檢測降鈣素原的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測降鈣素原的試劑盒，包括：抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體和堿性磷酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液。本發(fā)明提供的檢測降鈣素原的試劑盒采用雙抗體夾心法的反應(yīng)模式，有效地利用了化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)結(jié)合磁微粒免疫分離技術(shù)原理，定量測定人體血清或血漿樣品中的PCT含量，確保了檢測的靈敏度，且各項指標(biāo)均達到同類進口試劑盒的分析法水平。
【專利說明】檢測降鈣素原的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，特別是涉及ー種檢測降鈣素原的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]降鈣素原(簡稱PCT)是無激素活性的降鈣素(簡稱CT)前體物質(zhì)，來自定位于第11號染色體上(llpl5，4)的單拷貝基因，PCT是由116個氨基酸組成、分子量為13KD的糖蛋白。PCT由N末端-降鈣素-C末端三部分組成，其不會降解為降鈣素，不受體內(nèi)激素水平影響。PCT的半衰期為25?30小時，是用于檢測細(xì)菌感染所致炎癥反應(yīng)的較好指標(biāo)之一。臨床資料顯示，PCT濃度高于0.1ng/mL時說明存在臨床相關(guān)的細(xì)菌感染，需要采用抗生素進行治療；當(dāng)PCT濃度>0.5ng/mL時，要考慮患者可能發(fā)展成重癥敗血癥或敗血癥性休克的危險，因此，PCT可以作為ー個全身性細(xì)菌感染和膿毒癥輔助和鑒別診斷的實驗室常規(guī)指標(biāo)。
[0003]目前，檢測降鈣素原的方法主要有放射性免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金免疫層析法(GICA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)等。RIA有很高的檢測靈敏度，但由于標(biāo)記物具有放射性危害，標(biāo)記物穩(wěn)定性差，廢棄物難以處理等缺點，已逐漸退出臨床檢驗領(lǐng)域；ELISA法存在靈敏度低、線性范圍窄、不易實現(xiàn)全自動化等缺陷；GICA具有操作簡單，檢測速度快等優(yōu)點，但也存在靈敏度低、試劑不穩(wěn)定、重復(fù)性較差、難以進行定量等缺點；CLIA法是在酶聯(lián)免疫分析法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的ー種免疫檢測技木，具有靈敏度高、檢測線性范圍寬、操作簡便，自動化程度高等優(yōu)勢。目前化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)因其有上述諸多優(yōu)點得到了廣泛的應(yīng)用。但是，現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒多為進ロ的封閉式全自動化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，需要昂貴的全自動化學(xué)發(fā)光檢測儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應(yīng)用于臨床診斷和科研工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種檢測降鈣素原的試劑盒，具有簡便、快速、靈敏度高、線性范圍寬和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005]基于上述目的，本發(fā)明提供的檢測降鈣素原的試劑盒包括:
[0006]抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒，
[0007]異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體，
[0008]堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體，和
[0009]堿性磷酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液。
[0010]可選地，所述試劑盒還包括用于稀釋所述抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體的稀釋液，所述稀釋液為PH值為7.5?8.5、含質(zhì)量比為0.3?0.7%的牛血清白蛋白和0.05?0.3%的疊氮化鈉防腐劑的0.05?0.2M Tris-HCl緩沖液。
[0011]較佳地，所述抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒懸浮于稀釋液配制成
0.5?2 ii g/mL的磁微粒溶液。[0012]較佳地，所述異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶解在稀釋液中配制成0.25?0.5 μ g/mL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降|丐素原單克隆抗體溶液。
[0013]優(yōu)選地，所述堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶解在稀釋液中配制成0.25?0.5 μ g/mL堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液。
[0014]可選地，所述化學(xué)發(fā)光底物液是0.1?0.3M，pH值為8?10的Tris-HCl緩沖液，并含有0.2?0.4mg/mL的二氧雜環(huán)乙燒。
[0015]較佳地，所述化學(xué)發(fā)光底物液是0.2M，pH值為9.3的Tris-HCl緩沖液，并含有0.3mg/mL的二氧雜環(huán)乙燒。
[0016]可選地，所述試劑盒還包括清洗液，所述清洗液為0.1?0.2M，pH值為8?9的Tris-HCl緩沖液中加入質(zhì)量百分比為0.01?0.04%的吐溫20和15?20%的氯化鈉。
[0017]較佳地，所述清洗液為0.1M，pH值為8的Tris-HCl緩沖液中加入質(zhì)量百分比為
0.02%的吐溫20和15%的氯化鈉。
[0018]可選地，所述試劑盒還包括降鈣素原系列校準(zhǔn)品，所述校準(zhǔn)品濃度范圍為O?50ng/mLo
[0019]從上面所述可以看出，本發(fā)明提供的檢測降鈣素原的試劑盒采用雙抗體夾心法的反應(yīng)模式，有效地利用了化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)結(jié)合磁微粒免疫分離技術(shù)原理，定量測定人體血清或血漿樣品中的PCT含量，確保了檢測的靈敏度，且各項指標(biāo)均達到同類進口試劑盒的分析法水平。而且，對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單可靠，可快速、高通量檢測大批樣品，便于操作和生產(chǎn)。本發(fā)明提供的試劑盒結(jié)構(gòu)簡便，使用方便，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單，試劑盒成本低，無放射性污染，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測，適合在國內(nèi)的各級醫(yī)院推廣使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明實施例試劑盒中PCT的濃度一發(fā)光值曲線圖；
[0021]圖2為本發(fā)明實施例A，B點連點擬合曲線圖；
[0022]圖3為本發(fā)明實施例的試劑盒與國外試劑盒的PCT血清樣本檢測結(jié)果相關(guān)性圖(單位:ng/ml)0
【具體實施方式】
[0023]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明進一步詳細(xì)說明。
[0024]本發(fā)明提供的檢測降鈣素原的試劑盒，包括抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體和堿性磷酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液。
[0025]具體地，所述檢測降鈣素原的試劑盒可以通過以下步驟制得:
[0026]一、PCT校準(zhǔn)品的制備
[0027]用pH=7.5,0.1M Tris-HCl緩沖液將PCT純品稀釋成6個水平的凍干校準(zhǔn)品，用純水復(fù)溶后的目標(biāo)濃度分別為0、0.25、2、10、25和50ng/ml。其中，所述降鈣素原校準(zhǔn)品的原料為標(biāo)準(zhǔn)級，純度不低于99%。[0028]ニ、抗異硫氰酸熒光素(FITC)多克隆抗體包被的磁微粒溶液的制備
[0029]將粒徑為I U m的磁微粒加磁場，靜置15min，倒出上清液，用pH=4.7的25mM的MES緩沖液清洗3次，并用該緩沖液進行懸浮，濃度為50mg/mL ;每mL懸浮液中加入抗FITC多克隆抗體2mg，在室溫條件下混合均勻；用去離子水配制濃度為lOmg/mL的EDC溶液，每mL磁微粒懸浮液中加入ImL濃度為lOmg/mL的EDC溶液，在室溫條件下攪拌反應(yīng)4小時后得到包被抗FITC多克隆抗體的磁微粒；然后加磁場，靜置15min，倒出上清液，用pH=8.0，含質(zhì)量比為0.5%的牛血清白蛋白(BSA)和0.2%的疊氮化鈉防腐劑的0.1M Tris-HCl緩沖液清洗4次，并用該緩沖液將包被抗FITC多克隆抗體的磁微粒配制成I U g/mL的工作液。該包被抗FITC多克隆抗體的磁微粒溶液在4°C保存，不應(yīng)凍存，用時混勻。
[0030]三、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液的制備
[0031]將降鈣素原單克隆抗體置于透析袋，在用0.2M pH=9.0的碳酸鹽緩沖液中過夜透析；用0.2M pH=9.0的NaHCO3溶液配制濃度為0.5mg/mL的FITC溶液，每mg降鈣素原單克隆抗體加入0.15mL濃度為0.5mg/mL的FITC溶液，混合均勻，室溫下反應(yīng)20小時后，在
0.2M pH=9.0的碳酸鹽緩沖液中過夜透析，即得到異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體；用含有質(zhì)量百分含量為0.5%的牛血清白蛋白和質(zhì)量百分含量為0.2%的疊氮化鈉防腐劑的0.1M Tris-HCl緩沖液稀釋異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體，得到濃度為0.5 ii g/mL的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降I丐素原單克隆抗體溶液。
[0032]四、堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液的制備
[0033]用去離子水配制13.76mg/mL的2_亞氨基硫羥烷鹽酸鹽溶液，取降鈣素原單克隆抗體預(yù)先裝在尖底試管里，加入13.76mg/mL的2-亞氨基硫羥烷鹽酸鹽溶液(加入量為抗體體積1/100)，混勻，在室溫下放置30分鐘，即得活化后的降鈣素原單克隆抗體。
[0034]取堿性磷酸酶預(yù)先裝在尖底試管里(堿性磷酸酶與降鈣素原單克隆抗體的質(zhì)量比為1:1)，用無水ニ甲基甲酰胺配制6.69mg/mL的Sulfo-SMCC溶液，在含有堿性磷酸酶的試管中加入Sulfo-SMCC溶液(加入量為ALP體積1/20)，混勻，在室溫下放置15分鐘，即得活化后的堿性磷酸酶溶液。
[0035]在上述活化后的降鈣素原單克隆抗體中加入IM的MgCl2溶液(加入量為抗體體積1/500)，再繼續(xù)加入活化后的堿性磷酸酶溶液，將試管放在4°C條件下14?16小吋，即得堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液。
[0036]安裝蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(AKTA purifier 100),使用Superdex200制備級16/70(或相近)柱子，使用PH=7.0去離子水配制的質(zhì)量百分濃度為2%的三こ醇胺溶液進行平衡，流速lml/min,收集各洗脫峰流分,測定各洗脫峰流分的280nm處吸光值,收集280nm處吸光值大于0.02的管份，計算堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體的濃度。用含有質(zhì)量百分濃度為0.5%的牛血清白蛋白和質(zhì)量百分濃度為0.2%的疊氮化鈉防腐劑的0.1M Tris-HCl緩沖液稀釋該堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體，得到濃度為0.5 y g/mL的堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液。
[0037]五、堿性磷酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液的制備
[0038]用0.2M pH=9.3的Tris-HCl緩沖液配制ニ氧雜環(huán)こ烷化合物(APCL)終濃度為0.3mg/mL的溶液。
[0039]六、清洗液的配制[0040]向0.1M、pH=8.0的Tris-HCl緩沖液中加入吐溫20和氯化鈉，其中，吐溫20的質(zhì)量百分濃度為0.02%，氯化鈉的質(zhì)量百分濃度為15% ；
[0041]七、將用上述方法制備的各組分檢驗合格后組裝成試劑盒，組裝成試劑盒后需要抽檢合格后才能出廠。
[0042]在實際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質(zhì)成分較多，一定程度上影響了檢測靈敏度和準(zhǔn)確性，所以從復(fù)雜的待測樣品基質(zhì)中快速分離、純化出目的待測物是臨床檢驗工作者面臨的難題之一。磁微粒免疫檢測技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的抗體或抗原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡單、不影響被分離細(xì)胞或其他生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點，在外加磁場作用下可定向運動，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化?？蛇x地，所述磁微粒為0.7?3 μ m粒徑、四氧化三鐵內(nèi)核、表面包裹有活性基團的聚合物。優(yōu)選地，所述活性基團為羧基。
[0043]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒還包括反應(yīng)試管，其材料選自透明的聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中的至少一種。
[0044]本發(fā)明提供的試劑盒的檢測原理為:將待測樣本，F(xiàn)ITC標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液和ALP標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液混合溫育，熒光素(FITC)和堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的一對抗PCT單克隆抗體與樣本中PCT抗原分子結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。然后加入包被有抗FITC多克隆抗體的磁微粒，免疫復(fù)合物被吸附到磁微粒表面。洗滌去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)后加入發(fā)光底物，ALP催化底物發(fā)光，測定相對發(fā)光強度(RLU)。在一定范圍內(nèi)RLU與PCT抗原濃度呈正比，通過內(nèi)插法就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取待測樣本的PCT含量。
[0045]具體地，本發(fā)明提供的試劑盒的檢測方法可以包括:
[0046]一、樣本要求
[0047]取5.0ml靜脈血至玻璃試管中，不加抗凝劑，在室溫中靜置，然后通過離心(3000rpmX5min)分離血清部分。
[0048]二、檢測方法
[0049]試劑從儲存條件下取出后應(yīng)平衡到室溫再用于檢測；使用前將抗FITC多克隆抗體包被的磁微粒溶液徹底混勻，確保磁微粒懸浮均勻，但是不能使用磁力攪拌器攪拌；清洗液:用去離子水將清洗液稀釋15倍，混勻；設(shè)定好37°C水??；使化學(xué)發(fā)光檢測儀處于待測狀態(tài)；根據(jù)需要準(zhǔn)備試管并做好標(biāo)記。
[0050]加50 μ I校準(zhǔn)品和待測樣本至對應(yīng)試管中，每個樣品應(yīng)更換移液器頭避免交叉污染。加50 μ I FITC標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液和50 μ I ALP標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液至每一試管中，用多管混勻器振蕩混勻30秒(2000轉(zhuǎn)/分)，置37±0.5°C水浴15分鐘。然后加入50μ I抗FITC多克隆抗體包被的磁微粒溶液至每一試管中，用多管混勻器振蕩混勻30秒(2000轉(zhuǎn)/分)，置37±0.5°C水浴5分鐘，試管連架放至磁分離器上，確保試管與磁板接觸，沉淀2分鐘。用一大而緩慢的圓周運動倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同分離器一起放在濾紙上，拍擊，以除去沾在管壁上的液滴。加300 μ I稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器振蕩混勻30秒(2000轉(zhuǎn)/分)。重復(fù)上述清洗操作，共清洗3次。
[0051]加100 μ I堿性磷酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液至每一試管中，混勻3秒，在5分鐘內(nèi)用發(fā)光檢測儀進行檢測。利用四參數(shù)邏輯擬合得到校準(zhǔn)品劑量-反應(yīng)曲線的回歸方程，參見圖1，再根據(jù)待測樣本的相對發(fā)光強度(RLU)可以從回歸曲線上返算出樣本中待測物的濃度。
[0052]按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對本發(fā)明的試劑盒進行檢定，結(jié)果如下:
[0053]1、試劑盒精密度測定
[0054](I)分析內(nèi)精密度
[0055]將本發(fā)明提供的試劑盒取兩批，分別測定低、高不同濃度的血清，10孔平行測定，得出批內(nèi)變異系數(shù)為2%和1.75%。
[0056]表1分析內(nèi)精密度測試
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測降鈣素原的試劑盒，其特征在于，包括: 抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒， 異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體， 堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體，和 堿性磷酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測降鈣素原的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括用于稀釋所述抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體的稀釋液，所述稀釋液為PH值為7.5?8.5、含質(zhì)量比為0.3?0.7%的牛血清白蛋白和0.05?0.3%的疊氮化鈉防腐劑的0.05 ?0.2M Tris-HCl 緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測降鈣素原的試劑盒，其特征在于，所述抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒懸浮于稀釋液配制成0.5?2 μ g/mL的磁微粒溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測降鈣素原的試劑盒，其特征在于，所述異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶解在稀釋液中配制成0.25?0.5 μ g/mL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測降鈣素原的試劑盒，其特征在于，所述堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶解在稀釋液中配制成0.25?0.5 μ g/mL堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測降鈣素原的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物液是0.1?0.3M，pH值為8?10的Tris-HCl緩沖液，并含有0.2?0.4mg/mL的二氧雜環(huán)乙燒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測降鈣素原的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物液是0.2M，pH值為9.3的Tris-HCl緩沖液，并含有0.3mg/mL的二氧雜環(huán)乙烷。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測降鈣素原的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括清洗液，所述清洗液為0.1?0.2M, pH值為8?9的Tris-HCl緩沖液中加入質(zhì)量百分比為0.01?0.04%的吐溫20和15?20%的氯化鈉。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測降鈣素原的試劑盒，其特征在于，所述清洗液為0.ΙΜ,ρΗ值為8的Tris-HCl緩沖液中加入質(zhì)量百分比為0.02%的吐溫20和15%的氯化鈉。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測降鈣素原的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括降鈣素原系列校準(zhǔn)品，所述校準(zhǔn)品濃度范圍為O?50ng/mL。
【文檔編號】G01N33/74GK103592445SQ201310484699
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:北京利德曼生化股份有限公司