專利名稱：用于從單個樣品中分離基因組dna、rna和蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分離基因組DNA、總RNA和蛋白質(zhì)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及 用于從單個樣品中提取和純化基因組DNA、總RNA和蛋白質(zhì)的簡單且快速的系統(tǒng)和方法。
背景技術(shù)：
近三十年來已看出，在開發(fā)用于從生物來源中分離和純化核酸和蛋白質(zhì)的改良方 法的方面付出了相當(dāng)大的努力。這主要是由于核酸和蛋白質(zhì)在醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)中應(yīng)用的不 斷增加。從血液、組織或培養(yǎng)細(xì)胞中分離基因組RNA有幾種用途，其包括PCR、測序、基因分 型、雜交和DNA印跡法。質(zhì)粒DNA已被用于測序、PCR、疫苗開發(fā)和基因治療。分離的RNA有 多種下游應(yīng)用，包括體外翻譯、cDNA合成、RT-PCR以及用于微陣列基因表達(dá)分析。在蛋白 質(zhì)領(lǐng)域中，通過蛋白印跡鑒定蛋白已成為基礎(chǔ)研究中研究基因表達(dá)以及為了診斷目的鑒定 特定蛋白(例如病毒蛋白的檢測)的重要工具。通常在核酸和蛋白質(zhì)的分析和體外操作之前要進(jìn)行分離步驟，以便使樣品從不需 要的污染物中游離出來，所述污染物可能會干擾后續(xù)的處理步驟。對于研究和診斷用分子 生物學(xué)中的大部分方法來說，需要提取的核酸和蛋白質(zhì)作為第一步。RNA、DNA和蛋白質(zhì)的用途增加為用于分離DNA、RNA和蛋白質(zhì)的快速、簡單且可靠 的方法和試劑創(chuàng)造了需要。在許多應(yīng)用中，若可從單個樣品中同時分離出三種細(xì)胞組分 (RNA、DNA和蛋白質(zhì))，則將極大簡化收集生物材料樣品及其后續(xù)分析。當(dāng)樣品量小(例如 在活檢時)到不允許將其分成更小的樣品來進(jìn)行針對DNA、RNA和蛋白質(zhì)的單獨分離方案 時，同時分離尤為重要。此外，出于不同原因，DNA、RNA和蛋白質(zhì)的全部三種水平提供了有價值的信息。DNA 或基因型提供了關(guān)于遺傳易感性和獲得性突變/局部重排的重要信息。mRNA譜和蛋白質(zhì) 譜得到了生物學(xué)階段/狀態(tài)或疾病的“分子肖像(molecular portrait) ”，并且還可用于疾 病的發(fā)展和治療的分期和監(jiān)測。與DNA相反，mRNA譜和蛋白質(zhì)譜代表了細(xì)胞生物學(xué)的“快 照”，這是由于它們會隨周圍環(huán)境作出反應(yīng)而不斷變化。由于調(diào)節(jié)機(jī)制作用于轉(zhuǎn)錄、翻譯和 翻譯后水平三者，mRNA水平和蛋白質(zhì)水平并不總是相互關(guān)聯(lián)。因此研究同一樣品中的mRNA 和蛋白質(zhì)是極其重要的。因此，如上所述，然而mRNA水平和蛋白質(zhì)水平之間并非一定存在1 1的相關(guān)性。 若將蛋白質(zhì)水平和相應(yīng)的mRNA水平作比較，那么對于mRNA與蛋白質(zhì)之比并不為1 1的每 種蛋白質(zhì)而言，所述蛋白質(zhì)受到了一些形式的感興趣的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和/或翻譯后調(diào)節(jié)。針 對特定基因的mRNA/蛋白質(zhì)之比往往在疾病條件下會轉(zhuǎn)變。為了能夠研究調(diào)節(jié)機(jī)制并解釋 mRNA/蛋白質(zhì)之比轉(zhuǎn)變背后的原因，從同一樣品中分離mRNA和蛋白質(zhì)是極其重要的。
此外，微小RNA(miRNA)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并且miRNA的失調(diào)牽涉到許多疾病或病況。 若微小RNA可從同一樣品中與總蛋白質(zhì)、基因DNA和總RNA—同被分離，則對于我們理解它 們之間的相互作用和效應(yīng)會有明顯的好處。用于分離微小RNA的有效方法還有助于癌癥、 神經(jīng)學(xué)、心臟病學(xué)及其它領(lǐng)域中基于微小RNA的診斷學(xué)和治療學(xué)的發(fā)展。本文提供了用于從同一樣品中進(jìn)行基因組DNA、RNA和蛋白質(zhì)的分離的新型且有 益的方法。發(fā)明簡述一般而言，本發(fā)明提供了用于從同一樣品中快速分開和分離雙鏈核酸和單鏈核酸 的改良的方法、系統(tǒng)和試劑盒。所述雙鏈核酸在高濃度的離液鹽存在下選擇性吸附到礦物 支持體(mineral support)。調(diào)節(jié)含單鏈核酸的流過液以使單鏈核酸吸附到第二礦物支持 體。所述核酸分別從各自的礦物支持體洗脫下來，而蛋白質(zhì)可從第二礦物支持體的流過液 中純化。因此，本發(fā)明的一個方面提供了用于分離和/或純化至少兩種細(xì)胞組分的方法， 所述細(xì)胞組分選自基因組DNA、RNA和蛋白質(zhì)。所述方法包括首先裂解生物樣品，得到含細(xì) 胞組分的水溶液；隨后將所述水溶液在使基因組DNA結(jié)合的條件下上樣(apply)至第一礦 物支持體；收集含有未結(jié)合的RNA和蛋白質(zhì)的流過液。所述方法還包括將所述流過液在使 RNA結(jié)合的條件下上樣至第二礦物支持體，并收集包含蛋白質(zhì)的流過液。在本發(fā)明的某些實施方案中，使用裂解液裂解樣品，所述裂解液包含離液鹽、非離 子型去污劑和還原劑。優(yōu)選所述離液鹽為鹽酸胍(GuHCl)。還優(yōu)選的是，所述非離子型去污 劑為NP-40而所述還原劑為巰基乙醇(0-ME)。在本發(fā)明的其它實施方案中，來自第一 礦物支持體的流過液在RNA與第二礦物支持體結(jié)合之前與有機(jī)物混合。在優(yōu)選的實施方案 中，所述有機(jī)物為極性或偶極的非質(zhì)子溶劑。最優(yōu)選地，所述有機(jī)物為丙酮。在某些實施方案中，所述方法還包括洗滌第一礦物支持體并洗脫其基因組DNA。在 其它的實施方案中，所述方法還包括洗滌第二礦物支持體并洗脫其RNA。在其它的實施方案 中，所述方法還包括從流過液中進(jìn)一步分離蛋白質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供了用于分開和分離雙鏈核酸、單鏈核酸和蛋白質(zhì)的試劑 盒。所述試劑盒包括用于裂解生物樣品的裂解液；用于結(jié)合雙鏈核酸的第一礦物支持體； 用于結(jié)合單鏈核酸的第二礦物支持體；用于從第一礦物支持體中洗脫雙鏈核酸的洗脫液； 和用于從第二礦物支持體中洗脫單鏈核酸的洗脫液。任選地，所述試劑盒還包括用于在基 因組DNA和RNA與各自的礦物支持體結(jié)合后從流過液中分離蛋白質(zhì)的工具(means)。在優(yōu)選的實施方案中，所述裂解液包含離液鹽、非離子型去污劑和還原劑。在另一 優(yōu)選的實施方案中，所述第一礦物支持體和所述第二礦物支持體各自為二氧化硅膜。本發(fā)明的上述和其它特征以及優(yōu)點將通過下面的詳述和權(quán)利要求而變得更清楚。附圖簡述

圖1出示了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，用于從單個樣品中分離基因組DNA、總RNA和 蛋白質(zhì)的方法的示意圖。圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案分離的基因組DNA和總RNA的凝膠圖像。圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案分離的基因組DNA和RNA樣品與市售產(chǎn)品 所得的那些基因組DNA和RNA樣品比較的凝膠圖像。上總RNA;下基因組DNA。左側(cè)凝膠顯示了從培養(yǎng)的海拉細(xì)胞(HaLa cell)中分離的核酸樣品。右側(cè)凝膠顯示了從大鼠肝組 織中分離的核酸樣品。圖4為根據(jù)本發(fā)明的實施方案從海拉細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的總RNA樣品對比市售產(chǎn) 品所得的那些RNA樣品的AgilentBioanalyzer所得的圖像。圖5顯示了來自海拉細(xì)胞培養(yǎng)物的基因組DNA樣品所得的實時PCR擴(kuò)增結(jié)果，該 結(jié)果具有在包括使用市售產(chǎn)品所得的那些基因組DNA樣品在內(nèi)的樣品中觀察到的非常相 似的擴(kuò)增概況。圖6顯示了從來自海拉細(xì)胞培養(yǎng)物的總RNA樣品所得的實時RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，該 結(jié)果具有在包括使用市售產(chǎn)品所得的那些總RNA樣品在內(nèi)的樣品中觀察到的非常相似的 擴(kuò)增概況。圖7為SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色結(jié)果，其顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方案從海拉 細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的總蛋白質(zhì)，以及從市售產(chǎn)品中分離的總蛋白質(zhì)。圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方案分離的蛋白質(zhì)樣品對比采用市售產(chǎn)品分離的 那些蛋白質(zhì)樣品的蛋白印跡實驗所得的結(jié)果。圖9是根據(jù)本發(fā)明的實施方案從大鼠肝組織中分離的總RNA樣品對比來自市售產(chǎn) 品的總RNA樣品的Agilent Bioanalyzer所得到的圖像。圖10顯示了來自大鼠肝組織的基因組DNA樣品所得到的實時PCR擴(kuò)增結(jié)果，該結(jié) 果具有在包括來自市售產(chǎn)品的樣品在內(nèi)的樣品中觀察到的非常相似的擴(kuò)增概況。圖11顯示了來自大鼠肝組織的總RNA樣品所得的實時RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，該結(jié)果 具有在包括使用市售產(chǎn)品所得總RNA樣品在內(nèi)的樣品中觀察到的非常相似的擴(kuò)增概況。圖12為SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色情況，其顯示了根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案 從大鼠肝組織中分離的總蛋白質(zhì)。圖13為SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色情況，其顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方案從大 鼠肝組織中分離的總蛋白質(zhì)，以及從市售產(chǎn)品中分離的總蛋白質(zhì)。圖14顯示了根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案從海拉細(xì)胞中分離到的基因組DNA和總 RNA的凝膠圖像和產(chǎn)量的結(jié)果。圖15顯示了根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案從大鼠肝組織中分離到的基因組DNA和 總RNA的凝膠圖像和產(chǎn)量的結(jié)果。圖16顯示了從根據(jù)本發(fā)明的實施方案純化的總RNA中分離的小RNA (泳道1、2、3) 以及對照樣品(Q和Q)的凝膠圖像和產(chǎn)量的結(jié)果。總RNA原材料作為另一對照(泳道‘輸 入’)加樣。圖17出示了四種微小RNA的qRT-PCR圖，確定了分離的小RNA樣品中低拷貝數(shù)微 小RNA和高拷貝數(shù)微小RNA兩者的存在情況。圖18比較了根據(jù)本方法分離的總RNA與從兩種市售產(chǎn)品中分離的總RNA的小RNA 分離情況。小RNA顯示在下面的凝膠中，而“大”RNA(無小RNA的總RNA)顯示于上面的凝 膠中。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于從單個生物材料(諸如細(xì)胞、組織和生物液體)中高效、簡單地 提取基因組DNA、RNA和蛋白質(zhì)的組合物、方法和試劑盒。有利地，這些可在無需使用有毒或腐蝕性試劑并且無需使用昂貴的超速離心設(shè)備的條件下實現(xiàn)。利用本發(fā)明的試劑和方法可 在短至30分鐘的時間內(nèi)分離基因組DNA和總RNA，并且可在短至45分鐘的時間內(nèi)分離蛋白 質(zhì)。這些結(jié)果大致上要快于用于分離各種組分的現(xiàn)有方法。本發(fā)明還適用于單獨分離RNA、DNA、蛋白質(zhì)或這些細(xì)胞組分中至少兩種的任何組 合。分離所得的基因組DNA和總RNA具有適用于下游應(yīng)用的高質(zhì)量。我們還發(fā)現(xiàn)，相對于 從其它的市售方案分離的總RNA，通過本方法分離的總RNA包含更高水平的小RNA。因此本 發(fā)明還提供了用于分離小RNA的方法，所述方法通過使根據(jù)本方法分離的總RNA接受任一 種已知的小RNA分離方法來進(jìn)行。因此，小RNA可從相同的起始樣品與其它組分(即基因 組DNA、總RNA和蛋白質(zhì))一同被分離?！吧锊牧稀被颉吧飿悠贰笔菑V義上采用的術(shù)語，意指包括多種含有核酸和蛋白質(zhì) 的生物來源。這些的來源非限制性地包括全組織(包括活檢材料和抽吸液(aspirate))； 體外培養(yǎng)的細(xì)胞(包括原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、以及組織和血細(xì)胞)；體液(諸 如尿、痰、精液、分泌物、洗眼液(eye washes)及眼抽吸液、洗肺液及肺抽吸液)。真菌組織 和植物組織(例如葉、根、莖和根冠)也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。生物樣品上或生物樣品 中可存在的微生物和病毒在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。細(xì)菌細(xì)胞也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在其最廣泛的方面，本發(fā)明涵蓋了用于從生物材料(包括組織、細(xì)胞和體液)中分 離基本上純化的且未降解的總RNA、基因組DNA和蛋白質(zhì)的方法。因此，首先裂解生物樣品 以得到含細(xì)胞組分的水溶液；然后將水溶液在使基因組DNA結(jié)合的條件下上樣至第一礦物 支持體；同時收集含未結(jié)合的總RNA和蛋白質(zhì)的流過液。將流過液在使RNA結(jié)合的條件下 上樣至第二礦物支持體；收集其流過液，該流過液包含蛋白質(zhì)。從所述第一和第二礦物支持 體中分別洗脫基因組DNA和總RNA。本發(fā)明的一個實施方案的流程的實例在圖1中示出。優(yōu)選的是，首先在含離液物質(zhì)和/或其它鹽的含水裂解系統(tǒng)中裂解生物樣品或細(xì) 胞，即在最簡單的情況下通過將其加入細(xì)胞中。本文所用術(shù)語“離液劑”或“離液鹽”是指 通過例如但不限于以下方式使蛋白質(zhì)或核酸無序化的物質(zhì)改變蛋白質(zhì)或核酸的二級、三 級或四級結(jié)構(gòu)同時保持一級結(jié)構(gòu)完整。例示性離液劑包括但不限于鹽酸胍、硫氰酸胍、硫 氰酸鈉、碘化鈉、高氯酸鈉和尿素。按離液強(qiáng)度由強(qiáng)至弱依次顯示，典型的陰離子型離液劑 系列(chaotropicseries)包括CC13C0(T — CNS" — CF3C0(T — CIO; > r — CH3C0(T — Br\ CF 或 CHO”所提及的一些原材料在含離液物質(zhì)的水系統(tǒng)中不可直接被裂解，以細(xì)菌為例，這 是由于它們的細(xì)胞壁狀況。因此，這些原材料必須經(jīng)過預(yù)處理，例如在被用于本發(fā)明的方法 之前用水解酶預(yù)處理。RNA和蛋白質(zhì)的分離中最重要的一個方面是防止它們在分離步驟期間降解。因此， 用于裂解生物樣品的現(xiàn)有試劑優(yōu)選為含有大量離液離子的溶液。該裂解緩沖液隨即滅活幾 乎所有酶，防止RNA和蛋白質(zhì)的酶解。所述裂解液包含濃度為0. 1-10M(例如1-10M)的離 液物質(zhì)。作為所述離液物質(zhì)，尤其可采用鹽，例如高氯酸鈉、氯化胍、異硫氰酸胍/硫氰酸 胍、碘化鈉、碘化鉀和/或其組合。優(yōu)選的是，所述裂解液還包含還原劑，所述還原劑通過離液劑促進(jìn)RNase變性并 且有助于分離未降解的RNA。優(yōu)選的是，所述還原劑為2-氨基乙硫醇、三-羧基乙基膦 (TCEP)或巰基乙醇。
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任選地，所述裂解液還包含非離子型表面活性劑(即去污劑)。去污劑的存在能夠使基因組DNA與礦物支持體選擇性結(jié)合。例示性非離子型表面活性劑包括 但不限于叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )、(辛基苯氧基)聚氧乙氧 基乙醇(IGEPALtmCA-630/NP-40)、三甘醇單月桂基醚(BRIJ 30)、失水山梨醇單月桂 酸酯(sorbitari monolaurate) (SPAN 20)或化學(xué)品的聚山梨酯家族，諸如聚山梨 酯20 (即TTOEN 20)。其它市售的聚山梨酯包括TWEEN 40、TWEEN 60和TWEEN 80(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。這些和其它相關(guān)化學(xué)品中任一種可有效作為TWEEN 20的代替品。用于選擇性結(jié)合雙鏈核酸的非離子型去污劑的有效量可隨不同的去污劑而稍作 變化。然而，各種去污劑(或去污劑的組合)的最佳濃度可很容易通過一些簡單的實驗 來確定。具體而言，已發(fā)現(xiàn)終濃度在0. 5%以上的去污劑對于選擇性結(jié)合雙鏈核酸而言是 有效的。在某些實施方案中，有效濃度為0.5%-約10%。在優(yōu)選的實施方案中，濃度為
-8%。還應(yīng)注意到的是可合并超過一種的非離子型去污劑，只要去污劑的合并濃度在 0. 5% -約10%的范圍內(nèi)即可。已發(fā)現(xiàn)一定濃度下，去污劑的存在不僅提高了核酸的回收而且減少了被純化的單 鏈核酸中雙鏈核酸的污染。這通過提高基因組DNA與二氧化硅膜的結(jié)合來至少部分地實 現(xiàn)。在優(yōu)選實施方案中，所述裂解液包含NP-40 (IGEPAL CA-630)。在最優(yōu)選實施方案 中，所述裂解液包含鹽酸胍、TWEEN 20、NP-40和β -巰基乙醇。本發(fā)明的裂解液還優(yōu)選包含足量的緩沖液以維持所述溶液的ρΗ。對于同時分離 RNA、DNA和蛋白質(zhì)而言，ρΗ應(yīng)保持在約5_8的范圍內(nèi)。裂解液中采用的優(yōu)選緩沖液包括 三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、磷酸鈉、醋酸鈉、四硼酸鈉-硼酸和甘氨酸-氫 氧化鈉。生物樣品一旦裂解后，則將含細(xì)胞組分的水溶液上樣至礦物支持體。已發(fā)現(xiàn)在裂 解液(含一定量的非離子型去污劑)的條件下，幾乎所有的基因組DNA結(jié)合到第一礦物支 持體，而總RNA和蛋白質(zhì)不結(jié)合并通過簡單的離心(spin)作為流過液收集。所述礦物支持體優(yōu)選由以下組成多孔或無孔的金屬氧化物或混合金屬氧化物、 硅膠、二氧化硅膜、主要由玻璃組成的材料(諸如未改性的玻璃顆粒、玻璃粉)、石英、氧化 鋁、沸石、二氧化鈦或二氧化鋯。礦物支持體材料的粒徑范圍為0. 1 μ m-1000 μ m，孔徑為 2-1000 μ m。所述多孔或無孔的支持體材料可以疏松填充物的形式存在或按以下形式被包 含(embody):由玻璃、石英或陶瓷制成的濾層，和/或其中排列有硅膠的膜，和/或由石英 或玻璃纖維的礦物支持體和織物制成的顆?；蚶w維，以及帶有或不帶有官能團(tuán)的乳膠顆 粒，或由聚乙烯、聚丙烯或聚偏二氟乙烯(特別是超高分子量聚乙烯和高密度聚乙烯)制成 的多孔材料(frit material)。來自第一礦物支持體的流過液含有總RNA和蛋白質(zhì)。所述流過液與有機(jī)溶液混合 并上樣至第二礦物支持體。已發(fā)現(xiàn)在某些有機(jī)溶液的存在下RNA與礦物支持體結(jié)合而蛋白 質(zhì)則不結(jié)合。簡單的離心步驟將與礦物支持體結(jié)合的RNA從流過液中的蛋白質(zhì)分離出來。舉例而言，極性質(zhì)子溶劑(如低級脂肪醇)為合適的有機(jī)溶劑。優(yōu)選所述有機(jī)溶 劑為偶極非質(zhì)子溶劑。合適的偶極非質(zhì)子溶劑包括但不限于丙酮、四氫呋喃(THF)、甲乙酮、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMS0)。更優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為丙酮 或乙腈。用于RNA結(jié)合的第二礦物支持體由與上述的第一礦物支持體相似的材料組成。優(yōu) 選的是，所述第一礦物支持體和第二礦物支持體各自為二氧化硅膜。應(yīng)預(yù)見的是，在某些應(yīng)用中使基因組DNA和RNA兩者一同與相同的礦物柱結(jié)合將 是有利的。這可通過在第一柱加樣之前加入有機(jī)溶劑(諸如偶極非質(zhì)子溶劑)來實現(xiàn)。DNA 和RNA的分離可通過常規(guī)技術(shù)，例如通過控制洗脫條件來實現(xiàn)?；蛘?，可通過酶反應(yīng)去除所 述核酸中的一種。在任選進(jìn)行洗滌步驟后，吸附于第一礦物支持體上的雙鏈核酸和吸附于第二礦物 支持體上的單鏈核酸可分別在低離子強(qiáng)度的條件下或用水洗脫。任選地，洗滌步驟還可在相應(yīng)的核酸(單鏈核酸或雙鏈核酸)的洗脫之前進(jìn)行。對 于純化雙鏈的基因組DNA而言，用裂解緩沖液對第一礦物支持體(即柱)的任選洗滌去除 了任何殘留量的RNA。此外，含高濃度的有機(jī)溶劑(如低級脂肪醇)的洗滌緩沖液可用于基 因組DNA和RNA兩者的純化，以通過快速離心步驟去除所需核酸之外的組分。根據(jù)圖1中說明的流程和如以下實施例2和3進(jìn)一步描述的實驗條件，已成功地 從生物樣品中純化DNA和總RNA。表1出示了利用培養(yǎng)細(xì)胞和大鼠肝組織所得的DNA和總 RNA的分離數(shù)據(jù)。通過比較當(dāng)前行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或其它市售純化試劑盒，從這些實驗中得到高質(zhì)量 的核酸(參見下文)。表1 從9個樣品中各自分離DNA和總RNA。
流過液中的蛋白質(zhì)可用本身已知的方法(例如沉淀、凝膠過濾或疏水作用色譜 (HIC))進(jìn)一步純化。優(yōu)選所述蛋白質(zhì)通過沉淀來純化。更優(yōu)選所述蛋白質(zhì)在二價金屬陽離 子存在下通過沉淀來純化。最優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)在ZnS04#在下通過沉淀分離。表2顯 示了采用不同的下游蛋白質(zhì)分離方法可得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。表2 采用不同的下游蛋白質(zhì)分離方案的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。
本發(fā)明還提供了用于從同一樣品分離小RNA的方法。簡單來說，通過上述方法純 化的總RNA相對于從其它的市售方案中分離的總RNA含有更高水平的小RNA，因此能夠從經(jīng)純化的總RNA中分離包括微小RNA在內(nèi)的小RNA。我們顯示，市售的微小RNA分離試劑盒對 于從本方法所得到的總RNA樣品中分離小RNA是有效的。所分離的小RNA包含高拷貝數(shù)和 低拷貝數(shù)的微小RNA。還提供的是用于從生物樣品中分離和/或純化基因組DNA、總RNA和蛋白質(zhì)的試劑 盒。所述試劑盒包括用于裂解生物樣品的裂解液；用于結(jié)合基因組DNA的第一礦物支持 體；用于結(jié)合RNA的第二礦物支持體；用于從所述第一礦物支持體中洗脫基因組DNA的洗 脫液；用于從所述第二礦物支持體中洗脫RNA的洗脫液以及有機(jī)溶劑例如丙酮。任選地，所 述試劑盒還包括用于在基因組DNA和RNA結(jié)合各自的礦物支持體后從流過液中分離蛋白質(zhì) 的工具，以及使用手冊。優(yōu)選地，試劑盒中的裂解液包含離液鹽、非離子型去污劑和還原劑。最優(yōu)選地，所 述裂解液包含鹽酸胍、TWEEN 20、NP-40和巰基乙醇。所述礦物支持體可按疏松填充，固定在兩個裝置(means)之間，或者以布置在柱 的中空殼體內(nèi)的膜的形式存在。優(yōu)選地，所述第一礦物支持體和第二礦物支持體各自為二
氧化硅膜。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將通過以下的實施例和權(quán)利要求顯而易見。 實施例以下實施例用于根據(jù)本發(fā)明的實施方案闡述用于從單個來源中分離基因組DNA、 RNA和蛋白質(zhì)的方法，而并不旨在限制。溶液和方案1.實施例中采用的溶液和柱 2.樣品破碎和勻漿化2. 1細(xì)胞破碎和勻漿化a.通過在8000xg離心1分鐘將lxlO6培養(yǎng)細(xì)胞沉淀在1. 5ml微量離心管中。b.通過抽吸完全去除上清液。c.加入350 u 1裂解緩沖液(含3 -ME)。
d.旋渦振蕩以使細(xì)胞沉淀重新懸浮。e.使所述裂解液通過安裝在無RNA酶和DNA酶的注射器上的20規(guī)針至少5次來 使所述裂解液勻漿化。f 進(jìn)行步驟3。2. 2 利用 P0LYTR0N 勻漿器(Kinematica AG, Switzerland)進(jìn)行組織破碎和勻漿 化a.將10mg組織置于合適尺寸的管中。b.加入350 u 1裂解緩沖液(含3 -ME)。c.根據(jù)P0LYTR0N 的使用手冊將組織勻漿化。d.肉眼觀察所制備的勻漿并確保已徹底勻漿化。e 進(jìn)行步驟3。2. 3利用研缽和研杵破碎組織后用針頭和注射器勻漿化a.將已稱重的組織迅速置于液氮中，并用研缽和研杵充分研磨。b.將組織粉末和液氮潷至無RNA酶、用液氮冷卻的2ml微量離心管中。c.使液氮揮發(fā)，但不讓組織解凍。d.加入適當(dāng)體積的裂解緩沖液，并將裂解液通過安裝在無RNA酶的注射器上的20 規(guī)針至少5次來勻漿化。3. rDNA 的純化3. lgDNA 的結(jié)合a.將新的離心柱置于新的收集管中。b.將步驟2中所勻漿化的裂解液(約350 u 1)轉(zhuǎn)移至柱中。c. llOOOxg 離心 1 分鐘。d.保存流過液用于RNA和蛋白質(zhì)的純化。e.將柱轉(zhuǎn)移至新的2ml收集管中。3. 2柱的洗滌a.將500 u 1裂解緩沖液加入柱中。b. llOOOxg離心1分鐘。棄去流過液。c.將柱放回相同的收集管中。d.將500 U 1洗滌緩沖液加入柱中。e. llOOOxg 離心 1 分鐘。f.將柱轉(zhuǎn)移至無DNA酶的1. 5ml微量離心管中。3. 3gDNA 的洗脫a.將100 ill gDNA洗脫緩沖液加入柱的中心。b. 8000xg 離心 1 分鐘。c.棄柱并將含純的gDNA的管儲存于-20°C。4.總RNA的純化4. 1RNA 的結(jié)合a.將新的離心柱置于新的收集管中。b.將350iill00%丙酮加入步驟3. 1. d的流過液中。通過上下移液數(shù)次充分混合。
12將全部混合液轉(zhuǎn)移至柱中。c. llOOOxg 離心 1 分鐘。d.保存流過液用于蛋白質(zhì)的純化。e.轉(zhuǎn)移柱至新的2ml收集管中。4. 2柱的洗滌a.加入500 u 1洗滌緩沖液至柱中。b. llOOOxg 離心 1 分鐘。c.轉(zhuǎn)移柱至無RNA酶的1. 5ml微量離心管中。4. 3RNA 的洗脫a.將100 u 1洗脫緩沖液加入柱的中心。b. 8000xg 離心 1 分鐘。c.棄柱并將含純的RNA的管儲存于_80°C待用。5.用 2-D Clean-Up 試劑盒(GE Healthcare)純化總蛋白質(zhì)注除非另外說明，否則所有步驟應(yīng)在冰上進(jìn)行。5.1蛋白質(zhì)沉淀a.用步驟4. 1的流過液作為用于蛋白質(zhì)沉淀的起點。充分混合并將100 yl流過 液轉(zhuǎn)移至新的1. 5ml的微量離心管中。b.加入300沉淀劑并充分混合。冰上孵育15分鐘。c.加入300共沉淀劑至混合物中。簡單混合。d.將管以最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘。e.通過移液或潷出盡可能完全地去除上清液。f.加入40 U 1共沉淀劑至沉淀上，并在冰上孵育5分鐘。g.將管以最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘。小心地去除并棄掉上清液。5. 2蛋白質(zhì)沉淀的洗滌a.用移液槍加入25 yl去離子水至沉淀中。旋渦振蕩管5分鐘。b.加入1ml預(yù)冷的洗滌緩沖液和5 u 1洗滌添加劑至各管中。劇烈旋渦振蕩(注 沉淀不溶于洗滌緩沖液)。c.在_20°C下孵育管30分鐘，每10分鐘旋渦振蕩一次，每次20-30秒。d.將管以最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘。e.小心地去除并棄掉上清。此步驟中應(yīng)可見白色沉淀。f.保持蓋子打開，在室溫下干燥沉淀多至5分鐘。5. 3蛋白質(zhì)沉淀的重新懸浮a.加入多至lOOiU的5%SDS或7M尿素并劇烈混合以溶解蛋白質(zhì)沉淀。用移液 槍的槍頭破碎沉淀。b.在95°C下孵育3分鐘以完全溶解蛋白質(zhì)并使其變性。然后將樣品冷卻至室溫。c. llOOOxg離心1分鐘以沉淀任何殘留的不溶性物質(zhì)。上清液用于下游的應(yīng)用，即 SDS-PAGE和蛋白印跡。樣品可在-20°C下儲存數(shù)月或在4°C下儲存數(shù)天。6.總蛋白質(zhì)的分離(用ZnSCX沉淀)
6.1蛋白質(zhì)的沉淀a.利用步驟4. 1. d中的流過液作為蛋白質(zhì)沉淀的起點。b.加入 60011110%的21^04溶液。c.劇烈混合并在室溫下孵育10分鐘以沉淀蛋白質(zhì)。d. 16000xg 離心 10 分鐘。e.通過移液或潷出小心地去除上清液。6. 2洗滌蛋白質(zhì)沉淀a.將500 ill的50%乙醇加入蛋白質(zhì)沉淀中。b. 16000xg 離心 1 分鐘。c.通過用移液槍吸走或通過潷出盡可能多的液體來去除上清液。d.保持蓋子打開并在室溫下干燥沉淀5-10分鐘。6. 3蛋白質(zhì)沉淀的重新懸浮a.為了定量蛋白質(zhì)，在SDS-PAGE前，加入至少lOOiil的5% SDS(或7M尿素)并 劇烈混合以溶解蛋白質(zhì)沉淀。用移液槍的槍頭破碎沉淀。b.若有需要，加入多至1ml的5% SDS (或7M尿素)以完全溶解沉淀。c.在95°C下孵育5分鐘以完全溶解蛋白質(zhì)并使其變性。劇烈旋渦振蕩。d.使樣品在室溫下冷卻5分鐘。e. llOOOxg 離心 1 分鐘。f.將上清液轉(zhuǎn)移至新的1. 5ml的微量離心管中。g.用上清液進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白印跡。h.樣品在-20°C下儲存數(shù)月或在4°C下儲存數(shù)天。實施例1 流程的優(yōu)化在努力尋找最佳流程中，我們測試了用于從海拉細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化基因組 DNA、總RNA和總蛋白質(zhì)的多種溶液和添加劑。我們發(fā)現(xiàn)，含有7M鹽酸胍、50mM Tris_HCl、pH 7 (含或不含去污劑，例如5% NP-40 或TWEEN 20)的混合液的裂解緩沖液在還原劑(例如TCEP或0-ME)存在下很有效?；?者，含7M鹽酸胍、50mM Tris_HCl、pH 5 (含去污劑，例如5% NP-40)的混合液的裂解緩沖液 在還原劑(例如TCEP或0-ME)存在下也很有效。生物樣品當(dāng)與任一溶液混合時，根據(jù)以 上提供的方案勻漿化并加樣到二氧化硅膜柱上?？焖匐x心(spin)去除以作為流過液的混 合液并使基因組DNA與柱結(jié)合。根據(jù)以上方案進(jìn)一步地處理含基因組DNA的柱以分離純的 基因組DNA。所述流過液含有總RNA和蛋白質(zhì)。對于進(jìn)一步地使總RNA與蛋白質(zhì)分離，發(fā)現(xiàn)0. 7 體積的丙酮能有效地使總RNA選擇性吸附于二氧化硅膜柱。因此，將0. 7體積的丙酮加入 流過液中，然后將所述混合液加樣到二氧化硅膜柱中?？焖匐x心分離作為現(xiàn)含有蛋白質(zhì)的 流過液的混合液和上面結(jié)合有RNA的柱。根據(jù)上述方案進(jìn)一步地處理柱以分離純的RNA，而 流過液用于蛋白質(zhì)的純化。我們還測試了極性質(zhì)子溶劑如低級脂肪醇和偶極非質(zhì)子溶劑。正如預(yù)期，低級脂 肪醇能夠使RNA與二氧化硅膜柱結(jié)合。我們發(fā)現(xiàn)許多偶極非質(zhì)子溶劑也可以用于該目的。 具體而言，我們發(fā)現(xiàn)丙酮和乙腈比其它溶劑更優(yōu)選，但發(fā)現(xiàn)其它的被試偶極非質(zhì)子溶劑也有效(數(shù)據(jù)未顯示)。圖2顯示了從本方法分離的基因組DNA和總RNA的凝膠圖像。原材料是lxlO6的 海拉細(xì)胞。裂解液包含 7M GuHCl、50mMTris-HCl、pH 7,5% TWEEN 20 禾口 1%TCEP。在加 樣至第二礦物支持體之前，將流過液與丙酮或乙腈混合。其它步驟如上進(jìn)行。以200iU終 體積洗脫基因組DNA。以lOOyl終體積洗脫總RNA。每條凝膠泳道含10 yl的經(jīng)洗脫的樣 品。清楚的是所述方案對于分離和純化基因組DNA和總RNA兩者十分有效(泳道1-3 用 丙酮分離總RNA ；4-5 用乙腈分離總RNA ；M 入HindHI標(biāo)記)。實施例2 從培養(yǎng)細(xì)胞』中分離某因鉬DNA、RNA和蛋白質(zhì)用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)一步測試了流程的性能。我們還測試了所述流程與市售產(chǎn)品(即 AllPr印試劑盒(Qiagen Inc. , Valencia, CA)和 NUCLEOSPIN RNA/Protein 試劑盒(加上 DNA洗脫緩沖組套(set)，MACHEREY-NAGEL GmbH&Co. KG, Germany)的對比。處理多種樣品 以評價方案的一致性。產(chǎn)物的純度通過紫外分光光度計和凝膠分析評價。所得樣品還可在 下游應(yīng)用例如實時PCR、RT-PCR和蛋白印跡實驗中評價。我們的結(jié)果顯示上述方案一致性 有效并且十分適用于經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞。我們從lxlO7海拉細(xì)胞培養(yǎng)物開始。在制備開始前沉淀細(xì)胞并將其稀釋至lxlO6 的等份。三名操作人員各自用等份之一遵循上述或生產(chǎn)商的相同方案。不進(jìn)行各種方案 的任選步驟。在第一天分離基因組DNA和RNA。在第二天用以下三種不同的方法進(jìn)一步純 化蛋白質(zhì)流過液2_D Clean-Up 試劑盒(GE Healthcare, Piscataway, NJ)、NUCLEOSPIN Protein Pecipitator試劑盒(Macherey-Nagel)禾口 AllPrep Protein Precipitation試劑 盒(Qiagen)?；蚪MDNA和總RNA分離產(chǎn)量的結(jié)果在上表1中顯示。蛋白質(zhì)純化產(chǎn)量的結(jié)果在 上表2中顯示。可以看出，所述方案在分離基因組DNA、總RNA和蛋白質(zhì)方面產(chǎn)生了一致且 高質(zhì)量的結(jié)果。還通過瓊脂糖凝膠分析檢測基因組DNA和RNA的純度。圖3顯示了所分離的基因 組DNA和RNA樣品與市售產(chǎn)品對比的凝膠圖像。上總RNA ；下基因組DNA。左側(cè)凝膠顯示 了從培養(yǎng)的海拉細(xì)胞中分離的核酸樣品。右側(cè)凝膠顯示了從大鼠肝組織中分離的核酸樣品 (參見實施例3)。M:標(biāo)記人/Hind Ill(lOOng) ；D 大鼠的基因組DNA對照(400ng) ；R 大 鼠肝的總RNA對照(600ng)。對于基因組DNA，本方法和NUCLEOSPIN 為每孔加樣2 yl，而 AllPr印加樣4iil。對于總RNA，本方法和AllPr印為每孔加樣5iil，而NUCLEOSPIN 加樣 3 yl。從凝膠圖像清楚可見所分離的基因組DNA和RNA是純的并且?guī)缀醪唤徊嫖廴尽Ｎ覀冞€利用 Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.，Santa Clara， CA)分析所分離的總RNA。同樣地，該圖像顯示了從不同方案得到的相似結(jié)果(圖4)。經(jīng)純化的基因組DNA的質(zhì)量通過實時PCR測定評價。實時PCR反應(yīng)如下設(shè)定每 個樣品采用lOOng的經(jīng)純化的基因組DNA，在GELSTAR 染料存在下(Cambrex，Baltimore, MD)用 PuReTaqREADY-T0-G0 PCR 珠(GE Healthcare, Piscataway, NJ)，并采用特異性針 對GAPDH基因的引物。實時PCR反應(yīng)用水將基因組DNA模板稀釋至20ng/ u 1。 在 ABI7900HT 快速實時 PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems Inc.，F(xiàn)oster City, CA) 上監(jiān)測擴(kuò)增，按照以下循環(huán)條件 信號的量與GAPDH基因的擴(kuò)增密切相關(guān)。信號升高在本底閾值之上的點被定義為 擴(kuò)增的Ct值。所有被試樣品顯示出非常相似的擴(kuò)增概況(圖5)。類似地，總RNA通過實時RT-PCR檢測。圖6顯示了得到的擴(kuò)增結(jié)果，該結(jié)果具有 在包括來自市售產(chǎn)品的樣品在內(nèi)的樣品中觀察到的非常相似的擴(kuò)增概況。所分離的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上用考馬斯染色分析。來自RNA柱的流過液用 改良的2-D Clean-Up試劑盒方案進(jìn)行處理。所沉淀的蛋白質(zhì)用50 yl的5% SDS復(fù)溶。將 5ul的樣品蛋白質(zhì)加樣至各孔。圖7顯示了用本發(fā)明的方案從海拉細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的總 蛋白質(zhì)，可比得上用市售產(chǎn)品(AllPr印)的方案分離的總蛋白質(zhì)。還利用蛋白印跡實驗用抗0肌動蛋白抗體分析蛋白質(zhì)樣品并與市售產(chǎn)品比較。結(jié)果在圖 8 中示出。M :Full_Range RainbowMolecular Weight Markers (GE Healthcare)。 第1-2條、第6-7條和第10條泳道用2-D Clean-Up試劑盒的本方案的流過液。第3_4 條和第 8-9 條泳道 AllPrep Protein ppt。第 5 條泳道，用 Macherey-Nagel Protein Pecipitator的NUCLE0SPIN 流過液。對于從海拉細(xì)胞中分離的蛋白質(zhì)，每孔用5 y g，對于 從組織中分離的蛋白質(zhì)，每孔采用10 y g(參見實施例3)。經(jīng)純化的基因組DNA、RNA和蛋白質(zhì)的分析清楚地表明該流程對于培養(yǎng)細(xì)胞很有 效。實施例3 從組織樣品中分離基因組DNA、RNA和蛋白質(zhì)我們用多種組織來源檢測了所述流程的性能，包括大鼠的肝、脾和肺。我們還檢測 了所述流程與市售產(chǎn)品(即AllPr印試劑盒和NUCLE0SPIN RNA/Protein試劑盒(加上DNA 洗脫緩沖組套)的對比。處理多種樣品以評價方案的一致性。產(chǎn)物的純度通過紫外分光光 度計和凝膠分析測量。所得到的基因組DNA還在下游應(yīng)用中評價，例如實時PCR、RT-PCR和 蛋白印跡實驗。我們的結(jié)果顯示上述方案效果一致并且十分適用于組織樣品。作為實例，本文提供了用于從大鼠肝分離基因組DNA、RNA和蛋白質(zhì)的細(xì)節(jié)。用 P0LYTR0N 勻漿器將10mg大鼠肝組織勻漿化。該實驗與實施例2的實驗設(shè)計相似。簡單 來說，三名操作人員各自根據(jù)上述或生產(chǎn)商的相同方案處理等份的裂解液。不進(jìn)行每種方 案中的任選步驟。在第一天分離基因組DNA和RNA。在第二天用以下不同的方法進(jìn)一步地 純化蛋白質(zhì)流過液，包括2-DClean-Up試劑盒，NUCLE0SPIN Protein Pecipitator試劑 盒禾口 AllPrep Protein Precipitation 試劑盒?；蚪MDNA和總RNA的分離結(jié)果在上表1中顯示。蛋白質(zhì)分離結(jié)果在上表2中顯 示。從結(jié)果可以看出所述方案制備出一致的、高質(zhì)量的基因組DNA、總RNA和蛋白質(zhì)?；蚪MDNA和RNA的純度還通過瓊脂糖凝膠分析檢測。圖3顯示了所分離的基因 組DNA和RNA樣品的凝膠圖像(細(xì)節(jié)參見實施例2)。從凝膠圖像明顯看出所分離的基因組 DNA和RNA是純的并且?guī)缀醪痪哂薪徊嫖廴?。我們還利用Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.，Santa Clara, CA)分析了所分離的總RNA。同樣地，該圖像顯示在不 同方案中的相似結(jié)果(圖9)。經(jīng)純化的基因組DNA的質(zhì)量通過實時PCR測定評價。根據(jù)實施例2的方案，每種 樣品采用lOOng經(jīng)純化的基因組DNA設(shè)定實時反應(yīng)(圖10)。類似地，通過實時RT-PCR檢 測總RNA。圖11顯示了所得到的擴(kuò)增結(jié)果，該結(jié)果具有在包括來自市售產(chǎn)品的樣品在內(nèi)的 樣品中觀察到的非常相似的擴(kuò)增概況。所分離的蛋白質(zhì)在SDS-PAFE凝膠上用考馬斯染色分析。來自本方案的蛋白質(zhì)流 過液用多種方法進(jìn)行處理，所述方法包括用不同量的21^04或11^沉淀。所沉淀的蛋白質(zhì)用 700 ill的5% SDS復(fù)溶。將lOiU樣品加樣到每孔中。圖12顯示，在不同的沉淀方案中從 大鼠肝中分離的總蛋白質(zhì)概況是類似的。圖13顯示了來自本方案的蛋白質(zhì)流過液可用2-D Clean-Up試劑盒和Macherey-NagelProtein Precipitator試劑盒進(jìn)一步純化。產(chǎn)量與市 售的AllPr印試劑盒或NUCLE0SPIN 試劑盒的產(chǎn)量類似(圖13)。還采用蛋白印跡實驗分析所述蛋白質(zhì)樣品并與市售產(chǎn)品作比較(圖8，詳見實施 例2)。經(jīng)純化的基因組DNA、RNA和蛋白質(zhì)的分析清楚地證明該流程對于組織樣品很有
如實施例2和3所闡述，我們的含2% TWEEN 20的標(biāo)準(zhǔn)裂解緩沖液很有效。然 而，我們發(fā)現(xiàn)在第一實例中增大的非離子型去污劑的量提高基因組DNA與二氧化硅膜的結(jié) 合，從而增大了基因組DNA和總RNA的回收。因此，實施例1用含5% TWEEN 20的裂解緩 沖液進(jìn)行。增大去污劑水平的另外的益處是所分離的總RNA中基因組DNA的交叉污染的減 少，這至少部分是由于在第一實例中基因組DNA與二氧化硅膜結(jié)合的提高。我們發(fā)現(xiàn)許多非離子型去污劑(例如TWEEN 20、NP-40、TRITON X-100 )中任 一種可實現(xiàn)該效果。這些去污劑的各種組合也是有效的。此外，增大的去污劑的量可作為 裂解液的一部分，或者其可恰好在樣品與二氧化硅膜柱結(jié)合之前加入。我們在此出示了用 TWEEN 20和NP-40的最佳結(jié)合所得的結(jié)果。即在裂解緩沖液中用2% TWEEN 20和5% NP-40的組合代替2% TWEEN 20。雖然其它的溶液和方案按照實施例的開始部分所述來使 用和進(jìn)行，但去污劑的組合和水平的調(diào)整導(dǎo)致所分離的總RNA中基因組DNA污染的極大減 少。此外，基因組DNA和總RNA兩者的產(chǎn)量也增加了。通過增大裂解緩沖液中去污劑的水 平，并不對總蛋白質(zhì)的分離有不利影響(數(shù)據(jù)未顯示)。圖14出示了從各lxlO6細(xì)胞的海 拉細(xì)胞樣品中所得的凝膠圖像和產(chǎn)量。圖15出示了從大鼠肝樣品(各10mg)中所得的凝 膠圖像和產(chǎn)量。實施例5 所分離的總RNA含有高水平的小RNA在所分離的總RNA中，我們觀察到高濃度的小RNA分子(參見圖14和圖15)。我 們在此出示的數(shù)據(jù)顯示了從上述方案中純化的總RNA樣品中富集并分離小RNA(長度小于 200nt)，并將所分離的小RNA與利用市售的微小RNA分離試劑盒分離的小RNA比較。我們首先采用Qiagen的市售試劑盒(miRNeasy Mini Kit Qiagen，產(chǎn)品編號 217004)從根據(jù)本發(fā)明分離的總RNA中純化小RNA。簡單來說，根據(jù)市售試劑盒的方案用 上述分離的30 y g總RNA(相當(dāng)于與從10mg大鼠肝組織中分離的總RNA的約2/3)純化小 RNA。作為對照，還采用miRNeasy Mini試劑盒中提供的方案從10mg大鼠肝組織中直接分 離小RNA。圖16顯示了結(jié)果。第1、2、3條泳道為從根據(jù)本方案分離的總RNA中純化的小 RNA。標(biāo)記為C的泳道顯示了從大鼠肝組織中直接分離的對照小RNA。我們還將所分離的總 RNA作為另一對照運(yùn)行(例如泳道標(biāo)記為輸入)。清楚的是，遵照本方法比直接從組織樣品 分離可分離到更多的小RNA。為了驗證所分離的小RNA含有微小RNA，我們用各種拷貝數(shù)的不同的微小RNA進(jìn)行 qRT-PCR測定。我們成功地檢測到樣品中的全部四種微小RNA(圖17)。因此我們利用市售 試劑盒從本方法中純化的總RNA中成功地分離到了微小RNA。我們還就所分離的總RNA中小RNA的存在情況和豐富程度將我們的方案與市售產(chǎn) 品作比較。我們選擇Qiagen的AllPr印和Norgen的RNA/DNA/Protein純化試劑盒。兩者 都被推薦用于同時分離基因組DNA、總RNA和蛋白質(zhì)。我們利用這些試劑盒以及我們自己的 方案分離總RNA。然后我們試圖利用miRNeasy Mini試劑盒從總RNA中分離小RNA。結(jié)果 在圖18中顯示。小RNA在下面凝膠中顯示，而“大”RNA(除去了小RNA的總RNA)在上面凝 膠中顯示。本方法(cm)和AllPr印試劑盒(Q)中的輸入總RNA作為對照顯示。我們估計， 利用我們的方案分離的總RNA所含的小RNA超過10%，而從其它的試劑盒分離的總RNA所含的小RNA低于3%。 本文提及的所有專利、專利申請和其它公布的參考文獻(xiàn)在此全部引作參考，其程 度如同各自具體并單獨地通過參考引入到本文中。雖然描述了本發(fā)明優(yōu)選的闡述性實施方 案，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的是本發(fā)明可通過所述實施方案之外的方案實踐，其僅以 闡述性的目的而并非限制性的方式示出。本發(fā)明僅受限于以上的權(quán)利要求。
權(quán)利要求
一種用于分離和/或純化至少兩種細(xì)胞組分的方法，所述細(xì)胞組分選自基因組DNA、總RNA和蛋白質(zhì)，所述方法包括a)通過用裂解液裂解生物樣品，產(chǎn)生含所述細(xì)胞組分的水溶液；b)將所述水溶液在使得基因組DNA結(jié)合第一礦物支持體的條件下上樣至所述第一礦物支持體；c)收集含有未結(jié)合的RNA和蛋白質(zhì)的流過液；d)將步驟(c)中的所述流過液與偶極非質(zhì)子溶劑混合以形成混合液，然后將所述混合液在使得RNA結(jié)合第二礦物支持體的條件下上樣至所述第二礦物支持體；和(e)收集含蛋白質(zhì)的流過液。
2.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括洗滌所述第一礦物支持體和從所述第一礦物支 持體中洗脫基因組DNA。
3.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括洗滌所述第二礦物支持體和從所述第二礦物支 持體中洗脫RNA。
4.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括從步驟(e)的流過液中純化蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述蛋白質(zhì)通過沉淀、凝膠過濾或疏水作用色譜(HIC)純化。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述裂解液包含離液鹽、非離子型去污劑和還原劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述離液鹽為鹽酸胍。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述非離子型去污劑選自三甘醇單月桂基醚、(辛基苯氧 基)聚乙氧基乙醇、失水山梨醇單月桂酸酯、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚山梨酯20、聚 山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80或其組合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述非離子型去污劑或其組合的范圍為0.1-10%。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述裂解液包含1-10M鹽酸胍、0.1-10% TWEEN 20和 0. 1-10% NP-40。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一礦物支持體和第二礦物支持體是多孔或無孔的， 并且由金屬氧化物或混合金屬氧化物、硅膠、二氧化硅膜、玻璃顆粒、玻璃粉、石英、氧化鋁、 沸石、二氧化鈦或二氧化鋯組成。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一礦物支持體和第二礦物支持體各自為二氧化硅膜。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述偶極非質(zhì)子溶劑選自丙酮、乙腈、四氫呋喃(THF)、甲 乙酮、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品選自培養(yǎng)細(xì)胞、微生物、植物、動物或酶反 應(yīng)的混合物。
15.一種用于分離微小RNA的方法，所述方法包括使從權(quán)利要求3中洗脫的總RNA接受 一個或多個另外的分離步驟以純化微小RNA。
16.一種用于從單個生物樣品中分離和/或純化基因組DNA、總RNA和蛋白質(zhì)的試劑 盒，所述試劑盒包含a)用于裂解生物樣品的裂解液；b)用于結(jié)合基因組DNA的第一礦物支持體；c)用于結(jié)合RNA的第二礦物支持體；d)用于從所述第一礦物支持體中洗脫基因組DNA的洗脫液；e)用于從所述第二礦物支持體中洗脫RNA的洗脫液； 任選地，所述試劑盒還包含用于在基因組DNA和RNA結(jié)合各自的礦物支持體后從流過液中分離蛋白質(zhì)的工具。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述裂解液包含離液鹽、非離子型去污劑和還原劑。
18.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述第一礦物支持體和所述第二礦物支持體各自為二氧化硅膜。
19.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述試劑盒還包含偶極非質(zhì)子溶劑，所述偶極非質(zhì)子 溶劑選自丙酮、四氫呋喃(THF)、甲乙酮、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于分離和/或純化至少兩種細(xì)胞組分的系統(tǒng)、方法和試劑盒，所述細(xì)胞組分選自基因組DNA、RNA和蛋白質(zhì)。所述方法包括首先裂解生物樣品，得到含所述細(xì)胞組分的水溶液；然后將所述水溶液在使基因組DNA結(jié)合的條件下上樣至第一礦物支持體；收集合有未結(jié)合的總RNA和蛋白質(zhì)的流過液。所述方法還包括將所述流過液在使RNA結(jié)合的條件下上樣至第二礦物支持體，收集含蛋白質(zhì)的流過液?？上疵摫唤Y(jié)合的基因組DNA和總RNA，而流過液中的蛋白質(zhì)可進(jìn)一步地被純化。此外，所分離的總RNA可被用于分離諸如微小RNA的小RNA。
文檔編號C12N15/10GK101878304SQ200880118888
公開日2010年11月3日 申請日期2008年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者M·S·布里格斯, R·E·布魯諾, R·杜利帕拉, Y·C·蔡, 蔣淼 申請人:通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生物科學(xué)公司