用于治療mrsa感染的脂質(zhì)體萬古霉素的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了在治療細(xì)菌感染尤其是MRSA感染中高度有效的脂質(zhì)體萬古霉素制劑。本發(fā)明還教導(dǎo)了使用本文所公開的制劑治療細(xì)菌感染的方法。發(fā)明人確定了本文所公開的某些制劑可能產(chǎn)生比通常與萬古霉素治療相關(guān)的更低的毒性。
【專利說明】用于治療MRSA感染的脂質(zhì)體萬古霉素
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2011年4月26日提交的美國臨時專利申請No. 61/479, 305的優(yōu)先權(quán)， 該臨時專利申請以引用方式整體并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本文所公開的發(fā)明整體涉及對細(xì)菌感染的治療。
[0004] 背景
[0005] 本文的所有出版物均以引用方式并入本文，達到如同各個出版物或?qū)＠暾埦唧w 且單獨地表明以引用方式并入的相同程度。以下說明包括可用于理解本發(fā)明的信息。并非 承認(rèn)本文提供的任何信息都是現(xiàn)有技術(shù)的，或與受權(quán)利要求書保護的本發(fā)明有關(guān)，或具體 地或隱含地提及的任何專利公開都是現(xiàn)有技術(shù)的。
[0006] 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在全世界范圍內(nèi)對公眾健康造成了重大問題。具有增 強的萬古霉素耐藥性的MRSA菌株導(dǎo)致與更高發(fā)病率相關(guān)的感染并威脅到這種曾經(jīng)為金標(biāo) 準(zhǔn)的抗葡萄球菌藥物的使用。本領(lǐng)域需要對細(xì)菌感染尤其是對耐傳統(tǒng)抗生素的那些感染的 改進治療措施。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 在一些實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了一種包含萬古霉素、DCP脂質(zhì)體和/或DMPG脂 質(zhì)體的組合物。在一些實施方案中，該組合物包含萬古霉素、DSPC、DCP和膽固醇。在一些 實施方案中，DSPC、DCP和膽固醇的摩爾比為7:2:1。在一些實施方案中，該組合物包含萬古 霉素、DSPC、DMPG和膽固醇。在某些實施方案中，DSPC、DMPG和膽固醇的摩爾比為7:2:1。
[0009] 在某些實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了一種治療個體中的感染的方法，其包括：提供包 含萬古霉素、DCP脂質(zhì)體和/或DMPG脂質(zhì)體的組合物；以及將治療有效量的該組合物施用 給個體以便治療感染。
[0010] 在一些實施方案中，該組合物包含萬古霉素、DSPC、DCP和膽固醇。在一些實施方 案中，DSPC、DCP和膽固醇的摩爾比為7:2:1。在一些實施方案中，該組合物包含DSPC、DMPG 和膽固醇。在一些實施方案中，DSPC、DMPG和膽固醇的摩爾比為7:2:1。在一些實施方案 中，該感染是由選自以下的微生物導(dǎo)致的細(xì)菌感染：金黃色葡萄球菌（S. aureus)、耐甲氧 西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素中介金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌（S. pneumoniae)、糞腸球 菌（E. faecalis)、屎腸球菌（E. faecium)、凝固酶陰性葡萄球菌及其組合。在一些實施方案 中，該感染由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌導(dǎo)致。
[0011] 在某些實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了一種用于治療細(xì)菌感染的試劑盒，其包括：包含 萬古霉素、DCP脂質(zhì)體和/或DMPG脂質(zhì)體的組合物；以及其在治療個體中的細(xì)菌感染的使 用說明。在一些實施方案中，該組合物包含萬古霉素、DSPC、DCP和膽固醇。在一些實施方 案中，DSPC、DCP和膽固醇的摩爾比為7:2:1。在一些實施方案中，該組合物包含萬古霉素、 05卩(：、010^和膽固醇。在一些實施方案中，05?(：、010^和膽固醇的摩爾比為7 :2:1。在一些 實施方案中，該感染是由選自以下的微生物導(dǎo)致的細(xì)菌感染：金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林 金黃色葡萄球菌、萬古霉素中介金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、凝固酶 陰性葡萄球菌及其組合。在一些實施方案中，該感染由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌導(dǎo)致。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 示例性實施方案在參考附圖中示出。本文所公開的實施方案和附圖旨在被視為示 例性的而非限制性的。
[0013] 圖1根據(jù)本發(fā)明的實施方案示出了 MRSA的時間殺菌試驗。將LAC或NRS-35通 過游離的萬古霉素或DCP脂質(zhì)體萬古霉素孵育。圖中顯示了在選定時間點的存活CFU, (a) LAC :對于3小時時間點，游離與DCP VAN組相比較的p值對于0. 3mg/L和1. 25mg/L的濃 度〈0. 005,對于0. 6mg/L的濃度〈0. 01。對于6小時時間點，游離與DCPVAN相比較的p值 在0· 6mg/L下為0· 02。（b)NRS-35 :游離與DCPVAN組相比較的p值對于1. 25mg/L的濃度 〈0.005 (3小時）和〈0.05 (6小時)。結(jié)果是三個實驗的平均值。
[0014] 圖2根據(jù)本發(fā)明的實施方案顯示了游離的萬古霉素和DCP脂質(zhì)體萬古霉素在治療 MRSA全身性感染中的功效。將⑶1小鼠通過4X 106CFU的MRSA(LAC)在腹膜內(nèi)進行感染。 一小時后，將小鼠通過PBS、DCP脂質(zhì)體萬古霉素或游離的萬古霉素處理。A. 24小時時的脾 臟細(xì)菌負(fù)荷，PBS與DCP VAN相比較的p值為0. 001，而DCP VAN與游離VAN相比較的p值 為0. 07。B. 24小時后的腎臟細(xì)菌負(fù)荷，PBS與DCP VAN相比較的p值〈0. 001，PBS與游離 VAN相比較的p值為0.03,而DCP VAN與游離VAN相比較的p值為0.015。線表示中值。
[0015] 發(fā)明描述
[0016] 本文列出的所有參考文獻整體以引用方式并入，如同完整闡述一樣。除非另 外定義，否則本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理 角軍的相同含義° Singleton 等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第 3 版，J.Wiley&Sons(New York, NY2001) ;March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure 第 5 版，J.Wiley&Sons (New York, NY2〇01)以及 Sambrook and Russel, Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY2001)為本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供用在本 專利申請中的許多術(shù)語的一般性指導(dǎo)。
[0017] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到可用于本發(fā)明實踐的與本文所述的那些方法和材料 相似或等效的許多方法和材料。實際上，本發(fā)明絕不限于所述的方法和材料。為了本發(fā)明， 下文定義以下術(shù)語。
[0018] 如本文所用：
[0019] 首字母縮略詞"MRSA"意指耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（S. aureus)。
[0020] 首字母縮略詞"MIC"意指最低抑制濃度。
[0021] 首字母縮略詞"MBC"意指最低殺菌濃度。
[0022] 首字母縮略詞"DSPC"意指1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酰膽堿。
[0023] 首字母縮略詞"DMPG"意指二肉豆蘧酰磷脂酰甘油。
[0024] 首字母縮略詞"DCP"意指磷酸二鯨蠟酯。
[0025] 縮寫"CH0L"意指膽固醇。
[0026] 如本文所用，"有益結(jié)果"可包括但絕不限于降低或緩解疾病病癥的嚴(yán)重性、防止 疾病病癥惡化、治愈疾病病癥、防止疾病病癥發(fā)展、減小受試者出現(xiàn)疾病病癥的機會以及延 長受試者的生命或預(yù)期壽命。
[0027] 如本文所用的"病癥"和"疾病病癥"可包括但絕不限于細(xì)菌感染、與之相關(guān)的病 癥及其組合。
[0028] 如本文所用的"哺乳動物"是指任何哺乳動物類，包括但不限于人類和非人靈長 類，諸如黑猩猩和其它猿和猴物種；農(nóng)場動物，諸如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家庭哺乳動物， 諸如狗和貓；實驗室動物，包括嚙齒類，諸如小鼠、大鼠和豚鼠，等等。該術(shù)語不指定特定的 年齡或性別。因此，成年和新生受試者以及胎兒無論是雄性還是雌性都旨在包括在該術(shù)語 的范圍內(nèi)。
[0029] 如本文所用的"治療"是指治療性治療和預(yù)防性或防治性措施，其中目標(biāo)是減緩 (減輕）目標(biāo)病理病癥、防止病理病癥、追求或獲得有益結(jié)果、或減小個體出現(xiàn)病癥的機會， 即使治療最終不成功。需要治療的那些包括已患有病癥的那些以及易于罹患病癥的那些或 需要預(yù)防病癥的那些。
[0030] 在一些實施方案中，用于對本申請的某些實施方案進行描述和提出權(quán)利要求的表 示成分的量、諸如分子量的性質(zhì)、反應(yīng)條件等的數(shù)字應(yīng)被視為在一些情況下通過術(shù)語"約" 來修飾。因此，在一些實施方案中，在書面說明和所附權(quán)利要求書中所述的數(shù)字參數(shù)為近似 值，其可根據(jù)特定實施方案力圖獲得的所需特性而變化。在一些實施方案中，數(shù)字參數(shù)應(yīng)按 照所報告的有效數(shù)位并通過應(yīng)用慣常的四舍五入法而加以解釋。盡管本申請的一些實施方 案以寬范圍示出的數(shù)字范圍和參數(shù)為近似值，但是在具體實例中所示的數(shù)值盡可能可行地 精確報告。
[0031] 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA)感染屬于對公眾健康造成災(zāi)害的最具挑戰(zhàn)性 的感染。在過去十年中，社區(qū)相關(guān)性MRSA(CA-MRSA)尤其是USA300的出現(xiàn)已大大加重了感 染造成的負(fù)擔(dān)η。治療MRSA的金標(biāo)準(zhǔn)是萬古霉素，它是一種抑制細(xì)菌表面上的肽聚糖合成 的大糖肽類抗生素。然而，許多臨床研究已表明，萬古霉素 MIC高于1. 5的金黃色葡萄球菌 菌株與更高的發(fā)病率和治療失敗相關(guān)，因為它們可使得在特定的宿主組織內(nèi)MRSA更難以 被殺死。
[0032] 增強抗微生物試劑的抗微生物功效的一個策略是將試劑包封在脂質(zhì)體內(nèi)，以增強 藥物向某些宿主組織的遞送 3。已證實脂質(zhì)體可改善抗生素對吞噬細(xì)胞所吞噬的細(xì)菌的殺 滅，但是取決于它們的組成，它們也能夠增強抗生素向細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的遞送以直接增強它們 的抗微生物功效 4。另外，脂質(zhì)體包載通常降低與藥物相關(guān)的毒性，并因此已用作允許更高 的藥物劑量的方法。為了靶向金黃色葡萄球菌，已證實哌拉西林的脂質(zhì)體包封可改善金黃 色葡萄球菌的生長抑制 5。在之前的研究中，在不同的脂質(zhì)體制備物內(nèi)包載萬古霉素增強了 巨噬細(xì)胞吞噬的MRSA的消除但是基本上沒有在體外改善細(xì)胞外金黃色葡萄球菌的殺 滅 7。如本文所公開，發(fā)明人展示萬古霉素的兩種脂質(zhì)體制劑針對游離的MRSA的抗葡萄球 菌活性。
[0033] 在一些實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了 一種包含萬古霉素、DCP脂質(zhì)體和/或DMPG脂質(zhì) 體的脂質(zhì)體萬古霉素組合物。在一些實施方案中，該脂質(zhì)體萬古霉素包含萬古霉素、DSPC、 DCP和膽固醇。在一些實施方案中，DSPC、DCP和膽固醇的摩爾比為7:2:1。在其它實施方 案中，該脂質(zhì)體萬古霉素包含萬古霉素、DSPC、DMPG和膽固醇。在一些實施方案中，DSPC、 DMPG和膽固醇的摩爾比為7:2:1。
[0034] 在一些實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了一種治療個體中的感染的方法，其包括：提供包 含萬古霉素和DCP脂質(zhì)體和/或DMPG脂質(zhì)體的組合物；以及將治療劑量的該組合物施用給 個體。在一些實施方案中，該脂質(zhì)體萬古霉素包含萬古霉素、DSPC、DCP和膽固醇。在一些 實施方案中，DSPC、DCP和膽固醇的摩爾比為7:2:1。在一些實施方案中，該脂質(zhì)體萬古霉素 包含萬古霉素、DSPC、DMPG和膽固醇。在一些實施方案中，DSPC、DMPG和膽固醇的摩爾比為 7:2:1。在一些實施方案中，通過本文所公開的脂質(zhì)體萬古霉素的一種或多種治療的感染是 由選自以下的微生物導(dǎo)致的感染：金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素 中介金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、凝固酶陰性葡萄球菌及其組合。在 一些實施方案中，該感染由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌導(dǎo)致。在一些實施方案中，該感染由 革蘭氏陽性菌導(dǎo)致。在一些實施方案中，所治療的個體是哺乳動物。在一些實施方案中，所 治療的個體是人。在某些實施方案中，所治療的個體是免疫低下的。在一些實施方案中，所 治療的個體具有一種或多種由一種或多種另外的病原體導(dǎo)致的繼發(fā)感染。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明方法和試劑盒的藥物組合物可配制成通過任何給藥途徑遞送。"給藥 途徑"可指本領(lǐng)域已知的任何給藥途徑，包括但不限于氣溶膠、鼻腔、口腔、經(jīng)粘膜、透皮或 腸胃外。"透皮"給藥可使用局部用乳霜或油膏或通過透皮貼片而實現(xiàn)。"腸胃外"是指通常 與注射相關(guān)的給藥途徑，包括眶內(nèi)、輸注、動脈內(nèi)、囊內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、 脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、子宮內(nèi)、靜脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、囊下、皮下、經(jīng)粘膜或經(jīng)氣管。通過腸胃外 途徑，組合物可以是輸注或注射用溶液劑或混懸劑的形式。通過腸道途徑，藥物組合物可以 是片劑、凝膠膠囊、糖衣片、糖漿劑、混懸劑、溶液劑等的形式。通過局部途徑，基于根據(jù)本發(fā) 明化合物的藥物組合物可配制成治療皮膚和粘膜，并為油膏、乳霜、乳劑、藥膏、散劑、浸漬 墊、溶液劑、凝膠劑、噴霧劑、洗劑或混懸劑的形式。通過眼睛途徑，它們可以為滴眼液的形 式。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的方法和試劑盒的藥物組合物還可以包含任何藥學(xué)上可接受的載體。 如本文所用的"藥學(xué)上可接受的載體"是指在所關(guān)注的化合物從一個組織、器官或身體部分 攜帶到或轉(zhuǎn)運到另一組織、器官或身體部分時涉及到的藥學(xué)上可接受的材料、組合物或媒 介物。例如，載體可以是液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料或它們的組 合。載體的每種組分必須是"藥學(xué)上可接受的"，因為它必須與制劑的其它成分相容。它還 必須適用于與其可接觸的任何組織或器官發(fā)生接觸，也就是說，它不得帶有毒性、刺激、變 應(yīng)性反應(yīng)、免疫原性或過分超出其治療性有益效果的任何其它并發(fā)癥風(fēng)險。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明方法和試劑盒的藥物組合物還可以用膠囊包封、壓片、或以乳液或糖 漿的形式制備以供口服?？商砑铀帉W(xué)上可接受的固體或液體載體，以增強或穩(wěn)定組合物，或 有利于組合物的制備。液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、甘油、鹽水、醇和水。固體載體 包括淀粉、乳糖、硫酸鈣二水合物、石膏粉、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石、果膠、阿拉伯樹膠、瓊 脂或明膠。載體還可以包括持續(xù)釋放材料，諸如單獨的或與蠟一起的單硬脂酸甘油酯或二 硬脂酸甘油酯。
[0038] 藥物制劑物根據(jù)藥劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備，這些技術(shù)涉及對于片劑而言的必要時的碾 磨、混合、造粒和壓片；或?qū)τ谟裁髂z膠囊劑而言的碾磨、混合和充填。當(dāng)使用液體載體時， 制備物將為糖漿、酏劑、乳劑或水性或非水性混懸劑的形式。這樣的液體制劑可直接口服或 充填到軟明膠膠囊中。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明方法和試劑盒的藥物組合物可按治療有效量遞送。精確的治療有效量 是將在給定受試者中就治療功效而言產(chǎn)生最有效結(jié)果的組合物的量。該量將根據(jù)許多因素 而變化，包括但不限于治療性化合物的特性(包括活性、藥代動力學(xué)、藥效動力學(xué)和生物利 用率)、受試者的生理狀況(包括年齡、性別、疾病類型和階段、一般性身體狀況、對給定劑量 的反應(yīng)和藥物類型)、在制劑中藥學(xué)上可接受的一種或多種載體的性質(zhì)以及給藥途徑。臨床 和藥理學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)實驗確定治療有效量，例如通過監(jiān)測受試者對化 合物施用的反應(yīng)并相應(yīng)地調(diào)整劑量。對于另外的指導(dǎo)，參見Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro 編，第 20 版，Williams&Wilkins PA，USA)(2000)。
[0040] 典型的劑量可在制造商推薦的范圍內(nèi)（如果使用已知的治療性化合物)，而對技術(shù) 人員而言則可通過體外反應(yīng)或動物模型中的反應(yīng)表明。此類劑量在濃度或量上通?？山档?最多約一個數(shù)量級而不喪失相關(guān)生物活性。因此，實際的劑量將取決于醫(yī)生的判斷、患者的 病癥，以及基于例如體外響應(yīng)或在合適動物模型中觀察到的反應(yīng)的治療方法有效性。
[0041] 在一些實施方案中，本發(fā)明還涉及治療細(xì)菌感染的試劑盒。在一些實施方案中，該 試劑盒可用于治療個體中的MRSA感染。試劑盒是材料或組成部分(包括本文所述的組合物 的一種或多種）的組裝。因此，在一些實施方案中，試劑盒包含含有萬古霉素、DCP脂質(zhì)體和 /或DMPG脂質(zhì)體的組合物。在一些實施方案中，該脂質(zhì)體萬古霉素包含萬古霉素、DSPC、DCP 和膽固醇。在一些實施方案中，DSPC、DCP和膽固醇的摩爾比為7:2:1。在其它實施方案中， 該脂質(zhì)體萬古霉素包含萬古霉素、DSPC、DMPG和膽固醇。在一些實施方案中，DSPC、DMPG和 膽固醇的摩爾比為7:2:1。
[0042] 在本發(fā)明試劑盒中構(gòu)造的組成部分的確切性質(zhì)取決于其預(yù)期目的。例如，將一些 實施方案構(gòu)造成用于治療細(xì)菌感染的目的。在一些實施方案中，該細(xì)菌感染由選自以下的 微生物導(dǎo)致：金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素中介金黃色葡萄球 菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、凝固酶陰性葡萄球菌及其組合。在一個實施方案中， 該感染由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌導(dǎo)致。在一些實施方案中，該試劑盒被構(gòu)造成尤其用 于治療哺乳動物受試者的目的。在其它實施方案中，該試劑盒被構(gòu)造成尤其用于治療人類 受試者的目的。在另外的實施方案中，該試劑盒被構(gòu)造成用于獸醫(yī)應(yīng)用，從而治療諸如但不 限于農(nóng)場動物、家庭動物和實驗室動物的受試者。
[0043] 使用說明可包括在試劑盒內(nèi)。"使用說明"通常包括描述在使用試劑盒的組成部分 實現(xiàn)所需的結(jié)果諸如治療細(xì)菌感染時將采用的技術(shù)的有形表達。任選地，試劑盒還包含其 它有用的組成部分，諸如稀釋劑、緩沖劑、藥學(xué)上可接受的載體、注射器、導(dǎo)管、涂藥器、移液 或測量工具、繃帶材料或本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到的其它有用器具。
[0044] 以保證可操作性和實用性的任何便利和合適方式儲存的在試劑盒中組裝的材料 或組成部分可提供給從業(yè)者。例如，組分可以為溶解、水合或凍干的形式；它們可在室溫、冷 藏或冷凍溫度下提供。組成部分通常容納在合適的包裝材料中。如本文所采用，短語"包裝 材料"是指用于容納試劑盒內(nèi)容物(諸如本文所公開的本發(fā)明的組合物等）的一種或多種物 理結(jié)構(gòu)。包裝材料通過熟知的方法構(gòu)造，優(yōu)選地提供無菌、無污染的環(huán)境。試劑盒中采用的 包裝材料是通常用于治療細(xì)菌感染的那些。如本文所用，術(shù)語"包裝"是指能夠容納各個試 劑盒組成部分的合適固體基質(zhì)或材料，諸如玻璃、塑料、紙張、箔等。因此，例如，包裝可以是 用于容納適量的用于治療細(xì)菌感染的本發(fā)明組合物的玻璃小瓶。包裝材料通常具有外部標(biāo) 簽，它指明試劑盒的內(nèi)容物和/或目的和/或其組成部分。
[0045] 提供以下非限制性實施例以進一步闡述本文所公開的本發(fā)明的實施方案。本領(lǐng)域 的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，以下實施例中公開的技術(shù)代表在實踐本發(fā)明時發(fā)現(xiàn)的能夠很好地 發(fā)揮作用的方法并因此可視為構(gòu)成其實踐模式的實施例。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本 公開應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，在所公開的具體實施方案中可作 出許多改變并仍能獲得相同或相似的結(jié)果。 實施例
[0046] 實施例1
[0047] 細(xì)菌菌株、小鼠和化學(xué)品
[0048] 用于本研究的MRSA菌株為：NRS-35 (得自NARSA的醫(yī)院相關(guān)性MRSA)、LAC (脈沖 型（pulsotype)USA300 的 CA-MRSA 菌株）、ATCC29213、ATCC433000 和得自 Cedars-Sinai 臨 床實驗室的六個另外的MRSA分離株（Cedars-Sinai IRB exemption Pro0022541)。十周 齡的CD1雄性小鼠購自Charles River。1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰膽堿（DSPC) 和膽固醇得自 Northern Lipids Inc. (Burnaby, BC, Canada)。憐酸二嫁錯酯（DCP)和二 肉豆蘧酰磷脂酰甘油（DMPG購自Sigma-Aldrich(St. Louis，M0，USA)。萬古霉素購自Gold Biotechnology(St. Louis, M0, USA)〇
[0049] 實施例2
[0050] 脂質(zhì)體制備
[0051] 將 7:2:1 摩爾比的 DSPC:DMPG:CH0L (DSPC71.5mg、DMPG17.8mg 和膽固醇 5mg)或 7:2:1摩爾比的DSPC:DCP:CH0L (DSPC71. 5mg、DCP14. lmg和膽固醇5mg)的脂質(zhì)混合物在 圓底錐形瓶中溶于lmL氯仿/甲醇（2:lv/v比)。將有機溶劑在真空和55°C下使用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀（Buchi-Rotavapor R205，Brinkmann, Toronto, ON, Canada)除去。該過程產(chǎn)生了干燥 的脂質(zhì)薄膜。
[0052] 將1ml萬古霉素水溶液（50mg/mL)加到干燥的脂質(zhì)薄膜，用手在55°C的水浴中搖 晃1分鐘。然后將脂質(zhì)懸浮液在浸入冰浴的情況下超聲處理5分鐘（Sonic Dismembrator M〇del500, Fischer Scientific，USA)。超聲儀在任何時候均不直接接觸脂質(zhì)體懸浮液。將 懸浮液凍干過夜以便保存（Labconco model77540，USA)。
[0053] 脂質(zhì)體的平均直徑采用在23 °C運行的NIC0MP270亞微米粒度分析儀（Santa Barbara, CA, USA)通過光子相關(guān)光譜法測定。脂質(zhì)體的大小為527. 6nm±58. 2nm。將50mg/ ml的萬古霉素用于制備脂質(zhì)體萬古霉素。這些脂質(zhì)體的包封效率(定義為留在脂質(zhì)體內(nèi)的 活性化合物的量與引入的萬古霉素初始量的比率）通過在具有金黃色葡萄球菌ATCC29213 菌苔的Mueller-Hinton瓊脂（Becton Dickinson)中切割的孔中的徑向擴散以及由標(biāo)準(zhǔn)曲 線計算的萬古霉素濃度確定。效率對于DCP為9%，對于DMPG為20%。對于脂質(zhì)體的再水合， 將磷酸鹽緩沖溶液（PBS)加入、渦旋并在44°C的水浴中加熱30分鐘，然后以12000rpm離心 20分鐘。將上清液丟棄，將沉淀用PBS復(fù)溶，并在兩天內(nèi)使用。
[0054] 實施例3
[0055] MRSA殺滅動力學(xué)測定
[0056] 使MRSA菌株在Todd Hewitt肉湯（THB)中在37°C和振蕩下生長過夜。第二天，將 細(xì)菌在PBS中洗滌兩次，添加到含或不含抗生素的THB中，達到約2X10 5CFU/ml的最終濃 度，然后在37°C和振蕩下孵育。在0、3和6小時時，將細(xì)菌鋪到瓊脂上以對存活的CFU計 數(shù)。
[0057] 實施例4
[0058] 全身性MRSA感染的治療
[0059] 將過夜MRSA培養(yǎng)物在THB中稀釋，在37°C和振蕩下生長到0. 6的0D_，離心，然 后在PBS中洗滌兩次。將十周齡⑶-1雄性小鼠通過3. 9X 106CFU的MRSA在腹膜內(nèi)進行感 染。感染后一小時，將小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射PBS、50mg/kg的DCP脂質(zhì)體萬古霉素或50mg/kg 的游離萬古霉素。24小時后，將小鼠處死，采集脾臟和腎臟，勻化，然后鋪到瓊脂上以對CFU 計數(shù)。動物感染實驗得到了 Cedars-Sinai Committee on the Use and Care of Animals 的批準(zhǔn)并使用公認(rèn)的獸醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)進行。
[0060] 實施例5
[0061] 統(tǒng)計分析
[0062] 對于時間殺菌試驗，使用未配對斯氏t檢驗進行了比較。對于鼠類研究，計算了對 組的平均值的方差分析（AN0VA)，并將〈0. 05的p值視為具有統(tǒng)計顯著性。
[0063] 實施例6
[0064] 脂質(zhì)體萬古霉素制劑的MIC和MBC
[0065] 在研究中評價了兩個脂質(zhì)體萬古霉素制劑，基于它們包含在相應(yīng)脂質(zhì)體制備物中 而指定為DCP和DMPG。如表1所示，DCP和DMPG萬古霉素均顯示出與游離萬古霉素相比針 對HA-MRSA菌株NRS-35和CA-MRSA菌株LAC的低2至4倍的MIC。對于脂質(zhì)體抗生素而 言，與游離萬古霉素相比，MBC約低4倍(表2)。進一步針對一組共7個MRSA菌株評估了 DCP萬古霉素，與游離萬古霉素相比，其表現(xiàn)出大約低2倍的MIC (表1)。無抗生素的對照 脂質(zhì)體未抑制MRSA菌株的生長(數(shù)據(jù)未示出）。
[0066] 實施例7
[0067] 脂質(zhì)體萬古霉素在清除MRSA中的功效
[0068] 接下來，在時間殺菌試驗中調(diào)查了 DCP萬古霉素的抗微生物活性。為游離和脂質(zhì) 體萬古霉素選擇的濃度包括了 1/2XMICUXMIC和2XMIC。如圖la所示，在3小時后在 所有3種濃度下，DCP萬古霉素與常規(guī)萬古霉素相比均展示出增強的MRSA (LAC)殺滅。DCP 與游離萬古霉素組之間的差異對于〇. 6mg/L的劑量在6小時時仍然具有顯著性，但對于其 它兩個劑量而言則無。在1. 25mg/L的劑量下，在3h和6h時，DCP萬古霉素殺滅NRS-35也 均比游離萬古霉素有效（圖lb)。在其它藥物濃度下未觀察到殺滅的顯著差異。
[0069] 實施例8
[0070] DCP脂質(zhì)體萬古霉素在全身性MRSA感染模型中的功效
[0071 ] 為了在體內(nèi)評價DCP的功效，將10-12只小鼠為一組用MRSA(LAC)進行腹膜內(nèi)接 種。一小時后，向小鼠施用PBS、50mg/kg的游離萬古霉素或50mg/kg的DCP萬古霉素。在 感染后24小時，對腎臟和脾臟中的CFU負(fù)荷計數(shù)（圖2)?？傮w而言，DCP萬古霉素與PBS組 相比將脾臟和腎臟中的細(xì)菌負(fù)荷降低了 2至3個數(shù)量級（p〈=0. 001)。與游離萬古霉素治療 相比，DCP萬古霉素治療將腎臟和脾臟中的細(xì)菌負(fù)荷均降低了一個數(shù)量級。這對于腎臟CFU 是明顯的，但對于脾臟CFU不明顯。
[0072] 實施例9
[0073] MIC和MBC的測定
[0074] 通過肉湯稀釋技術(shù)測定了所有菌株的游離和脂質(zhì)體抗生素的MIC。簡而言之，制備 了從20至0. 3 μ g/ml的游離或脂質(zhì)體包封抗生素的序列稀釋樣。對于細(xì)菌懸液，將MRSA 的冷凍儲液劃線接種到綿羊血瓊脂板上。將單個集落接種到新鮮培養(yǎng)基中，在37°C下振蕩 20小時。將過夜細(xì)菌稀釋，然后加到96孔板（Becton Dickinson)中以實現(xiàn)大約IX 105的 濃度。將接種物通過鋪到瓊脂上進行了確認(rèn)。然后將96孔板在振蕩或不振蕩的情況下在 37°C進行孵育，在24小時后確定了抑制細(xì)菌可見生長的抗生素制劑的最低濃度（MIC)。將 孔板在振蕩下（200rpm)孵育增加了脂質(zhì)體制劑的MIC測量的一致性。對于MBC的測定，將 用于MIC測定的肉湯鋪到瓊脂上，然后確定原始接種物99. 9%被殺滅時的第一個稀釋度。所 有MIC和MBC測定均進行了至少三次。
[0075] 實施例10
[0076] 表
[0077] 表1-MRSA菌株的萬古霉素 MIC
[0078]

【權(quán)利要求】
1. 一種組合物，其包含萬古霉素、DCP脂質(zhì)體和/或DMPG脂質(zhì)體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其包含萬古霉素、DSPC、DCP和膽固醇。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述DSPC、DCP和膽固醇的摩爾比為7:2:1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其包含萬古霉素、DSPC、DMPG和膽固醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述DSPC、DMPG和膽固醇的摩爾比為7:2:1。
6. -種治療個體中的感染的方法，其包括： 提供包含萬古霉素、DCP脂質(zhì)體和/或DMPG脂質(zhì)體的組合物；以及 向所述個體施用治療有效量的所述組合物以便治療所述感染。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述組合物包含萬古霉素、DSPC、DCP和膽固醇。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述DSPC、DCP和膽固醇的摩爾比為7:2:1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述組合物包含DSPC、DMPG和膽固醇。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述DSPC、DMPG和膽固醇的摩爾比為7:2:1。
11. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述感染是由選自以下的微生物導(dǎo)致的細(xì)菌感 染：金黃色葡萄球菌（S. aureus)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素中介金黃色葡萄 球菌、肺炎鏈球菌（S. pneumoniae)、奠腸球菌（E. faecalis)、屎腸球菌（E. faecium)、凝固 酶陰性葡萄球菌及其組合。
12. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述感染由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌導(dǎo)致。
13. -種用于治療細(xì)菌感染的試劑盒，其包括： 包含萬古霉素、DCP脂質(zhì)體和/或DMPG脂質(zhì)體的組合物；以及 其在治療個體中的細(xì)菌感染的使用說明。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述組合物包含萬古霉素、DSPC、DCP和膽固 醇。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中所述DSPC、DCP和膽固醇的摩爾比為7:2:1。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述組合物包含萬古霉素、DSPC、DMPG和膽固 醇。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述DSPC、DMPG和膽固醇的摩爾比為7:2:1。
18. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述細(xì)菌感染由選自以下的微生物導(dǎo)致：金 黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素中介金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、 糞腸球菌、屎腸球菌、凝固酶陰性葡萄球菌及其組合。
19. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述感染由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌導(dǎo) 致。
【文檔編號】A61K9/127GK104159571SQ201280022336
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月26日
【發(fā)明者】G·Y·劉, A·歐姆瑞 申請人:席德-西奈醫(yī)療中心