專利名稱：抗體恒定區(qū)修飾體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及物性(穩(wěn)定性、異質(zhì)性)、免疫原性(抗原性)、安全性和/或血漿中半 衰期得到改善的抗體恒定區(qū)和包含該恒定區(qū)的抗體。
背景技術(shù)：
抗體在血漿中(血中)的穩(wěn)定性高、副作用也少，因此作為藥品而受到關(guān)注。其中， 有多種IgG型抗體藥物已上市，目前還有多種抗體藥物正在開發(fā)中(非專利文獻(xiàn)1、非專利 文獻(xiàn)2)。目前上市的抗體藥物幾乎都是IgGl亞型抗體。IgGl型抗體可以與Fc y受體結(jié) 合，可以發(fā)揮ADCC活性，認(rèn)為IgGl型抗體可以作為抗癌抗體藥物。但是，在以中和抗原的 生物學(xué)作用為目的的抗體藥物中，與對Fc區(qū)的ADCC等效應(yīng)子功能重要的Fc y受體的結(jié)合 有可能引發(fā)不必要的副作用，所以希望排除(非專利文獻(xiàn)3)。并且，有報道稱由于Fcy受 體在抗原提示細(xì)胞中表達(dá)，所以與Fcy受體結(jié)合的分子容易被抗原提示，由于蛋白或肽與 IgGl的Fc部分結(jié)合從而免疫原性增強(qiáng)(有可能使其增強(qiáng))(非專利文獻(xiàn)4、專利文獻(xiàn)1)。 另外，認(rèn)為在TGN1412的I期臨床試驗中發(fā)現(xiàn)的重大副作用的原因之一是抗體的Fc部分與 Fey受體的相互作用(非專利文獻(xiàn)5)。如上所述，從副作用和免疫原性的角度考慮，認(rèn)為 在以中和抗原的生物學(xué)作用為目的的抗體藥物中不優(yōu)選與Fc y受體的結(jié)合。作為雖然無法完全消除與FcY受體的結(jié)合但可以使其降低的方法，有人考慮將 IgG抗體的亞型由IgGl變?yōu)镮gG2或IgG4的方法(非專利文獻(xiàn)6)。作為完全消除與Fcy 受體結(jié)合的方法，有人報道了向Fc區(qū)導(dǎo)入人工修飾的方法。例如，抗CD3抗體和抗CD4抗 體的效應(yīng)子功能會引起副作用。因此，在Fc區(qū)的Fcy受體結(jié)合部分導(dǎo)入有野生型序列中 不存在的氨基酸突變(非專利文獻(xiàn)3、7)的Fcy受體非結(jié)合型的抗CD3抗體和抗CD4抗體 的臨床試驗現(xiàn)在正在進(jìn)行(非專利文獻(xiàn)5、8)。另外，通過將IgGl的FcyR結(jié)合位點(EU編 號第233、234、235、236、327、330、331位)形成IgG2和IgG4的序列，可以制備Fc y受體非 結(jié)合型抗體(非專利文獻(xiàn)9、專利文獻(xiàn)2)。但這些分子中均出現(xiàn)能夠形成天然不存在的T 細(xì)胞表位肽的9 12個氨基酸的新的肽序列，認(rèn)為存在免疫原性的風(fēng)險。迄今為止，還沒 有上述課題已解決的Fcy受體非結(jié)合型抗體的報道。另一方面，在開發(fā)抗體作為藥品時，其蛋白質(zhì)的物性、其中尤其是均一性和穩(wěn)定性 極為重要。關(guān)于IgG2亞型，有人報道了來自鉸鏈區(qū)的二硫鍵的異質(zhì)性( 卜口 7工二 f 4 一 heterogeneity)(非專利文獻(xiàn)10、專利文獻(xiàn)3)。難以在維持來源于此的目標(biāo)物質(zhì)/相關(guān) 物質(zhì)的異質(zhì)性的批次間差異(製造間差)的同時作為藥品進(jìn)行大量制造。優(yōu)選作為藥物開 發(fā)的抗體分子盡可能是單一物質(zhì)。另外，IgG2和IgG4在酸性條件下的穩(wěn)定性不足。通常IgG型抗體在使用蛋白A 的純化工序和病毒滅活工序中被暴露在酸性條件下，所以必需注意IgG2和IgG4在同樣的 工序中的穩(wěn)定性，作為藥物開發(fā)的抗體分子優(yōu)選在酸性條件下也穩(wěn)定。在天然型的IgG2和 IgG4、以及來源于IgG2和IgG4的Fc y受體非結(jié)合型抗體(非專利文獻(xiàn)6、7、專利文獻(xiàn)2)中存在上述問題，在作為藥品開發(fā)時希望得到解決。有報道稱IgGl型抗體在酸性條件下比較穩(wěn)定、來自鉸鏈區(qū)的二硫鍵的異質(zhì)性也 少，但在制劑保存中，鉸鏈區(qū)的肽鍵在溶液中進(jìn)行非酶性分解，生成作為雜質(zhì)的Fab片段 (非專利文獻(xiàn)11)。在作為藥品開發(fā)時，希望解決生成雜質(zhì)的問題。作為抗體C末端序列的異質(zhì)性，有人報道了 由C末端氨基酸的賴氨酸殘基的缺 失和C末端的2個氨基酸甘氨酸、賴氨酸的缺失引起的C末端氨基的酰胺化(非專利文獻(xiàn) 12)，作為藥品開發(fā)時希望不存在上述異質(zhì)性。如上所述，以中和抗原為目的的抗體藥物的恒定區(qū)優(yōu)選上述所有問題均得到解決 的恒定區(qū)序列，但迄今為止還沒有關(guān)于滿足上述所有條件的恒定區(qū)的報道。關(guān)于抗體藥物的給藥方式，當(dāng)在慢性自身免疫疾病等疾病的情況下，優(yōu)選皮下給 藥制劑。為了能夠發(fā)揮持續(xù)的治療效果，認(rèn)為通過延長抗體的血漿中半衰期來減少給藥蛋 白量、賦予高濃度制劑盡可能高的穩(wěn)定性，從而可以以較長的給藥間隔進(jìn)行皮下給藥，可以 提供成本低且便利性高的抗體藥物。通常皮下給藥制劑必需是高濃度制劑，相對于此，當(dāng)為IgG型抗體制劑時，從穩(wěn)定 性等方面考慮，通常認(rèn)為100mg/mL左右的制劑是極限(非專利文獻(xiàn)13)，確保高濃度中的穩(wěn) 定性成為課題。但迄今為止還沒有通過向恒定區(qū)中導(dǎo)入氨基酸取代來改善高濃度中的IgG 的穩(wěn)定性的報道。作為延長抗體的血漿中半衰期的方法，有人報道了恒定區(qū)的氨基酸取代 (非專利文獻(xiàn)14、非專利文獻(xiàn)15)，但從免疫原性風(fēng)險的角度考慮，并不優(yōu)選向恒定區(qū)中導(dǎo) 入天然不存在的序列。如上所述，以中和抗原為目的的抗體藥物的恒定區(qū)優(yōu)選上述所有問題均已解決的 恒定區(qū)序列，但迄今為止未見滿足上述條件的恒定區(qū)的報道。因此，人們希望開發(fā)上述問題 得到改善的抗體恒定區(qū)。需要說明的是，與本發(fā)明有關(guān)的在先技術(shù)文獻(xiàn)如下。非專利文獻(xiàn) 1 :Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice MReichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23，1073-1078 (2005)非專禾丨J文獻(xiàn) 2 :Pavlou AK, Belsey MJ. , The therapeutic antibodiesmarket to 2008.，Eur J Pharm Biopharm. 2005Apr ；59 (3) :389_96.非專利文獻(xiàn)3 :Reddy MP, Kinney CA, Chaikin MA, Payne A, Fishman-Lobell J, Tsui P,Dal Monte PR,Doyle ML,Brigham-Burke MR,Anderson D,Reff M,Newman R,Hanna N,Sweet Rff,Truneh A. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modifiedIgG4 monoclonal antibody to human CD4. J Immunol. 2000Feb 15 ； 164 (4) 1925-33.非專利文獻(xiàn) 4 :Guyre PM, Graziano RF, Goldstein J, Wallace PK, Morganelli PM, Wardwell K, Howell AL. Increased potency ofFc-receptor-targeted antigens. Cancer Immunol Immunother. 1997Nov-Dec ；45 (3-4) 146-8.非專禾丨J 文獻(xiàn) 5 Strand V, Kimberly R, Isaacs JD. Biologic therapies inrheumatology lessons learned, future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007Jan ； 6(1) 75-92.
非專利文獻(xiàn) 6 :Gessner JE, Heiken H, Tamm A, Schmidt RE. The IgG Fcreceptor family. Ann Hematol. 1998Jun ；76 (6) :231_48·7 =Cole MS, Anasetti C, Tso JY. Human IgG2 variants ofchimeric anti_CD3 are nonmitogenic to T cells. J Immunol. 1997 Oct 1 ；159(7) :3613_21·非專利文獻(xiàn)8 :Chau LA, Tso JY, Melrose J, Madrenas J. HuM291 (Nuvion), a humanized Fc receptor-nonbinding antibody againstCD3, anergizes peripheral blood T cells as partial agonist of the T cellreceptor. Transplantation. 2001 Apr 15 ；71 (7) :941-50.非專禾O文獻(xiàn) 9 =Armour KL, Clark MR, Hadley AG, Williamson LM. ，Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I bindingand monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 1999 Aug ；29 (8) :2613_24·非專利文獻(xiàn)10 :Chu GC, Chelius D, Xiao G, Khor HK, Coulibaly S, Bondarenko PV.Accumulation of Succinimide in a RecombinantMonoclonal Antibody in Mildly Acidic Buffers Under ElevatedTemperatures. Pharm Res. 2007Mar 24 ；24 (6) : 1145-5611 :A. J. Cordoba, B. J. Shyong, D. Breen, R. J. Harris, Nonenzymatic hinge region fragmentation of antibodies in solution, J. Chromatogr. , B, Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 818 (2005) 115—121.非專利文獻(xiàn) 12 :Johnson ΚΑ,Paisley-Flango K,Tangarone BS,Porter TJ,Rouse JC. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry revealC-terminal amidation of an IgGl heavy chain. Anal Biochem. 2007 Jan 1；360(1) :75_83·非專利文獻(xiàn) 13 :Shire SJ, Shahrokh Ζ, Liu J. Challenges in thedevelopment of high protein concentration formulations. J Pharm Sci. 2004Jun ；93 (6) 1390-402.非專利文獻(xiàn)14 :Hinton PR,Xiong JM, Johlfs MG,Tang MT,Keller S,Tsurushita N. ,An engineered human IgGl antibody with longer serumhalf-life. ,J Immunol. 2006 Jan 1 ；176(1) :346_56·非專禾Ij文獻(xiàn) 15 =Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES. , Increasing the serum persistence of anIgG fragment by random mutagenesis. , Nat Biotechnol. 1997 Jul ；15(7) :637_40·專利文獻(xiàn)1 :US 20050261229A1專利文獻(xiàn)2 :W0 99/58572專利文獻(xiàn)3 :US 2006/0194280

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明鑒于上述狀況而進(jìn)行，其目的在于提供通過修飾抗體恒定區(qū)的氨基酸，使 物性(穩(wěn)定性和均一性)、免疫原性、安全性、以及藥物動力學(xué)得到改善(改善血漿中(血 中)滯留性)的抗體恒定區(qū)。解決課題的方法本發(fā)明人等為了通過修飾抗體恒定區(qū)的氨基酸序列來創(chuàng)制物性(穩(wěn)定性和均一
7性)、免疫原性、安全性、及藥物動力學(xué)得到改善的抗體恒定區(qū)而進(jìn)行深入研究。其結(jié)果，本 發(fā)明人等成功地改善了抗體恒定區(qū)在酸性條件下的穩(wěn)定性、來自鉸鏈區(qū)二硫鍵的異質(zhì)性、 來自H鏈C末端的異質(zhì)性、在高濃度制劑中的穩(wěn)定性，進(jìn)一步成功地發(fā)現(xiàn)了在將新的T細(xì)胞 表位肽的出現(xiàn)降至最小限度的同時，降低與Fc y受體結(jié)合的新的恒定區(qū)序列。本發(fā)明涉及抗體恒定區(qū)、均一性包含該抗體恒定區(qū)的抗體、含有該抗體的藥物組 合物以及它們的制造方法，所述恒定區(qū)通過修飾抗體的恒定區(qū)的氨基酸序列而具有更優(yōu)異 的安全性、免疫原性風(fēng)險、物性(穩(wěn)定性、均一性)，具有更優(yōu)異的藥物動力學(xué)。更具體而言， 本發(fā)明提供下述[1] [35]。[1]下述(a) (c)中任一項所述的人抗體恒定區(qū)；(a)人抗體恒定區(qū)，其特征在于在SEQ ID NO 1記載的氨基酸序列中，第329位 (EU 編號第 446 位、參照 Sequences of proteins of immunological interest (目標(biāo)免疫蛋 白序列)，NIH出版No. 91-3242)的Gly和第330位(EU編號第447位)的Lys均缺失。(b)人抗體恒定區(qū)，其特征在于在SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列中，第325位 (EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的Lys均缺失。(c)人抗體恒定區(qū)，其特征在于在SEQ ID NO 3記載的氨基酸序列中，第326位 (EU編號第446位)的Gly和第327位(EU編號第447位)的Lys均缺失。[2]IgG2恒定區(qū)，其中，在SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列中，第209位(EU編號 第330位)、第210位(EU編號第331位)和第218位(EU編號第339位)的氨基酸被取代 成其他氨基酸。[3]IgG2恒定區(qū)，其中，在SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列中，第276位(EU編號 第397位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。[4]IgG2恒定區(qū)，其中，在SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列中，第14位(EU編號第 131位)、第102位(EU編號第219位)和/或第16位(EU編號第133位)的氨基酸被取 代成其他氨基酸。[5] [4]所述的IgG2恒定區(qū)，其特征在于在SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列中， 第20位(EU編號第137位)和第21位(EU編號第138位)的氨基酸進(jìn)一步被取代成其他
氨基酸。[6]IgG2恒定區(qū)，其中，在SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列中，第147位(EU編號第 268位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg和/或第298位(EU編號第419位) 的Gin被取代成其他氨基酸。[7] IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ ID NO 2記載的氨 基酸序列中，第209位(EU編號第330位)、第210位(EU編號第331位)、第218位(EU編 號第339位)、第276位(EU編號第397位)、第14位(EU編號第131位)、第16位(EU編 號第133位)、第102位(EU編號第219位)、第20位(EU編號第137位)和第21位(EU 編號第138位)的氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。[8] IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在[7]所述的IgG2恒定區(qū) 中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的Lys 的氨基酸序列。[9] IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ ID NO 2記載的氨
8基酸序列中，第276位(EU編號第397位)、第14位(EU編號第131位)、第16位(EU編號 第133位)、第102位(EU編號第219位)、第20位(EU編號第137位)和第21位(EU編 號第138位)的氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。[10] IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在[9]所述的IgG2恒定 區(qū)中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。[11] IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ ID NO 2記載的氨 基酸序列中，第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的Arg、第 102位(EU編號第219位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第21位(EU編號第 138位)的Ser、第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg 和第298位(EU編號第419位)的Gln被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。[12]IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在[11]所述的IgG2恒定 區(qū)中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。[13] IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ ID NO 2記載的氨 基酸序列中，第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的Arg、第102 位(EU編號第219位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第21位(EU編號第138 位)的Ser、第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg、第 298位(EU編號第419位)的Glru以及第313位(EU編號第434位)的Asn被取代成其他 氨基酸的氨基酸序列。[14]IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在[13]所述的IgG2恒定 區(qū)中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。[15] IgG4恒定區(qū)，其特征在于在SEQ ID NO :3記載的氨基酸序列中，第289位 (EU編號第409位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。[16] IgG4恒定區(qū)，該IgG4恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ ID NO 3記載的氨 基酸序列中，第14位、第16位、第20位、第21位、第97位、第100位、第102位、第103位、 第 104 位、第 105 位(EU 編號第 131、133、137、138、214、217、219、220、221、222 位)、第 113 位、第114位、第115位(EU編號第233、234、235位)和第289位(EU編號409)的氨基酸 被取代成其他氨基酸且第116位(EU編號第236位)的氨基酸缺失的氨基酸序列。[17]IgG4恒定區(qū)，其中在[16]所述的IgG4恒定區(qū)中，進(jìn)一步缺失第326位(EU編 號第446位)的Gly和第327位(EU編號第447位)的Lys的氨基酸序列。[18] IgGl恒定區(qū)，該IgGl恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ ID NO=I記載的 IgGl恒定區(qū)中，第317位(EU編號O第434位)的Asn被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。[19] IgGl恒定區(qū)，該IgGl恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在[18]所述的IgGl恒定 區(qū)中，第329位(EU編號第446位)的Gly和第330位(EU編號第447位)的Lys缺失的 氨基酸序列。[20] IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ ID NO 2記載的氨 基酸序列中，第209位(EU編號第330位)的Ala、第210位(EU編號第331位)的Pro、第218位(EU編號第339位)的Thr、第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第 133位)的Arg、第102位(EU編號第219位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、 第21位(EU編號第138位)的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。[21]IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在[20]所述的IgG2恒定 區(qū)中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。[22]IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ ID NO :2記載的氨 基酸序列中，第14位(EU編號131)的Cys、第16位(EU編號133)的Arg、第102位(EU編 號219)的Cys、第20位(EU編號137)的Glu、第21位(EU編號138)的Ser被取代成其他
氨基酸的氨基酸序列。[23] IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在[22]所述的IgG2恒定 區(qū)中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。[24]人抗體恒定區(qū)，其具有SEQ ID NO 5中記載的氨基酸序列。[25]人抗體恒定區(qū)，其具有SEQ ID NO 7中記載的氨基酸序列。[26]人抗體恒定區(qū)，其具有SEQ ID NO 9中記載的氨基酸序列。[27]人抗體恒定區(qū)，其具有SEQ ID NO 35中記載的氨基酸序列。[28]人抗體恒定區(qū)，其具有SEQ ID NO 36中記載的氨基酸序列。[29]人抗體恒定區(qū)，其具有SEQ ID NO 37中記載的氨基酸序列。[30]人抗體恒定區(qū)，其具有SEQ ID NO 43中記載的氨基酸序列。[31]人抗體恒定區(qū)，其具有SEQ ID NO :57(M40 AGK)中記載的氨基酸序列。[32]人抗體恒定區(qū)，其具有SEQ ID NO :55(M86 AGK)中記載的氨基酸序列。[33]抗體，其具有[1] [32]中任一項所述的恒定區(qū)。[34]抗IL-6受體抗體，其具有[1] [32]中任一項所述的恒定區(qū)。以及[35]藥物組合物，其包含具有[1] [32]中任一項所述的恒定區(qū)的抗體。


圖1是顯示通過凝膠過濾層析分析經(jīng)鹽酸洗提法純化的WT-IgGl、WT_IgG2、 WT-IgG4、IgG2-M397V、IgG4-R409K的聚集物含量的結(jié)果的曲線圖。圖2是顯示W(wǎng)T-IgGl、WT-IgG2、WT_IgG4的陽離子交換層析(IEC)分析結(jié)果的圖。圖3是顯示W(wǎng)T_IgG2的鉸鏈區(qū)的推定二硫鍵構(gòu)象(結(jié)合樣式)的圖。圖4是顯示IgG2_SKSC的鉸鏈區(qū)的推定二硫鍵結(jié)合樣式的圖。圖5是顯示W(wǎng)T_IgG2和IgG2_SKSC的陽離子交換層析(IEC)分析結(jié)果的圖。圖6是顯示人源化PM-1抗體、H鏈C末端A K抗體、H鏈C末端A GK抗體的陽離 子交換層析(IEC)分析結(jié)果的圖。圖 7 是顯示 WT-IgGl、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14 AGK、WT-M17 AGK、WT-M11 AGK 與 FcyRI的結(jié)合量的比較的圖。圖 8 是顯示 WT-IgGl、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14 AGK、WT-M17 AGK、WT-M11 AGK 與 Fc y RIIa的結(jié)合量的比較的曲線圖。
圖 9 是顯示 WT-IgGl、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14 AGK、WT-M17 AGK、WT-M11 AGK 與 FcyRIIb的結(jié)合量的比較的曲線圖。圖 10 是顯示 WT-IgGl、WT-IgG2、WT_IgG4、WT-M14 AGK、WT-M17 AGK、WT-M11 AGK 與FcYRIIIa(Val)的結(jié)合量的比較的曲線圖。圖 11 是顯示 WT-IgGl、WT-M14 A GK、WT-M17 A GK、WT-M11 A GK 在高濃度穩(wěn)定性試 驗中聚集物增加量的曲線圖。圖 12 是顯示 WT-IgGl、WT-M14 A GK、WT-M17 A GK、WT-M11 A GK 在高濃度穩(wěn)定性試 驗中Fab片段增加量的曲線圖。圖13是顯示W(wǎng)T-IgG2、WT_M14 AGK、WT_M31 AGK的陽離子交換層析(IEC)分析結(jié) 果的圖。圖14是顯示將WT-IgGl和WT-M14對人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥后血漿 中濃度變化的曲線圖。圖15是顯示將WT-IgGl、WT-M44、WT-M58、WT-M73對人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行靜脈 內(nèi)給藥后血漿中濃度變化的曲線圖。圖16是通過陽離子交換層析評價抗IL-6受體抗體WT、抗IL-6受體抗體F2H/L39、 抗IL-31受體抗體H0L0、抗RANKL抗體DNS的恒定區(qū)對異質(zhì)性的影響的圖。圖17是通過陽離子交換層析評價抗IL-6受體抗體WT、抗IL-6受體抗體F2H/L39 的CH1結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸對異質(zhì)性的影響的圖。圖18是通過DSC評價抗IL-6受體抗體WT、抗IL-6受體抗體F2H/L39的CH1結(jié)構(gòu) 域的半胱氨酸對變性峰的影響的圖。圖19是顯示T0CILIZUMAB、對照和Fv5_M83在BaF/gpl30中的中和活性的曲線圖。圖 20 是顯示 TOCILIZUMAB、Fv3_M73 和 Fv4_M73 在 BaF/gpl30 中的中和活性的曲 線圖。圖21是顯示將TOCILIZUMAB、對照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83對食蟹猴進(jìn)行靜 脈內(nèi)給藥后血漿中濃度變化的曲線圖。圖22是顯示將TOCILIZUMAB、對照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83對食蟹猴進(jìn)行靜 脈內(nèi)給藥后CRP濃度變化的曲線圖。圖23是顯示將TOCILIZUMAB、對照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83對食蟹猴進(jìn)行靜 脈內(nèi)給藥后非結(jié)合型的食蟹猴可溶型IL-6受體濃度變化的曲線圖。圖24是顯示將WT-IgGl、WT_M14和WT-M58對人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥 后血漿中濃度變化的曲線圖。發(fā)明的實施方式本發(fā)明提供抗體恒定區(qū)、均一性包含該恒定區(qū)的抗體、包含該抗體的藥物組合物 以及它們的制造方法，所述恒定區(qū)通過修飾該抗體恒定區(qū)的氨基酸序列使物性(穩(wěn)定性和 均一性)、免疫原性、安全性及藥物動力學(xué)得到改善。在本發(fā)明中，抗體恒定區(qū)是指IgGl、IgG2、IgG4型的恒定區(qū)。抗體恒定區(qū)優(yōu)選為人 抗體恒定區(qū)。人IgGl恒定區(qū)、人IgG2恒定區(qū)和人IgG4恒定區(qū)的氨基酸序列是公知的(人 IgGl 恒定區(qū)SEQ ID NO :1、人 IgG2 恒定區(qū):SEQ ID NO :2、人 IgG4 恒定區(qū)SEQ ID NO :3)。 需要說明的是，本發(fā)明的氨基酸被取代的抗體恒定區(qū)只要包含本發(fā)明的氨基酸取代即可，還可以包含其他氨基酸取代及修飾。因此，在本發(fā)明中，對SEQ ID NO :2中記載的氨基酸序 列中已經(jīng)有1個或多個氨基酸被取代和/或修飾的IgG2恒定區(qū)進(jìn)行本發(fā)明的氨基酸取代 時、或者在進(jìn)行本發(fā)明的氨基酸取代后對1個或多個氨基酸進(jìn)行取代和/或修飾時，進(jìn)行本 發(fā)明的氨基酸取代的IgG2恒定區(qū)相當(dāng)于具有SEQ ID N0:2中記載的氨基酸序列的IgG2恒 定區(qū)。具有SEQ ID NO 1記載的氨基酸序列的IgGl恒定區(qū)、SEQ ID NO 3記載的IgG4恒 定區(qū)亦同。需要說明的是，人IgG4恒定區(qū)是導(dǎo)入了用于改善鉸鏈部分的穩(wěn)定性的修飾(Mol Immunol. 1993 Jan ；30(1) 105-8.)的序列。另外，EU編號第297位的糖鏈可以是任何糖 鏈構(gòu)造，糖鏈也可以不進(jìn)行結(jié)合(例如可以在大腸桿菌中生產(chǎn))。〈氨基酸修飾IgG2>本發(fā)明提供在酸性下的穩(wěn)定性得到改善的IgG2恒定區(qū)。更具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)，該 IgG2恒定區(qū)中第276位(EU編號第397位)的Met被取代成其他氨基酸。對取代后的氨基 酸沒有特別限定，但優(yōu)選取代成Val。通過將SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列中第276位 (EU編號第397位)的Met取代成其他氨基酸，可以提高抗體在酸性條件下的穩(wěn)定性。通過本發(fā)明提供的、在酸性下的穩(wěn)定性得到改善的IgG2恒定區(qū)可至少進(jìn)行上述 氨基酸取代，也可以同時進(jìn)行其他氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等。本發(fā)明還提供鉸鏈區(qū)的異質(zhì)性得到改善的IgG2恒定區(qū)。更具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)，該 IgG2恒定區(qū)中第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的Arg和/ 或第102位(EU編號第219位)的Cys被取代成其他氨基酸。對取代后的氨基酸沒有特別 限定，但優(yōu)選第14位(EU編號第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU編號第133位) 的Arg取代成Lys、第102位(EU編號第219位)的Cys取代成Ser (IgG2_SKSC)。通過進(jìn)行上述取代，可以降低來自IgG2鉸鏈區(qū)的異質(zhì)性。本發(fā)明的氨基酸被取代 的IgG2恒定區(qū)包括上述3種氨基酸取代中至少1種氨基酸被取代的IgG2恒定區(qū)，優(yōu)選第 14位的Cys和第102位的Cys被取代成其他氨基酸、或者上述3種氨基酸均被取代。通過本發(fā)明提供的、異質(zhì)性得到改善的IgG2恒定區(qū)可至少進(jìn)行上述氨基酸取代， 但也可以同時進(jìn)行其他氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等。例如，在具有SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)中，當(dāng)向第14位的 Cys和第16位的Arg中導(dǎo)入突變時，出現(xiàn)能夠形成天然不存在的T細(xì)胞表位肽的9 12個 氨基酸的新的肽序列，有可能產(chǎn)生免疫原性風(fēng)險。因此，伴隨著上述氨基酸取代，進(jìn)一步將 第20位(EU編號第137位)的Glu和第21位(EU編號第138位)的Ser取代成其他氨基 酸，從而可以避免天然不存在的T細(xì)胞表位肽的表達(dá)。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但 優(yōu)選第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly。本發(fā)明還提供與Fc γ受體的結(jié)合活性降低的IgG2恒定區(qū)。更具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)，該 IgG2恒定區(qū)中第209位(EU330)的Ala取代成Ser、第210位(EU331)的Pro取代成Ser 和/或第218位(EU339)的Thr取代成Ala。已經(jīng)有報道稱通過取代第209位(EU330)的 Ala、第 210 位(EU331)的Pro，可以降低 IgG2 與 Fc γ 受體的結(jié)合(Eur J Immunol. 1999Aug ； 29⑶2613-24.)。通過該修飾會出現(xiàn)能夠形成T細(xì)胞表位的不來自于人的肽，所以從免疫原性風(fēng)險的角度考慮并不優(yōu)選。于是，通過同時將第218位(EU339)的Thr取代成Ala，可 以在只使用來自人的肽作為能夠形成T細(xì)胞表位的9 12個氨基酸的情況下降低IgG2與 Fey受體的結(jié)合。本發(fā)明的氨基酸被取代的IgG2恒定區(qū)只要在上述3處氨基酸取代中的至少1處 氨基酸被取代即可，但優(yōu)選上述3處氨基酸均被取代。因此，作為本發(fā)明的氨基酸被取代的 IgG2恒定區(qū)的優(yōu)選方式，可列舉在具有SEQ ID N0:2記載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)中， 第209位(EU330)的Ala被取代成Ser、第210位(EU331)的Pro被取代成Ser且第218位 (EU339)的Thr被取代成Ala。通過本發(fā)明提供的、與Fc y受體的結(jié)合活性降低的IgG2恒定區(qū)可至少進(jìn)行上述 氨基酸取代，也可以同時進(jìn)行其他氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等。本發(fā)明還提供C末端的異質(zhì)性得到改善的IgG2恒定區(qū)。更具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)，該 IgG2恒定區(qū)中第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的Lys 均缺失。通過缺失這兩個氨基酸，首次可以降低來自抗體H鏈C末端的異質(zhì)性。通過本發(fā)明提供的、C末端的異質(zhì)性得到改善的IgG2恒定區(qū)可至少進(jìn)行上述氨基 酸的缺失，也可以同時進(jìn)行其他氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等。本發(fā)明還提供藥物動力學(xué)提高的IgG2恒定區(qū)。更具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)，該 IgG2恒定區(qū)中第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg、 第298位(EU編號第419位)的Gin被取代成其他氨基酸。通過上述氨基酸取代，可以使 抗體的藥物動力學(xué)提高。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第147位(EU編號第268 位)的His取代成Gin、第234位(EU編號第355位)的Arg取代成Gin、第298位(EU編 號第419位)的Gin取代成Glu。本發(fā)明的氨基酸被取代的IgG2恒定區(qū)包括上述3種氨 基酸取代中至少1種氨基酸被取代的IgG2恒定區(qū)，但優(yōu)選上述3種氨基酸均被取代。并且，在本發(fā)明中，作為在酸性下的穩(wěn)定性得到改善、鉸鏈區(qū)的異質(zhì)性得到改善和 /或與Fc Y受體的結(jié)合活性降低的IgG2的優(yōu)選方式，可以列舉下述IgG2?？贵w，其中在具有包含SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列的恒定區(qū)的IgG2中，第209 位的Ala、第210位的Pro、第218位的Thr、第276位的Met、第14位的Cys、第16位的Arg、 第102位的Cys、第20位的Glu、第21位的Ser被取代成其他氨基酸。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第209位(EU編號330)的Ala取代成 Ser、第210位(EU編號331)的Pro取代成Ser、第218位(EU編號339)的Thr取代成Ala、 第276位(EU編號397)的Met取代成Val、第14位(EU編號131)的Cys取代成Ser、第16 位(EU編號133)的Arg取代成Lys、第102位(EU編號219)的Cys取代成Ser、第20位 (EU編號137)的Glu取代成Gly、第21位(EU編號138)的Ser取代成Gly。這樣的IgG2恒定區(qū)的實例可列舉具有SEQ ID NO :4(M14)的氨基酸序列的IgG2 恒定區(qū)。本發(fā)明的IgG2恒定區(qū)的其他優(yōu)選方式可列舉在上述IgG2恒定區(qū)中，進(jìn)一步缺失 第325位的Gly和第326位的Lys以降低C末端的異質(zhì)性的IgG2恒定區(qū)。這樣的抗體的 實例可列舉具有包含SEQ IDN0 :5(M14AGK)的氨基酸序列的恒定區(qū)的IgG2。
并且，本發(fā)明的鉸鏈區(qū)的異質(zhì)性得到改善和/或與Fc Y受體的結(jié)合活性降低的 IgG2的優(yōu)選方式可列舉下述IgG2?？贵w，其中在具有包含SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列的恒定區(qū)的IgG2中，第209 位的Ala、第210位的Pro、第218位的Thr、第14位的Cys、第16位的Arg、第102位的Cys、 第20位的Glu、第21位的Ser被取代成其他氨基酸。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第209位(EU編號330)的Ala取代成 Ser、第210位(EU編號331)的Pro取代成Ser、第218位(EU編號339)的Thr取代成Ala、 第14位(EU編號131)的Cys取代成Ser、第16位(EU編號133)的Arg取代成Lys、第102 位(EU編號219)的Cys取代成Ser、第20位(EU編號137)的Glu取代成Gly、第21位(EU 編號138)的Ser取代成Gly。這樣的IgG2恒定區(qū)的實例可列舉具有SEQ ID NO :54(M86)的氨基酸序列的IgG2 恒定區(qū)。并且，本發(fā)明的IgG2恒定區(qū)的其他優(yōu)選方式可列舉在上述IgG2恒定區(qū)中，進(jìn)一 步缺失第325位的Gly和第326位的Lys以降低C末端的異質(zhì)性的IgG2恒定區(qū)。這樣的 抗體的實例可列舉具有包含SEQID NO :55(M86AGK)的氨基酸序列的恒定區(qū)的IgG2。并且，本發(fā)明的在酸性下的穩(wěn)定性得到改善、鉸鏈區(qū)的異質(zhì)性得到改善的IgG2恒 定區(qū)的優(yōu)選方式可列舉下述IgG2恒定區(qū)。IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列，其中第276位 的Met、第14位的Cys、第16位的Arg、第102位的Cys、第20位的Glu、第21位的Ser被取 代成其他氨基酸。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第276位(EU編號397)的Met取代成 Val、第14位(EU編號131)的Cys取代成Ser、第16位(EU編號133)的Arg取代成Lys、 第102位(EU編號219)的Cys取代成Ser、第20位(EU編號137)的Glu取代成Gly、第21 位(EU編號138)的Ser取代成Gly0這樣的IgG2恒定區(qū)的實例可列舉具有SEQ ID NO 6 (M31)的氨基酸序列的IgG2 恒定區(qū)。本發(fā)明的IgG2恒定區(qū)的其他優(yōu)選方式可列舉在上述IgG2恒定區(qū)中，進(jìn)一步缺失 第325位的Gly和第326位的Lys的IgG2恒定區(qū)。這樣的抗體的實例可列舉具有SEQ ID NO :7(M31AGK)的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)。并且，本發(fā)明的鉸鏈區(qū)異質(zhì)性得到改善的IgG2恒定區(qū)的優(yōu)選方式可列舉下述 IgG2恒定區(qū)。IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列，其中第14位 的Cys、第16位的Arg、第102位的Cys、第20位的Glu、第21位的Ser被取代成其他氨基酸。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第14位(EU編號131)的Cys取代成Ser、 第16位(EU編號133)的Arg取代成Lys、第102位(EU編號219)的Cys取代成Ser、第20 位(EU編號137)的Glu取代成Gly、第21位(EU編號138)的Ser取代成Gly。這樣的IgG2恒定區(qū)的實例可列舉具有SEQ ID NO 56 (M40)的氨基酸序列的IgG2 恒定區(qū)。
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本發(fā)明的IgG2恒定區(qū)的其他優(yōu)選方式可列舉在上述IgG2恒定區(qū)中，進(jìn)一步缺失 第325位的Gly和第326位的Lys的IgG2恒定區(qū)。這樣的抗體的實例可列舉具有SEQ ID NO 57 (M40 A GK)的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)。本發(fā)明提供IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ ID NO 2 記載的氨基酸序列中，第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的 Arg、第102位(EU編號第219位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第21位(EU 編號第138位)的Ser、第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位) 的Arg和第298位(EU編號第419位)的Gin被取代成其他氨基酸、且第325位(EU編號 第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的Lys缺失的氨基酸序列。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg 取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成 Gly、第147位的His取代成Gin、第234位的Arg取代成Gin、第298位的Gin取代成Glu。具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO 35記載的氨基酸序列的恒定區(qū)(M58)。本發(fā)明提供IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ ID NO 2 記載的氨基酸序列中，第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的 Arg、第102位(EU編號第219位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第21位(EU 編號第138位)的Ser、第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位) 的Arg、第298位(EU編號第419位)的Gin和第313位(EU編號第434位)的Asn被取代 成其他氨基酸、且第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys缺失的氨基酸序列。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg 取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成 Gly、第147位的His取代成Gin、第234位的Arg取代成Gin、第298位的Gin取代成Glu、 第313位的Asn取代成Ala。具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO 37記載的氨基酸序列的恒定區(qū)(M73)。上述抗體恒定區(qū)具有與Fc y受體的結(jié)合活性降低、免疫原性風(fēng)險降低、酸性條件 下的穩(wěn)定性提高、異質(zhì)性降低、藥物動力學(xué)提高和/或與IgGl恒定區(qū)相比在制劑中的穩(wěn)定 性高的性質(zhì)，是最優(yōu)化的抗體恒定區(qū)?！窗被嵝揎桰gG4>本發(fā)明提供在酸性下的穩(wěn)定性得到改善的IgG4恒定區(qū)。更具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID N0:3記載的氨基酸序列的IgG4恒定區(qū)，該 IgG4恒定區(qū)中第289位(EU編號第409位)的Arg被取代成其他氨基酸。對取代后的氨基 酸沒有特別限定，但優(yōu)選取代成Lys。通過將SEQ ID NO :3記載的氨基酸序列中第277位 (EU編號第409位)的Arg取代成其他氨基酸，可以提高抗體在酸性條件下的穩(wěn)定性。通過本發(fā)明提供的、在酸性下的穩(wěn)定性得到改善的IgG4恒定區(qū)，對其至少可以進(jìn) 行上述氨基酸取代，也可以同時進(jìn)行其他氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等。本發(fā)明還提供C末端的異質(zhì)性得到改善的IgG4恒定區(qū)。更具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID N0:3記載的氨基酸序列的IgG4恒定區(qū)，該 IgG4恒定區(qū)中第326位(EU編號第446位)的Gly和第327位(EU編號第447位)的Lys均缺失。通過使這兩個氨基酸缺失，首次可以降低來自抗體H鏈C末端的異質(zhì)性。通過本發(fā)明提供的、C末端的異質(zhì)性得到改善的IgG4恒定區(qū)可至少進(jìn)行上述氨基 酸缺失，也可以同時進(jìn)行其他氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等。并且，作為本發(fā)明的在酸性下的穩(wěn)定性得到改善、異質(zhì)性得到改善和/或與Fc Y 受體的結(jié)合活性降低的IgG4的優(yōu)選方式，可以列舉下述包含恒定區(qū)的IgG4。IgG4恒定區(qū)，該IgG4恒定區(qū)具有SEQ ID NO 3記載的氨基酸序列，其中第14位 的Cys、第16位的Arg、第20位的Glu、第21位的Ser、第97位的Arg、第100位的Ser、第 102位的Tyr、第103位的Gly、第104位的Pro、第105位的Pro、第113位的Glu、第114位 的Phe、第115位的Leu、以及第289位的Arg被取代成其他氨基酸且第116位的Gly缺失。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第14位(EU編號131)的Cys取代成Ser、 第16位(EU編號133)的Arg取代成Lys、第20位(EU編號137)的Glu取代成Gly、第21 位(EU編號138)的Ser取代成Gly、第97位(EU編號214)的Arg取代成Thr、第100位 (EU編號217)的Ser取代成Arg、第102位(EU編號219)的Tyr取代成Ser、第103位(EU 編號220)的Gly取代成Cys、第104位(EU編號221)的Pro取代成Val、第105位(EU編 號222)的Pro取代成Glu、第113位(EU編號233)的Glu取代成Pro、第114位(EU編號 234)的Phe取代成Val、第115位(EU編號235)的Leu取代成Ala、第289位(EU編號409) 的Arg取代成Lys。這樣的IgG4恒定區(qū)的實例可列舉具有SEQ ID NO 8 (Mil)的氨基酸序列的IgG4 恒定區(qū)。本發(fā)明的IgG4恒定區(qū)的其他優(yōu)選方式可列舉在上述IgG4恒定區(qū)中進(jìn)一步缺失 第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的Lys的IgG4恒定 區(qū)。這樣的抗體的實例可列舉具有SEQ ID NO 9 (Mil AGK)的氨基酸序列的IgG4恒定區(qū)?！窗被嵝揎桰gGl>本發(fā)明提供C末端的異質(zhì)性得到改善的IgGl恒定區(qū)。更具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID N0:1記載的氨基酸序列的IgG4恒定區(qū)，該 IgG4恒定區(qū)中第329位(EU編號第446位)的Gly和第330位(EU編號第447位)的Lys 缺失。通過使這兩個氨基酸均缺失，首次可以降低來自抗體H鏈C末端的異質(zhì)性。本發(fā)明還提供藥物動力學(xué)有所提高的IgGl恒定區(qū)。更具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO 1記載的氨基酸序列的IgGl恒定區(qū)，該 IgG4恒定區(qū)中第317位(EU編號第434位)的Asn被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。對 取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選取代成Ala。本發(fā)明還提供從SEQ ID NO :36記載的氨基酸序列中缺失第329位的Gly和第330 位的Lys的恒定區(qū)。更具體而言，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO :43 (M83)記載的氨基酸序列 的恒定區(qū)(M83)。通過本發(fā)明提供的、C末端的異質(zhì)性得到改善的IgGl恒定區(qū)可至少進(jìn)行上述氨基 酸缺失，也可以同時進(jìn)行其他氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等。本發(fā)明還提供抗體，該抗體包括上述任意抗體恒定區(qū)。本發(fā)明的抗體只要具有上 述抗體恒定區(qū)即可，對抗原種類、抗體的來源等沒有限定，可以是任何抗體。本發(fā)明的抗體還包括包含上述任意氨基酸取代的抗體修飾物。對抗體的來源沒有特別限定，可列舉人抗體、小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體等。本發(fā)明的抗體還可以是嵌合抗 體、人源化抗體、完全人源化抗體等。作為本發(fā)明抗體的優(yōu)選方式，可以列舉人源化抗體。另外，上述抗體恒定區(qū)和/或包含上述抗體恒定區(qū)的抗體分子還可以與抗體樣結(jié) 合分子(支架分子scaffold分子)、生理活性肽、結(jié)合肽等以Fc融合分子的形式結(jié)合。只要是包含上述任意恒定區(qū)的抗體，其修飾物也包括在本發(fā)明的抗體中。作為抗體修飾物的實例，例如可列舉與聚乙二醇(PEG)或細(xì)胞毒性物質(zhì)等各種 分子結(jié)合的抗體。這樣的抗體修飾物可以通過對本發(fā)明的抗體進(jìn)行化學(xué)修飾而得到。抗體 的修飾方法在該領(lǐng)域已經(jīng)確立。并且，本發(fā)明的抗體可以是雙特異性抗體(bispecific antibody) 0雙特異性抗 體是指在同一抗體分子內(nèi)具有識別不同表位的可變區(qū)的抗體，該表位可以存在于不同分子 中，也可以存在于同一分子中。上述抗體恒定區(qū)可以用作抗任意抗原的抗體的恒定區(qū)，對抗原沒有特別限定。本發(fā)明的抗體可以如下得到。在取得本發(fā)明的抗體的一個方式中，首先，在抗 體恒定區(qū)中，將1個或多個氨基酸殘基取代成其他目標(biāo)氨基酸、或使其缺失。作為將1 個或多個氨基酸殘基取代成其他目標(biāo)氨基酸的方法，例如可列舉位點特異性誘變法 (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y,禾口 Nakagawa, M. (1995) Anoligodeoxyribo nucleotide-directed dual amber method for site-directedmutagenesis (寡脫氧核糖 核苷酸定向雙琥珀法位點定向誘變).Genel52，271-275、Zoller，MJ，和Smith, M. (1983)01 igonucleotide-directedmutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors(DNA 片段克隆到M13載體的寡聚核苷酸定向誘變).Methods Enzymol. 100，468-500、Kramer, ff, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pfluggelder, M,禾口 Fritz, HJ(1984)The gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed mutation construction(帶 缺 口的雙鏈體DNA接近寡聚核苷酸定向突變結(jié)構(gòu)).Nucleic Acids Res. 12，9441-9456、 Kramer ff,禾口 Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction ofmutations via gapped duplex DNA Methods (經(jīng)由帶缺口的雙鏈體DNA法突變的寡聚核苷酸定向 結(jié)構(gòu)) Enzymol. 154,350-367、Kunkel, TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection (無表型篩選的迅速及高效的位點特異性誘 變法).Proc Natl Acad Sci U S A. 82，488-492)。利用上述方法可以將抗體恒定區(qū)所期望 的氨基酸取代成其他目標(biāo)氨基酸。作為用于取得抗體的另一方式，首先，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的方法得到與 目標(biāo)抗原結(jié)合的抗體。所取得的抗體為非人動物抗體時，還可以將其人源化?？贵w的結(jié)合 活性可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行測定。之后，將抗體恒定區(qū)中的1個或多 個氨基酸殘基取代成其他目標(biāo)氨基酸、或使其缺失。更具體而言，本發(fā)明涉及抗體的制造方法，該制造方法包括下述工序(a)和(b)。(a)使編碼H鏈的DNA和編碼L鏈的DNA表達(dá)的工序，所述H鏈的恒定區(qū)中1個或 多個氨基酸殘基被取代成其他目標(biāo)氨基酸或缺失；(b)回收工序(a)的表達(dá)產(chǎn)物的工序。在本發(fā)明的制造方法中，首先，使編碼抗體H鏈的DNA和編碼抗體L鏈的DNA表達(dá)， 所述H鏈的恒定區(qū)中1個或多個氨基酸殘基被取代成其他目標(biāo)氨基酸或缺失。編碼恒定區(qū)中的1個或多個氨基酸殘基被取代成其他目標(biāo)氨基酸或缺失的H鏈的DNA可如下得到取 得編碼野生型H鏈的DNA的恒定區(qū)部分，之后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)娜〈乖摵愣▍^(qū)中編碼特定氨基 酸的密碼子編碼其他目標(biāo)氨基酸，即可得到。此外，通過預(yù)先設(shè)計編碼蛋白的DNA，之后化學(xué)合成該DNA，也可以得到編碼恒定 區(qū)中的1個或多個氨基酸殘基被取代成其他目標(biāo)氨基酸或缺失的H鏈的DNA，所述蛋白的野 生型H鏈的恒定區(qū)中1個或多個氨基酸殘基被取代成其他目標(biāo)氨基酸或缺失。氨基酸取代的種類并不限于此，還可列舉本說明書中記載的取代。另外，編碼H鏈的DNA可以分成部分DNA來制造，所述H鏈恒定區(qū)中的1個或多個 氨基酸殘基被取代成其他目標(biāo)氨基酸或缺失。作為部分DNA的組合，例如可列舉編碼可變 區(qū)的DNA與編碼恒定區(qū)的DNA、或者編碼Fab區(qū)的DNA與編碼Fc區(qū)的DNA等，但并不限于這 些組合。編碼L鏈的DNA也同樣可以分成部分DNA來制造。作為使上述DNA表達(dá)的方法，可列舉下述方法。例如，將編碼H鏈可變區(qū)的DNA與 編碼H鏈恒定區(qū)的DNA同時整合到表達(dá)載體中，構(gòu)建H鏈表達(dá)載體。同樣，將編碼L鏈可 變區(qū)的DNA與編碼L鏈恒定區(qū)的DNA同時整合到表達(dá)載體中，構(gòu)建L鏈表達(dá)載體。這些H 鏈和L鏈的基因也可以整合到單一載體中。作為表達(dá)載體，例如可以使用SV40病毒載體 (SV40virus-based vectors)、EB 病毒載體(EBvirus—based vectors)禾口 BPV (乳頭瘤病毒) 載體(BPV(papillomavirus)-based vectors)等，但并不限于這些。利用按照上述方法制備的抗體表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。作為宿主細(xì)胞，除 CH0細(xì)胞(中國倉鼠卵巢)等上述細(xì)胞外，還可使用大腸桿菌、酵母或枯草桿菌等微生 物或動植物個體(Nature Biotechnology 25，563-565 (2007)、Nature Biotechnology 16,773-777 (1998)、Biochemicaland Biophysical Research Communications 255, 444-450(1999)、NatureBiotechnology 23，1159—1169 (2005)、Journal of Virology 75， 2803-2809 (2001)、Biochemical and Biophysical Research Communications 308, 94-100(2003))。進(jìn)行轉(zhuǎn)化時優(yōu)選采用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(R.W.Malone等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86,6077(1989) ；P. L. Feigner 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,7413(1987))、 電穿孔法、磷酸鈣法(F. L. Graham & A. J. van der Eb, Virology 52,456-467(1973))、 DEAE-葡聚糖法等。制造抗體時，接下來，回收工序(a)中得到的表達(dá)產(chǎn)物。表達(dá)產(chǎn)物的回收例如可以 通過在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體后，從轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞內(nèi)或培養(yǎng)液中分離表達(dá)產(chǎn)物來進(jìn)行。在抗體的分離、 純化中可以適當(dāng)組合離心、硫酸銨分級分離、鹽析、超濾、lq、FcRn、蛋白A、蛋白G柱、親和色 譜、離子交換色譜、凝膠過濾層析等方法來進(jìn)行。<提高IgG2恒定區(qū)在酸性條件下的穩(wěn)定性的方法>本發(fā)明還涉及提高抗體在酸性條件下的穩(wěn)定性的方法，該方法包括將SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列(IgG2)中第276位(EU編號第397位)的Met取代成其他氨基酸 的工序。本發(fā)明的提高抗體在酸性條件下的穩(wěn)定性的方法只要包括將SEQ ID N0:2記載的 氨基酸序列(IgG2)中第276位(EU編號第397位)的Met取代成其他氨基酸的工序即可， 還可以包括其他氨基酸取代。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選取代成Val。對氨基 酸取代的方法沒有特別限定，例如可以按照上述位點特異性誘變法或?qū)嵤├杏涊d的方法 進(jìn)行。
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<改善來自IgG2恒定區(qū)鉸鏈部分的異質(zhì)性的方法> 本發(fā)明還涉及改善抗體異質(zhì)性的方法，該方法包括將SEQ IDNO 2記載的氨基酸 序列(IgG2)中第14位(EU編號第131位)的Cys取代成其他氨基酸的工序、將第16位 (EU編號第133位)的Arg取代成其他氨基酸的工序和/或?qū)⒌?02位(EU編號第219位) 的Cys取代成其他氨基酸的工序。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第14位的Cys 取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser。本發(fā)明的改善抗體異 質(zhì)性的方法只要包括對SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列(IgG2)中第14位(EU編號第131 位)的Cys進(jìn)行取代的工序、對16位(EU編號第133位)的Arg進(jìn)行取代的工序和/或?qū)?第102位(EU編號第219位)的Cys進(jìn)行取代的工序即可，還可以包括其他氨基酸取代。對 氨基酸取代的方法沒有特別限定，例如可以按照上述位點特異性誘變法或?qū)嵤├杏涊d的 方法進(jìn)行。被取代的氨基酸可以是上述3個氨基酸均被取代，也可以是1個或2個(例如 第14位和第102位等)氨基酸被取代?！唇档蛠碜訧gG2恒定區(qū)的C末端氨基酸缺失的異質(zhì)性的方法〉本發(fā)明還涉及改善抗體異質(zhì)性的方法，該方法包括使具有SEQID NO 2記載的氨 基酸序列的IgG2恒定區(qū)中第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447 位)的Lys缺失的工序。本發(fā)明的改善抗體異質(zhì)性的方法只要包括使具有SEQ ID N0:2記 載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)中第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編 號第447位)的Lys缺失的工序即可，還可以包括其他氨基酸取代。對氨基酸取代的方法 沒有特別限定，例如可以按照上述位點特異性誘變法或?qū)嵤├杏涊d的方法進(jìn)行。<通過取代IgG2恒定區(qū)的氨基酸來提高藥物動力學(xué)的方法>本發(fā)明還涉及提高抗體藥物動力學(xué)的方法，該方法包括將具有SEQ ID NO :2記 載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)中第147位(EU268)的His、第234位(EU355)的Arg和/ 或第298位(EU419)的Gln取代成其他氨基酸的工序。本發(fā)明的提高藥物動力學(xué)的方法只 要包括上述工序即可，還可以包括其他氨基酸取代。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但 優(yōu)選第147位(EU268)的His取代成Gin、第234位(EU355)的Arg取代成Gin、第298位 (EU419)的 Gln 取代成 Glu。本發(fā)明還涉及提高抗體藥物動力學(xué)的方法，該方法包括將具有SEQ ID NO 20或 SEQ ID NO :35(M58)的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)中第313位(EU434)的Asn取代成其他 氨基酸的工序。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選取代成Ala。本發(fā)明的提高藥物動 力學(xué)的方法只要包括上述工序即可，還可以包括其他氨基酸取代。<通過取代IgGl恒定區(qū)的氨基酸來提高藥物動力學(xué)的方法>本發(fā)明還涉及提高抗體藥物動力學(xué)的方法，該方法包括將具有SEQ ID NO 1記載 的氨基酸序列的IgGl恒定區(qū)中第317位(EU434)的Asn取代成其他氨基酸的工序。對取 代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選取代成Ala。本發(fā)明的提高藥物動力學(xué)的方法只要包括 上述工序即可，還可以包括其他氨基酸取代。本發(fā)明還涉及提高抗體的藥物動力學(xué)、降低來自C末端氨基酸缺失的異質(zhì)性的方 法，該方法包括將具有SEQ ID NO :1記載的氨基酸序列的IgGl恒定區(qū)中第317位(EU434) 的Asn取代成其他氨基酸的工序、以及使第329位(EU446)的Gly和第330位(EU447)的 Lys缺失的工序。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選取代成Ala。本發(fā)明的提高藥物動力學(xué)的方法只要包括上述工序即可，還可以包括其他氨基酸取代。<在維持IgG2恒定區(qū)的人序列不變的情況下降低與Fc γ R結(jié)合的方法>本發(fā)明還涉及降低抗體與Fc γ R結(jié)合的方法，該方法包括將具有SEQ ID NO 2 記載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)中第209位(EU330)的Ala取代成Ser的工序、將第210 位(EU331)的Pro取代成Ser的工序、以及將第218位(EU339)的Thr取代成Ala的工序。 本發(fā)明的降低抗體與FcyR結(jié)合的方法只要包括將具有SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列的 IgG2恒定區(qū)中第209位(EU330)的Ala取代成Ser的工序、將第210位(EU331)的Pro取 代成Ser的工序、以及將第218位(EU339)的Thr取代成Ala的工序即可，還可以包括其他 氨基酸取代。對氨基酸取代的方法沒有特別限定，例如可以按照上述位點特異性誘變法或 實施例中記載的方法進(jìn)行。本發(fā)明還涉及降低來自IgG2鉸鏈部分的異質(zhì)性的方法、提高在酸性條件下 的穩(wěn)定性的方法、降低來自C末端異質(zhì)性的方法和/或降低抗體與Fc γ R結(jié)合的方法 (M14 Δ GK)，上述方法均包括對具有SEQ IDNO :2記載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)進(jìn)行下述
工序(a)將SEQ ID NO 2的第209位(EU編號第330位)的Ala取代成其他氨基酸的
工序；(b)將SEQ ID NO 2的第210位(EU編號第331位)的Pro取代成其他氨基酸的
工序；(c)將SEQ ID NO 2的第218位(EU編號第339位)的Thr取代成其他氨基酸的
工序；(d)將SEQ ID NO 2的第276位(EU編號第397位)的Met取代成其他氨基酸的
工序；(e)將SEQ ID NO 2的第14位(EU編號第131位)的Cys取代成其他氨基酸的
工序；(f)將SEQ ID NO 2的第16位(EU編號第133位)的Arg取代成其他氨基酸的
工序；(g)將SEQ ID NO 2的第102位(EU編號第219位)的Cys取代成其他氨基酸的
工序；(h)將SEQ ID NO 2的第20位(EU編號第137位)的Glu取代成其他氨基酸的
工序；⑴將SEQ ID NO 2的第21位(EU編號第138位)的Ser取代成其他氨基酸的 工序；以及(j)使SEQ ID NO 2的第325位的Gly和第326位的Lys (分別為EU編號第446 位和第447位)缺失的工序。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第209位(EU編號330)的Ala取代成 Ser、第210位(EU編號331)的Pro取代成Ser、第218位(EU編號339)的Thr取代成Ala、 第276位(EU編號397)的Met取代成Val、第14位(EU編號131)的Cys取代成Ser、第16 位(EU編號133)的Arg取代成Lys、第102位(EU編號219)的Cys取代成Ser、第20位 (EU編號137)的Glu取代成Gly、第21位(EU編號138)的Ser取代成Gly。
本發(fā)明還涉及降低來自IgG2鉸鏈部分的異質(zhì)性的方法、降低來自C末端的異質(zhì)性 的方法和/或降低抗體與Fc YR結(jié)合的方法(M86 AGK)，上述方法均包括對具有SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)進(jìn)行下述工序(a)將SEQ ID NO 2的第209位(EU編號第330位)的Ala取代成其他氨基酸的
工序；(b)將SEQ ID NO 2的第210位(EU編號第331位)的Pro取代成其他氨基酸的
工序；(c)將SEQ ID NO 2的第218位(EU編號第339位)的Thr取代成其他氨基酸的
工序；(d)將SEQ ID NO 2的第14位(EU編號第131位)的Cys取代成其他氨基酸的
工序；(e)將SEQ ID NO 2的第16位(EU編號第133位)的Arg取代成其他氨基酸的
工序；(f)將SEQ ID NO 2的第102位(EU編號第219位)的Cys取代成其他氨基酸的
工序；(g)將SEQ ID N0:2的第20位(EU編號第137位)的Glu取代成其他氨基酸的
工序；(h)將SEQ ID N0:2的第21位(EU編號第138位)的Ser取代成其他氨基酸的 工序；以及(i)使SEQ ID NO 2的第325位的Gly和第326位的Lys (分別為EU編號第446 位和第447位)缺失的工序。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第209位(EU編號330)的Ala取代成 Ser、第210位(EU編號331)的Pro取代成Ser、第218位(EU編號339)的Thr取代成Ala、 第14位(EU編號131)的Cys取代成Ser、第16位(EU編號133)的Arg取代成Lys、第102 位(EU編號219)的Cys取代成Ser、第20位(EU編號137)的Glu取代成Gly、第21位(EU 編號138)的Ser取代成Gly。本發(fā)明的方法只要包括上述工序即可，還可以包括其他氨基酸取代和缺失的其他 工序。對氨基酸的取代和缺失的方法沒有特別限定，例如可以按照上述位點特異性誘變法 或?qū)嵤├杏涊d的方法進(jìn)行。本發(fā)明還涉及降低來自IgG2鉸鏈部分的異質(zhì)性的方法、提高在酸性條件下的穩(wěn) 定性的方法和/或降低來自C末端的異質(zhì)性的方法(M31 A GK)，上述方法均包括對具有SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)進(jìn)行下述工序(a)將SEQ ID N0 2的第276位(EU編號第397位)的Met取代成其他氨基酸的
工序；(b)將SEQ ID NO 2的第14位(EU編號第131位)的Cys取代成其他氨基酸的
工序；(c)將SEQ ID NO 2的第16位(EU編號第133位)的Arg取代成其他氨基酸的
工序；(d)將SEQ ID NO 2的第102位(EU編號第219位)的Cys取代成其他氨基酸的
21工序；(e)將SEQ ID NO 2的第20位(EU編號第137位)的Glu取代成其他氨基酸的
工序；(f)將SEQ ID NO 2的第21位(EU編號第138位)的Ser取代成其他氨基酸的 工序；以及(g)使SEQ ID NO 2的第325位的Gly和第326位的Lys (分別為EU編號第446 位和第447位)缺失的工序。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第276位(EU編號397)的Met取代成 Val、第14位(EU編號131)的Cys取代成Ser、第16位(EU編號133)的Arg取代成Lys、 第102位(EU編號219)的Cys取代成Ser、第20位(EU編號137)的Glu取代成Gly、第21 位(EU編號138)的Ser取代成Gly0本發(fā)明還涉及降低來自IgG2鉸鏈部分的異質(zhì)性的方法和/或降低來自C末端的 異質(zhì)性的方法(M40 Δ GK)，上述方法均包括對具有SEQID NO :2記載的氨基酸序列的IgG2恒 定區(qū)進(jìn)行下述工序(a)將SEQ ID NO 2的第14位(EU編號第131位)的Cys取代成其他氨基酸的
工序；(b)將SEQ ID NO 2的第16位(EU編號第133位)的Arg取代成其他氨基酸的
工序；(c)將SEQ ID NO 2的第102位(EU編號第219位)的Cys取代成其他氨基酸的
工序；(d)將SEQ ID NO 2的第20位(EU編號第137位)的Glu取代成其他氨基酸的
工序；(e)將SEQ ID NO 2的第21位(EU編號第138位)的Ser取代成其他氨基酸的 工序；以及(f)使SEQ ID NO 2的第325位的Gly和第326位的Lys (分別為EU編號第446 位和第447位)缺失的工序。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第14位(EU編號131)的Cys取代成Ser、 第16位(EU編號133)的Arg取代成Lys、第102位(EU編號219)的Cys取代成Ser、第20 位(EU編號137)的Glu取代成Gly、第21位(EU編號138)的Ser取代成Gly。本發(fā)明還涉及降低來自IgG2鉸鏈部分的異質(zhì)性的方法、提高藥物動力學(xué)的方法 和/或降低來自C末端的異質(zhì)性的方法(M58)，上述方法均包括對具有SEQ ID NO 2記載 的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)中進(jìn)行下述工序(a)將SEQ ID NO 2的第14位(EU編號第131位)的Cys取代成Ser的工序；(b)將SEQ ID NO 2的第16位(EU編號第133位)的Arg取代成Lys的工序；(c)將SEQ ID NO 2的第102位(EU編號第219位)的Cys取代成Ser的工序；(d)將SEQ ID NO 2的第20位(EU編號第137位)的Glu取代成Gly的工序；(e)將SEQ ID NO 2的第21位(EU編號第138位)的Ser取代成Gly的工序；(f)將SEQ ID NO 2的第147位(EU編號第268位)的His取代成Gln的工序；(g)將SEQ ID NO 2的第234位(EU編號第355位)的Arg取代成Gln的工序；
(h)將SEQ ID NO 2的第298位(EU編號第419位)的Gin取代成Glu的工序； 以及(i)使SEQ ID NO 2的第325位的Gly和第326位的Lys (分別為EU編號第446 位和第447位)缺失的工序。本發(fā)明還涉及降低來自IgG2鉸鏈部分的異質(zhì)性的方法、提高藥物動力學(xué)的方法、 和/或降低來自C末端的異質(zhì)性的方法(M73)，上述方法均包括對具有SEQ ID NO 2記載 的氨基酸序列的IgG2恒定區(qū)進(jìn)行下述工序(a)將SEQ ID NO 2的第14位(EU編號第131位)的Cys取代成Ser的工序；(b)將SEQ ID NO 2的第16位(EU編號第133位)的Arg取代成Lys的工序；(c)將SEQ ID NO 2的第102位(EU編號第219位)的Cys取代成Ser的工序；(d)將SEQ ID NO 2的第20位(EU編號第137位)的Glu取代成Gly的工序；(e)將SEQ ID NO 2的第21位(EU編號第138位)的Ser取代成Gly的工序；(f)將SEQ ID NO 2的第147位(EU編號第268位)的His取代成Gin的工序；(g)將SEQ ID NO 2的第234位(EU編號第355位)的Arg取代成Gin的工序；(h)將SEQ ID NO 2的第298位(EU編號第419位)的Gin取代成Glu的工序；⑴將SEQ ID NO 2的第313位(EU編號第434位)的Asn取代成Ala的工序； 以及(j)使SEQ ID NO 2的第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號 第447位)的Lys缺失的工序。本發(fā)明的方法只要包括上述工序即可，還可以包括其他氨基酸取代和缺失的其他 工序。對氨基酸的取代和缺失的方法沒有特別限定，例如可以按照上述位點特異性誘變法 或?qū)嵤├杏涊d的方法進(jìn)行。<提高IgG4恒定區(qū)在酸性條件下的穩(wěn)定性的方法>本發(fā)明還涉及提高抗體在酸性條件下的穩(wěn)定性的方法，該方法包括將具有SEQ ID NO 3記載的氨基酸序列的IgG4恒定區(qū)(Mo 1 Immunol. 1993Jan ；30(1) 105-8)中第289位 (EU編號第409位)的Arg取代成其他氨基酸的工序。本發(fā)明的提高抗體在酸性條件下的 穩(wěn)定性的方法只要包括將SEQ ID NO 3記載的氨基酸序列(人IgG4恒定區(qū))中第289位 (EU編號第409位)的Arg取代成其他氨基酸的工序即可，還可以包括其他氨基酸取代。對 取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選取代成Lys。對氨基酸取代的方法沒有特別限定，例 如可以按照上述位點特異性誘變法或?qū)嵤├杏涊d的方法進(jìn)行。<降低來自IgG4恒定區(qū)的C末端氨基酸缺失的異質(zhì)性的方法>本發(fā)明還涉及改善抗體異質(zhì)性的方法，該方法包括使具有SEQ IDN0 3記載的氨 基酸序列的 IgG4 恒定區(qū)(Mol Immunol. 1993Jan ；30(1) 105-8)中第 326 位(EU 編號第 446 位)的Gly和第327位(EU編號第447位)的Lys缺失的工序。本發(fā)明的改善抗體異質(zhì)性 的方法只要包括使具有SEQ ID NO 3記載的氨基酸序列的IgG4恒定區(qū)中第327位(EU編 號第447位)的Lys和/或第326位(EU編號第446位)的Gly缺失的工序即可，還可以 包括其他氨基酸取代。對氨基酸取代的方法沒有特別限定，例如可以按照上述位點特異性 誘變法或?qū)嵤├杏涊d的方法進(jìn)行。本發(fā)明還涉及提高IgG4在酸性條件下的穩(wěn)定性的方法、降低來自C末端的異質(zhì)性的方法、減少抗體與Fc Y R結(jié)合的方法(Mil A GK)，上述方法均包括對具有SEQ ID NO 3記 載的氨基酸序列的IgG4恒定區(qū)進(jìn)行下述工序
工序；
(a (b (c (d (e
(f (g
(h
(i (j
(k (1 (m
將SEQ ID NO 3的第14位(EU編號第131位)的Cys取代成其他氨基酸的 將SEQ ID N0:3的第16位(EU編號第133位)的Arg取代成其他氨基酸的 將SEQ ID N0:3的第20位(EU編號第137位)的Glu取代成其他氨基酸的 將SEQ ID N0:3的第21位(EU編號第138位)的Ser取代成其他氨基酸的 將SEQ ID NO 3的第97位(EU編號第214位)的Arg取代成其他氨基酸的 將SEQ ID NO 3的第100位(EU編號第217位)的Ser取代成其他氨基酸的 3的第102位(EU編號第219位)的Tyr取代成其他氨基酸的 3的第103位(EU編號第220位)的Gly取代成其他氨基酸的 3的第104位(EU編號第221位)的Pro取代成其他氨基酸的 3的第105位(EU編號第222位)的Pro取代成其他氨基酸的 :3的第113位(EU編號第233位)的Glu取代成其他氨基酸的 3的第114位(EU編號第234位)的Phe取代成其他氨基酸的 3的第115位(EU編號第235位)的Leu取代成其他氨基酸的
將 SEQ ID NO 將 SEQ ID NO 將 SEQ ID NO 將 SEQ ID NO 將 SEQ ID NO 將 SEQ ID NO 將 SEQ ID NO
3的第116位(EU編號第236位)的Gly缺失的工序； 3的第289位(EU編號第409位)的Arg取代成其他氨基酸的
(n)使 SEQ ID NO (o)將 SEQ ID NO 工序；以及(p)使SEQ ID NO 3的第236位(EU編號第446位)的Gly和第237位(EU編號 第447位)的Lys缺失的工序。對取代后的氨基酸沒有特別限定，但優(yōu)選第14位(EU編號131)的Cys取代成Ser、 第16位(EU編號133)的Arg取代成Lys、第20位(EU編號137)的Glu取代成Gly、第21 位(EU編號138)的Ser取代成Gly、第97位(EU編號214)的Arg取代成Thr、第100位 (EU編號217)的Ser取代成Arg、第102位(EU編號219)的Tyr取代成Ser、第103位(EU 編號220)的Gly取代成Cys、第104位(EU編號221)的Pro取代成Val、第105位(EU編 號222)的Pro取代成Glu、第113位(EU編號233)的Glu取代成Pro、第114位(EU編號
24234)的Phe取代成Val、第115位(EU編號235)的Leu取代成Ala、第289位(EU編號409) 的Arg取代成Lys。本發(fā)明的方法只要包括上述工序即可，還可以包括其他氨基酸取代和缺失的其他 工序。對氨基酸的取代和缺失的方法沒有特別限定，例如可以按照上述位點特異性誘變法 或?qū)嵤├杏涊d的方法進(jìn)行。<降低來自IgGl恒定區(qū)的C末端氨基酸缺失的異質(zhì)性的方法>本發(fā)明還涉及改善抗體異質(zhì)性的方法，該方法包括使具有SEQ IDNO 1記載的氨 基酸序列的IgGl恒定區(qū)中第329位(EU編號第446位)的Gly和第330位(EU編號第447 位)的Lys缺失的工序。本發(fā)明的改善抗體異質(zhì)性的方法只要包括使具有SEQ ID N0:1記 載的氨基酸序列的IgGl恒定區(qū)中第330位(EU編號第447位)的Lys和第329位(EU編 號第446位)的Gly缺失的工序即可，還可以包括其他氨基酸取代。對氨基酸取代的方法 沒有特別限定，例如可以按照上述位點特異性誘變法或?qū)嵤├杏涊d的方法進(jìn)行。對上述抗體恒定區(qū)沒有特別限定，可用于任何抗體，但作為本發(fā)明的使用恒定區(qū) 的抗體的實例，例如有以下抗體。(a) SEQ ID N0:48(具有(VH4-M73)的氨基酸序列的重鏈)；(b)SEQ ID N0:46(具有(VH3-M73)的氨基酸序列的重鏈)；(c)SEQ ID N0:44(具有(VH5-M83)的氨基酸序列的重鏈)；(d)SEQ ID N0:49(具有(VLl-kappa)的氨基酸序列的輕鏈)；(e) SEQ ID N0:47(具有(VL3_kappa)的氨基酸序列的輕鏈)；(f)SEQ ID N0:45(具有(VL5_kappa)的氨基酸序列的輕鏈)；(g)包含(a)的重鏈和(d)的輕鏈的抗體(FV3-M73)；(h)包含(b)的重鏈和(e)的輕鏈的抗體(FV4-M73)；⑴包含(c)的重鏈和(f)的輕鏈的抗體(FV5-M83)。<包含抗體的藥物組合物>本發(fā)明提供包含本發(fā)明抗體的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物除包含抗體外，還可以導(dǎo)入藥物上可接受的載體，按照公知 的方法制成制劑。例如可以和水或除水以外的藥學(xué)上可接受的液體制成無菌溶液或混懸液 等注射劑的形式，進(jìn)行胃腸外給藥。例如，考慮將其與藥理學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)適當(dāng)組 合，按照通常認(rèn)可的制藥操作(製薬実施)所要求的單位用量形式進(jìn)行混合，從而制成制 劑，所述載體和介質(zhì)具體有滅菌水或生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定 劑、香味劑、賦形劑、媒介物、防腐劑、粘合劑等。這些制劑中的有效成分量為在所指示的范 圍內(nèi)得到適當(dāng)容量的量。注射用無菌組合物可以使用注射用蒸餾水這樣的媒介物，按照通常的制劑操作制 成處方。作為注射用水溶液，例如有生理鹽水、含有葡萄糖或其他輔劑(例如D-山梨醇、 D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)的等滲溶液。上述注射用水溶液可以和適當(dāng)?shù)闹軇?例 如醇，具體有乙醇、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇))、非離子性表面活性劑(例如聚山梨酯 80 (TM)、HC0-50)結(jié)合使用。作為油性液體，可列舉芝麻油、大豆油。上述油性液體可以和作為助溶劑的苯甲酸芐酯、苯甲醇結(jié)合使用。還可以與緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖液、乙酸鈉緩沖液)、鎮(zhèn)痛劑(例 如鹽酸普魯卡因)、穩(wěn)定劑(例如苯甲醇、苯酚)、抗氧劑混合。所制備的注射液通常填充在 適當(dāng)?shù)陌碴持?。給藥方式優(yōu)選為胃腸外給藥，具體有注射劑型、經(jīng)鼻給藥劑型、經(jīng)肺給藥劑型、經(jīng) 皮給藥劑型等。注射劑型的實例有例如可以通過靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮 下注射等進(jìn)行全身或局部給藥?？梢愿鶕?jù)患者的年齡、癥狀選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法。作為含有抗體或編碼抗體的多 核苷酸的藥物組合物的給藥量，例如可以在每次0. 000lmg 1000mg/kg體重的范圍內(nèi)選 擇?；蛘?，例如可以按照每名患者0.001 lOOOOOmg/人的范圍選擇給藥量，但并不限于上 述數(shù)值。給藥量、給藥方法可以根據(jù)患者的體重、年齡和癥狀等而變動，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以適當(dāng)選擇。
本說明書中使用的氨基酸的三字母表示與單字母表示的對應(yīng)關(guān)系如下。 丙氨酸:Ala(A) 精氨酸Arg(R) 天冬酰胺Asn(N) 天冬氨酸Asp (D) 半胱氨酸Cys(C) 谷氨酰胺Gln(Q)
Glu(E) Gly(G) His(H)
谷氨酸 甘氨酸 組氨酸 異亮氨酸Ile(I) 亮氨酸Leu(L) 賴氨酸:Lys(K) 甲硫氨酸:Met (M) 苯丙氨酸Phe(F)
脯氨酸 絲氨酸 蘇氨酸 色氨酸 酪氨酸 纈氨酸
Pro (P) Ser(S) Thr (T) Trp(ff) Tyr(Y) Val(V)
需要說明的是，本說明書中引用的所有在先技術(shù)文獻(xiàn)均作為參照而納入本說明書 實施例
以下，通過實施例來進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。 [實施例1]提高IgG2和IgG4在酸性條件下的穩(wěn)定性 ISG2、IrG4化人源化IL-6受體抗體表達(dá)載體的制備、表達(dá) 雖然人源化抗人IL-6受體抗體、即人源化PM1抗體(Cancer Res. 1993Feb 15 ；53(4) 851-6)的恒定區(qū)是IgGl同種型，但為了降低Fc γ受體結(jié)合性，制備將恒定區(qū)取代 成 IgG2 的分子(WT-IgG2、SEQ ID NO 13)和取代成 IgG4(Mol Immunol. 1993 Jan ；30(1) 105-8.)的分子(WT-IgG4、SEQ ID N0:14)。在IgG的表達(dá)中使用動物細(xì)胞表達(dá)用載體。如 下構(gòu)建表達(dá)載體通過參考例1中使用的人源化PMl抗體(IgGl)的恒定區(qū)部分的NheI/ NotI消化并通過連接反應(yīng)(ligation)將恒定區(qū)取代成IgG2或IgG4。各DNA片段的核苷 酸序列通過使用BigDyeTerminator循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems)，利用DNA序 列分析儀ABI PRISM 3730xL DNA序列分析儀或ABI PRISM 3700DNA序列分析儀(Applied Biosystems)，按照所附說明書中所述的方法進(jìn)行確定。使用WT(SEQ ID NO 15)作為L鏈， 按照下述方法進(jìn)行WT-IgGl、WT-IgG2、WT-IgG4的表達(dá)。將來自人胚腎癌細(xì)胞的HEK293H 株(Invitrogen)懸浮于含有 10%胎牛血清(Invitrogen)的 DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen) 中，以5 6X IO5個/mL的細(xì)胞密度在粘附細(xì)胞用培養(yǎng)皿(直徑IOcm ;C0RNING)的各皿 中分別接種10mL，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一晝夜，之后吸除培養(yǎng)基，添加6. 9mL CHO-S-SFM-II (Invitrogen)培養(yǎng)基。將制備的質(zhì)粒DNA混合液(總計13. 8 μ g)與 20. 7 μ Ll μ g/mL 的聚乙烯亞胺(Polysciences Inc.)禾口 690 μ L CHO-S-SFMII 培養(yǎng)基混合， 在室溫下靜置10分鐘，之后投入各皿的細(xì)胞中，在37°C、5% CO2的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 5 小時。之后，添加6. 9mLCH0-S-SFM-II (Invitrogen)培養(yǎng)基，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天?；?收培養(yǎng)上清，之后以約2000g的離心力在室溫下離心5分鐘以除去細(xì)胞，再通過0. 22 μ m的 濾器MILLEX -GV (Millipore)進(jìn)行滅菌。該安瓿使用前一直在4°C下保存。(1)人源化 PMl 抗體(PM_lVH+IgGl)H 鏈=SEQ ID NO 12(氨基酸序列)(2)人源化 PM-lVH+IgG2H 鏈=SEQ ID NO 13(氨基酸序列)(3)人源化 PM_lVH+IgG4H 鏈SEQ ID NO 14(氨基酸序列)通過鹽酸洗提從蛋白A中純化WT-IgGl、rr-IgG2、rr_IgG4向得到的培養(yǎng)上清中添加懸浮于TBS中的50μ L rProteinASepharose Fast Flow (Amersham Biosciences),在 4°C下倒置混合(転倒混合 mixed by inversion) 4 小時 以上。將該溶液移至0. 22 μ m濾杯Ultrafree -MC(Millipore)中，用500 μ L TBS清洗3 次，之后將 rProteinA Sepharose 樹脂懸浮于 100 μ L 的 IOmM HCl、150mM NaCl (pH 2.0) 中，靜置2分鐘，之后洗提抗體(鹽酸洗提法)。立即加入6.7yL的1.5M Tris-HCl (pH7. 8) 進(jìn)行中和。洗提2次，得到200 μ L的純化抗體。通過鹽酸洗提法純化的WT-I甙1、WT-I甙2、WT-I甙4的凝膠過濾層析分析為了評價通過鹽酸洗提法得到的純品的聚集物含量，進(jìn)行凝膠過濾層析分析。聚集物評價方法系統(tǒng)=Waters Alliance柱G3000SWxl(T0S0H)流動相50mM磷酸鈉、300mM KCl、pH7. O流速、波長0.5ml/分鐘、220nm結(jié)果見圖1。WT-IgGl純化后的聚集物含量為約2%左右，相對于此，WT_IgG2和 WT-IgG4純化后的聚集物含量均為約25%左右。由此認(rèn)為IgGl對鹽酸洗提時的酸穩(wěn)定，而 IgG2和IgG4對鹽酸洗提時的酸不穩(wěn)定，發(fā)生變性、聚集化，由此可知與IgGl相比，IgG2和 IgG4在酸性條件下的穩(wěn)定性低。在IgG分子的純化中往往會使用蛋白A，而從蛋白A中洗提IgG分子時則在酸性條件下進(jìn)行。此外，開發(fā)IgG分子作為藥品時必需將病毒滅活，該滅 活通常在酸性條件下進(jìn)行。由此可知雖然希望IgG分子在酸性條件下的穩(wěn)定性高，但I(xiàn)gG2 和IgG4分子在酸性條件下的穩(wěn)定性較IgGl差，首次明確了在開發(fā)IgG2和IgG4分子作為 藥品時存在酸性條件下的變性、聚集化的問題。認(rèn)為在開發(fā)IgG2和IgG4分子作為藥品時 希望解決變性、聚集化的問題，但迄今為止通過氨基酸取代來解決此問題的方法未見報道。WT-IgG2、WT-IgG4的CH3結(jié)構(gòu)域改變體的制備和評價由于已顯示出IgG2和IgG4分子在酸性條件下的穩(wěn)定性較IgGl差，所以研究IgG2 和IgG4分子在酸性條件下的穩(wěn)定性得到改善的改變體。根據(jù)IgG2和IgG4分子的恒定區(qū) 模型，認(rèn)為在酸性條件下不穩(wěn)定的要因在于CH3結(jié)構(gòu)域中CH3/CH3界面的不穩(wěn)定性，認(rèn)為 IgG2中EU編號第397位的甲硫氨酸、IgG4中EU編號第409位的精氨酸分別使IgG2和IgG4 的CH3/CH3界面不穩(wěn)定。由于IgGl中EU編號第397位是纈氨酸、EU編號第409位是賴 氨酸，因此制備了將IgG2的EU編號第397位的甲硫氨酸變成纈氨酸的抗體(IgG2_M397V， SEQID NO :16(氨基酸序列))和將IgG4的EU編號第409位的精氨酸變成賴氨酸的抗體 (IgG4-R409K, SEQ ID NO :17(氨基酸序列))。目標(biāo)抗體的表達(dá)載體的制備、表達(dá)、純化采用上述鹽酸洗提法來進(jìn)行。為了評價通 過鹽酸洗提法由蛋白A得到的純品的聚集物含量，進(jìn)行凝膠過濾層析分析。聚集物評價方法系統(tǒng)=Waters Alliance柱G3000SWxl(TOSOH)流動相50mM 磷酸鈉、300mM KCl、pH7. 0流速、波長0.5ml/分鐘、220nm結(jié)果見圖l。WT_IgGl純化后的聚集物含量為約2%，而WT_IgG2和WT_IgG4純化后 的聚集物含量均為約25%。相對于此，作為CH3結(jié)構(gòu)域改變體的IgG2-M397V和IgG4_R409K 的聚集物含量均為約2%，與IgGl在同等水平。研究表明通過將IgG2的EU編號第397 位的甲硫氨酸變成纈氨酸、或者通過將IgG4的EU編號第409位的精氨酸變成賴氨酸，可 以提高IgG2抗體和IgG4抗體在酸性條件下的穩(wěn)定性。將純化抗體用20mM乙酸鈉、150mM NaCl、pH6. 0的溶液進(jìn)行透析(EasySEP，Τ0ΜΥ)，在約0. lmg/mL蛋白濃度下，在40°C 100°C 之間以1°C /分鐘的升溫速度進(jìn)行DSC測定(測定熱變性中間溫度、Tm值)。測定WT-IgG2、 WT-IgG4、IgG2-M397V和IgG4_R409K的熱變性中間溫度，結(jié)果表明與WT-IgG2和WT-IgG4 相比，IgG2-M397V和IgG4_R409K中分別導(dǎo)入有改變的CH3結(jié)構(gòu)域的Tm值均較高。由此可 知與WT-IgG2和WT-IgG4相比，IgG2_M397V和IgG4_R409K的熱穩(wěn)定性也均優(yōu)異。由于IgG2和IgG4在使用了蛋白A的純化工序和病毒滅活工序中被暴露在酸 性條件下，所以上述工序中的變性、聚集化成了問題。但發(fā)現(xiàn)通過使用IgG2-M397V和 IgG4-R409K作為IgG2和IgG4的恒定區(qū)序列，可以解決上述問題?？芍鲜龈淖冊陂_發(fā) IgG2和IgG4抗體作為藥品時極為有用。從IgG2-M397V和IgG4_R409K的熱穩(wěn)定性也優(yōu)異 的觀點出發(fā)，也可知兩者有用。[實施例2]改善來自IgG2的二硫鍵的異質(zhì)性通過乙酸洗提從蛋白A中純化WT-IgGl、町-1甙2、町-1甙4向?qū)嵤├?中得到的培養(yǎng)上清中添加50 μ L懸浮于TBS中的rProteinASepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)，在 4°C下倒置混合 4 小時以上。將該溶 液移至 0.22iim 濾杯 Ultrafree -MC(Millipore)中，用 500 y L TBS 清洗 3 次，之后將 rProtein A Sepharose 樹脂懸浮于100 ii L的50mM乙酸鈉水溶液(pH3. 3)中，靜置2分 鐘，之后洗提抗體。立即加入6. 7iiL的1.5M Tris-HCl(pH7. 8)進(jìn)行中和。洗提2次，得到 200 u L的純化抗體。ffT-IgGUffT-IgG2.ffT~IgG4 的陽離子交換餼譜(IEC)分析為了評價純化的WT-IgGl、WT_IgG2、WT_IgG4的均一性，通過陽離子交換色譜進(jìn)行 分析。IEC評價方法系統(tǒng)Waters Alliance柱ProPacWCX-10(Dionex)流動相A :25mM MES-NaOH、pH6. 1B :25mM MES_Na0H、250mM 乙酸鈉、pH6. 1流速、波長0.5ml/分鐘、280nm梯度B 分析 WT-IgGl 時，50% -75% (75 分鐘)B 分析 WT-IgG2 和 WT_IgG4 時，30% -55% (75 分鐘)結(jié)果見圖2。由結(jié)果可知在離子交換分析中，WT-IgGl和WT_IgG4為單峰，而 WT-IgG2存在多個峰，與IgGl和IgG4相比，IgG2分子的異質(zhì)性多。實際上，有人報道了 IgG2的同種型的來自鉸鏈區(qū)二硫鍵的異質(zhì)性(不均一性)(非專利文獻(xiàn)10)，認(rèn)為圖2所示 的IgG2的雜峰也是來源于此的目標(biāo)物質(zhì)/相關(guān)物質(zhì)。難以在維持目標(biāo)物質(zhì)/相關(guān)物質(zhì)的 異質(zhì)性的批次間差異的同時作為藥品大量制造，希望開發(fā)作為藥品的抗體分子盡可能是均 一(異質(zhì)性少)的物質(zhì)，因此，對于野生型IgG2而言，當(dāng)將抗體作為藥品開發(fā)時，在重要的 均一性方面存在問題。實際上，US20060194280(A1)中報道了 天然型IgG2在離子交換色 譜分析中觀察到了來自二硫鍵的各種雜峰，這些峰之間生物活性不同。作為將該雜峰單一 化的方法，US20060194280(A1)中報道了在純化工序中進(jìn)行重折疊的方法，但由于在制造中 采用上述工序會使成本增加且繁雜，所以優(yōu)選通過氨基酸取代將雜峰單一化的方法。雖然 認(rèn)為在作為藥品進(jìn)行開發(fā)時，希望解決來自鉸鏈區(qū)二硫鍵的異質(zhì)性，但迄今為止通過氨基 酸取代來解決此問題的方法未見報道。ffT-IgG2的CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)的改變體的制備和評價如圖3所示，認(rèn)為IgG2分子存在各種二硫鍵構(gòu)象。認(rèn)為來自IgG2鉸鏈區(qū)的異質(zhì) 性的原因是二硫鍵的不一致和游離半胱氨酸的存在。IgG2在上鉸鏈區(qū)存在2個半胱氨酸 (EU編號第219位和第220位)，作為與該上鉸鏈的2個半胱氨酸相鄰的半胱氨酸，有存在 于H鏈CH1結(jié)構(gòu)域的EU編號第131位的半胱氨酸和L鏈C末端的半胱氨酸、以及二聚化的 伙伴H鏈(相手H鎖)的相同上鉸鏈的2個半胱氨酸。S卩，在IgG2的上鉸鏈周邊在H2L2 締合狀態(tài)下總計有8個半胱氨酸相鄰，由此認(rèn)為存在由于二硫鍵的不一致和游離半胱氨酸 產(chǎn)生的各種異質(zhì)性。為了降低來自IgG2鉸鏈區(qū)的異質(zhì)性，對IgG2的鉸鏈區(qū)序列和CH1結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了 改變。進(jìn)行了用于避免IgG2中由于二硫鍵的不一致和游離半胱氨酸產(chǎn)生的異質(zhì)性的研究。 對各種改變體進(jìn)行研究的結(jié)果認(rèn)為通過將野生型IgG2恒定區(qū)序列中存在于H鏈CHI結(jié)構(gòu)域的EU編號第131位的半胱氨酸和第133位的精氨酸分別改變成絲氨酸和賴氨酸、并 將存在于H鏈上鉸鏈的EU編號第219位的半胱氨酸改變成絲氨酸(以下記作IgG2-SKSC) (IgG2-SKSC，SEQ ID NO :18)，可以在不降低熱穩(wěn)定性的情況下避免異質(zhì)性。認(rèn)為通過上述 改變，IgG2-SKSC的H鏈和L鏈的共價鍵通過EU編號第220位的半胱氨酸與L鏈C末端的 半胱氨酸之間的二硫鍵來均一地形成(圖4)。IgG2-SKSC的表達(dá)載體的制備、表達(dá)、純化按照參考例1所述的方法進(jìn)行。為了評 價純化的IgG2-SKSC和野生型IgG2(WT-IgG2)的均一性，通過陽離子交換色譜進(jìn)行分析。IEC評價方法系統(tǒng)=Waters Alliance柱ProPacWCX-10(Dionex)流動相A :25mM MES-NaOH, pH5. 6B :25mM MES_Na0H、250mM 乙酸鈉、ρΗ5· 6流速、波長0.5ml/分鐘、280nm梯度B :50%-100% (75 分鐘)結(jié)果見圖5。如上所述，由結(jié)果可知WT_IgG2存在多個峰，而IgG2_SKSC以單峰的 形式洗脫。這表明通過導(dǎo)入IgG2-SKSC的改變使在EU編號第220位的半胱氨酸與L鏈C 末端的半胱氨酸之間形成單一的二硫鍵，可以避免來自IgG2鉸鏈區(qū)二硫鍵的異質(zhì)性。按照 與實施例1相同的方法測定WT-IgGl、WT-IgG2和IgG2_SKSC的熱變性中間溫度，結(jié)果在 WT-IgG2中觀察到Tm值較WT-IgGl低的Fab結(jié)構(gòu)域的峰，而在IgG2_SKSC中沒有確認(rèn)到這 樣的峰。由此可知與WT-IgG2相比，IgG2-SKSC的熱穩(wěn)定性優(yōu)異。在開發(fā)抗體作為藥品時，認(rèn)為野生型IgG2在重要的均一性方面存在問題，但已經(jīng) 明確通過使用IgG2-SKSC作為IgG2的恒定區(qū)序列可以解決此問題，在開發(fā)IgG2作為藥品 時非常有用。此外，從IgG2-SKSC的熱穩(wěn)定性優(yōu)異方面考慮，其也是有用的。[實施例3]IgG分子的C末端異質(zhì)性的改善VT-IrGI的H鏈C末端Δ GK抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建作為抗體C末端序列的異質(zhì)性，有人報道了 由C末端氨基酸的賴氨酸殘基的缺 失和C末端的2個氨基酸甘氨酸和賴氨酸的缺失引起的C末端氨基的酰胺化(非專利文獻(xiàn) 12)，在開發(fā)抗體作為藥品時，希望不存在上述異質(zhì)性。實際上，即使在作為人源化PM-I抗 體的T0CILIZUMAB中，其主要成分也是存在于核苷酸序列上的C末端氨基酸的賴氨酸在翻 譯后通過修飾而缺失的序列，殘留有賴氨酸的副成分也以異質(zhì)性的形式存在。因此，為了降 低C末端氨基酸的異質(zhì)性，對C末端氨基酸進(jìn)行改變。具體而言，通過預(yù)先使野生型IgGl 的H鏈恒定區(qū)C末端的賴氨酸和甘氨酸從核苷酸序列上缺失，來研究是否可以抑制由C末 端的2個氨基酸甘氨酸和賴氨酸的缺失引起的C末端氨基的酰胺化。使用參考例1中得到的人源化PM-I抗體(WT)的pB-CH載體，向H鏈C末端序列中 導(dǎo)入突變。使用QuikChange位點定向誘變試劑盒(Stratagene)，按照所附說明書中所述的 方法，向編碼EU編號第447位的Lys和/或EU編號第446位的Gly的核苷酸序列中導(dǎo)入 突變，使其成為終止密碼子。由此制備C末端的1個氨基酸賴氨酸(EU編號第447位)預(yù) 先缺失的抗體和C末端的2個氨基酸甘氨酸(EU編號第446位)和賴氨酸(EU編號第447 位)預(yù)先缺失的抗體的表達(dá)載體。通過表達(dá)人源化PMl抗體的L鏈，得到了 H鏈C末端ΔΚ
30抗體和H鏈C末端A GK抗體?？贵w的表達(dá)、純化按照參考例1所述的方法進(jìn)行。純化的H鏈C末端AGK抗體的陽離子交換色譜分析如下進(jìn)行。使用純化的H鏈 C末端△ GK抗體，按照下述方法通過陽離子交換色譜進(jìn)行分析，評價C末端缺失對異質(zhì)性 的影響。陽離子交換色譜分析條件如下，比較人源化PM1抗體、H鏈C末端AK抗體、H鏈C 末端A GK抗體的色譜圖。柱ProPacWCX-10(Dionex)流動相A :25mmol/L MES/NaOH、pH6. 1B :25mmol/L MES/NaOH、250mmol/L NaCl、pH6. 1流速0.5ml/ 分鐘梯度25%B(5 分鐘)—(105 分鐘)一67% B — (1 分鐘)—100% B(5 分鐘)檢測280nm未改變的人源化PM-1抗體、H鏈C末端A K抗體和H鏈C末端A GK抗體的分析結(jié) 果見圖6。根據(jù)非專利文獻(xiàn)10，保留時間較主峰延遲的堿性峰中包含H鏈C末端第449位 的Lys殘留體和第447位的Pro酰胺體，在H鏈C末端△ K抗體中沒有確認(rèn)到堿性峰的大 幅減少，但在H鏈C末端A GK抗體中確認(rèn)到了堿性峰的大幅減少，由此可知通過使H鏈C 末端的2個氨基酸缺失，首次可以降低H鏈C末端異質(zhì)性。為了評價H鏈C末端的2個殘基的缺失對熱穩(wěn)定性的影響，通過DSC測定H鏈C 末端A GK抗體的熱變性溫度。作為DSC測定用，通過用含150mM NaCl的20mM乙酸緩沖液 (pH6. 0)進(jìn)行透析來置換緩沖液。將人源化PM-1抗體、H鏈C末端AGK抗體和參比溶液 (透析外液)充分脫氣，之后將上述溶液分別封入量熱計盒中，在40°C下充分進(jìn)行熱平衡。 接下來，以約1K/分鐘的掃描速度在40°C 100°C進(jìn)行DSC掃描。參考非專利文獻(xiàn)(Rodolfo 等人，Immunology Letters, 1999，第47-52頁)，對所得變性峰進(jìn)行峰指定時，確認(rèn)C末端 缺失對CH3結(jié)構(gòu)域的熱變性溫度沒有影響。由此，通過預(yù)先使H鏈恒定區(qū)的C末端的賴氨酸和甘氨酸從核苷酸序列上缺失， 可以在不影響抗體熱穩(wěn)定性的情況下降低C末端氨基酸的異質(zhì)性。由于在人抗體恒定區(qū) IgGl、IgG2、IgG4中C末端序列的EU編號第447位均為Lys、EU編號第446位均為Gly， 所以認(rèn)為在本實施例中發(fā)現(xiàn)的降低C末端氨基酸異質(zhì)性的方法也可適用于IgG2恒定區(qū)和 IgG4恒定區(qū)。[實施例4]新型最優(yōu)化恒定區(qū)M14A GK序列的制備在以中和抗原為目的的抗體藥物中，不需要Fc區(qū)所具有的ADCC等效應(yīng)子功能，所 以不必與Fcy受體結(jié)合。從免疫原性和副作用的角度考慮，認(rèn)為可能也不優(yōu)選與FCY受 體的結(jié)合(非專利文獻(xiàn)5、6)。作為人源化抗IL-6受體IgGl抗體的T0CILIZUMAB與IL-6 受體進(jìn)行特異性結(jié)合，通過中和其生物學(xué)作用，可以用作類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等與IL-6有關(guān)的 疾病的治療藥，不必與Fcy受體結(jié)合。Fc Y受體非結(jié)合的最優(yōu)化恒定區(qū)M14 A GK、Mil A GK、M17 A GK的制備和評價作為降低與Fc y受體結(jié)合的方法，認(rèn)為有將IgG抗體的同種型由IgGl變?yōu)镮gG2 或IgG4同種型的方法(Ann Hematol. 1998Jun ；76 (6) :231_48)。作為完全消除與Fc Y受 體結(jié)合的方法，有人報道了 向Fc區(qū)導(dǎo)入人工改變的方法。例如，由于抗CD3抗體和抗CD4 抗體的效應(yīng)子功能會引起副作用，所以向Fc區(qū)的Fcy受體結(jié)合部分導(dǎo)入野生型序列中不
31存在的氨基酸突變(非專利文獻(xiàn)3、7)，所得的Fc γ受體非結(jié)合型的抗CD3抗體和抗CD4抗 體的臨床試驗正在進(jìn)行中(非專利文獻(xiàn)5、8)。有報道稱通過將IgGl ^FcyR結(jié)合位點 (EU 編號第 233、234、235、236、327、330、331 位)轉(zhuǎn)換成 IgG2 (EU 編號第 233、234、235、236 位)和IgG4(EU編號第327、330、331位)的序列，可以制備Fcy受體非結(jié)合型抗體(專利 文獻(xiàn)3)。但若將上述所有突變導(dǎo)入IgGl中，則認(rèn)為會出現(xiàn)能夠形成天然不存在的T細(xì)胞表 位肽的9個氨基酸的新型肽序列，免疫原性風(fēng)險會升高。在開發(fā)抗體作為藥品時，希望免疫 原性風(fēng)險極低。為了解決上述課題，研究了 IgG2恒定區(qū)的改變。在IgG2恒定區(qū)的Fc γ R結(jié)合位 點中，EU編號第233、234、235、236位是非結(jié)合型，MFcyR結(jié)合位點中EU編號第327、330、 331位是不同于非結(jié)合型IgG4的序列，所以必需將EU編號第327、330、331位的氨基酸變成 IgG4 的序歹Ij (Eur J Immunol. 1999Aug ；29 (8) :2613_24 中的 G2 Δ a)。但 IgG4 中 EU 編號第 339位的氨基酸是丙氨酸，而IgG2中是蘇氨酸，所以只將EU編號第327、330、331位的氨基 酸變成IgG4的序列，就可出現(xiàn)能夠形成天然不存在的T細(xì)胞表位肽的9個氨基酸的新型肽 序列，產(chǎn)生免疫原性風(fēng)險。于是，發(fā)現(xiàn)除上述改變外，還創(chuàng)新地將IgG2的EU編號第339位 的蘇氨酸改變成丙氨酸，從而可以防止新的肽序列的出現(xiàn)。除了導(dǎo)入上述突變外，還導(dǎo)入了下述突變實施例1中發(fā)現(xiàn)的提高IgG2在酸性條 件下的穩(wěn)定性的、IgG2中EU編號第397位的甲硫氨酸取代成纈氨酸的突變；實施例2中 發(fā)現(xiàn)的改善來自鉸鏈區(qū)二硫鍵的異質(zhì)性的、EU編號第131位的半胱氨酸取代成絲氨酸的突 變、EU編號第133位的精氨酸取代成賴氨酸的突變、以及EU編號第219位的半胱氨酸取代 成絲氨酸的突變。并且，由于隨著第131位和第133位的突變的導(dǎo)入，出現(xiàn)能夠形成天然不 存在的T細(xì)胞表位肽的9個氨基酸的新型肽序列，產(chǎn)生免疫原性風(fēng)險，所以通過導(dǎo)入EU編 號第137位的谷氨酸取代成甘氨酸的突變、第138位的絲氨酸取代成甘氨酸的突變，使第 131位 第139位附近的肽序列與天然存在的人序列相同。并且，為了降低來自C末端的異 質(zhì)性，使H鏈C末端EU編號第446、447位的甘氨酸和賴氨酸缺失。將導(dǎo)入有上述所有突變 的恒定區(qū)序列作為機(jī)4八61(^14八61(，SEQ ID NO :5)。雖然M14 Δ GK中存在1個導(dǎo)入有由 第219位的半胱氨酸取代成絲氨酸的突變而作為能夠形成T細(xì)胞表位肽的9個氨基酸的新 的肽序列的位點，但由于半胱氨酸和絲氨酸作為氨基酸序列的性質(zhì)近似，所以認(rèn)為免疫原 性的風(fēng)險極小，在利用ΤΕΡΙΤ0ΡΕ進(jìn)行的免疫原性預(yù)測中，也沒有確認(rèn)到免疫原性的變化。按照參考例1所述的方法制備具有WT作為可變區(qū)序列、具有M14AGK作為恒定區(qū) 序列的抗體H鏈序列(M14AGK,SEQ ID NO 5 ；WT-M14 Δ GK, SEQ ID NO 19)的表達(dá)載體，使 用WT-M14 Δ GK作為H鏈、使用WT作為L鏈，按照參考例1所述的方法進(jìn)行表達(dá)、純化。按照相同的方法制備WT-MlIAGK (Ml 1 Δ GK，SEQ ID NO 8 ；WT-Mll Δ GK, SEQ ID NO 21)的表達(dá)載體，在所述WT-MlIAGK中，向IgG4恒定區(qū)的EU編號第233、234、235、236 位中導(dǎo)入突變，以降低與Fc γ受體的結(jié)合(EurJ Immunol. 1999Aug ；29 (8) :2613_24中的 G4Ab ；在該改變中，由于產(chǎn)生新的非人序列，所以免疫原性風(fēng)險提高)；為了降低免疫原性 風(fēng)險，除上述改變外，還向EU編號第131、133、137、138、214、217、219、220、221、222位中導(dǎo) 入突變，使鉸鏈區(qū)二硫鍵的構(gòu)象與M14AGK的相同；并且，向EU編號第409位中導(dǎo)入突變， 以提高在酸性條件下的穩(wěn)定性(實施例1)；使EU編號第446位和第447位的氨基酸缺失， 以降低C末端異質(zhì)性(實施例3)。
進(jìn)一步制備WT-M17 AGK(M17 AGK，SEQ ID NO 10 ；WT-M17 AGK, SEQ ID NO :20)， 在所述 WT-M17 AGK 中，向 IgGl 恒定區(qū)的 EU 編號第 233、234、235、236、327、330、331、339 位 中導(dǎo)入突變(Eur J Immunol. 1999Aug ；29 (8) :2613_24 中的 G1 A ab)，以降低與 Fc y 受體 的結(jié)合，并且使EU編號第446位和第447位的氨基酸缺失，以降低C末端的異質(zhì)性(實施 例3)。使用WT-M17 A GK或WT-M11 A GK作為H鏈、使用WT作為L鏈，按照實施例1所述 的方法進(jìn)行表達(dá)、純化。WT-M14 A GK、ffT~M17 A GK、ffT~Mll A GK 的 Fc Y 警體結(jié)合件的評價與FcyRI結(jié)合的評價如下進(jìn)行。使用Biacore T100，使固定在傳感器芯片上的 來源于人的Fcy受體1(以下記作Fc yRI)與用作分析物的IgGl、IgG2、IgG4、MllAGK、 M14AGK、M1AGK 7進(jìn)行相互作用，比較其結(jié)合量。來源于人的Fc Y RI使用重組人FcRIA/ CD64 (R&Dsystems)，使用 IgGl、IgG2、IgG4、Ml 1 A GK、M14 A GK、M17 A GK 作為樣品進(jìn)行測定。 利用胺耦合法將Fc y RI固定在傳感器芯片CM5 (BIACORE)上。hFc y RI的最終固定量為約 13000RU(resonance units,共振單位)。運行緩沖液使用HBS-EP+，流速為20 u L/分鐘。 將樣品用HBS-EP+調(diào)節(jié)為100 u g/mL的濃度。分析包括下述兩個工序注射10 y L抗體溶 液的2分鐘作為結(jié)合相，之后切換成HBS-EP+，作為4分鐘的解離相。解離相結(jié)束后，注射 20 y L的5mM氫氧化鈉，由此使傳感器芯片再生。以上述結(jié)合、解離、再生作為1個分析周 期，注射各種抗體溶液，得到傳感圖。依次注入作為分析物的IgG4、IgG2、IgGl、Mil、M14、 M17，重復(fù)操作2次。測定的結(jié)合量數(shù)據(jù)的比較結(jié)果見圖7。其結(jié)果，結(jié)合量按IgGl>IgG4 >> IgG2 = Mil AGK = M14AGK = M17AGK的順序遞減，由此可知與野生型IgGl、IgG4 相比，野生型 IgG2、Mll AGK、M14 AGK、M17 AGK 與 Fc y RI 的結(jié)合弱。與FcyRIIa結(jié)合的評價如下進(jìn)行。使用Biacore T100，使固定在傳感器芯片 上的來源于人的Fcy受體IIa(以下記作FcyRIIa)與用作分析物的IgGl、IgG2、IgG4、 M11AGK、M14A A GK、M17 A GK發(fā)生相互作用，之后比較其結(jié)合量。來源于人的FcyRIIa使 用重組人 FcRIIA/CD32a(R&D systems)，使用 IgGl、IgG2、IgG4、Mll A GK、M14 A GK、M17 A GK 作為樣品進(jìn)行測定。利用胺耦合法將FcyRIIa固定在傳感器芯片CM5(BIAC0RE)上。 Fc y Rlla的最終固定量為約3300RU。運行緩沖液使用HBS-EP+，流速為20 u L/分鐘。之 后，注入運行緩沖液直至基線穩(wěn)定，基線穩(wěn)定后開始測定。使作為分析物的各IgG同種型 (IgGl、IgG2、IgG4)和導(dǎo)入有突變的抗體(Mil AGK、M14AGK、M17AGK)與固定的 FcyRIIa 發(fā)生相互作用，觀察其結(jié)合量。運行緩沖液使用HBS-EP+，流速為20 u L/分鐘，測定溫度為 25°C。將各IgG和改變體調(diào)節(jié)為100118/1^，注入20111^分析物，使其與固定的？(3￥1 113發(fā) 生相互作用。進(jìn)行相互作用后，注入200 u L運行緩沖液，從而使分析物自Fc Y Rlla上解離， 使傳感器芯片再生。依次注入分析物IgG4、IgG2、1861、1111八61(、1114八61(、1117八61(，重復(fù) 操作2次。測定的結(jié)合量數(shù)據(jù)的比較結(jié)果見圖8。其結(jié)果，結(jié)合量按IgGl > IgG2 = IgG4 > Mil AGK = M14 AGK = M17 AGK的順序遞減，由此可知與野生型IgGl、IgG2、IgG4相比， Mil AGK、M14 AGK、M17 AGK 與 Fc Y Rlla 的結(jié)合弱。與FcyRIIb結(jié)合的評價如下進(jìn)行。使用Biacore T100，使固定在傳感器芯片上 的、來源于人的Fcy受體lib (以下記作FcyRIIb)與作為分析物的IgGl、IgG2、IgG4、 Mil AGK、M14AGK、M17AGK發(fā)生相互作用，比較其結(jié)合量。來源于人的Fc yRIIb使用重組人 FcRIIB/C(R&D systems)，使用 IgGl、IgG2、IgG4、Mil Δ GK、M14 Δ GK、M17 Δ GK 作為樣品 進(jìn)行測定。通過胺耦合法將Fc γ RIIb固定在傳感器芯片CM5 (BIACORE)上。Fc γ RIIb的 最終固定量為約4300RU。之后，注入運行緩沖液直至基線穩(wěn)定，基線穩(wěn)定后開始測定。使 作為分析物的各IgG同種型(IgGl、IgG2、IgG4)和導(dǎo)入有突變的抗體(Mil Δ GK、M14 Δ GK、 Μ17 Δ GK)與固定的Fc γ RIIb發(fā)生相互作用，觀察其結(jié)合量。運行緩沖液使用HBS-EP+，流速 為20 μ L/分鐘，測定溫度為25 V。將各IgG及其改變體調(diào)節(jié)為200 μ g/mL,注入20 μ L作 為分析物，使其與固定的Fc γ RIIb發(fā)生相互作用。發(fā)生相互作用后，注入200 μ L運行緩沖 液，使分析物自Fc YRIIb上解離，使傳感器芯片再生。依次注入分析物IgG4、IgG2、IgGl、 M11AGK、M14AGK、M17AGK，重復(fù)操作2次。測定的結(jié)合量數(shù)據(jù)的比較結(jié)果見圖9。其結(jié)果， 結(jié)合量按IgG4 > IgGl > IgG2 > Mil Δ GK = M14 Δ GK = Μ17Δ6Κ的順序遞減，由此可知 與野生型 IgGl、IgG2、IgG4 相比，Mil Δ GK、M14 Δ GK、M17 Δ GK 與 Fc γ RIIb 的結(jié)合弱。
與Fc γ RIIIa結(jié)合的評價如下進(jìn)行。使用Biacore Τ100，使固定在傳感器芯片 上的、來源于人的Fc γ受體IIIa(以下記作Fc YRIIIa)與用作分析物的IgGl、IgG2、 IgG4、Mil Δ GK, M14AGK、Μ17Δ6Κ發(fā)生相互作用，比較其結(jié)合量。來源于人的Fc YRIIIa 使用 hFcYRIIIaV-His6(重組 hFcYRIIIaV-His6 本公司制品)，使用 IgGl、IgG2、IgG4、 Mil AGK、M14AGK、M17 AGK作為樣品進(jìn)行測定。通過胺耦合法將Fc y RIIIa固定在傳感器 芯片 CM5 (BIAC0RE)上。hFc YRIIIaV-His6 的最終固定量為約 8200RU (resonance units，共 振單位)。運行緩沖液使用HBS-EP+，流速為5 μ L/分鐘。將樣品用HBS-EP+調(diào)節(jié)為250 μ g/ mL的濃度。分析包括下述2個工序注射10 μ L抗體溶液的2分鐘作為結(jié)合相，之后切換 成HBS-EP+，作為4分鐘的解離相。解離相結(jié)束后，注入20 μ L的5mM鹽酸，從而使傳感器 芯片再生。將上述結(jié)合、解離、再生作為1個分析周期，注射各種抗體溶液，得到傳感圖。依 次注射作為分析物的IgG4、IgG2、IgGl、Mil ΔGK, M14AGK、M17AGK。測定的結(jié)合量數(shù)據(jù) 的比較結(jié)果見圖10。其結(jié)果，結(jié)合量按IgGl >> IgG4 > IgG2>M17AGK> Mil AGK = M14 Δ GK 的順序遞減，這表明與野生型 IgGl、IgG2、IgG4 相比，Ml 1 Δ GK、M14 Δ GK、M17 Δ GK 與 Fc γ RIIIa 的結(jié)合弱。此外，與 Eur J Immunol. 1999Aug ；29 (8) :2613_24 中報道的、包含 Gl Δ ab的突變的M17 Δ GK相比，可知Ml 1 Δ GK、Μ14 Δ GK與Fc γ RIIIa的結(jié)合更弱。由上述結(jié)果確認(rèn)與野生型化61相比，111-]\114八61(、111-]\117八61(、111-]\111八61(與各 種Fc γ受體的結(jié)合明顯降低。通過使用訂-] 14八61(、111-]\117八61(、111-]\111八61(作為恒定 區(qū)，可以避免來自經(jīng)由Fc γ受體進(jìn)入到APC中的免疫原性風(fēng)險和來自ADCC等效應(yīng)子功能 的副作用，11^114八61(、11^117八61(、11^111八61(作為以中和抗原為目的的抗體藥物的恒定 區(qū)序列是有用的。WT-M14 A GK、WT-M17 A GK、WT-M11 A GK 的高濃度穩(wěn)定性試驗評價WT-M14 Δ GK、WT-Ml7 Δ GK、WT-Ml 1 Δ GK在高濃度制劑中的穩(wěn)定性。將 WT-IgGl ,WT-M14 Δ GK.WT-M17 Δ GK,WT-Ml 1 Δ GK 的純化抗體用 20mM 組氨酰氯、150mM NaCl、 PH6.5的溶液進(jìn)行透析(EasySEP，Τ0ΜΥ)，之后用超濾膜進(jìn)行濃縮，進(jìn)行高濃度穩(wěn)定性試驗。 試驗條件如下?？贵w=WT-IgGl,WT-M14 Δ GK, WT-M17 Δ GK, WT-Ml 1 Δ GK緩沖液20mM組氨酰氯、150mM NaCl、pH6. 5濃度61mg/mL
保存溫度和保存時間40°C下2周、40°C下1個月、40°C下2個月聚集物評價方法系統(tǒng)Waters Alliance柱G3000SWxl(T0S0H)流動相50mM 磷酸鈉、300mM KC1、pH7. 0流速、波長0.5ml/分鐘、220nm將樣品稀釋100倍后進(jìn)行分析利用上述凝膠過濾層析法評價原始制劑(剛制成的制劑)和在各種條件下保存后 的制劑的聚集物含量，原始制劑中聚集物含量的變化量見圖11。其結(jié)果，與WT-IgGl相比， WT-M14AGK、WT-M17AGK、WT-M11 AGK的聚集物增加量低，為WT中聚集物增加量的約1/2。 如圖12所示，就Fab片段的增加量而言，WT-IgGl和WT-M17 A GK程度相同，但WT-M14 A GK 和WT-M11 AGK中Fab片段的增加量為WT的Fab片段增加量的約1/4。作為IgG型抗體制 劑的變性途徑(劣化経路degeneration pathway)，如W0 2003/039485所述，主要可列舉聚 集物的生成和Fab分解物的生成。研究發(fā)現(xiàn)與WT-IgGl相比，WT-M14 AGK和WT-M11 AGK 在聚集物的生成及Fab片段的生成這兩個方面制劑的穩(wěn)定性均優(yōu)異。由此認(rèn)為即使是在 IgGl恒定區(qū)的穩(wěn)定性不充分、無法制成可以開發(fā)作為藥品的高濃度溶液制劑的抗體，通過 使用WT-M14AGK、WT-M17AGK、WT-M11 AGK作為恒定區(qū)，也可以制備具有高穩(wěn)定性的高濃 度溶液制劑。特別是M14 A GK,認(rèn)為其作為新的恒定區(qū)序列極為有用，所述新的恒定區(qū)序列使原 始IgG2分子所具有的酸性條件下的不穩(wěn)定性提高、改善了來自鉸鏈區(qū)二硫鍵的異質(zhì)性、不 與Fc Y受體結(jié)合、將能夠形成T細(xì)胞表位肽的9個氨基酸的新的肽序列抑制在最低限度、 并且在高濃度制劑中的穩(wěn)定性優(yōu)于IgGl。[實施例5]M31A GK的制備和評價將實施例4中制備的M14 A GK的EU編號第330、331、339位的氨基酸變成IgG2的 序列，來制備M31 AGK(M31 AGK，SEQ ID NO :7)。按照參考例1所述的方法制備具有WT作為 可變區(qū)序列、具有M31 A GK作為恒定區(qū)序列的抗體H鏈序列(WT-M31 A GK, SEQ ID NO 22) 的表達(dá)載體，使用WT-M31 A GK作為H鏈、使用WT作為L鏈，按照參考例1所述的方法表達(dá)、 純化 WT-M31 AGK。除WT-M31 A GK外，同時表達(dá)、純化的WT_IgG2和WT-M14 A GK的陽離子交換色譜分 析如下進(jìn)行。陽離子交換色譜分析條件如下，比較WT-IgG2、WT-M14 A GK、WT-M31 A GK的色 譜圖。柱ProPacWCX-10(Dionex)流動相A :25mmol/L MES/NaOH、pH6. 1B:25mmol/L MES/NaOH、250mmol/L NaCl、pH6.1流速0.5mL/ 分鐘梯度0%B(5 分鐘)—(65 分鐘)一100% B — (1 分鐘)檢測280nmWT-IgG2、WT-M14 AGK、WT-M31 AGK 的分析結(jié)果見圖 13?？芍猈T_IgG2 存在多個 峰，但WT-M31 AGK和WT-M14AGK—樣以單峰的形式洗脫。這表明即使在WT-M31 AGK中也可以避免來自IgG2的鉸鏈區(qū)二硫鍵的異質(zhì)性。[實施例6]WT_M14的血漿中滯留性的評價人體內(nèi)的血漿中滯留件的預(yù)測方法IgG分子的血漿中滯留性長(消除慢)，這是由于作為IgG分子的補(bǔ)救受 體(寸卟《一夕 > 七夕一 salvage receptor)而已知的FcRn在起作用(Nat Rev Immunol. 2007Sep ；7 (9) :715_25)。通過胞飲作用進(jìn)入核內(nèi)體中的IgG分子，其在核內(nèi)體內(nèi) 的酸性條件下(PH6. 0附近)與在核內(nèi)體內(nèi)表達(dá)的FcRn結(jié)合。無法與FcRn結(jié)合的IgG分 子進(jìn)入溶酶體內(nèi)，被溶酶體分解，但與FcRn結(jié)合的IgG分子向細(xì)胞表面移動，在血漿中的中 性條件下(PH7. 4附近)自FcRn上解離，又返回到血漿中。作為IgG型抗體，已知有IgGl、IgG2、IgG3、IgG4同種型，有報道稱，上述同種型在 人體內(nèi)的血漿中半衰期分別為IgGl、IgG2的半衰期為約36天；IgG3的半衰期為約29天； IgG4 的半衰期為 16 天(Nat. Biotechnol. 2007Dec ；25(12) :1369_72)，認(rèn)為 IgGl 和 IgG2 的血漿中滯留性最長。通常，抗體藥物的同種型為IgGl、IgG2、IgG4，作為進(jìn)一步提高上述 IgG抗體的藥物動力學(xué)的方法，有人報道了 通過改變IgG恒定區(qū)的序列來提高上述的與人 FcRn 的結(jié)合性的方法(JBiol Chem. 2007Jan 19 ；282 (3) :1709_17 ;J Immunol. 2006Jan 1 ； 176(1) 346-56)。由于小鼠FcRn與人FcRn之間存在種特異性差異(Proc Natl AcadSci USA. 2006Dec 5 ； 103 (49) 18709-14)，所以為了預(yù)測恒定區(qū)序列已發(fā)生改變的IgG抗體在 人體內(nèi)的血漿中滯留性，認(rèn)為希望評價與人FcRn的結(jié)合以及在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的 血菜中滯留性(Intlmmunol. 2006Dec ；18(12) 1759-69)。與人FcRn結(jié)合的評價FcRn是FcRn與0 2_微球蛋白的復(fù)合體。根據(jù)公開的人FcRn基因序列 (J. Exp. Med. 180(6) ,2377-2381 (1994))制備寡 DNA 引物。以人 cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)為模板，使用制備的引物，通過PCR法調(diào)整編碼全長 基因的DNA片段。以得到的DNA片段為模板，通過PCR法擴(kuò)增編碼包含信號區(qū)的胞外 區(qū)(Metl-Leu290)的DNA片段，之后將其插入動物細(xì)胞表達(dá)載體中(人FcRn氨基酸序 列、SEQ ID N0:24)。同樣，根據(jù)公開的人3 2-微球蛋白基因序列(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 99 (26) ,16899-16903 (2002))制備寡 DNA 引物。以人 cDNA (Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH)為模板，使用制備的引物，利用PCR法制備編碼全長基因 的DNA片段。以所得的DNA片段為模板，通過PCR法擴(kuò)增編碼包含信號區(qū)的全長0 2-微球 蛋白(Metl-Metll9)的DNA片段，之后將其插入動物細(xì)胞表達(dá)載體中(人02-微球蛋白氨 基酸序列、SEQ ID NO 25)。可溶型人FcRn的表達(dá)按照下述程序進(jìn)行。采用使用了 10 %胎牛血清 (Invitrogen)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，將已制備的人FcRn和人0 2-微球蛋白的質(zhì)粒導(dǎo)入來自人 胚腎癌細(xì)胞的HEK293H株(Invitrogen)細(xì)胞中?；厥账玫呐囵B(yǎng)上清，之后使用IgG Sepharose 6 Fast Flow (AmershamBiosciences),按照(J Immunol. 2002 Nov 1 ； 169 (9) 5171-80)的方法進(jìn)行純化。之后，使用HiTrap Q HP(GE Healthcare)進(jìn)行純化。評價與人FcRn的結(jié)合時使用Biacore 3000，通過使作為分析物的人FcRn與抗體 相互作用時的人FcRn的結(jié)合量算出親和性(KD)，所述抗體與固定在傳感器芯片上的蛋白L
36或兔抗人IgG Kappa鏈抗體結(jié)合。具體而言，使用含有150mM NaCl的50mM磷酸鈉緩沖液 (PH6.0)作為運行緩沖液，利用胺耦合法將蛋白L或兔抗人IgG Kappa鏈抗體固定在傳感器 芯片CM5 (BIACORE)上。之后，用含有0. 02% Tween20的運行緩沖液稀釋抗體并注入，使抗 體與芯片結(jié)合，之后注入人FcRn，評價人FcRn與抗體的結(jié)合性。計算親和性時使用BIA評估(ΒΙΑ evaluation)軟件。由得到的傳感圖求出在人FcRn注射即將結(jié)束前與抗體結(jié)合的hFcRn的量，通過穩(wěn)態(tài)親和法進(jìn)行擬合，算出抗體與人 FcRn的親和性。人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的血漿中滯留件的評價在人 FcRn 轉(zhuǎn)基因小鼠(B6. mFcRn-/-· hFcRn Tg line 276+/+ 小鼠 Jackson Laboratories)體內(nèi)的動力學(xué)評價如下進(jìn)行。將抗體以lmg/kg的給藥量對小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi) 單次給藥，在適當(dāng)?shù)臅r間點采血。采集的血液立即在4°C下以15，OOOrpm的轉(zhuǎn)速離心15分 鐘，得到血漿。分離的血漿在實施測定前一直保存在被設(shè)定為-20°C以下的冷庫中。血漿中 濃度按照ELISA法來測定。WT-M14在人體內(nèi)的血漿中滯留件的預(yù)測評價利用BIAcore評價WT-IgGl和WT-M14與人FcRn的結(jié)合性，結(jié)果如表1所示，與 WT-IgGl相比，WT-M14的結(jié)合性略強(qiáng)。[表 1]_KD ( μ M)_WT-IgG 12. 07WT-M14 1. 85_但是，對WT-IgGl和WT-M14在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的血漿中滯留性進(jìn)行了評 價，結(jié)果如圖14所示，WT-IgGl和WT-M14顯示出同等的血漿中滯留性，由此認(rèn)為即使在人 體內(nèi)Μ14恒定區(qū)也顯示出與IgGl恒定區(qū)同等的血漿中滯留性。[實施例7]藥物動力學(xué)得到提高的WT-M44、WT-M58、WT-M73的制備WT-M58分子的制備如實施例6所示，WT-M14在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的血漿中滯留性與WT-IgGl 同等。作為提高藥物動力學(xué)的方法，已知有降低抗體等電點的方法和增強(qiáng)FcRn結(jié)合性的方 法，但為了提高WT-M14的藥物動力學(xué)，導(dǎo)入下述的改變。具體而言，將實施例4中由WT-M14 制備的WT-M31 Δ GK的EU編號第397位的纈氨酸取代成甲硫氨酸、將第268位的組氨酸取代 成谷氨酰胺、將第355位的精氨酸取代成谷氨酰胺、將第419位的谷氨酰胺取代成谷氨酸。 將上述4處改變導(dǎo)入WT-M31AGK中，制備WT-M58(SEQ ID NO :26 (氨基酸序列))。表達(dá)載 體的制備按照實施例1的方法進(jìn)行。使用WT-M58作為H鏈、使用L(WT)作為L鏈。WT-M58 的表達(dá)、純化按照實施例1所述的方法進(jìn)行。WT-M73分子的制備另一方面，將IgGl的EU編號第434位的氨基酸取代成丙氨酸，來制備WT-M44 (SEQ ID N0:27(氨基酸序列))。再制備為了降低H鏈C末端的異質(zhì)性而使M44的第446位的甘氨酸和第447位的賴氨酸缺失的WT-M83 (SEQ ID NO 58(氨基酸序列))。將WT-M58的EU 編號第434位的氨基酸取代成丙氨酸，來制備WT-M73 (SEQ ID NO :28 (氨基酸序列))。上述抗體的表達(dá)載體的制備按照實施例1的方法進(jìn)行，使用WT-M44、WT-M58或 WT-M73作為H鏈，使用L(WT)作為L鏈。WT-M44、WT-M58和WT-M73的表達(dá)、純化按照實施 例1所述的方法進(jìn)行。WT-M44、ffT~M58.ffT~M73在人體內(nèi)的血漿中滯留件的預(yù)測評價使用BIAcore 評價 WT-IgG 1、WT-M44、WT_M58 和 WT-M73 與人 FcRn 的結(jié)合性，結(jié)果 如表2所示，WT-M44、WT-M58和WT-M73的結(jié)合性均較WT-IgGl優(yōu)異，分別為WT-IgGl的約 2. 7倍、約1. 4倍和約3. 8倍左右。[表 2]_KD ( μ M)_WT-IgGl 1. 62WT-M44 0. 59WT-M58 1. 17WT-M73 0. 42_對WT-IgG 1、WT-Ml4和WT-M58在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的血漿中滯留性進(jìn)行了 評價，其結(jié)果如圖24所示，確認(rèn)到與WT-IgGl和WT-M14相比，WT-M58的藥物動力學(xué)有所提 高。并且，對WT-IgGl、WT-M44、WT-M58和WT-M73在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的血漿中滯留 性進(jìn)行了評價，其結(jié)果如圖15所示，確認(rèn)與WT-IgGl相比，WT-M44、WT-M58和WT-M73的藥 物動力學(xué)均有所改善，其藥物動力學(xué)的改善效果與人FcRn結(jié)合能力相關(guān)。其中，與WT-IgGl 相比，WT-M73在28天后的血漿中濃度改善約16倍，由此認(rèn)為即使在人體內(nèi)，與具有IgGl 恒定區(qū)的抗體相比，具有M73恒定區(qū)的抗體的藥物動力學(xué)也大幅提高。[實施例8]各種抗體中新的恒定區(qū)M14和M58降低異質(zhì)性的效果如實施例4所示，確認(rèn)到在作為抗IL-6受體抗體的人源化PMl抗體(WT)中，通過 將恒定區(qū)由IgG2變成M14，可以降低來自IgG2的鉸鏈區(qū)的異質(zhì)性。因此，對于除人源化PMl 抗體以外的IgG2型抗體，也進(jìn)行了下述的研究即通過將恒定區(qū)變成M14或M58，來研究其 能否降低異質(zhì)性。作為除人源化PMl抗體以外的抗體，使用了作為抗IL-6受體抗體的F2H/L39 (F2H/ L39_VH 氨基酸序列，SEQ ID NO 29 ；F2H/L39VL 氨基酸序列，SEQ ID NO 30)、作為抗 IL-31 受體抗體的H0L0(H0L0_VH氨基酸序列，SEQ ID NO :31 ;H0L0_VL氨基酸序列，SEQID NO: 32)、作為抗RANKL抗體的DNS(DNS_VH氨基酸序列，SEQID NO :33 ;DNS_VL氨基酸序列， SEQ ID N0:34)。對于各抗體，制備恒定區(qū)為 IgGl (SEQ ID NO :1)、IgG2(SEQ ID NO 2)和 M14(SEQID NO 5)或 M58 (SEQ ID NO 35)的抗體。作為異質(zhì)性的評價方法，通過陽離子交換色譜進(jìn)行評價。評價制備的抗體的異質(zhì) 性時，柱使用ProPac WCX-10 (Dionex)，流動相A使用20mM乙酸鈉(ρΗ5· 0)，流動相B使 用20mM乙酸鈉/IM NaCl (pH5. 0)，采用適當(dāng)?shù)牧魉俸吞荻冗M(jìn)行評價。通過陽離子交換色譜(IEC)進(jìn)行評價的結(jié)果見圖16。如圖16所示，確認(rèn)到不僅在作為抗IL-6受體抗體的人源化PMl抗體(WT)中，即 使在作為抗IL-6受體抗體的F2H/L39、作為抗IL-31受體抗體的HOLO、作為抗RANKL抗體 的DNS中，通過將恒定區(qū)由IgGl變成IgG2，異質(zhì)性增大；通過將恒定區(qū)變成M14或M58，在 所有抗體中均可降低異質(zhì)性。由此表明通過將存在于H鏈CHl結(jié)構(gòu)域的EU編號第131位 的半胱氨酸和存在于H鏈上鉸鏈的EU編號第219位的半胱氨酸取代成絲氨酸，不管可變區(qū) 的抗體序列和抗原種類如何，均可降低來自天然型IgG2的異質(zhì)性。[實施例9]新的恒定區(qū)M58改善各種抗體的藥物動力學(xué)的效果如實施例7所示，發(fā)現(xiàn)在作為抗IL-6受體抗體的人源化PMl抗體(WT)中，通過將 恒定區(qū)由IgGl變成M58，與人FcRn的結(jié)合性得到提高，在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中藥物動力學(xué) 得到提高。因此，對于除人源化PMl抗體以外的IgGl抗體，也進(jìn)行了下述的研究即通過將 恒定區(qū)變成M58，能否提高藥物動力學(xué)。作為除人源化PMl抗體(WT)以外的抗體，使用作為抗IL-31受體抗體的 HOLO (H0L0_VH 氨基酸序列，SEQ ID NO 31 ；H0L0_VL 氨基酸序列，SEQ ID N0:32)、作為抗 RANKL 抗體的 DNS (DNS_VH氨基酸序列，SEQ ID NO 33 ；DNS_VL 氨基酸序列，SEQ ID NO :34)。 相對于各抗體，制備恒定區(qū)為IgGl (SEQ ID NO 1)和M58 (SEQ IDNO 35)的抗體，按照實施 例6所述的方法評價其與人FcRn的結(jié)合性。結(jié)果見表3。[表 3] 如表3所示，確認(rèn)到即使在作為抗IL-31受體抗體的H0L0、作為抗RANKL抗體的 DNS中，通過將恒定區(qū)由IgGl變成Μ58，與作為抗IL-6受體抗體的WT —樣，與人FcRn的結(jié) 合性提高。由此表明不管可變區(qū)的抗體序列和抗原種類如何，通過將恒定區(qū)由IgGl變成 Μ58，可以提高在人體內(nèi)的藥物動力學(xué)。[實施例10]CHl結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸對異質(zhì)性和穩(wěn)定性的影響如實施例2所示，為了降低天然型IgG2的異質(zhì)性，對IgG2鉸鏈部分的半胱氨酸和 存在于CHl結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸進(jìn)行改變。研究各種改變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在野生型IgG2恒定 區(qū)序列中，通過使用SKSC(SEQID NO :38)，可以在不降低穩(wěn)定性的情況下降低異質(zhì)性，所述 SKSC是將存在于H鏈CHl結(jié)構(gòu)域的EU編號第131位的半胱氨酸和第133位的精氨酸分別 取代成絲氨酸和賴氨酸、將存在于H鏈上鉸鏈的EU編號第219位的半胱氨酸取代成絲氨酸 而得到的恒定區(qū)。另一方面，作為降低異質(zhì)性的方法，認(rèn)為有只將存在于H鏈上鉸鏈的EU編號第219 位的半胱氨酸取代成絲氨酸的方法以及只將EU編號第220位的半胱氨酸取代成絲氨酸的 方法。制備具有將IgG2的EU編號第219位的半胱氨酸取代成絲氨酸的恒定區(qū)SC (SEQ ID NO 39)和將IgG2的EU編號第220位的半胱氨酸取代成絲氨酸的恒定區(qū)CS (SEQ ID NO 40)作為恒定區(qū)的 WT-SC (SEQ ID NO 41)禾口 WT-CS (SEQ ID NO :42)，并與 WT_IgGl、WT-IgG2、 WT-SKSC和WT-M58比較異質(zhì)性和熱穩(wěn)定性。另外，對不同于WT的抗體的抗IL-6受體抗
39體、即 F2H/L39(F2H/L39VH 氨基酸序列，SEQ ID NO :29 ;F2H/L39_VL 氨基酸序列，SEQ ID NO :30)制備分別具有恒定區(qū) IgGl(SEQ ID NO 1)、IgG2 (SEQ ID NO 2), SC (SEQ ID NO: 39)、CS(SEQID NO 40)、SKSC(SEQ ID NO :38)、M14(SEQ ID NO 5)的 F2H/L39_IgGl、F2H/ L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、F2H/L39-M14，比較上述抗體的異質(zhì)性 和穩(wěn)定性。作為WT-IgGl、WT-IgG2、WT-SC, WT-CS, WT-SKSC, WT-M58、F2H/L39_IgGl、F2H/ L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、F2H/L39-M14 的異質(zhì)性的評價方法，通 過陽離子交換色譜進(jìn)行評價。柱使用ProPac WCX-10 (Dionex)，流動相A使用20mM乙酸鈉 (ρΗ5. 0)，流動相B使用20mM乙酸鈉/IM NaCl (ρΗ5. 0)，采用適當(dāng)?shù)牧髁亢吞荻冗M(jìn)行評價。 利用陽離子交換色譜進(jìn)行評價的結(jié)果見圖17。其結(jié)果，如圖17所示，在WT和F2H/L39的任一個中，通過將恒定區(qū)由IgGl變成 IgG2，異質(zhì)性均增大；但通過將恒定區(qū)變成SKSC和M14或M58，異質(zhì)性均大幅下降。另一方 面，當(dāng)恒定區(qū)為SC時，與恒定區(qū)為SKSC時的情形一樣，異質(zhì)性大幅下降；而當(dāng)恒定區(qū)為CS 時，異質(zhì)性沒有得到充分改善。通常，為了開發(fā)抗體作為藥品，除了希望異質(zhì)性少以外，還希望具有高穩(wěn)定性，以 制備穩(wěn)定的制劑。因此，作為穩(wěn)定性的評價方法，利用差示掃描量熱法(DSC)測定熱變性 中間溫度(Tm值)(VP-DSC、Microcal社制)。熱變性中間溫度(Tm值)是穩(wěn)定性的指標(biāo)， 為了制備穩(wěn)定的制劑作為藥品，希望熱變性中間溫度(Tm值)高(J Pharm Sci. 2008Apr ； 97(4) 1414-26)。將 WT-IgGl、WT_IgG2、WT-SC, WT-CS, WT-SKSC, WT-M58 用 20mM 乙酸鈉、 150mM NaCl、pH6. O的溶液進(jìn)行透析(EasySEP ；Τ0ΜΥ)，在約0. lmg/mL的蛋白濃度下以1°C / 分鐘的升溫速度在40°C 100°C之間進(jìn)行DSC測定。所得的DSC變性曲線見圖18，F(xiàn)ab部 分的Tm值見下表4。[表 4]_Tm/"C_WT--IgGl94,
WT-_IgG293
WT--SC86,
WT--CS86,
WT--SKSC93
WT--M5893_ WT-IgGl和WT-IgG2的Tm值大致相等，均為約94°C左右(IgG2的Tm值低約1°C )， 而WT-SC和WT-CS的Tm值均為約86°C，與WT-IgGl和WT_IgG2相比，Tm值顯著降低。另一 方面，WT-M58和WT-SKSC的Tm值均為約94°C，與WT-IgGl和WT_IgG2大致相等。由于與 IgG2相比，WT-SC和WT-CS的穩(wěn)定性明顯低，所以為了開發(fā)抗體作為藥品，認(rèn)為優(yōu)選CHl結(jié) 構(gòu)域的半胱氨酸也取代成絲氨酸的WT-SKSC和WT-M58。與IgG2相比，WT-SC和WT-CS的Tm 值均大幅下降，認(rèn)為其原因在于WT-SC和WT-CS在二硫鍵構(gòu)象方面不同于IgG2。
比較DSC變性曲線時，確認(rèn)WT-IgGl、WT-SKSC、WT_M58的Fab部分的變性峰窄且單 一，相對于此，WT-SC和WT-CS的Fab部分的變性峰寬，WT_IgG2在Fab部分的變性峰的低溫 側(cè)出現(xiàn)肩峰。認(rèn)為DSC在變性峰為單一成分時，通常顯示窄變性峰，而當(dāng)存在Tm值不同的 多種成分(即異質(zhì)性)時，變性峰變寬。即，上述結(jié)果表明WT-IgG2、WT-SC和WT-CS中有 可能存在多種成分，所以WT-SC和WT-CS的天然型IgG2的異質(zhì)性沒有得到充分的降低。由 此認(rèn)為野生型IgG2的異質(zhì)性不僅與鉸鏈部分的半胱氨酸有關(guān)，還與存在于CHl結(jié)構(gòu)域的 半胱氨酸有關(guān)，為了降低DSC上的異質(zhì)性，不僅必需改變鉸鏈部分的半胱氨酸，還必需改變 CHl結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸。如上所述，通過不僅改變鉸鏈部分的半胱氨酸、還改變CHl結(jié)構(gòu)域 的半胱氨酸，首次有可能具有與野生型IgG2同等的穩(wěn)定性。根據(jù)上述結(jié)果認(rèn)為作為降低來自IgG2鉸鏈區(qū)的異質(zhì)性的恒定區(qū)，只將鉸鏈部分 的半胱氨酸取代成絲氨酸的恒定區(qū)SC和CS，從異質(zhì)性和穩(wěn)定性的角度考慮并不充分，發(fā)現(xiàn) 除了將鉸鏈部分的半胱氨酸取代成絲氨酸以外，還將存在于CHl結(jié)構(gòu)域的EU編號第131位 的半胱氨酸也取代成絲氨酸，從而首次可以在維持與IgG2同等的穩(wěn)定性的同時大幅降低 異質(zhì)性。作為這樣的恒定區(qū)，有上述M14、M31、M58、M73等，特別是M58和M73的藥物動力 學(xué)提高、穩(wěn)定性高、異質(zhì)性下降，因此認(rèn)為其作為抗體藥物的恒定區(qū)非常有用。[實施例11]PK/PD得到改善的完全人源化抗IL-6受體抗體的制備為了制備PK/PD得到改善的完全人源化抗IL-6受體抗體，通過改變 T0CILIZUMAB (H 鏈，WT-IgGl (SEQ ID NO: 12) ；L 鏈，WT (SEQ ID NO 15))，制備以下所示的分 子。作為完全人源化IL-6受體抗體，制備恒定區(qū)中使用了實施例7中制備的M73或M83的 Fy3-M73 (H|j|VH4-M73SEQ ID NO 48 ；L鏈 VLl-kappa SEQ ID NO :49)、Fv4_M73 (H鏈 VH3-M73 SEQ ID NO 46 ；L 鏈 VL3_kappa SEQ ID NO :47)、Fv5_M83 (H 鏈 VH5-M83SEQ ID N0:44;L 鏈 VL5-kappa SEQID NO 45)。將制備的Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5_M83與IL-6受體的親和性和T0CILIZUMAB進(jìn)行 比較。測定上述抗體與IL-6受體的親和性，結(jié)果見表5 (方法參照參考例)。此外，比較了 T0CILIZUMAB和對照(參考例的公知的高親和性抗IL-6受體抗體、US 2007/0280945中的 VQ8F11-21 hlgGl)的BaF/gpl30中和活性(方法參照參考例)。測定這些抗體在BaF/gpl30 中的生物活性，結(jié)果見圖19(IL-6的終濃度為300ng/mL :T0CILIZUMAB、對照、Fv5_M83) 和圖 20 (IL-6 的終濃度為 30ng/mL :T0CILIZUMAB、Fv3_M73、Fv4_M73)。如表 5 所示，與 T0CILIZUMAB相比，F(xiàn)v3_M73和Fv4_M73具有約2 3倍強(qiáng)的親和性；與T0CILIZUMAB相比， Fv5-M83顯示出約100倍強(qiáng)的親和性(由于Fv5_M83的親和性難以測定，所以使用恒定區(qū) 為IgGl的Fv5-IgGl來測定親和性，認(rèn)為恒定區(qū)通常對親和性沒有影響)。如圖20所示，與 T0CILIZUMAB相比，F(xiàn)v3_M73、Fv4_M73顯示出稍強(qiáng)的活性；如圖19所示，與T0CILIZUMAB相 比，F(xiàn)v5-M83在50%抑制濃度下具有100倍以上的極強(qiáng)的活性，并且，與作為對照的公知的 高親和性抗IL-6受體抗體相比，F(xiàn)v5-M83在50%抑制濃度下也顯示出約10倍高的中和活 性。[表 5]ka(1/Ms)M1/S)KD (M)
TOCILIZUMAB 4.0E+051.1E-032.7E-09Fv3-M738.5E+058.7E-041.0E-09
Fv4-M73 7.5E+051.0E-031.4E-09
Fv5-M83 1.1E+062.8E-052.5E-11 利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，通過等電點電泳來測定TOCILIZUMAB、對照、 Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83的等電點，結(jié)果T0CILIZUMAB的等電點為約9. 3、對照的等電 點為約8. 4 8. 5、Fv3-M73的等電點為約5. 7 5. 8、Fv4_M73的等電點為約5. 6 5. 7、 Fv5-M83的等電點為約5. 4 5. 5，與TOCILIZUMAB和對照相比，這些抗體的等電點均大幅 下降。另外，利用GENETYX (GENETYXCORPORATI ON)來計算可變區(qū)VH/VL的理論等電點時， TOCILIZUMAB的理論等電點為9. 20、對照的理論等電點為7. 79、Fv3-M73的理論等電點為 5. 49、Fv4-M73的理論等電點為5. 01、Fv5_M83的理論等電點為4. 27，與TOCILIZUMAB和 對照相比，這些抗體的理論等電點均大幅下降。由此認(rèn)為與TOCILIZUMAB和對照相比， Fv3-M73、Fv4-M73、Fv5_M83的藥物動力學(xué)有所提高。使用ΤΕΡΙΤ0ΡΕ (Methods. 2004Dec ；34 (4) 468-75)對存在于 TOCILIZUMAB、 Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83的可變區(qū)序列的T細(xì)胞表位進(jìn)行分析。其結(jié)果，雖然預(yù)測 TOCILIZUMAB的多個序列存在與HLA結(jié)合的T細(xì)胞表位，但在Fv3_M73、Fv4_M73和Fv5_M83 中被預(yù)測與T細(xì)胞表位結(jié)合的序列大幅減少。另外，F(xiàn)v3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83在構(gòu)架 中沒有殘留小鼠序列，被完全人源化。由此表明與TOCILIZUMAB相比，F(xiàn)v3_M73、Fv4-M73 和Fv5-M83的免疫原性風(fēng)險有可能大幅降低。[實施例12]完全人源化抗IL-6受體抗體在猴體內(nèi)的PK/PD試驗將TOCILIZUMAB、對照、Fv3_M73、Fv4_M73 和 Fv5_M83 以 lmg/kg 對食蟹猴進(jìn)行靜 脈內(nèi)單次給藥，評價血漿中濃度變化(方法參照參考例)。TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73 和Fv5-M83靜脈內(nèi)給藥后的血漿中濃度變化見圖21。其結(jié)果，與TOCILIZUMAB和對照 相比，F(xiàn)v3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83在食蟹猴體內(nèi)的血漿中滯留性大幅改善。其中，與 TOCILIZUMAB相比，F(xiàn)v3_M73和Fv4_M73的藥物動力學(xué)大幅改善。為了評價中和膜型食蟹猴IL-6受體的藥效，在抗體給藥后第6天 第18天(給 予TOCILIZUMAB后第3天 第10天)將食蟹猴IL-6以5 μ g/kg對腰背部連日進(jìn)行皮下給 藥，測定24小時后各個體的CRP濃度(方法參照參考例)。各抗體給藥時的CRP濃度變化 見圖22。為了評價中和可溶型食蟹猴IL-6受體的藥效，測定食蟹猴血漿中非結(jié)合型的可溶 型食蟹猴IL-6受體的濃度，計算可溶型IL-6受體的中和率(方法參照參考例)。各抗體給 藥后可溶型IL-6受體的中和率變化見圖23。與TOCILIZUMAB和作為對照的公知的高親和性抗IL-6受體抗體相比，F(xiàn)v3_M73、 Fv4-M73和Fv5-M83均能更持續(xù)地中和膜型食蟹猴IL-6受體，長期抑制CRP的增加。而 且，與TOCILIZUMAB和對照相比，F(xiàn)y3_M73、Fv4_M73和Fv5_M83均能更持續(xù)地中和可溶型 食蟹猴IL-6受體，長期抑制非結(jié)合型的可溶型食蟹猴IL-6受體的增加。由此發(fā)現(xiàn)在中 和膜型IL-6受體和可溶型IL-6受體的持續(xù)性方面，F(xiàn)v3-M73、Fv4_M73和Fv5_M83均較 TOCILIZUMAB和對照優(yōu)異。其中，F(xiàn)v3_M73和Fv4_M73的中和的持續(xù)性極其優(yōu)異。另一方 面，與Fv3-M73和Fv4-M73相比，F(xiàn)v5_M83將CRP和非結(jié)合型的可溶型食蟹猴IL-6受體抑制在更低水平。由此認(rèn)為與Fv3-M73、Fv4-M73和作為對照的公知的高親和性抗IL-6受 體抗體相比，F(xiàn)v5-M83更強(qiáng)效地中和膜型IL-6受體和可溶型IL-6受體。認(rèn)為這是Fv5_M83 與IL-6受體的親和性較對照強(qiáng)、且Fv5-M83在BaF/gpl30中的生物活性強(qiáng)的情況在食蟹猴 體內(nèi)得到反映的結(jié)果。上述研究表明與T0CILIZUMAB和對照相比，F(xiàn)v3_M73和Fv4_M73作為抗IL-6受體 中和抗體的作用持續(xù)性極其優(yōu)異，可以大幅降低給藥頻率和給藥量；另外，F(xiàn)v5-M83作為抗 IL-6受體中和抗體的作用強(qiáng)度極其優(yōu)異，作用持續(xù)性也優(yōu)異。因此，認(rèn)為Fv3-M73、Fv4-M73 和Fv5-M83可以以IL-6拮抗劑的形式用作藥物。[參考例]mmmm^mm n-e 剩本(cIL-6R)的制各根據(jù)公開的恒河猴IL-6受體基因序列(Birney等人，Ensembl 2006，Nucleic Acids Res. 2006Jan 1 ；34 (Database issue) :D556_61)制備寡 DNA 引物，以由食蟹猴胰臟 制備的cDNA為模板，使用引物，通過PCR法制備編碼食蟹猴IL-6受體全長基因的DNA片 段。將得到的DNA片段插入動物細(xì)胞表達(dá)載體中，使用該載體制備CHO恒定表達(dá)株(產(chǎn)生食 蟹猴SIL-6R的CHO細(xì)胞)。將產(chǎn)生食蟹猴SIL-6R的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)液用HisTrap柱(GE Healthcare Bioscience)純化，之后使用 Amicon Ultra-15 Ultracel-IOk(Millipore)進(jìn) 行濃縮，用 Superdex200pgl6/60 凝膠過濾柱(GE Healthcare Bioscience)進(jìn)一步純化，得 到可溶型食蟹猴IL-6受體(以下記作CIL-6R)的最終純品。重組食蟹猴IL-6(cIL_6)的制備食蟹猴IL-6如下制備。制成編碼在SWISSPROT Accession No. P79341中注冊 的212個氨基酸的核苷酸序列，將其克隆到動物細(xì)胞表達(dá)載體中，再將所得載體導(dǎo)入CHO 細(xì)胞中，從而制備恒定表達(dá)細(xì)胞株(產(chǎn)生食蟹猴IL-6的CHO細(xì)胞)。將產(chǎn)生食蟹猴IL-6 的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)液用SP-S印harose/FF柱(GE Healthcare Bioscience)純化，之后用 Amicon Ultra-15 Ultracel_5k(Millipore)濃縮，再用 Superdex75pg26/60凝膠過濾柱(GE Healthcare Bioscience)進(jìn)一步純化，并用 AmiconUltra-15 Ultracel_5k(Millipore)進(jìn) 行濃縮，得到食蟹猴IL_6(以下記作cIL-6)的最終純品。公知高親和性抗IL-6受體抗體的制備為了表達(dá)公知的高親和性抗IL-6受體抗體、即US 2007/0280945A1中所述的高親 和性抗 IL-6 受體抗體 VQ8F11-21 hlgGl (US2007/0280945 Al，H鏈氨基酸序列、SEQ ID N0: 19 ;L鏈氨基酸序列、SEQ ID NO :27)，構(gòu)建動物細(xì)胞表達(dá)用載體?？贵w可變區(qū)通過組合有合 成寡DNA的PCR法(裝配PCR)來制備，恒定區(qū)則使用IgGl。利用裝配PCR法使抗體可變區(qū) 與恒定區(qū)結(jié)合，之后插入動物細(xì)胞表達(dá)用載體中，制備目標(biāo)H鏈表達(dá)載體和L鏈表達(dá)載體。 所得表達(dá)載體的核苷酸序列按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來確定。使用制備的表達(dá)載體 進(jìn)行表達(dá)、純化。表達(dá)、純化按照實施例1所述的方法進(jìn)行，得到高親和性抗IL-6受體抗體 (以下記作對照)。利用人ct130表達(dá)BaF3細(xì)胞(BaF/CT130)進(jìn)行的生物活性評價使用顯示IL-6/IL-6受體依賴性增殖的BaF3/gpl30，評價IL-6受體中和活性。將 BaF3/gpl30用含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基清洗3次，之后懸浮于含有600ng/mL或 60ng/mL人白介素-6 (TORAY)(終濃度為300ng/mL或30ng/mL)、適量的重組可溶性人IL-6受體(SR344)和10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，達(dá)到5X IO4細(xì)胞/mL，再向96孔平板 (CORNING)的各孔中分別注入50 μ L。接下來，將純化的抗體用含有10% FBS的RPMI1640 培養(yǎng)基稀釋，向各孔中分別混合50 μ L。在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)3天，以20 μ L/孔加 入用PBS稀釋至2倍的WST-8試劑(細(xì)胞計數(shù)試劑盒8 ；株式會社同仁化學(xué)研究所)，之后 立即使用SUNRISE CLASSIC(TECAN)測定450nm的吸光度(參比波長為620nm)。培養(yǎng)2小 時后，再次測定450nm的吸光度(參比波長為620nm)，以2小時的吸光度變化為指標(biāo)，評價 IL-6受體中和活性。利用Biacore評價與IL_6胺體的結(jié)合 使用Biacore TlOO (GE Healthcare)，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的速度論的分析。通過胺 耦合法將適量的抗IgG(Y-鏈特異性)F(ab’)2固定在傳感器芯片上，接下來，在pH7. 4下 使目標(biāo)抗體結(jié)合，再于PH7. 4下使調(diào)節(jié)為各種濃度的IL-6受體、即SR344作為分析物流動， 測定抗體與SR344的相互作用。所有測定均在37°C下進(jìn)行。由測定中得到的傳感圖算出動 力學(xué)參數(shù)、即結(jié)合速度常數(shù)ka(l/Ms)和解離速度常數(shù)kd(l/s)，根據(jù)該值算出Kd(M)。使用 Biacore TlOO評估軟件(GE Healthcare)計算各參數(shù)。誦i寸猴PK/PD i式駘測丨伊血漿中杭體濃度、CRP濃度以及非結(jié)合型的可溶型IL-6考 體濃度食蟹猴血漿中濃度測定按照ELISA法、利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行測 定。CRP濃度利用Cias R CRP(關(guān)東化學(xué)株式會社)、使用自動分析裝置(TBA-120FR、東芝 Medical Systems株式會社)進(jìn)行測定。食蟹猴血漿中非結(jié)合型的可溶型食蟹猴IL-6受體濃度如下測定。將30 μ L食蟹 猴的血漿添加到0. 22 μ m的濾杯(Millipore)中已干燥的適量rProtein A瓊脂糖快速流 動樹月旨(rProtein A Sepharose Fast Flow resinGE Healthcare)上，使血漿中存在的所 有IgG型抗體(食蟹猴IgG、抗人IL-6受體抗體、抗人IL-6受體抗體-可溶型食蟹猴IL-6 受體復(fù)合體)均吸附在蛋白A上。之后，用高速離心機(jī)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)來使血漿流下，回收通過的 溶液。由于通過的溶液中不含與蛋白A結(jié)合的抗人IL-6受體抗體-可溶型食蟹猴IL-6受 體復(fù)合體，所以通過測定通過蛋白A的溶液中的可溶型食蟹猴IL-6受體濃度，即可測定非 結(jié)合型的可溶型IL-6受體濃度。至于可溶型食蟹猴IL-6受體濃度，以上述制備的可溶型 食蟹猴IL-6受體(CIL-6R)作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用測定人IL-6受體濃度的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的方法進(jìn)行測定?？扇苄虸L-6受體的中和率通過下式來計算。(抗體給予后的非結(jié)合型的可溶性IL-6受體濃度+抗體給予前的可溶性IL-6受 體濃度)χ 100產(chǎn)業(yè)實用性通過本發(fā)明提供適合作為藥品的抗體恒定區(qū)，所述抗體恒定區(qū)通過改變抗體恒定 區(qū)的氨基酸序列，以使物性(穩(wěn)定性和均一性)、免疫原性、安全性及藥物動力學(xué)得到改善。
權(quán)利要求
下述(a)～(c)中任一項所述的人抗體恒定區(qū)(a)人抗體恒定區(qū)，其特征在于在SEQ ID NO1記載的氨基酸序列中，第329位(EU編號第446位)的Gly和第330位(EU編號第447位)的Lys均缺失；(b)人抗體恒定區(qū)，其特征在于在SEQ ID NO2記載的氨基酸序列中，第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的Lys均缺失；(c)人抗體恒定區(qū)，其特征在于在SEQ ID NO3記載的氨基酸序列中，第326位(EU編號第446位)的Gly和第327位(EU編號第447位)的Lys均缺失。
2.IgG2恒定區(qū)，其中，在SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列中，第209位(EU編號第330 位)、第210位(EU編號第331位)和第218位(EU編號第339位)的氨基酸被取代成其他 氨基酸。
3.IgG2恒定區(qū)，其中，在SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列中，第276位(EU編號第397 位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。
4.IgG2恒定區(qū)，其中，在SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列中，第14位(EU編號第131 位)、第102位(EU編號第219位)和/或第16位(EU編號第133位)的氨基酸被取代成 其他氨基酸。
5.權(quán)利要求4所述的IgG2恒定區(qū)，其特征在于在SEQID NO :2記載的氨基酸序列中， 第20位(EU編號第137位)和第21位(EU編號第138位)的氨基酸進(jìn)一步被取代成其他氨基酸。
6.IgG2恒定區(qū)，其中，在SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列中，第147位(EU編號第268 位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg和/或第298位(EU編號第419位)的 Gln被取代成其他氨基酸。
7.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ IDNO 2記載的氨基酸序 列中，第209位(EU編號第330位)、第210位(EU編號第331位)、第218位(EU編號第 339位)、第276位(EU編號第397位)、第14位(EU編號第131位)、第16位(EU編號第 133位)、第102位(EU編號第219位)、第20位(EU編號第137位)和第21位(EU編號第 138位)的氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
8.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在權(quán)利要求7所述的IgG2恒定 區(qū)中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。
9.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ IDNO 2記載的氨基酸序 列中，第276位(EU編號第397位)、第14位(EU編號第131位)、第16位(EU編號第133 位)、第102位(EU編號第219位)、第20位(EU編號第137位)和第21位(EU編號第138 位)的氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
10.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在權(quán)利要求9所述的IgG2恒定 區(qū)中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。
11.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ IDNO 2記載的氨基酸序 列中，第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的Arg、第102位(EU 編號第219位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第21位(EU編號第138位)的Ser、第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg和第298 位(EU編號第419位)的Gin被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
12.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在權(quán)利要求11所述的IgG2恒定 區(qū)中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。
13.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ IDN0 2記載的氨基酸序 列中，第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的Arg、第102位(EU 編號第219位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第21位(EU編號第138位) 的Ser、第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg、第298 位(EU編號第419位)的Gin以及第313位(EU編號第434位)的Asn被取代成其他氨基 酸的氨基酸序列。
14.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在權(quán)利要求13所述的IgG2恒定 區(qū)中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。
15.IgG4恒定區(qū)，其特征在于在SEQ ID NO 3記載的氨基酸序列中，第289位(EU編 號第409位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。
16.IgG4恒定區(qū)，該IgG4恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ IDN0 3記載的氨基酸序 列中，第14位、第16位、第20位、第21位、第97位、第100位、第102位、第103位、第104 位、第 105 位(EU 編號第 131、133、137、138、214、217、219、220、221、222 位)、第 113 位、第 114位、第115位(EU編號第233、234、235位)和第289位(EU編號409)的氨基酸被取代 成其他氨基酸且第116位(EU編號第236位)的氨基酸缺失的氨基酸序列。
17.IgG4恒定區(qū)，其中在權(quán)利要求16所述的IgG4恒定區(qū)中，進(jìn)一步缺失第326位(EU 編號第446位)的Gly和第327位(EU編號第447位)的Lys。
18.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ IDN0 :2記載的氨基酸序 列中，第209位(EU編號第330位)的Ala、第210位(EU編號第331位)的Pro、第218位 (EU編號第339位)的Thr、第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133 位)的Arg、第102位(EU編號第219位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第 21位(EU編號第138位)的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
19.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在權(quán)利要求18所述的IgG2恒定 區(qū)中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。
20.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在SEQ IDN0 2記載的氨基酸序 列中，第14位(EU編號131)的Cys、第16位(EU編號133)的Arg、第102位(EU編號219) 的Cys、第20位(EU編號137)的Glu、第21位(EU編號138)的Ser被取代成其他氨基酸 的氨基酸序列。
21.IgG2恒定區(qū)，該IgG2恒定區(qū)具有下述氨基酸序列在權(quán)利要求20所述的IgG2恒定 區(qū)中，進(jìn)一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。
22.人抗體恒定區(qū)，其具有SEQID NO :5中記載的氨基酸序列。
23.人抗體恒定區(qū)，其具有SEQID NO :7中記載的氨基酸序列。
24.人抗體恒定區(qū)，其具有SEQID NO :9中記載的氨基酸序列。
25.人抗體恒定區(qū)，其具有SEQIDNO :35中記載的氨基酸序列。
26.人抗體恒定區(qū)，其具有SEQID NO :36中記載的氨基酸序列。
27.人抗體恒定區(qū)，其具有SEQID NO :37中記載的氨基酸序列。
28.人抗體恒定區(qū)，其具有SEQID NO :43中記載的氨基酸序列。
29.人抗體恒定區(qū)，其具有SEQID NO :57(M40AGK)中記載的氨基酸序列。
30.人抗體恒定區(qū)，其具有SEQID NO :55(M86)中記載的氨基酸序列。
31.抗體，其具有權(quán)利要求1 30中任一項所述的恒定區(qū)。
32.抗IL-6受體抗體，其具有權(quán)利要求1 30中任一項所述的恒定區(qū)。
33.藥物組合物，其包含具有權(quán)利要求1 30中任一項所述的恒定區(qū)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明人等成功地改善了抗體恒定區(qū)在酸性條件下的穩(wěn)定性、來自鉸鏈區(qū)二硫鍵的異質(zhì)性、來自H鏈C末端的異質(zhì)性、在高濃度制劑中的穩(wěn)定性。進(jìn)一步成功地發(fā)現(xiàn)了在將新的T細(xì)胞表位肽的出現(xiàn)降至最小限度的同時降低與Fcγ受體結(jié)合的新的恒定區(qū)序列。由此，成功地發(fā)現(xiàn)了使物性(穩(wěn)定性和均一性)、免疫原性、安全性以及藥物動力學(xué)得到改善的抗體恒定區(qū)。
文檔編號C12N15/09GK101874041SQ20088011858
公開日2010年10月27日 申請日期2008年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月26日
發(fā)明者井川智之, 白巖宙丈 申請人:中外制藥株式會社