專利名稱：：鑒定蘄蛇的pcr方法及其特異引物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及中藥及中藥材鑒定
技術領域：
，特別涉及一種能夠特異鑒定蘄蛇的PCR方法及其特異引物。主要用于蘄蛇藥材、含有蘄蛇的制劑以及蘄蛇活體材料的快速鑒定。
背景技術：
：蘄蛇為中國藥典(2005年版)一部收載的一種常用中藥，來源于蝰科動物五步蛇AgkistrodonacutusGUenther的干燥體。有祛風，通絡，止痙之功效。用于風濕頑痹，麻木拘攣，半身不遂，抽搐痙攣，破傷風，麻風疥癬(中國藥典.一部.2005.258))。蘄蛇作為貴重動物藥材的臨床功效確切，但商品來源復雜、藥材形態(tài)鑒別困難，我們在收集實驗材料的同時對巿場上蘄蛇藥材的流通情況進行了調(diào)査。商品流通中多以中介蝮蛇、山烙鐵頭、蝰蛇等經(jīng)過加工后混作正品蘄蛇銷售。這些品種與蘄蛇同科不同屬，因其來源相近，造成鑒定困難。此外，藥材在加工處理時剖去內(nèi)臟后，要進行干燥處理，皮上的花紋特征、顏色變得模糊，使得辨認困難，如百花錦蛇、玉斑錦蛇、滑鼠蛇、眼鏡蛇等其大小、形態(tài)特征有與蘄蛇相近之處，這也是造成鑒定困難的另一重要原因。為了獲取暴利，造假的手段越來越高明，一些造假者將蘄蛇蛇皮黏合其他動物的肉以增加份量。因此就要求鑒別者具備豐富的鑒別經(jīng)驗，如僅根據(jù)形態(tài)特征來進行鑒別已不能滿足市場的需求。隨著分子生物學技術的發(fā)展，我們曾利用PCR技術對蘄蛇的鑒別鑒別進行了一些探索(唐曉晶，馮成強，黃璐琦，錢忠直，崔光紅，張繼.蘄蛇及其混淆品高特異性PCR鑒別.藥物分析雜志，2006,26(2):152~155)，但原有方法需要配制大量的試劑，且操作時間長，不具有推廣實用性。因此，建立更快捷和特異的方法是解決蘄蛇乃至中藥材真?zhèn)舞b別迫切的需求。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的PCR引物及方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種蘄蛇的PCR引物及其鑒定方法，該PCR鑒定方法操作簡單、.樣品量少、能快速準確的鑒定蘄蛇藥材、粉末制劑以及活體材料，特別適用于鑒定因加工而導致DNA含量極少、形態(tài)破碎的中藥真?zhèn)蔚蔫b定。一種鑒定蘄蛇的特異引物P1、P2，其序列為Pl:5'國GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-3'P2:5，-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3'一種蘄蛇的PCR鑒定方法，包括下列步驟a)從所述材料中提取得到DNA樣品；b)用P1、P2為引物進行PCR擴增，PCR反應參數(shù)為95'C預變性5min后，進行30次循環(huán)(95。C30s，60-63°C45s)，后延伸72°C5min，獲得擴增產(chǎn)物；c)電泳所述擴增產(chǎn)物，如果存在分子量343bp的單一條帶，則確定所檢材料為蘄蛇。本發(fā)明采用試劑盒提取DNA的方法，不需配制任何試劑，使得提取時間大大縮短，樣品量只需0.1g，可以為蛇體的任何部分。同時采用兩步法PCR，使得PCR過程只需1.5h即可完成，整個鑒別過程只需3h。綜上所述，本發(fā)明提供了快速準確鑒定蘄蛇的PCR引物及方法，以蘄蛇DNA為模板，能將蘄蛇從與其親緣關系極近的其他的蛇類中，高效、準確地鑒定出來，為蘄蛇鑒定提供了一種實用的技術。圖1為蘄蛇藥材及其混淆品PCR鑒別結(jié)果1.陽性對照2.蘄蛇3.虎斑頸槽蛇4.三索錦蛇5.雙全白花蛇6.灰鼠蛇7.滑鼠蛇8.紅點錦蛇9.王錦蛇IO.赤鏈華游蛇ll.中國水蛇12.短吻蝮蛇13.百花錦蛇14.眼鏡蛇15.赤練蛇16.鉛色水蛇17.金環(huán)蛇18.山烙鐵頭蛇19.黑眉錦蛇20.環(huán)紋華游蛇21.烏梢蛇22.金錢白花蛇23.陰性對照24.空白M.DNA分子量標準從上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp圖2為8個不同批次的蘄蛇藥材PCR鑒別結(jié)果l.陽性對照2-9.蘄蛇(順序見表1)IO.陰性對照11.空白M.DNA分子量標準從上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp具體實施方式1材料蘄蛇樣品來自河北安國地區(qū)、北京同仁堂藥店、北京金象大藥房、北京陽光同仁大藥房、北京京隆堂藥店等，詳見表l。樣品均經(jīng)中國藥品生物制品檢定所中藥室標本館張繼館長鑒定。、表1樣品來源表編號樣品名稱il<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>6三索錦蛇￡7a//zeraWata7雙全白花蛇i_ycoiio"力5cZaftw8灰鼠蛇P一sfowos(Schlegel)9滑鼠蛇P腦cosiw丄/朋wetw10紅點錦蛇raj^doraato(Cantor)11王錦蛇￡.caW"ata(GUenther)12赤鏈華游蛇57"o<3/Wjc朋咖/an's(Hallowell)13中國水蛇c/j/"otw\s14短吻蝮蛇JgHyfrofifo"Zza/jj(Pallas)15百花錦蛇woe//e"<io/"^(Boettger)16目艮鏡蛇A^/a"咖Linnaeus17赤鏈蛇"/"0(jfcwzo"aftOT(Cantor)18鉛色水蛇￡nft>dr!'s(Boie)19金環(huán)蛇5朋ga層y^wc/ate(Schneider)20山恪鐵頭蛇Z/woeww'a附aw/a"e肌.s21黑眉錦蛇￡.toe"Zwra22環(huán)紋華游蛇aegwi/^'c7'ato23烏梢蛇Zao，cft鵬"acfes(Cantor)24金錢白花蛇ff柳gaTO51OTwtedwcfttf_說明書第3/5頁屮國藥品生物檢定所河北安國河北安國中國藥品生物檢定所中國藥品生物檢定所中國藥品生物檢定所江西樟樹河北安國'河北安國河北安國中國藥品生物檢定所江西樟樹河北安國河北安國河北安國河北安國江西昌北江西樟樹北京同仁堂2特異引物設計搜索GENBANK中蘄蛇及其常見混淆品百花錦蛇、玉斑錦蛇、滑鼠蛇、眼鏡蛇等20余種蛇的細胞色素b(c^b)序列，用DNAMAN進行同源比對，根據(jù)其變異區(qū)設計一對特異引物P1、P2，序列如下PI:5，-GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-3'P2:5'國CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3'3DNA提取采用Promega公司DNA提取試劑盒WizardSVGenomicDNAPurificationSystem提取各種材料的DNA。①取供試品適量(約0.5g)，去除表面污染物，液氮中充分研磨使成粉末，取適量(約O.lg)至1.5mL離心管中；②加入275pL消化液，比例如下NucleilysisSolution200|^L0.5MEDTA50pLProteinaseK(20mg/mL)20nLRNaseASolution_5uL_總體積275pL③放置55。C水浴中溫育0.5~lh;取出后加入250nLWizardSVLysisBuffer,混勻后將溶液全部轉(zhuǎn)移入過濾柱中，10OOOrpm離心3min;⑤棄掉過濾液，加入800pL洗脫液，10OOOrpm離心lmin;⑥棄掉過濾液，反復清洗3次，每次10OOOrpm離心lmin;⑦棄掉最后一次過濾液后再離心2min，將過濾柱轉(zhuǎn)移入新的離心管中，加入100pL無菌雙蒸水，室溫放置2min后10OOOrpm離心2min。濾液-20"C保存?zhèn)溆谩?PCR擴增PCR反應在200nLPCR反應管中進行，反應總體積25pL，包括以下試劑IOXPCR緩沖液2.5pLdNTP(2.5mM)2pL引物(10|iM)0.5jaLTaqDNA聚合酶(Takara公司，ExTaq5UnL-1)0.2(xL模板(約100ng)0.5pL無菌雙蒸水19.3pL總體積25nLPCR鑒別極易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，為防止誤差的產(chǎn)生，PCR鑒別須建立嚴格的陽性、陰性及空白對照。陽性對照為中國藥品生物制品檢定所提供的正品蘄蛇，選用與蘄蛇DNA序列最為接近的眼鏡蛇作為陰性對照，空白對照為無菌雙蒸水。按樣品同樣的方法進行DNA提取和PCR擴增。PCR反應液配制完后，以4000r/min離心10s，將PCR管插入PCR儀中，進行如下反應95。C5min;進行30次擴增反應循環(huán)(95。C30s，60-63°C45s)，然后72。C5min。取8pL擴增產(chǎn)物，采用1.5%的瓊脂糖凝膠，在電壓70100V下電泳20分鐘后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。其涉及其20個相關混淆品的電泳如圖1，8批蘄蛇的電泳如圖2。結(jié)果可見，蘄蛇能擴增343bp的單一條帶，而混淆品沒有擴增條帶，表明該體系能將蘄蛇與其混淆品準確的分開，不同來源的蘄蛇樣品能實現(xiàn)準確的鑒別。SEQUENCELISTING<110>中國中醫(yī)科學院中藥研究所<120>鑒定蘄蛇的PCR方法及其特異引物<130>-<160>2<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>28<212>DNA<213>人工合成<220><221>PI<222>(1)..(28)<400>1gcaattcactacacagccaacatcaact28<210>2<211>24<212>DNA<213>人工合成<220><221>P2<222>(1)"(24)<400>2ccatagtcaggtggttagtgatac2權(quán)利要求1、一種鑒定蘄蛇的特異引物P1、P2，其序列為P15’-GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-3’P25’-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3’2、一種蘄蛇的PCR鑒定方法，其特征在于，包括下列步驟a)從所述材料中提取得到DNA樣品；b)用權(quán)利要求1所述的引物進行PCR反應，PCR反應參數(shù)為95'C預變性5min后，進行30次循環(huán)(95°C30s，60-63°C45s)，后延伸72°C5min，獲得擴增產(chǎn)物；c)電泳所述擴增產(chǎn)物，如果存在分子量343bp的單一DNA條帶，則確定所檢材料為蘄全文摘要本發(fā)明屬于中藥及中藥材鑒定
技術領域：
，特別涉及到一種能夠特異鑒定蘄蛇的PCR方法及其特異引物。使用此方法鑒別蘄蛇的真?zhèn)危煌ㄟ^簡單的DNA提取、PCR特異性擴增、電泳檢測即可完成對樣品真?zhèn)蔚蔫b別。具有操作簡單、特異性強、重復性好等優(yōu)點。主要用于蘄蛇藥材、含有蘄蛇的制劑以及蘄蛇活體材料的快速鑒定。文檔編號C12Q1/68GK101613758SQ20091014859公開日2009年12月30日申請日期2009年6月30日優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日發(fā)明者唐曉晶,崔光紅,趙靜雪,黃璐琦申請人:中國中醫(yī)科學院中藥研究所