勻，在12000r/min條件下離心10min；然后再用0.45μm偏氟膜過(guò)濾；過(guò)濾后的清液供HPLC檢測(cè)(HPLC檢測(cè)條件同“陳代杰等，萬(wàn)古霉素的研究開(kāi)發(fā)，中國(guó)抗生素雜志，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁(yè)”)。該HPLC柱連續(xù)分析50個(gè)樣品后，柱壓為123～125bar，目的峰的理論塔板數(shù)為6500～6600；分析前后，柱壓沒(méi)有變化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理論塔板數(shù)未下降。
實(shí)施例2
取一定量的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液(同現(xiàn)有技術(shù)“陳代杰等，萬(wàn)古霉素的研究開(kāi)發(fā)，中國(guó)抗生素雜志，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁(yè)”)，用草酸調(diào)pH至4.5，于4000r/min離心15min，去除菌絲體與固體雜質(zhì)；吸取一定量的上清液，按上清液∶甲醇＝1∶2的體積比加入甲醇，混合均勻，在10000r/min條件下離心10min；然后再用0.45μm偏氟膜過(guò)濾；過(guò)濾后的清液樣品供HPLC檢測(cè)分析(HPLC檢測(cè)條件同“陳代杰等，萬(wàn)古霉素的研究開(kāi)發(fā)，中國(guó)抗生素雜志，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁(yè)”)。該HPLC柱連續(xù)分析50個(gè)清液樣品后，柱壓為123～125bar，目的峰的理論塔板數(shù)6500～6600；分析前后，柱壓沒(méi)有變化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理論塔板數(shù)未下降。
實(shí)施例3取一定量的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液(同申請(qǐng)?zhí)朇N200410067197.7的專(zhuān)利申請(qǐng))，用草酸與醋酸的混合物(質(zhì)量比為1∶1)調(diào)pH至4.5，于4000r/min離心15min，去除菌絲體與固體雜質(zhì)；吸取一定量的上清液，按上清液∶甲醇＝2∶1的體積比加入甲醇，混合均勻，在10000r/min條件下離心10min；然后再用0.22μm偏氟膜過(guò)濾，過(guò)濾后的清液樣品用HPLC檢測(cè)分析(HPLC檢測(cè)條件同“陳代杰等，萬(wàn)古霉素的研究開(kāi)發(fā)，中國(guó)抗生素雜志，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁(yè)”)。該HPLC柱連續(xù)分析50個(gè)清液樣品后，柱壓為123～125bar，目的峰的理論塔板數(shù)為6500～6600；分析前后，柱壓沒(méi)有變化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理論塔板數(shù)未下降。
實(shí)施例4取一定量的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液(同申請(qǐng)?zhí)朇N200410067197.7的專(zhuān)利申請(qǐng))，用草酸與醋酸的混合物(質(zhì)量比為1∶1)調(diào)pH至4.5，于4000r/min離心15min，去除菌絲體與固體雜質(zhì)；吸取一定量的上清液，按上清液∶甲醇＝1∶1的體積比加入甲醇，混合均勻，在10000r/min條件下離心10min；然后再用0.45μm偏氟膜過(guò)濾，過(guò)濾后的清液樣品用HPLC檢測(cè)分析(HPLC檢測(cè)條件同“陳代杰等，萬(wàn)古霉素的研究開(kāi)發(fā)，中國(guó)抗生素雜志，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁(yè)”)。該HPLC柱連續(xù)分析50個(gè)清液樣品后，柱壓為123～125bar，目的峰的理論塔板數(shù)為6500～6600；分析前后，柱壓沒(méi)有變化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理論塔板數(shù)未下降。
實(shí)施例5取一定量的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液(同申請(qǐng)?zhí)朇N01132048.6的專(zhuān)利申請(qǐng))，用丙酸調(diào)pH至4.3，過(guò)濾，去除菌絲體與固體雜質(zhì)；吸取一定量的濾液，按濾液∶甲醇＝1∶1的體積比加入甲醇，混合均勻，在11000r/min條件下離心10min；離心后的清液樣品用HPLC檢測(cè)分析(HPLC檢測(cè)條件同“陳代杰等，萬(wàn)古霉素的研究開(kāi)發(fā)，中國(guó)抗生素雜志，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁(yè)”)。該HPLC柱連續(xù)分析50個(gè)清液樣品后，柱壓為127～129bar，目的峰的理論塔板數(shù)為6500～6600；分析前后，柱壓略有升高(上升約3.2％)，HPLC的分析效果良好，目的峰的理論塔板數(shù)未下降。
權(quán)利要求
1.一種供HPLC分析的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液前處理方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)用有機(jī)弱酸將萬(wàn)古霉素發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)至4.0～4.5，過(guò)濾得濾液或離心分離得上清液；2)將上述的濾液或上清液與甲醇以1∶0.5～2的體積比混合均勻，離心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中離心后的上清液用孔徑為0.22μm～0.6μm偏氟膜過(guò)濾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟2)中離心后的上清液用孔徑為0.45μm偏氟膜過(guò)濾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于步驟1)中所述的有機(jī)弱酸為C1～3的有機(jī)弱酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟1)中所述的有機(jī)弱酸為醋酸和/或草酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于步驟1)中所述的離心是在3500～4000r/min下離心8～20分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于步驟2)中所述的濾液或上清液與甲醇以1∶1的體積比混合均勻。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于步驟2)中所述的離心是在10000～12000r/min下離心8～20分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種供HPLC分析的萬(wàn)古霉素發(fā)酵液前處理方法，該方法包括如下步驟1)用有機(jī)弱酸將萬(wàn)古霉素發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)至4.0～4.5，過(guò)濾得濾液或離心分離得上清液；2)將上述的濾液或上清液與甲醇以1∶0.5～2的體積比混合均勻，離心。用該方法預(yù)處理發(fā)酵液后，供HPLC分析的樣品中的雜質(zhì)大大降低，連續(xù)進(jìn)行上百個(gè)樣品分析，未見(jiàn)柱壓升高，分析效果良好，而且分析的萬(wàn)古霉素準(zhǔn)確率高。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1861629SQ200510110958
公開(kāi)日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者陳代杰, 劉垚, 李繼安, 戈梅, 陶正利, 葉衛(wèi)東 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院