專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種三維轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體外模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種三維轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體外模型的構(gòu)建方法，屬于組織體外模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)的單層平面培養(yǎng)技術(shù)在癌癥體外細(xì)胞模型建立、癌細(xì)胞生物學(xué)行為分析中一直發(fā)揮著主導(dǎo)作用，但受細(xì)胞培養(yǎng)方法本身及癌細(xì)胞數(shù)次傳代的限制，細(xì)胞的形態(tài)、極性、基因表達(dá)乃至功能狀態(tài)與體內(nèi)癌細(xì)胞的實(shí)際病理生理狀況相距甚遠(yuǎn)，由此產(chǎn)生的兩維體外癌細(xì)胞模型在疾病分子病理機(jī)制的探討中受到越來(lái)越多的挑戰(zhàn)。近些年，體外三維培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)展及癌細(xì)胞生物學(xué)特性的深入研究，使得模擬體內(nèi)組織細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境具有明顯優(yōu)勢(shì)的立體培養(yǎng)，在癌細(xì)胞生物學(xué)特性解析、藥物療效的評(píng)估中受到普遍的關(guān)注。單層平面培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞由于受重力作用而自然沉降在支架材料上，使細(xì)胞貼壁而無(wú)極性，細(xì)胞的形態(tài)由球形轉(zhuǎn)為扁平狀，由此影響細(xì)胞的分泌功能及部分關(guān)鍵基因的異常表達(dá)，且單層平板培養(yǎng)無(wú)法反映細(xì)胞與細(xì)胞之間，細(xì)胞與基質(zhì)微環(huán)境之間等多維的相互作用，從而缺少有利的實(shí)驗(yàn)證據(jù)對(duì)細(xì)胞間粘附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行體外模擬研究，單層平板培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特征與體內(nèi)細(xì)胞真實(shí)的生理病理狀況也相去甚遠(yuǎn)。三維立體培養(yǎng)技術(shù)克服了上述單層平板培養(yǎng)的不足，較好地模擬再現(xiàn)細(xì)胞在組織體內(nèi)接近真實(shí)的生存狀況，對(duì)體外細(xì)胞生物學(xué)功能的深入解析產(chǎn)生有力的推動(dòng)，在細(xì)胞功能研究上，體外三維立體培養(yǎng)技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，主要包括(1)簡(jiǎn)化宿主體內(nèi)復(fù)雜生長(zhǎng)環(huán)境，提供易于重復(fù)研究的特定體外模擬培養(yǎng)環(huán)境，有利于三維狀態(tài)下細(xì)胞的分化，生長(zhǎng)等生理病理特征解析。(2)在特定培養(yǎng)體系中，提高了同種細(xì)胞、異種細(xì)胞間的相互作用，結(jié)構(gòu)上易于建立起緊密的縫隙連接，橋粒連接。(3)增強(qiáng)胞外基質(zhì)的產(chǎn)量，易于觀察胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移等細(xì)胞生物特征的影響。(4)體現(xiàn)出分化細(xì)胞的基因表達(dá)狀況和相關(guān)功能特征。RWV生物反應(yīng)器的出現(xiàn)在三維培養(yǎng)的方法學(xué)進(jìn)展上具有突破性的意義，該裝置是美國(guó)國(guó)家航空航天局科學(xué)家為評(píng)價(jià)微重力與液體低流速對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的潛在影響而發(fā)展起來(lái)的，它由一水平旋轉(zhuǎn)并能通過(guò)底部硅樹(shù)脂膜進(jìn)行氣體交換的壁式組織培養(yǎng)器皿和旋轉(zhuǎn)控制器組成，通過(guò)對(duì)旋轉(zhuǎn)速度的調(diào)節(jié)形成低剪切、微重力體外環(huán)境，增強(qiáng)培養(yǎng)細(xì)胞的組織樣黏附與聚集，并對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，分化，細(xì)胞因子分泌及細(xì)胞間的相互作用產(chǎn)生影響。低剪切、微重力的體外培養(yǎng)環(huán)境使其明顯優(yōu)于靜止及其它高剪切的旋轉(zhuǎn)三維培養(yǎng)技術(shù)，成為目前細(xì)胞三維培養(yǎng)最常用的技術(shù)之一，另外在多種細(xì)胞間的混合培養(yǎng)方面，該體系也具有明顯優(yōu)勢(shì)。材料科學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展為三維細(xì)胞培養(yǎng)方法的提高與改進(jìn)也提供了更多選擇，微載體珠，可降解生物支架是當(dāng)前三維立體培養(yǎng)中應(yīng)用較廣的兩種起機(jī)械支撐材料，前者的優(yōu)勢(shì)在于能較大面積地促進(jìn)細(xì)胞間的粘附聚集，尤其在不易發(fā)生自發(fā)聚集的細(xì)胞系，常規(guī)條件下難培養(yǎng)的細(xì)胞及敏感性高的細(xì)胞生物學(xué)功能的研究上有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但微載體珠應(yīng)用需聯(lián)合旋轉(zhuǎn)瓶或旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)而帶來(lái)的整合優(yōu)化問(wèn)題，以及形成假球形體中含有大的微載體珠是該法期待解決的難題?？山到馍镏Ъ芤肴S培養(yǎng)主要利用其模擬胞外基質(zhì)成分的性質(zhì)和提供細(xì)胞培養(yǎng)中三維機(jī)械結(jié)構(gòu)的支撐，常用生物材料包括膠原組分和合成聚合物(聚羥基乙酸或聚乙醇酸PGA，聚乙醇酸-乳酸共聚物PLGA)，這類(lèi)生物材料應(yīng)用于三維培養(yǎng)中可有效地提高體外細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)、分化，而且其基質(zhì)成分的性質(zhì)也參與增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程而對(duì)關(guān)鍵細(xì)胞功能遷移、增殖、分化等產(chǎn)生影響，生物支架材料在三維培養(yǎng)中的應(yīng)用是目前體外再生活組織天然結(jié)構(gòu)和功能形成最理想的一種方法。理想的體外腫瘤模型既能較好地模擬體內(nèi)腫瘤的生存環(huán)境，也應(yīng)有助于腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)解析。在肝癌體外轉(zhuǎn)移模型建立方面，復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所進(jìn)行了大量創(chuàng)造性的工作，先后建立了人肝癌裸小鼠移植模型(LT麗,一LT醒4)、人肝癌裸大鼠移植模型(LTNR、LTNR2)，高轉(zhuǎn)移人肝癌裸小鼠模型(LCI一D20)、轉(zhuǎn)移潛能不同人肝癌細(xì)胞系(MHCC97L,MHCC97H，LM3,LM6)，上述轉(zhuǎn)移模型被國(guó)內(nèi)外學(xué)者大量研究應(yīng)用，對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)分子機(jī)制的闡明起到積極的推動(dòng)。但受技術(shù)和方法的限制，在體外肝癌腫瘤組織模型建立方面依然空白，而且從腫瘤細(xì)胞生物特性來(lái)看，體外多次傳代的二維貼壁培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞易改變或丟失腫瘤細(xì)胞的某些表型特征、生物特性，且常出現(xiàn)基因水平表達(dá)模式、藥物篩査情況與臨床標(biāo)本不一致的情況。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是構(gòu)建既能較好地模擬體內(nèi)腫瘤的生存環(huán)境，也有助于腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為實(shí)驗(yàn)解析的理想體外轉(zhuǎn)移性肝癌組織模型，解決體外研究肝癌組織細(xì)胞病理特征缺少理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛦?wèn)題及肝癌臨床藥物治療缺少a想體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估體系問(wèn)題，提供易于重復(fù)研究又相對(duì)簡(jiǎn)化的肝癌生長(zhǎng)的特定體外模擬培養(yǎng)環(huán)境。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種三維轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體外模型的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟為第一步將DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清和青鏈霉素溶液以體積比為100:10:1的比例混合得到混合培養(yǎng)液；第二步將lxl(T高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞MHCC97H混懸在10ml第一步獲得的混合培養(yǎng)液中，隨后置入10ml的RWV生物反應(yīng)器中，并置入生物可降解支架聚乙醇酸-乳酸共聚物，先靜止10min再以速度7rpm/min8rpm/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)1015min，重復(fù)三次，然后靜止30分鐘，后以速度7rpm/min8rpm/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)夜，次日根據(jù)細(xì)胞團(tuán)塊的大小調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)速度，以懸浮在一個(gè)水平位置且不觸及RWV反應(yīng)器壁為宜，每36小時(shí)更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)15天，得到類(lèi)組織體。所述的青鏈霉素溶液是將青霉素和鏈霉素溶于0.85g/100ml氯化鈉溶液中得到，所述的青霉素的濃度是10000單位/ml，所述的鏈霉素的濃度是10000單位/ml。所述生物可降解支架聚乙醇酸-乳酸共聚物的長(zhǎng)、寬和高分別為34mm、34mrn和0.81.2mm。本發(fā)明技術(shù)方案中轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體形成時(shí)間周期為15天，該時(shí)間點(diǎn)的界定主要來(lái)自組織病理、電鏡形態(tài)學(xué)觀察，糖代謝特征，肝癌及肝臟特異基因表達(dá)，細(xì)胞周期特征、凋亡及DNA異倍體分析，以及裸鼠成瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。肝癌類(lèi)組織體形成中葡萄糖消耗及特征酶學(xué)指標(biāo)變化，與肝癌實(shí)體瘤組織改變十分相似。三維肝癌類(lèi)組織結(jié)構(gòu)形成后，MHCC97H細(xì)胞增殖減慢且球狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部的細(xì)胞獲取氧份、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較弱，對(duì)葡萄糖消耗量也下降，而乳酸脫氫酶活性明顯升高，提示該類(lèi)組織體具有體內(nèi)肝癌糖代謝特征(糖有氧氧化減弱，糖酵解增加)。白蛋白含量逐漸增加提示類(lèi)組織體具有了部分肝臟組織的特征。A谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶含量的逐漸升高及甲胎蛋白含量微量升高提示類(lèi)組織體部分再現(xiàn)肝癌組織的特征。肝癌及其轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)或肝臟特異基因的表達(dá)模式是評(píng)價(jià)類(lèi)組織體能否成為體外腫瘤模型的關(guān)鍵，對(duì)肝癌或肝臟特征基因CD54(細(xì)胞間粘附分子l)，CD44，CD29(整合素PI),E-cadherin(轉(zhuǎn)粘蛋白E)，AFP(甲胎蛋白)，Albumin(白蛋白)，畫(huà)P9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)，MMP2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)等表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間粘附分子1，CD44，整合素ei，鈣粘蛋白E，甲胎蛋白，基質(zhì)金屬蛋白酶9，基質(zhì)金屬蛋白酶2基因在三維培養(yǎng)條件下類(lèi)組織體中的表達(dá)明顯不同于兩維培養(yǎng)條件下的MHCC97H，其中細(xì)胞間粘附分子1,CD44,整合素ei，甲胎蛋白，基質(zhì)金屬蛋白酶9，白蛋白在腫瘤類(lèi)組織體中均顯示出上調(diào)表達(dá)，鈣粘蛋白E，基質(zhì)金屬蛋白酶2在腫瘤類(lèi)組織體明顯下調(diào)表達(dá)。上述基因的表達(dá)模式與發(fā)生轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)的惡性肝癌組織中的表達(dá)模式基本一致，提示三維培養(yǎng)體外形成的肝癌腫瘤類(lèi)組織體可以作為一種新型腫瘤體外組織模型用于肝癌實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究。三維培養(yǎng)形成的類(lèi)組織體的腫瘤細(xì)胞處于DNA合成期和有絲分裂期的細(xì)胞比例降低，細(xì)胞凋亡比例升高，提示肝癌類(lèi)組織體細(xì)胞增殖較平板培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞明顯不活躍，與其周邊細(xì)胞增殖活躍而球狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)影響而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加有關(guān)，與臨床腫瘤組織標(biāo)本的情況基本一致。而DNA倍體(非二倍體，包括近二倍體，四倍體，多倍體，非整倍體)在兩維與三維培養(yǎng)下的改變不明顯。類(lèi)組織體裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)將旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)15天形成的肝癌類(lèi)組織體切成lmm3的組織塊原位種植于五周齡雄性裸鼠肝臟，35天后査體摸到實(shí)體腫瘤，49天取出，裸鼠肝臟發(fā)現(xiàn)腫瘤組織并經(jīng)病理學(xué)分析證實(shí)。本發(fā)明的原理如下單層平面培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞受重力作用而自然沉降在支架材料上，使細(xì)胞貼壁而無(wú)極性，細(xì)胞的形態(tài)由球形轉(zhuǎn)為扁平狀，由此影響細(xì)胞的分泌功能及部分關(guān)鍵基因的異常表達(dá)，且兩維平板培養(yǎng)無(wú)法反映細(xì)胞與細(xì)胞之間，細(xì)胞與基質(zhì)微環(huán)境之間等多維的相互作用，從而缺少有利的實(shí)驗(yàn)證據(jù)對(duì)細(xì)胞間粘附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行體外模擬研究，單層平板培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特征與體內(nèi)細(xì)胞真實(shí)的生理病理狀況相去甚遠(yuǎn)。受技術(shù)和方法的限制，在體外肝癌腫瘤組織模型建立方面依然空白，且從腫瘤細(xì)胞生物特性來(lái)看，體外多次傳代的二維貼壁培養(yǎng)易改變或丟失腫瘤細(xì)胞的某些表型特征、生物特性，也經(jīng)常出現(xiàn)基因水平表達(dá)模式、藥物篩查情況與臨床標(biāo)本不一致的情況，采用三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)與實(shí)體瘤生長(zhǎng)特性更為接近，更容易模擬出腫瘤細(xì)胞的自然狀態(tài)和生存環(huán)境。本發(fā)明創(chuàng)造性地應(yīng)用RWV生物反應(yīng)器與生物支架PLGA相結(jié)合的三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)體系，將高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系MHCC97H在此培養(yǎng)體系中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)15天形成轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體外模型，通過(guò)與兩維平板培養(yǎng)的高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系MHCC97H生物學(xué)特征比較，發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)條件下形成的肝癌類(lèi)組織體在組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、特異基因表達(dá)、蛋白分泌情況等方面具有更接近體內(nèi)轉(zhuǎn)移性肝癌組織的特征，較好地模擬和再現(xiàn)了體內(nèi)轉(zhuǎn)移性肝癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng)特征及病理改變，顯示出優(yōu)于兩維平板培養(yǎng)的高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞模型，可成為肝癌研究較理想的一種新型體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下該新型肝癌類(lèi)組織體模型在模擬體內(nèi)轉(zhuǎn)移性肝癌生物學(xué)特征方面明顯優(yōu)于兩維平板培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，提供易于重復(fù)研究又相對(duì)簡(jiǎn)化的肝癌生長(zhǎng)的特定體外模擬培養(yǎng)環(huán)境，有助于肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)解析，可解決體外研究肝癌組織細(xì)胞病理特征缺少理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛦?wèn)題及肝癌臨床藥物治療缺少理想體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估體系問(wèn)題，同時(shí)該發(fā)明應(yīng)用也相對(duì)簡(jiǎn)單易行。本發(fā)明主要用于評(píng)估三維生長(zhǎng)狀態(tài)下肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為改變包括生長(zhǎng)、增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲、凋亡、DNA異倍體、特征或特異基因表達(dá)、分泌等，以及肝癌組織的體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究包括病理分析、特征基因表達(dá)、分泌情況等；可進(jìn)行肝癌放療、化療等治療效果的體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，提供接近體內(nèi)真實(shí)生理病理狀況的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，指導(dǎo)臨床肝癌的治療；作為一種新瘤源，用于轉(zhuǎn)移性肝癌裸鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建及相關(guān)研究。圖1為MHCC97H在RWV三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)中不同天數(shù)培養(yǎng)形成的細(xì)胞聚集體和類(lèi)組織體圖2為MHCC97H在RWV三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)15天形成的肝癌類(lèi)組織體組織化學(xué)結(jié)果圖3為三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)形成肝癌類(lèi)組織體15天透射電鏡結(jié)果圖；圖4為肝癌類(lèi)組織體形成不同時(shí)間點(diǎn)肝臟(肝癌)特征基因表達(dá)圖；圖5為MHCC97H在兩維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)15天ICAM1,AFP，CD29免疫組化結(jié)果圖；圖6為肝癌類(lèi)組織體裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1一種三維轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體外模型的構(gòu)建方法，具體步驟為第一步將DMEM/F12培養(yǎng)液1X(GIBIC0公司生產(chǎn))、FBS(胎牛血清，Biointernational公司)和青鏈霉素溶液(10000單位/ml青霉素，10000單位/ml鏈霉素溶于0.85g/100ml氯化鈉溶液，GIBICO公司生產(chǎn))以體積比為100:10:1的比例混合得到混合培養(yǎng)液；第二步將lxl()7高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞MHCC97H混懸在10ml第一步獲得的混合培養(yǎng)液中，隨后置入10ml的RWV生物反應(yīng)器(Synthecon公司，美國(guó))中，并置入生物可降解支架聚乙醇酸-乳酸共聚物(長(zhǎng)、寬和高分別為3mm、3mm和0.8mm。)，先靜止10min再以速度7rpm/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10min，重復(fù)三次，然后靜止30分鐘，后以速度7rpm/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)夜，次日根據(jù)細(xì)胞團(tuán)塊的大小調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)速度，以懸浮在一個(gè)水平位置且不觸及RWV反應(yīng)器壁為宜，每36小時(shí)更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)15天，得到類(lèi)組織體。實(shí)施例2一種三維轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體外模型的構(gòu)建方法，具體步驟為第一步將DMEM/F12培養(yǎng)液1X(GIBIC0公司生產(chǎn))、FBS(胎牛血清，Biointernational公司)和青鏈霉素溶液(10000單位/ml青霉素，10000單位/ml鏈霉素溶于0.85g/100ml7氯化鈉溶液，GIBICO公司生產(chǎn))以體積比為100:10:1的比例混合得到混合培養(yǎng)液；第二步將lxl(T高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞MHCC97H混懸在10ml第一步獲得的混合培養(yǎng)液中，隨后置入10ml的RWV生物反應(yīng)器(Synthecon公司，美國(guó))中，并置入生物可降解支架聚乙醇酸-乳酸共聚物(長(zhǎng)、寬和高分別為4mm、4mm和1.2mm。)，先靜止10min再以速度8rpm/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)15min，重復(fù)三次，然后靜止30分鐘，后以速度8rpm/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)夜，次日根據(jù)細(xì)胞團(tuán)塊的大小調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)速度，以懸浮在一個(gè)水平位置且不觸及RWV反應(yīng)器壁為宜，每36小時(shí)更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)15天，得到類(lèi)組織體。實(shí)施例3一種三維轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體外模型的構(gòu)建方法，具體步驟為第一步將DMEM/F12培養(yǎng)液lX(GIBICO公司生產(chǎn))、FBS(胎牛血清，Biointernational公司)和青鏈霉素溶液(10000單位/ml青霉素，10000單位/ml鏈霉素溶于0.85g/100ml氯化鈉溶液，GIBIC0公司生產(chǎn))以體積比為100:10:1的比例混合得到混合培養(yǎng)液；第二步將lxl(T高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞MHCC97H混懸在10ml第一步獲得的混合培養(yǎng)液中，隨后置入10ml的RWV生物反應(yīng)器(Synthecon公司，美國(guó))中，并置入生物可降解支架聚乙醇酸-乳酸共聚物(長(zhǎng)、寬和高分別為4mm、4mm和lmm。)，先靜止10min再以速度7.6rpm/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10min，重復(fù)三次，然后靜止30分鐘，后以速度7.6rpm/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)夜，次日根據(jù)細(xì)胞團(tuán)塊的大小調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)速度，以懸浮在一個(gè)水平位置且不觸及RWV反應(yīng)器壁為宜，每36小時(shí)更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)15天，到15天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，旋轉(zhuǎn)速度一般達(dá)到18rpm/min，得到直徑為0.7cm_l.0cm的類(lèi)組織體。其中，由于細(xì)胞三維培養(yǎng)的周期一般較長(zhǎng)15天到30天，且形成的球形類(lèi)組織體結(jié)構(gòu)使得內(nèi)部細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，選擇與基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)液成分接近且營(yíng)養(yǎng)條件優(yōu)于其的DMEM/F12培養(yǎng)液IX(GIBIC0公司生產(chǎn))，對(duì)MHCC97H細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)有利于培養(yǎng)周期的延長(zhǎng)。定期及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液是球形類(lèi)組織體形成及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，平均培養(yǎng)36小時(shí)更換新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)液可獲得較理想的培養(yǎng)結(jié)果。最大限度地形成體積較大的類(lèi)組織體有利于下游基因、蛋白表達(dá)的體外分析及動(dòng)物移植等方面的研究。在10mlRWV生物反應(yīng)器體系中，置入lxl()7腫瘤細(xì)胞(MHCC97H)培養(yǎng)15天可形成直徑約0.7cm-1.0cm左右大小的類(lèi)組織樣球形體有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。加入生物可降解支架，有助于貼壁細(xì)胞粘附生長(zhǎng)，從而為腫瘤細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)提供了附著空間和機(jī)械支持，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞類(lèi)組織體的形成。本發(fā)明方法形成的肝癌類(lèi)組織體組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)、特異基因表達(dá)、蛋白分泌情況等，有更接近體內(nèi)實(shí)體肝癌組織特征，可成為肝癌研究較理想體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?1)三維培養(yǎng)體系腫瘤類(lèi)組織體形成的時(shí)間周期界定1X10'高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97H在置入PLGA支架的生物反應(yīng)器中連續(xù)培養(yǎng)15天，其間分別收集旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)不同天數(shù)新鮮換液24小時(shí)的培養(yǎng)上清(day5，day10，dayl5)和三個(gè)時(shí)段所形成的球形細(xì)胞聚集體或類(lèi)組織體，-8(TC保存待檢。如圖1所示，為MHCC97H在RWV三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)中不同天數(shù)培養(yǎng)形成的細(xì)胞聚集體和類(lèi)組織體圖。對(duì)培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶、葡萄糖、甲胎蛋白、白蛋白、A谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶五項(xiàng)指標(biāo)含量分別進(jìn)行檢測(cè)，培養(yǎng)上清中葡萄糖及細(xì)胞分泌的乳酸脫氫酶、入谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，白蛋白含量與兩維培養(yǎng)條件下上清中含量比較均發(fā)生了明顯的變化，尤其在三維培養(yǎng)第15天時(shí)，上述各指標(biāo)與兩維平板培養(yǎng)及三維培養(yǎng)第5天、第10天時(shí)的含量比較改變尤為明顯，而甲胎蛋白含量?jī)H在第15天時(shí)檢測(cè)出現(xiàn)微量表達(dá)。另外，15天時(shí)類(lèi)組織體中細(xì)胞間粘附分子l、CD44,整合素ei，鈣粘蛋白E，甲胎蛋白，白蛋白等基因的表達(dá)與兩維培養(yǎng)時(shí)的表達(dá)相比，也發(fā)生明顯的改變。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)第15天，如圖2所示，MHCC97H在RWV三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)15天形成的肝癌類(lèi)組織體組織化學(xué)結(jié)果圖(采用HE染色，放大倍數(shù)分別是50x，100x，200x，400x)，類(lèi)組織體鏡下形態(tài)學(xué)大體顯示類(lèi)似于肝癌腫瘤組織部分組織學(xué)特征，從外層增殖相對(duì)活躍腫瘤細(xì)胞到團(tuán)塊中央呈靜息或壞死的腫瘤細(xì)胞分層排列，排列于周邊的腫瘤細(xì)胞或粘附于PLGA支架，或緊密排列，染色較深，呈數(shù)十層。如圖3所示，為三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)形成肝癌類(lèi)組織體15天透射電鏡結(jié)果圖，其中，A為細(xì)胞微絨毛，B為橋粒，C為線粒體，D為細(xì)胞間基質(zhì)，E為PLGA支架，F(xiàn)為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，G為胞核，電鏡分析顯示細(xì)胞呈多邊形，胞間有間隙，其間微絨毛多，且有基質(zhì)生成，細(xì)胞外層線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，相鄰細(xì)胞的胞膜局部突起密切接觸，形成橋粒與緊密連接。綜上所述，界定15天作為肝癌細(xì)胞三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)形成腫瘤類(lèi)組織體的時(shí)間點(diǎn)。(2)細(xì)胞培養(yǎng)上清葡萄糖消耗及特征酶學(xué)指標(biāo)變化分別對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)段培養(yǎng)上清中LDH(乳酸脫氫酶)、葡萄糖、AFP(甲胎蛋白)、白蛋白、A-GT(A-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)含量進(jìn)行檢測(cè)(結(jié)果如表1所示)，三維培養(yǎng)條件下24h培養(yǎng)上清葡萄糖含量高于平板培養(yǎng)條件下培養(yǎng)上清含量，提示三維結(jié)構(gòu)形成前，MHCC97H細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量相對(duì)較多，與平板培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞增殖相對(duì)活躍有關(guān)，三維類(lèi)組織結(jié)構(gòu)形成后，MHCC97H細(xì)胞增殖減慢且球狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部細(xì)胞獲取氧份，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較弱，對(duì)葡萄糖消耗量也下降，而乳酸脫氫酶活性明顯升高，提示三維類(lèi)組織體具有體內(nèi)肝癌糖代謝特征(糖有氧氧化減弱，糖酵解增加)，白蛋白含量逐漸增加提示第15天的類(lèi)組織體具有了部分肝臟組織的特征，入谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶含量的逐漸升高及甲胎蛋白含量微量升高提示第15天的類(lèi)組織體部分再現(xiàn)肝癌組織的特征。泰l:2雨上I麵,麗腸，百短，r翻,甲磨至玩平<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(3)肝癌或肝臟特異基因表達(dá)情況分析肝癌及其轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)或肝臟特異基因的表達(dá)模式是評(píng)價(jià)類(lèi)組織體能否成為體外肝癌模型的關(guān)鍵，也是肝癌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)優(yōu)于兩維培養(yǎng)的證據(jù)之一。我們對(duì)細(xì)胞間粘附分子l(ICAM)，CD44，整合素ei(CD29)，鈣粘蛋白E(E-Cadherin),甲胎蛋白(AFP),白蛋白(ALB)，基質(zhì)金屬蛋白酶9(畫(huà)P9),基質(zhì)金屬蛋白酶2(麗P2)基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，如圖4所示，為肝癌類(lèi)組織體形成不同時(shí)間點(diǎn)肝臟(肝癌)特征基因表達(dá)圖，其中，M為平板培養(yǎng)，D5為三維培養(yǎng)5天，D10為三維培養(yǎng)10天，D15為三維培養(yǎng)15天，從圖中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間粘附分子1，CD44，整合素ei，鈣粘蛋白E，甲胎蛋白，基質(zhì)金屬蛋白酶9，基質(zhì)金屬蛋白酶2在三維培養(yǎng)條件下類(lèi)組織體中的表達(dá)明顯不同于兩維培養(yǎng)條件下的MHCC97H，其中細(xì)胞間粘附分子1，CD44，整合素01，甲胎蛋白，基質(zhì)金屬蛋白酶9在肝癌類(lèi)組織體中均顯示出上調(diào)表達(dá)，鈣粘蛋白E、基質(zhì)金屬蛋白酶2在肝癌類(lèi)組織體明顯下調(diào)表達(dá)。如圖5所示，MHCC97H在兩維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)15天ICAM1,AFP,CD29免疫組化結(jié)果圖，細(xì)胞間粘附分子1，甲胎蛋白，整合素P1在腫瘤類(lèi)組織體中發(fā)生上調(diào)表達(dá)，與基因水平表達(dá)一致，也與培養(yǎng)上清中甲胎蛋白分泌情況基本一致。上述基因的表達(dá)模式與發(fā)生轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)的臨床惡性肝癌組織中的表達(dá)模式基本一致，提示三維培養(yǎng)體外形成的肝癌類(lèi)組織體可以作為腫瘤體外研究的模型，也優(yōu)于兩維平板培養(yǎng)的MHCC97H。(4)細(xì)胞周期特征、凋亡及DNA異倍體分析與兩維培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞相比，三維培養(yǎng)15天形成的肝癌類(lèi)組織體腫瘤細(xì)胞處于DNA合成期和有絲分裂期的細(xì)胞比例降低，細(xì)胞凋亡比例升高，提示腫瘤類(lèi)組織體細(xì)胞增殖較平板培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞明顯不活躍，這與其周邊細(xì)胞增殖活躍而球狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)影響而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加有關(guān)，與臨床腫瘤組織標(biāo)本的病理情況基本一致。而DNA倍體(非二倍體，包括近二倍體，四倍體，多倍體，非整倍體)在兩維與三維培養(yǎng)下的改變不明顯。平板培養(yǎng)類(lèi)組織體G0-G1期63.04%73.46%G2-M期11.77%5.4%S期25.18%21.14%凋亡指數(shù)0.769.06本發(fā)明方法形成的肝癌類(lèi)組織體進(jìn)行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)如下將三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)15天形成的肝癌類(lèi)組織體切成lmm3的組織塊原位種植于裸鼠肝臟，35天查體可摸到實(shí)體腫瘤，49天取出大體觀察成瘤并經(jīng)病理證實(shí)為肝腫瘤組織，如圖6所示，為肝癌類(lèi)組織體裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，大體觀與組織病理分析，提示肝癌類(lèi)組織塊可作為一種新瘤源用于動(dòng)物模型的構(gòu)建。改變了傳統(tǒng)肝癌裸鼠模型由皮下成瘤然后轉(zhuǎn)種肝臟的建立模式。本發(fā)明的使用方法如下1、該發(fā)明的應(yīng)用簡(jiǎn)單易行，肝癌類(lèi)組織體形成后，將待評(píng)價(jià)的藥物依據(jù)不同劑量直接溶入或加入組織培養(yǎng)液中混勻，通過(guò)對(duì)不同時(shí)程類(lèi)組織體生長(zhǎng)及病理特征評(píng)估變化來(lái)對(duì)藥物的療效進(jìn)行體外組織水平實(shí)驗(yàn)評(píng)估。2、在對(duì)放療效果的評(píng)估上，該發(fā)明的應(yīng)用也同樣簡(jiǎn)單易行，可直接對(duì)RWV生物反應(yīng)器進(jìn)行照射，通過(guò)對(duì)不同時(shí)程類(lèi)組織體生長(zhǎng)及病理特征評(píng)估變化調(diào)整射線劑量、照射時(shí)間、照射周期等進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估。3、在RWV生物反應(yīng)器中形成肝癌類(lèi)組織體后，將其原位種植到六周齡的雄性裸鼠肝臟中，六周后觀察成瘤及肺轉(zhuǎn)移情況，成為一種新瘤源，用于肝癌轉(zhuǎn)移裸鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建及相關(guān)研究。4、作為一種新三維組織模型，用于三維生長(zhǎng)狀態(tài)下肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為解析，以及肝癌組織的體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。1權(quán)利要求1、一種三維轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體外模型的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟為第一步將DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清和青鏈霉素溶液以體積比為100∶10∶1的比例混合得到混合培養(yǎng)液；第二步將1x107高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞MHCC97H混懸在10ml第一步獲得的混合培養(yǎng)液中，隨后置入10ml的RWV生物反應(yīng)器中，并置入生物可降解支架聚乙醇酸-乳酸共聚物，先靜止10min再以速度7rpm/min～8rpm/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10～15min，重復(fù)三次，然后靜止30分鐘，后以速度7rpm/min～8rpm/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)夜，次日根據(jù)細(xì)胞團(tuán)塊的大小調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)速度，以懸浮在一個(gè)水平位置且不觸及RWV反應(yīng)器壁為宜，每36小時(shí)更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)15天，得到類(lèi)組織體。2、如權(quán)利要求1所述的一種三維轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體外模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的青鏈霉素溶液是將青霉素和鏈霉素溶于0.85g/100ml氯化鈉溶液中得到，所述的青霉素的濃度是10000單位/ml，所述的鏈霉素的濃度是10000單位/ml。3、如權(quán)利要求1所述的一種三維轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體外模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述生物可降解支架聚乙醇酸-乳酸共聚物的長(zhǎng)、寬和高分別為34mm、34mm和0.81.2mm。全文摘要本發(fā)明提供了一種三維轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體外模型的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟為將高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系MHCC97H在RWV生物反應(yīng)器與生物支架PLGA(聚乙醇酸-乳酸共聚物)結(jié)合的三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)體系中連續(xù)培養(yǎng)15天形成轉(zhuǎn)移性肝癌類(lèi)組織體模型，其在組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、特異基因表達(dá)、蛋白分泌情況等方面具有更接近體內(nèi)轉(zhuǎn)移性肝癌組織的特征，較好地模擬和再現(xiàn)體內(nèi)轉(zhuǎn)移性肝癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng)特征及病理改變，顯示出優(yōu)于平板培養(yǎng)的高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系模型。文檔編號(hào)C12N5/08GK101508973SQ200910048099公開(kāi)日2009年8月19日申請(qǐng)日期2009年3月24日優(yōu)先權(quán)日2009年3月24日發(fā)明者劉銀坤,唐建華,崔杰峰,康曉楠,徐長(zhǎng)德,坤郭,陳榮新申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院