專利名稱：一種異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，屬生物醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)及 納米技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，各種形式的納米材料正以各種途徑進(jìn)入我們的生活，納米尺 度的材料具有小尺寸效應(yīng)、大比表面積、高反應(yīng)活性等性質(zhì)，其能夠進(jìn)入生物體，對(duì)生物體 造成的各種的影響已經(jīng)引起科學(xué)界和各國(guó)政府的廣泛關(guān)注。
納米生物技術(shù)在迅速發(fā)展的生物技術(shù)領(lǐng)域中正處于領(lǐng)先地位，利用納米技術(shù)對(duì)細(xì)胞和動(dòng) 物體內(nèi)成像的探索性發(fā)展已經(jīng)進(jìn)行了很多年。作為納米生物技術(shù)的基礎(chǔ)，納米粒子具有尺寸 小和新穎的特性，已廣泛用于藥物輸送，細(xì)胞成像，和生物醫(yī)學(xué)的診斷和治療。特別是用熒 光成像技術(shù)，納米粒子獨(dú)特的物化特性使其特別適合在細(xì)胞中對(duì)分子進(jìn)行觀察和軌跡跟蹤。 由于二氧化鈦納米管具有生物和化學(xué)惰性以及它的成本效益，二氧化鈦納米管結(jié)合了無機(jī)和 有機(jī)成分的特性，并且大范圍使用于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，利用異硫氰酸 熒光素標(biāo)記或修飾的二氧化鈦納米管研究其在細(xì)胞中的定位、遷移、代謝等分子生物活動(dòng)過 程。
本發(fā)明一種異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，其特征在于具有以下的過程和 步驟
a. 3-氨丙基三乙氧基硅烷與異硫氰酸熒光素化合物的合成(FITC-APTS)
用36.3ml3-氨丙基三乙氧基硅垸(APTS， d=0.949)、 2.625mg異硫氰酸熒光素(FITC) 與0.5ml的重蒸后的分析純無水乙醇，放置于潔凈的三頸燒瓶中共同混合；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下使 其反應(yīng)，反應(yīng)在磁力攪拌下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為12 15小時(shí)；在FITC-APTS兩物質(zhì)的合成過 程中要避光，避免光漂白；所述反應(yīng)的反應(yīng)方程式如下 <formula>formula see original document page 3</formula>
b. 異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管(Ti02-FITC-NTS)用lml氨水和30ml重蒸乙醇混合在100ml的圓底燒瓶中，用磁力攪拌機(jī)進(jìn)行攪拌，并 調(diào)節(jié)pH值，5分鐘后加入3mg二氧化鈦納米管和50ul四乙氧基硅烷(TEOS), 2分鐘后加 入1.4ml氨水，調(diào)節(jié)pH值至11.85, 10分鐘后加入100ul已標(biāo)記有異硫氰酸熒光素(FITC) 的3-氨丙基三乙氧基硅烷(FITC-APTS)，繼續(xù)磁力攪拌24 30小時(shí)；其具體反應(yīng)方程式如 下
<formula>formula see original document page 4</formula>
最終得到異硫氰酸熒光素標(biāo)記或修飾的二氧化鈦納米管(Ti02-FITC-NTS)。
一種異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法所得到的異硫氰酸熒光素二氧化鈦納米 管(Ti02-FITC-NTS)的用途是研究其在細(xì)胞中的定位、遷移、代謝等分子生物活動(dòng)過程；可 直接用于細(xì)胞生物試驗(yàn)。
本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)是熒光素標(biāo)記的二氧化鈦納米管分散性好。同時(shí)合成過程簡(jiǎn)單，不 需要如高溫、高壓、添加催化劑等特殊的反應(yīng)條件，并且硅是生物兼容性物質(zhì)、無毒性，同 時(shí)在反應(yīng)中選擇地加入少量TEOS，使得二氧化鈦納米管表面形成有序的硅矩陣包封在熒光 試劑周圍，避免光漂白，有利于增加其穩(wěn)定性，不影響二氧化鈦納米管與細(xì)胞的作用效果。
本發(fā)明標(biāo)記方法與半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比具有很多優(yōu)點(diǎn)比半導(dǎo)體的量子點(diǎn)的熒光量子效率 高，有利于在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用；并且半導(dǎo)體量子點(diǎn)需要紫外激發(fā)，會(huì)生成一種高毒性的Cd2+，
損傷及殺死生物細(xì)胞及生物大分子。


圖1為異硫氰酸熒光素修飾后二氧化鈦納米管的激光共聚焦熒光圖。
圖2為修飾后的二氧化鈦納米管的透射電鏡圖(TEM)。
圖3為修飾后的二氧化鈦納米管的紅外光譜分析圖。
圖4為修飾后的二氧化鈦納米管的X射線衍謝分析圖(XRD )。
圖5為修飾后的二氧化鈦納米管的紫外光譜分析圖。
圖6為熒光修飾納米二氧化鈦在細(xì)胞中的激光共聚焦表征圖。圖7為熒光修飾納米二氧化鈦在細(xì)胞中的激光共聚焦表征圖。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)將本發(fā)明的具體實(shí)施例敘述于后。 實(shí)施例l
本實(shí)施例中的過程和步驟如下
(1) 3-氨丙基三乙氧基硅烷與異硫氰酸熒光素化合物的合成(FITC-APTS) 用36.3ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS， d=0.949)、 2.625mg異硫氰酸熒光素(FITC) 與0.5ml的重蒸后的分析純無水乙醇，放置于潔凈的三頸燒瓶中共同混合；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下使 其反應(yīng)，反應(yīng)在磁力攪拌下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)；在FITC-APTS兩物質(zhì)的合成過程中 要避光，避免光漂白；所述反應(yīng)的反應(yīng)方程式如下
I FITC 'I
b.異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管(Ti02-FITC-NTS)
用1ml氨水和30ml重蒸乙醇混合在100ml的圓底燒瓶中，用磁力攪拌機(jī)進(jìn)行攪拌，并 調(diào)節(jié)pH值至11.55， 5分鐘后加入3mg 二氧化鈦納米管和50ul四乙氧基硅垸(TEOS)， 2分 鐘后加入1.4ml氨水，調(diào)節(jié)pH值至11.85， 10分鐘后加入lOOul已標(biāo)記有異硫氰酸熒光素 (FITC)的3-氨丙基三乙氧基硅烷(FITC-APTS)，繼續(xù)磁力攪拌24小時(shí)；其具體反應(yīng)方程 式如下
<formula>formula see original document page 5</formula>
最終得到異硫氰酸熒光素標(biāo)記或修飾的二氧化鈦納米管(Ti02-FITC-NTS)。 本發(fā)明實(shí)施例所制得的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二氧化鈦納米管的表征。 通過各項(xiàng)儀器檢測(cè)，所得的表征結(jié)果參見附圖中的圖1至圖5。圖1為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二氧化鈦納米管的激光共聚焦圖片，從圖中可以看出，修 飾后的納米管具有很好的熒光強(qiáng)度，且分布均勻。
圖2為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二氧化鈦納米管的TEM圖片
圖3為紅外光譜分析，其中實(shí)線為未修飾的二氧化鈦納米管光譜分析，虛線為異硫氰酸 熒光素修飾后的二氧化鈦納米管光譜分析。硫氰酸熒光素修飾后的二氧化鈦納米管在1055.93 cm—1處出現(xiàn)一強(qiáng)吸收峰，同時(shí)在1384.58 cm'1是OS雙鍵的伸縮振動(dòng)吸收區(qū)域出現(xiàn)了吸收峰， 如圖虛線所示。而沒有修飾FITC的二氧化鈦納米管沒有這些吸收峰，說明FITC成功標(biāo)記在 了二氧化鈦納米管表面。
圖4為異硫氰酸熒光素修飾后的二氧化鈦納米管的X射線衍射圖，圖a為未修飾的二氧 化鈦納米管，圖b為修飾了 FITC的二氧化鈦納米管。由圖中的二氧化鈦特征峰可以看出為 紅金石結(jié)構(gòu)，可以清楚的看到，未修飾的二氧化鈦納米管與修飾了 FITC的納米管的結(jié)構(gòu)是 相似的，二氧化鈦都是以紅金石單一結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。除了出現(xiàn)了鈦的特征峰外，圖譜上出現(xiàn)了硅 的特征峰，可以定性說明Ti02的表面有Si02的存在。說明在熒光修飾過程中，二氧化鈦表面
包覆了的Si02以非晶態(tài)存在。
圖5為紫外光譜分析圖，實(shí)線和虛線分別為未修飾的與異硫氰酸熒光素修飾后的二氧化 鈦納米管紫外光譜分析圖。二氧化鈦納米管在250-400 nm之間的紫外區(qū)有強(qiáng)吸收；在400-500 nm之間的長(zhǎng)波區(qū)有弱的吸收。未標(biāo)記的二氧化鈦納米管在350 nm處有較強(qiáng)的吸收峰，而標(biāo) 記了 FITC的二氧化鈦納米管在350 nm處吸收峰變?nèi)?，說明在標(biāo)記FITC過程中，非晶體硅 以Ti-O-Si鍵存在于二氧化鈦納米管的表面。
細(xì)胞試驗(yàn)
將標(biāo)記后的二氧化鈦納米管經(jīng)過離心分離，用PBS稀釋溶解后可直接用于細(xì)胞試驗(yàn)。在 激光共聚焦專用培養(yǎng)皿了加入一定量的Ti02-FITC，孵育3h， 48 h后，使用DAPI (4，6-聯(lián)脒 -2-苯基巧|哚二鹽酸鹽)染核，最后利用激光共聚焦顯微鏡直接觀察二氧化鈦納米管在細(xì)胞中 的定位(見附圖6、 7)，圖中顯示藍(lán)色為染色后的細(xì)胞核，綠色為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二 氧化鈦納米顆粒?？梢钥闯?，利用激光共聚焦顯微鏡可以直觀的觀察到二氧化鈦納米管在細(xì) 胞中的定位，其首先聚集在細(xì)胞核周圍，最終進(jìn)入細(xì)胞核。
權(quán)利要求
1、一種異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，其特征在于具有以下的過程和步驟a.3-氨丙基三乙氧基硅烷與異硫氰酸熒光素化合物的合成(FITC-APTS)用36.3ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS，d＝0.949)、2.625mg異硫氰酸熒光素(FITC)與0.5ml的重蒸后的分析純無水乙醇，放置于潔凈的三頸燒瓶中共同混合；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下使其反應(yīng)，反應(yīng)在磁力攪拌下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為12～15小時(shí)；在FITC-APTS兩物質(zhì)的合成過程中要避光，避免光漂白；所述反應(yīng)的反應(yīng)方程式如下b.異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管(TiO2-FITC-NTS)用1ml氨水和30ml重蒸乙醇混合在100ml的圓底燒瓶中，用磁力攪拌機(jī)進(jìn)行攪拌，并調(diào)節(jié)pH值，5分鐘后加入3mg二氧化鈦納米管和50ul四乙氧基硅烷(TEOS)，2分鐘后加入1.4ml氨水，調(diào)節(jié)pH值至11.85，10分鐘后加入100ul已標(biāo)記有異硫氰酸熒光素(FITC)的3-氨丙基三乙氧基硅烷(FITC-APTS)，繼續(xù)磁力攪拌24～30小時(shí)；其具體反應(yīng)方程式如下最終得到異硫氰酸熒光素標(biāo)記或修飾的二氧化鈦納米管(TiO2-FITC-NTS)。
2、 一種異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法所得到的異硫氰酸熒光素二氧化鈦納米 管(Ti02-FITC-NTs)的用途是研究其在細(xì)胞中的定位、遷移、代謝等分子生物活動(dòng)過程; 可直接用于細(xì)胞生物試驗(yàn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，屬生物醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)及納米技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的方法過程如下(1)用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)與異硫氰酸熒光素(FITC)合成一種化合物FITC-APTS；(2)用所得的異硫氰酸熒光素標(biāo)記二氧化鈦納米管，得到TiO₂-FITC-NTS，即異磁氰酸熒光素二氧化鈦納米管。利用該物可研究其在細(xì)胞中的定位、遷移、代謝等分子生物活動(dòng)過程。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101525154SQ20091004830
公開日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者瓊 盧, 吳明紅, 張海嬌, 文燎勇, 正 焦, 佳 王, 王艷麗, 程善君, 婧 閻, 陳欣欣 申請(qǐng)人:上海大學(xué)