專利名稱：一種快速免標(biāo)記檢測硫離子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硫離子的檢測方法，特別涉及一種快速免標(biāo)記檢測硫離子的方法。
背景技術(shù)：
地下水(特別是溫泉水)及生活污水，通常含有硫化物，如硫磺泉等。當(dāng)大量生活污水排入水系或下水道，由于含硫有機(jī)物受微生物作用而分解出硫化物，所釋出的硫化氫是造成管道維修工人喪命的主要禍魁。某些工業(yè)廢水如石油煉制、人造纖維、印刷、制革、造氣、選礦和造紙等廢水中，亦可發(fā)現(xiàn)含硫化物。水中的硫化物容易逸散于空氣中，產(chǎn)生臭味，且毒性很大。它可與人體細(xì)胞色素、 氧化酶以及該類物質(zhì)中的二硫鍵作用，影響細(xì)胞氧化過程，造成細(xì)胞組織缺氧，危及人的生命。水中硫化氫可消耗水中的氧氣，并致水生生物死亡。硫化氫除自身能腐蝕金屬外，還可以被污水中的微生物氧化成硫酸，進(jìn)而腐蝕下水道等。因此，硫化物是水體污染的一項(xiàng)重要指標(biāo)。國標(biāo)規(guī)定硫化物濃度低于I mg/L。水中存在的硫化物，包括溶解性的H2S、HS' S2_，存在于懸浮物中的可溶性硫化物、 酸可溶性金屬硫化物，以及未電離的有機(jī)，無機(jī)類硫化物。當(dāng)用絮凝和沉淀法把懸浮固體除去之后，剩余的為溶解的硫化物。通常所測定的水中硫化物系指溶解的H2S和S2^以及酸溶性金屬硫化物。對(duì)硫化物的檢測能加強(qiáng)環(huán)境污染防治工作，及時(shí)排查陰離子污染物及環(huán)境隱患， 解決危害群眾健康和生態(tài)環(huán)境的突出問題，對(duì)環(huán)境和社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展做出貢獻(xiàn)；有利于督促企業(yè)做好職業(yè)健康監(jiān)護(hù)工作、開展日常檢測評(píng)價(jià)工作、規(guī)范職業(yè)病危害告知制度等方面開展職業(yè)病防治的監(jiān)督管理工作，對(duì)勞動(dòng)者接觸危害因素造成的職業(yè)病損害做到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)和早處理，切實(shí)防止群體性職業(yè)病危害事件的發(fā)生；將有利于國家對(duì)食品、化妝品及高危行業(yè)等企業(yè)實(shí)施更為科學(xué)和有效的監(jiān)管，對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量和擴(kuò)大產(chǎn)品出口范圍、 對(duì)企業(yè)和社會(huì)健康發(fā)展都具有重要的意義。硫化物的檢測方法有較多報(bào)道，屬于儀器檢測方法的，有離子色譜法、間接原子吸收分光光度法、庫侖滴定法、離子選擇電極法、極譜法、電流滴定法、電位滴定法、冷原子熒光法、離子交換高壓液相色譜法、陽極溶出伏安法、流動(dòng)注射法等。近年來，原子光譜與ICP 技術(shù)的聯(lián)用，提高了檢測的靈敏度，拓寬了檢測的線性范圍，而ICP-MS使檢測更加靈敏，數(shù)據(jù)分析更加方便。但是，此類儀器較為昂貴，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中的推廣應(yīng)用因此受到限制。 除光譜法外，以亞甲藍(lán)小分子為代表的化學(xué)傳感方法也有一定的發(fā)展，但尚有靈敏度低的不足之處，檢測的可靠性和準(zhǔn)確性也不足。分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，為利用生物大分子 (蛋白質(zhì)、DNA等)的特異性檢測各種靶物質(zhì)提供了有利條件。最近，四川大學(xué)的XiaoDan等利用S2_與Pb0/Si02納米顆粒的特異性作用，設(shè)計(jì)了一種新型生物傳感方法，通過檢測S2_與 Pb0/Si02高親和性的相互作用后產(chǎn)生的熒光變化實(shí)現(xiàn)對(duì)S2_的特異性檢測。該方法具有較高的特異性，可排除實(shí)際樣品體系中大多數(shù)離子的干擾，檢測限可以達(dá)到1.38X10_7 mol/L。但Pb0/Si02納米顆粒合成復(fù)雜耗時(shí)，檢測成本仍然較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡便可行的硫離子濃度檢測方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
一種快速免標(biāo)記檢測硫離子的方法，包括如下步驟
1)將隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈DNA序列溶解，得到DNA溶液；
2)在DNA溶液中加入還原劑，混合均勻，之后加入二價(jià)銅離子，混勻；
3)避光還原反應(yīng)得到含有銅納米顆粒的隨機(jī)DNA雙鏈，該DNA雙鏈為檢測用DNA鏈；
4)將標(biāo)準(zhǔn)濃度的硫離子溶液與檢測用DNA鏈混合，避光反應(yīng)，測量檢測用DNA鏈的熒光值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；
5)將待測樣本液與檢測用DNA鏈混合，避光反應(yīng)，檢測其熒光值，計(jì)算得到硫離子濃度。優(yōu)選的，還原劑是維生素C或其鹽中的至少一種。優(yōu)選的，隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈DNA序列的長度不小于10 bp。優(yōu)選的，隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈DNA序列的長度為15 35 bp。優(yōu)選的，二價(jià)銅離子源自硫酸銅、乙酸銅和硝酸銅中的至少一種。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明的檢測原理是隨機(jī)雙鏈DNA在340 nm激發(fā)光下沒有熒光，當(dāng)加入二價(jià)銅離子和抗壞血酸鈉的時(shí)候,能夠在雙鏈DNA上形成突光銅納米顆粒,340 nm激發(fā)光下于585 nm 處會(huì)有熒光。當(dāng)再加入硫離子的時(shí)候，隨著硫離子濃度的增加，585 nm處的熒光會(huì)逐漸降低，并與硫離子的濃度呈很好的線性相關(guān)性，從而達(dá)到免標(biāo)記熒光快速檢測硫離子的目的。本發(fā)明的檢測方法，無需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，待測樣品可以是環(huán)境水樣，臨床樣本，或經(jīng)過離心，過濾等簡單處理的樣品。檢測過程操作簡單。本發(fā)明的檢測方法，特異性好，不易受其他金屬離子的影響，檢測精度高，靈敏度高，檢測限低達(dá)200 nM。


圖I是本發(fā)明檢測方法的原理圖2和3是本發(fā)明檢測方法的表征圖4是不同陰離子與含納米銅離子的隨機(jī)DNA雙鏈反應(yīng)的熒光值比較圖。
具體實(shí)施例方式一種快速免標(biāo)記檢測硫離子的方法，包括如下步驟
1)將隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈DNA序列溶解，得到DNA溶液；
2)在DNA溶液中加入還原劑，混合均勻，之后加入二價(jià)銅離子，混勻；
3)避光還原反應(yīng)10分鐘后得到含有銅納米顆粒的隨機(jī)DNA雙鏈，該DNA雙鏈為檢測用DNA鏈；
4)將標(biāo)準(zhǔn)濃度的硫離子溶液與檢測用DNA鏈混合，避光反應(yīng)，測量檢測用DNA鏈的熒光值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；
5)將待測樣本液與檢測用DNA鏈混合，避光反應(yīng)，檢測其熒光值，計(jì)算得到硫離子濃度。優(yōu)選的，還原劑是維生素C或其鹽中的至少一種。當(dāng)然，根據(jù)本說明書的教導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可以采用其他的還原劑，只要該還原劑可以將二價(jià)銅離子還原為銅原子即可。優(yōu)選的，隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈DNA序列的長度不小于10 bp,更佳的，隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈DNA序列的長度為15 35 bp。只要該段隨機(jī)序列可以容納納米銅顆粒即可。過長的DNA雙鏈合成較為困難，故其序列也不宜過長，避免增加成本。優(yōu)選的，二價(jià)銅離子源自硫酸銅、乙酸銅和硝酸銅中的至少一種。本發(fā)明的檢測原理如圖I所示。實(shí)施例I
基于隨機(jī)雙鏈DNA為模板形成的熒光銅納米顆粒用于硫離子的免標(biāo)記檢測的步驟如
下
1)用含有150mM乙酸鈉，50mM乙酸鎂的3-(N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽(MOPS)緩沖溶液(10 mM, pH=7. 5)溶解隨機(jī)互補(bǔ)的雙鏈DNA，隨機(jī)采用的DNA的序列是5’-TACTCATACGC TCATACGTTCATCACGACTACACA-3’(SEQ ID NO :1)(由生工生物工程(上海)有限公司合成)， 500 nM的兩條隨機(jī)互補(bǔ)DNA混合均勻，在90°C水浴反應(yīng)10分鐘，再緩慢降至室溫，得到500 nM隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈DNA溶液；
2)在500μ L 500 ηΜ的互補(bǔ)雙鏈DNA中加入I mM的抗壞血酸鈉，充分混勻，再加入 100 μ M的乙酸銅，充分混勻，室溫避光反應(yīng)約10分鐘，即得到基于隨機(jī)雙鏈DNA為模板形成的熒光銅納米顆粒；
3)向上一步驟制得的溶液中加入不同濃度的硫離子，室溫避光反應(yīng)5分鐘后用熒光分光光度計(jì)(Perkin-Elmer LS-55 Fluorescence Spectrometer (Perkin-Elmer, USA)) 檢測溶液的熒光強(qiáng)度，熒光檢測的激發(fā)峰是340 nm，發(fā)射峰是585 nm。其熒光檢測結(jié)果如圖2和3所示。從圖2可以看出，基于隨機(jī)雙鏈DNA為模板合成的熒光銅納米顆粒具有很好的熒光特征。其激發(fā)峰為340 nm,發(fā)射峰為585 nm。其中在585 nm處的發(fā)射峰峰值用來后續(xù)監(jiān)測加入不同濃度的硫離子后熒光強(qiáng)度變化情況。從圖3可以看出，硫離子的濃度與585 nm處的熒光強(qiáng)度響應(yīng)具有很好的相關(guān)性， 對(duì)硫離子檢測的線性范圍為20 O. 2 μ M ;該方法對(duì)硫離子的檢測限為200 ηΜ。實(shí)施例2
為了考察基于隨機(jī)雙鏈DNA為模板合成的熒光銅納米顆粒用于免標(biāo)記檢測硫離子的特異性，按如下步驟進(jìn)行了選擇性實(shí)驗(yàn)
I) 用含有150 mM乙酸鈉，50 mM乙酸鎂的3_(Ν_嗎啉)丙磺酸鈉鹽(MOPS) 緩沖溶液(10 mM, pH=7. 5)溶解隨機(jī)互補(bǔ)的雙鏈DNA，隨機(jī)采用的DNA的序列是 5’-ATGAACGTATGAGCG-3’(SEQ ID NO 2)(由生工生物工程(上海)有限公司合成)。500 ηΜ的兩條隨機(jī)互補(bǔ)DNA混合均勻，在90°C水浴反應(yīng)10分鐘，再緩慢降至室溫，得到500 ηΜ 隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈DNA溶液；2)在500μ L濃度為500 ηΜ的互補(bǔ)雙鏈DNA中加入I mM的抗壞血酸鈉，充分混勻， 再加入100 μ M的硫酸銅，充分混勻，室溫避光反應(yīng)約10分鐘，即得到基于隨機(jī)雙鏈DNA為模板形成的熒光銅納米顆粒；
3)向上一步驟所制得的溶液中加入不同的陰離子(硫離子的濃度為O. 3 μΜ； F—，Br-, Γ, IO4-, CIO:，C2H2CF, Ν03_，NO” N3, S032—，S2O82' C032—，HC03_，H2PO4' HPO42' B4O7' EDTA2—，SCN—濃度為50 μ M)，室溫避光反應(yīng)5分鐘后用熒光分光光度計(jì) (Perkin-Elmer LS-55 Fluorescence Spectrometer (Perkin-Elmer, USA))檢測溶液的突光強(qiáng)度，熒光檢測的激發(fā)峰是340 nm，發(fā)射峰是585 nm。檢測結(jié)果如圖4所示。從圖4的檢測結(jié)果可以看出，50 μΜ的Zn2+，Mg2+，Cd2+， Ni2+, Mn2+, Fe3+, Sn2+, Ca2+, Co2+, Hg2+, Ba2+對(duì)檢測沒有影響,只有當(dāng)加入硫離子后才會(huì)淬滅熒光銅納米顆粒的熒光，使熒光信號(hào)下降。這證明該方法對(duì)硫離子的熒光檢測具有很好的特異性。實(shí)施例3
為了考察基于隨機(jī)雙鏈DNA為模板合成的熒光銅納米顆粒用于實(shí)際樣品中硫離子的免標(biāo)記檢測，按如下步驟進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)
1)用含有150 mM乙酸鈉，50 mM乙酸鎂的3-(Ν-嗎啉)丙磺酸鈉鹽(MOPS) 緩沖溶液(10mM，pH=7. 5)溶解隨機(jī)互補(bǔ)的雙鏈DNA，隨機(jī)采用的DNA的序列是 5’ -AGTTGCAAGAAGATGACAGAGAAGT-3’ (SEQ ID NO 3)(由生工生物工程(上海)有限公司合成)。500 ηΜ的兩條隨機(jī)互補(bǔ)DNA混合均勻，在90°C水浴反應(yīng)10分鐘，再緩慢降至室溫， 得到500 ηΜ隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈DNA ；
2)在500μ L 500 ηΜ的互補(bǔ)雙鏈DNA中加入I mM的抗壞血酸鈉，充分混勻，再加入 100 μ M的硝酸銅，充分混勻，室溫避光反應(yīng)約10分鐘，即得到基于隨機(jī)雙鏈DNA為模板形成的熒光銅納米顆粒；
3)取3份河水樣品用O. 2 μ m的濾膜過濾后添加不同濃度的硫離子(濃度分別為0.5，5，13 PM)，將上述4份實(shí)際樣品加入到⑵中所制備的熒光銅納米顆粒溶液中，室溫避光反應(yīng)5分鐘后用突光分光光度計(jì)(Perkin-Elmer LS-55 Fluorescence Spectrometer (Perkin-Elmer, USA))檢測溶液的突光強(qiáng)度。突光檢測的激發(fā)峰是340 nm, 發(fā)射峰是585 nm。從表I的檢測結(jié)果可以看出，河水實(shí)際樣品中硫離子檢測的回收率為98. 6-114%, 說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的硫離子檢測方法能夠滿足實(shí)際樣品檢測的需要。
權(quán)利要求
1.一種快速免標(biāo)記檢測硫離子的方法，包括如下步驟1)將隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈DNA序列溶解，得到DNA溶液；2)在DNA溶液中加入還原劑，混合均勻，之后加入二價(jià)銅離子，混勻；3)避光還原反應(yīng)得到含有銅納米顆粒的隨機(jī)DNA雙鏈，該DNA雙鏈為檢測用DNA鏈；4)將標(biāo)準(zhǔn)濃度的硫離子溶液與檢測用DNA鏈混合，避光反應(yīng)，測量檢測用DNA鏈的熒光值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；5)將待測樣本液與檢測用DNA鏈混合，避光反應(yīng)，檢測其熒光值，計(jì)算得到硫離子濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速免標(biāo)記檢測硫離子的方法，其特征在于還原劑是維生素C或其鹽中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速免標(biāo)記檢測硫離子的方法，其特征在于隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈 DNA序列的長度不小于10 bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速免標(biāo)記檢測硫離子的方法，其特征在于隨機(jī)互補(bǔ)雙鏈 DNA序列的長度為15 35 bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速免標(biāo)記檢測硫離子的方法，其特征在于二價(jià)銅離子源自硫酸銅、乙酸銅和硝酸銅中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速免標(biāo)記檢測硫離子的方法。二價(jià)銅離子在有還原劑存在的情況，在隨機(jī)DNA雙鏈中形成納米銅顆粒，加入硫離子后會(huì)淬滅熒光銅納米顆粒的熒光，并且硫離子濃度與熒光強(qiáng)度具有很好的相關(guān)性，從而達(dá)到檢測硫離子的目的。該檢測方法具有很好的靈敏度，檢出限為200nM。該檢測方法具有很好的特異性，其他離子對(duì)檢測不產(chǎn)生影響，可用于實(shí)際樣品檢測，回收率為98.6-114%。本發(fā)明設(shè)計(jì)的對(duì)硫離子的檢測方法操作簡單，使用方便，靈敏度高，選擇性高，無需特意的核酸序列和復(fù)雜的儀器，為實(shí)際樣品中硫離子含量的快速檢測提供了一種新的檢測手段。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102608091SQ20121007799
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者劉杰, 曾令文, 陳俊華 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院