專利名稱：：修飾的Fc分子的制作方法修飾的Fc分子本申請要求申請日2004年9月24日，U.S.臨時申請?zhí)朜o.60/612,680為優(yōu)先權(quán)，其通過參考并入本文。
背景技術(shù)：
：藥物Enbrel(依那西普(etanercept))的成功使得有希望獲得與抗體恒定區(qū)結(jié)合的修飾治療劑?？贵w包括兩個功能獨立的部分，一個結(jié)合抗原的稱為"Fab"的可變區(qū)和一個稱為"Fc"的恒定區(qū)，恒定區(qū)與諸如補體激活和由吞噬細胞攻擊的效應子功能有關(guān)。Fc的血清半衰期長，而Fab是短壽的。Capon等(1989)，Nature337:525-31。當Fc結(jié)構(gòu)域與治療蛋白一起構(gòu)建時，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域可以提供較長的半衰期，或加入一些功能，諸如Fc受體結(jié)合、蛋白A結(jié)合、補體結(jié)合，也許甚至加入胎盤轉(zhuǎn)移。盅處同前。表l總結(jié)了本領(lǐng)域己知的Fc融合蛋白的應用。表l-Fc與治療蛋白的融合體<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>研制治療劑的一種相當不同的方法是肽文庫篩選。蛋白配體與其受體的相互作用通常發(fā)生在相對大的界面上。然而，正如用人生長激素及其受體所證明的，界面上僅少數(shù)關(guān)鍵殘基提供大部分結(jié)合能.Clackson等(1995)，Science267:383-6。大多數(shù)蛋白配體僅在適當?shù)耐負浣Y(jié)構(gòu)下展示結(jié)合表位，或用于與結(jié)合無關(guān)的功能。因此，僅"肽"長度(2-40個氨基脧)的分子可以結(jié)合于特定大蛋白配體的受體蛋白。這種肽可以模擬所述大蛋白配體的生物活性("肽激動劑")，或通過競爭結(jié)合抑制所述大蛋白配體的生物活性("肽拮抗劑")。噬菌體展示肽文庫已經(jīng)作為鑒定這種肽激動劑和肽拮抗劑的有力的方法出現(xiàn)。參見例如Scott等(1990)，Science,249:386;Devlin等(1990)，Science,249:404;1993年6月29日授予的美國專利No.5,223,409;1998年3月31日授予的美國專利No.5，733,731;1996年3月12日授予的美國專利No.5，498，530;1995年7月11日授予的美國專利No.5，432,018;1994年8月16日授予的美國專利No.5,338,665;1999年7月13日授予的美國專利No.5，922,545;1996年12月19日公開的WO96/40987;和1998年4月16日公開的W098/15833(每個文獻均引入以供參考)。在這種文庫中，通過與絲狀噬菌體的外被蛋白融合呈現(xiàn)隨機肽序列。通常，針對抗體固定的受體胞外域親和洗脫所述呈現(xiàn)的肽。可以通過連續(xù)數(shù)輪親和純化和再繁殖富集保留的噬菌體?？梢詫ψ罴呀Y(jié)合肽測序，以鑒定一個或多個結(jié)構(gòu)相關(guān)肽家族內(nèi)的關(guān)鍵殘基。參見例如Cwirla等(1997)，Science276:1696-9，其中鑒定了兩個不同的家族。所述肽序列也可以提示哪些殘基可以通過丙氨酸掃描或通過在DNA水平上誘變來安全置換。可以創(chuàng)造誘變文庫并對其篩選，以進一步優(yōu)化最佳結(jié)合物的序列。Lowman(1997)，Ann.Rev.Biophvs.Biomol.Struct.26:401-24。其它方法在肽研究方面與噬菌體展示競爭。可以將肽文庫與fe阻遏物的羧基端融合并在iMM中表達。另一種基于大腸桿菌的方法允許通過與肽聚糖有關(guān)的脂蛋白(PAL)融合而呈現(xiàn)在細胞外膜上。在下文中，這些方法和相關(guān)方法被統(tǒng)稱為"大腸桿菌展示"。另一種篩選可溶性肽混合物的生物方法使用酵母來表達和分泌。參見Sm池等(1993),Mol.Pharmacol.43:741-8。在下文中，Smith等的方法和相關(guān)方法被稱為"基于酵母的篩選"。在另一方法中，在核糖體釋放之前停止隨機RNA的翻譯，產(chǎn)生仍附著有其結(jié)合的RNA的多肽文庫。在下文中，該方法和相關(guān)方法被統(tǒng)稱為"核糖體展示"。其它方法利用肽與RNA的化學鍵；參見例如Roberts和Szostak(1997),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:12297-303。在下文中，該方法和相關(guān)方法統(tǒng)稱為"RNA-肽篩選"。已經(jīng)開發(fā)了化學衍生的肽文庫，其中肽固定在穩(wěn)定的非生物材料上，諸如聚乙烯棒或溶劑可滲透的樹脂。另一化學衍生的肽文庫使用光刻法來篩選固定到玻璃玻片上的肽。在下文中，這些方法和相關(guān)方法統(tǒng)稱為"化學肽篩選"。化學肽篩選可能是有利的，因為它允許利用D-氨基酸和其它非天然類似物以及非肽組分。在Wells和1o畫an(1992)，Curr.Opin.Biotechnol.3:355-62中綜述了生物方法和化學方法。就已知生物活性的肽來說，可以將肽配體合理設計成具有優(yōu)良的治療特性。在這種方法中，人們可以對肽序列進行逐步改變，來確定該替換對該肽生物活性或推測性生物物理特性(如溶液結(jié)構(gòu))的影響。在下文中，這些技術(shù)統(tǒng)稱為"合理設計"。在一種所述技術(shù)中，每次將一系列肽中的單個氨基酸用丙氨酸替換。該技術(shù)通常稱為"丙氨酸步移(alaninewalk)"或"丙氨酸掃描"。當兩個殘基(緊鄰或間隔開)被替換時，就稱為"雙丙氨酸步移"。獲得的氨基酸替換物可以單獨使用或者組合使用，從而獲得具有優(yōu)良治療特性的新肽實體。蛋白-蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)分析也可以用來提示模擬大蛋白配體結(jié)合活性的肽。在這種分析中，晶體結(jié)構(gòu)可以提示所述大蛋白配體關(guān)鍵殘基的身份和相對定位，據(jù)此可以設計肽。參見例如Takasaki等(1997)，NatureBiotech.15:1266-70。在下文中，這些方法和相關(guān)方法稱為"蛋白結(jié)構(gòu)分析"。這些分析方法也可以用來研究受體蛋白和通過噬菌體展示選擇的肽之間的相互作用，這可以提示對所述肽的進一步修飾以增加結(jié)合親和性。在概念上，采用噬菌體展示和上述的其它方法，人們可以發(fā)現(xiàn)任何蛋白的肽模擬物。這些方法已經(jīng)用于表位作圖、鑒定蛋白-蛋白相互作用中的關(guān)鍵氨基酸，并且用作發(fā)現(xiàn)新治療劑的指導。例如Cortese等(1996)，Curr.O。in.Biotech.7:616-21。現(xiàn)在肽文庫最常用于免疫學研究，例如表位作圖。Kreeger(1996)，TheScientist10(13):19-20。本文特別關(guān)注的是肽文庫和其它技術(shù)在發(fā)現(xiàn)藥理學活性肽方面的應用。在表2中總結(jié)了本領(lǐng)域鑒定的許多這種肽。在所列出的出版物中描述了所述肽，每個出版物引入本文以供參考。描述了所述肽的藥理學活性，并且在許多情況下在括號內(nèi)后接其簡寫術(shù)語。這些肽中的某些肽已經(jīng)進行了修飾(例如，形成C末端交聯(lián)的二聚體)。通常，根據(jù)與藥理學活性蛋白受體(例如EPO受體)的結(jié)合篩選肽文庫。在至少一種情況下(CTLA4)，根據(jù)與單克隆抗體的結(jié)合篩選所述肽文庫。表2-藥理學活性肽肽形式結(jié)合配偶體/目的蛋白a藥理學活性參考文獻肽內(nèi)二硫鍵EPO受體EPO-模擬物Wrighton等(1996),Science273:458-63;1998年6月30日授予Wrighton等的美國專利No.5,773,569c末端交聯(lián)EPO受體EPO-模擬物Livnah等(1996),Science273:464-71;二聚體Wrighton等(1997),NatureBiotechnology15:1261-5;19%年12月19日公布的國際專利申請WO96/40772線性EPO受體EPO-模擬物Naranda等(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:7569-74;1996年9月23日公布的WO99/47151線性;C末端交c-MplTPO-模擬物Cwirla等(1997)Science276:1696-9;聯(lián)二聚體1999年2月9日授予的美國專利No.5,869,451;1999年8月3日授予的美國專利No.5,932,946;2000年5月4日公布的WO00/24770;2003年9月18日公布的美國專利申請No.2003/0176352;2003年4月17日公布的WO03/031589a在該欄中所列出的蛋白可以被相關(guān)的肽(例如EPO受體，IL-1受體)結(jié)合或被相關(guān)的肽模擬。所列出的參考文獻分別用來說明該分子是被所述肽結(jié)合還是被所述肽模擬。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>線性Ras效應子結(jié)構(gòu)域通過抑制ras癌基因的生物功能而抗腫Moodie等(1994)，TrendsGenet10:44-48Rodriguez4(1994)，Nature370:527-532線性SH2/SH3結(jié)構(gòu)域通過用活化的酪氨酸激酶抑制腫瘤生長而抗腫瘤；治療SH3介導的疾病狀態(tài)("SH3拮抗劑")Pawson等(1993)，Curr.Biol.3:434-432Yu等(1994),Cell76:933-945;Rickles等(1994),EMBOJ.13:5598-5604;Sparks4(1994)，J.Biol.Chem.269:23853-6;Sparks等(1996)'Proc.Natl.Acad.Sci.93:1540-4;1999年3月23日授予的美國專利No.5,886,150;1999年3月30日授予的美國專利No.5,888,763<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>治療與整聯(lián)蛋白介導的細胞事件相關(guān)的病癥，包括血小板聚集、血栓形成、傷口愈合、骨質(zhì)疏松、組織修復、血管生成(例如治療癌癥)，和腫瘤侵入("整聯(lián)蛋白結(jié)合")1995年6月1日公開的國際申請WO95/14714;1997年3月6日公開的WO97/08203;1998年3月19日公開的WO98/10795;1999年5月20日公開的WO99/24462;Kraft等(1999)，J.Biol.Chem.274:1979-1985<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>通過肽文庫篩選鑒定的肽已經(jīng)長期被認為是研制治療劑的"指導"，而不是被認為是治療劑本身。同其它蛋白和肽一樣，它們將在tt通過腎過濾、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的細胞清除機制，或蛋白水解降解而被快速去除。Francis(1992),FocusonGrowthFactors3:4-11。結(jié)果，本領(lǐng)域應用所鑒定的肽來確證藥物靶或作為設計尚不能通過化學文庫篩選容易或快速鑒定的有機化合物的支架。Lowmana997),Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct26:401-24;Kay等0998),DrugDisc.Todav3:370-8。最近的研究是將隨機產(chǎn)生的肽與Fc結(jié)構(gòu)域融合。參見2003年12月9日授予Feige等的美國專利No.6，660，843(其全部引入供參考)。該分子已被稱為"肽體(peptibodies)"。它們包括連接到N-末端，C-末端，氨基酸側(cè)鏈，或連接到兩種或兩種以上所述位置的的一種或多種肽。肽體技術(shù)能夠?qū)⒅委焺┰O計成結(jié)合靶定一種或多種配體或受體、腫瘤尋耙肽，膜轉(zhuǎn)運肽等的肽。肽體技術(shù)已證實在設計許多下述分子方面是有用的，包括線性和二硫鍵束縛的肽，"串聯(lián)肽多聚體"(即，在Fc結(jié)構(gòu)域單鏈上有多于一種肽)。參見，例如美國專利No.6,660,843;2003年10月16日公開的美國專利申請No.2003/0195156(對應于2002年11月21日公開的WO02/092620);2003年9月18日公開的美國專利申請No.2003/0176352(對應于2003年4月17日公開的WO03/031589);1999年10月22日申請的美國系列No.09/422，838(對應于2000年5月4日公開的WO00/24770);2003年12月11日公開的美國專利申請No.2003/0229023;2003年7月17曰公開的WO03/057134;2003年12月25日公開的美國專利申請No.2003/0236193(對應于2004年4月8日申請的PCT/US04/010989);2003年9月18日申請的美國系列No.10/666,480(對應于2004年4月1日公開的WO04/026329)，其整體引入本文以供參考。本領(lǐng)域?qū)倪M一步的技術(shù)中獲益，通過該技術(shù)能夠合理設計多肽治療劑。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種將至少一種生物活性肽以內(nèi)部序列引入Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)的方法。所述內(nèi)部序列可以通過插入(即插到先前存在的Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸序列之間)或通過取代先前存在的Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸(即除去先前存在的FC結(jié)構(gòu)域中的氨基酸并添加肽氨基酸)來添加。在后一情況中，添加的肽氨基酸數(shù)量不需要與從先前存在的Fc結(jié)構(gòu)域除去的氨基酸數(shù)量相等；例如，本發(fā)明涉及一種除去了IO個氨基酸并且添加了15個氨基酸的分子。在本發(fā)明中，藥理學活性化合物的制備方法包括a)選擇調(diào)節(jié)目的蛋白活性的至少一種肽；和b)制備一種藥物，其包含作為Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)部序列的選定肽的氨基酸序列?？梢杂迷摲椒▉韺δ切┮呀?jīng)通過N-末端或C-末端或側(cè)鏈與多肽連接(例如依那西普)或與肽連接的Fc結(jié)構(gòu)域進行修飾(如美國專利申請No.2003/0195156，2003/0176352，2003/0229023，和2003/0236193;WO00/24770;WO04/026329所述)。本文描述的該方法還可以用于對抗體部分的Fc結(jié)構(gòu)域進行修飾(例如adalimumab，epratuzumab，infliximab,Herceptir^等)。這樣，可以將不同分子制成具有額外的功能性，比如結(jié)合不同表位的結(jié)構(gòu)域，或者結(jié)合前體分子現(xiàn)有表位的額外結(jié)構(gòu)域。所述表位可以是例如通過噬菌體展示(優(yōu)選)，大腸桿菌展示，核糖體展示，RNA-肽篩選，合理設計，或蛋白結(jié)構(gòu)分析選定的，或者可以是天然存在的月太(如PTH，GLP-1)。本發(fā)明進一步涉及包括Fc結(jié)構(gòu)域的分子，所述Fc結(jié)構(gòu)域被修飾成含有作為Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)部序列(優(yōu)選在環(huán)區(qū)域內(nèi))的肽。包含內(nèi)部肽序列的分子被稱為"Fc內(nèi)部肽體"或"Fc內(nèi)部肽分子"。這些分子將在下文中做進一步描述。Fc內(nèi)部肽分子可以在特定的內(nèi)部區(qū)域內(nèi)包括串聯(lián)的兩個或兩個以上的肽序列，并且可以在其它內(nèi)部區(qū)域內(nèi)包括其它肽。雖然優(yōu)選假定的環(huán)區(qū)域，但在Fc的任何其它非末端結(jié)構(gòu)域插入也在本發(fā)明的考慮范圍之內(nèi)。本發(fā)明也包括上述化合物的變體和衍生物(在下文描述)。本發(fā)明的化合物可以通過標準合成法、重組DNA技術(shù)、或制備肽和融合蛋白的任何其它方法來制備。設想的Fc內(nèi)部肽分子的主要用途是作為治療劑或預防劑。選定肽的活性可能與該肽模擬的天然配體相當，或甚至活性更高。另外，某些基于天然配體的治療劑可能誘導針對患者自身內(nèi)源配體的抗體；相反，所述載體連接肽(vehicle-linkedpeptide)的獨特序列通過幾乎不具有或通常不具有同所述天然配體一樣的序列，而避免了這種缺陷。另外，F(xiàn)c內(nèi)部肽體可能在重折疊和純化方面較N-或C-末端連接的Fc分子具有優(yōu)勢。另外，由于嵌合域的穩(wěn)定化作用，使得Fc內(nèi)部肽體可能在熱力學上更加穩(wěn)定，并由于增加了對氨基和羧基肽酶的蛋白水解降解抗性，而使得Fc內(nèi)部肽體可能在化學性質(zhì)上也更加穩(wěn)定。Fc內(nèi)部肽體可能還會顯現(xiàn)出改善的藥代動力學特性。雖然主要設想本發(fā)明化合物作為治療劑，但本發(fā)明的化合物也可以用于篩選這些治療劑。例如，在使用抗-Fc包被板的測定中，人們可以使用Fc內(nèi)部肽體(例如Fc-環(huán)-SH2結(jié)構(gòu)域肽)。Fc內(nèi)部肽體可以使不溶性肽成為可溶性，并因此可用于許多測定中。通過將本發(fā)明的化合物與合適的藥用載體物質(zhì)一起配制，并將其以有效量給予有需要的患者例如人(或其它哺乳動物)，可以將本發(fā)明的化合物用于治療或預防目的。其它相關(guān)方面也包括在本發(fā)明中?？紤]到附圖和發(fā)明詳述，本發(fā)明的許多其它方面和優(yōu)點將是顯而易見的。附圖簡述圖1A，1B和1C顯示FC結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)，該環(huán)區(qū)可以按照本發(fā)明來加以修飾。在這種FcCH2和CH3結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的表達式中，所述環(huán)區(qū)可以認為是未顯示為p-折疊(平面箭頭)或a-螺旋(圓柱體)的模型的任意部分。圖1A顯示單體鼠IgG2aFc結(jié)構(gòu)域(蛋白數(shù)據(jù)庫#1I1C，http:〃www.rcsb.org/pdb/)。該圖顯示鼠IgG2aFc結(jié)構(gòu)域單體X光衍射晶體結(jié)構(gòu)的三維模型(pdb#111C)。潛在的Fc環(huán)插入位點顯示為CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，尤其優(yōu)選鑒定的CH3結(jié)構(gòu)域Fc環(huán)插入位點。圖1B顯示單體鼠IgGlFc結(jié)構(gòu)域(蛋白數(shù)據(jù)庫弁1IGY)。該圖顯示鼠IgGlFc結(jié)構(gòu)域單體X光衍射晶體結(jié)構(gòu)的三維模型(pdb#1IGY)。潛在的Fc環(huán)插入位點顯示為CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，尤其優(yōu)選鑒定的CH3結(jié)構(gòu)域FC環(huán)插入位點。圖1C顯示單體人IgGlFc結(jié)構(gòu)域(蛋白數(shù)據(jù)庫MH3T)。該圖顯示人IgGlFc結(jié)構(gòu)域單體X光衍射晶體結(jié)構(gòu)的三維模型(pdb#1H3T)。潛在的Fc環(huán)插入位點顯示為CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，尤其優(yōu)選鑒定的CH3結(jié)構(gòu)域Fc環(huán)插入位點。.這些結(jié)構(gòu)說明不同IgG亞型和物種間的Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)的二級和三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象的高度同源性。這些結(jié)構(gòu)的X光晶體結(jié)構(gòu)坐標可以在RCSBProteinDataBank中找妾U(http:〃www.rcsb.org/pdb/)。圖2A顯示人IgGlFc序列用于與黑體字顯示的預測環(huán)序列的肽體融合的序列(SEQIDNO:599)。圖2A顯示，在用于本發(fā)明的人IgGl序列中，黑體字的Fc環(huán)區(qū)(SEQIDNOS:621,622,624，625，627，628,630,632，634,和636)，其由圖1A，1B和1C顯示的結(jié)構(gòu)所提示。任何，或所有這些黑體字顯示的位點可能適合全部或部分的肽序列置換或插入，而且被認為是本發(fā)明的一部分。特別優(yōu)選的內(nèi)部位點是劃有下劃線的(SEQIDNOS:623，626，629，631，633，635，和637)。一個優(yōu)選的位點是在DELTK(SEQIDNO:630)環(huán)的Leu!39和Thr,4o之間的SEQIDNO:631。其它Ig亞型中的潛在環(huán)位點是在圖2B和2C提供的比對的基礎(chǔ)上本領(lǐng)域所可以理解的。圖2B和2C顯示IgA，IgM和IgG亞類的人Fc結(jié)構(gòu)域的序列比對。圖2B和2C顯示IgA，IgM和IgG亞型的人Fc區(qū)的示例性氨基酸序列(SEQIDNOS:600至607)，所述序列對于本發(fā)明是有用的。圖2B和2C還顯示了一個共有序列(Consensussequence)(SEQIDNO:608)。圖2B和2C還以黑體字顯示了用于肽添加的優(yōu)選內(nèi)部位點，所述位點相應于圖2A顯示的那些Fc序列(SEQIDNO:599)。具體地說，圖2B和2C顯示下述優(yōu)選位點-在SEQIDNOS:603至608中以黑體字顯示的SEQIDNO:621;-在SEQIDNOS:603至606和608中的SEQIDNO:622;-在SEQIDNO:607中的SEQIDNO:638;-在SEQIDNO:603至608中的SEQIDNO:624;-在SEQIDNO:603和604中的SEQIDNO:625;-在SEQIDNO:605至608中的SEQIDNO:639;-在SEQIDNO:603至605，607，和608中的SEQIDNO:627;-在SEQIDNO:606中的SEQIDNO:640;-在SEQIDNO:603，604，和608中的SEQIDNO:628;-在SEQIDNO:605中的SEQIDNO:641;-在SEQIDNO:606中的SEQIDNO:642;畫在SEQIDNO:607中的SEQIDNO:643;-在SEQIDNO:603中的SEQIDNO:630;-在SEQIDNO:604至608中的SEQIDNO:644;-在SEQIDNO:603，604，606，607，和608中的SEQIDNO:632;畫在SEQIDNO:605中的SEQIDNO:645;-在SEQIDNO:603，604，和607中的SEQIDNO:634;-在SEQIDNO:605，606，和608中的SEQIDNO:646;-在SEQIDNO:603，604，606，和608中的SEQIDNO:636;-在SEQIDNO:605中的SEQIDNO:614;和-在SEQIDNO:607中的SEQIDNO:620;圖2B和2C的序列比對說明Q^/Pw8和/或G^/Sm是兩個更潛在的插入位點(使用圖2A中SEQIDNO:599的編號)。這些位置對應IgG序列中的缺口，在比對的IgA和IgM序列中發(fā)現(xiàn)在該缺口處有2個和3個殘基插入。其它優(yōu)選的插入位點對應于圖2A的序列。優(yōu)選的插入位點是圖2B和2C的下劃線，如下-SEQIDNO:603和604中的H53/E54;-SEQIDNO:605中的H^/Ekh;-SEQIDNO:606中的H49/E50;-SEQIDNO:607中的Q5()/E51;畫SEQIDNO:608中的H112/E113;-SEQIDNO:603和604中的Y81/N82;-SEQIDNO:605中的F128/N129;-SEQIDNO:606中的F77/N78;-SEQIDNO:607中的F78/N79;-SEQIDNO:608中的F140/N141;-SEQIDNO:603和604中的N110/Km;-SEQIDNO:605中的N157/K158;-SEQIDNO:606中的N106/K107;-SEQIDNO:607中的N1()7/K108;-SEQIDNO:608中的N169/K170;-SEQIDNO:603和604中的L143/T144;-SEQIDNO:605中的M190/T191;-SEQIDNO:606中的M139/T140;-SEQIDNO:607中的M140/T141;-SEQIDNO:608中的M204/T205;-SEQIDNO:603和604中的Q171P172;-SEQIDNO:605中的Q218/P219;-SEQIDNO:606中的Q167/P168;-SEQIDNO:607中的Q168/P169;-SEQIDNO:608中的Q232/P233;-SEQIDNO:603和604中的E173N174;-SEQIDNO:605中的E22。/N221;-SEQIDNO:606中的E169/N170;-SEQIDNO:607中的E170/N171;-SEQIDNO:608中的E234/N235;-SEQIDNO:603和604中的S186/D87;-SEQIDNO:605中的S232/D233;-SEQIDNO:606中的S181/D182;-SEQIDNO:607中的S182/D183;-SEQIDNO:608中的S246/D247;-SEQIDNO:603和604中的G188/S189;-SEQIDNO:605中的G234/S235;-SEQIDNO:606中的G183/S184;-SEQIDNO:607中的G184/S185;-SEQIDNO:608中的G248/S249;國SEQIDNO:603和604中的G205/N206;誦SEQIDNO:605中的G252/N253;-SEQIDNO:606中的G2()1/N202;-SEQIDNO:607中的G202/N203;禾口畫SEQIDNO:608中的G268/N269;圖2D顯示用于肽體平臺的人IgGlFc結(jié)構(gòu)域(AmgenFc，SEQIDNO:609)與來自FcRn/Fc復合體晶體結(jié)構(gòu)的大鼠IgG2A(111A.pdb，SEQIDNO:610)的比對。還顯示了所得的共有序列(SEQIDNO:611)。圖3A顯示包含插入的肌肉生長抑制素(myostatin)結(jié)合肽(SEQIDNO:365)的人IgGlFc結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:612)。在下文中，該分子稱為"肌肉生長抑制素環(huán)肽體"或"Fc-環(huán)-myo7"。插入的肽以黑體字顯示，甘氨酸接頭以斜體字顯示。圖3B顯示稱為TN8-19-07的C-末端連接的肽體的氨基酸序列(SEQIDNO:613)。該肽體包括與Fc-環(huán)-myo7相同的肽序列(SEQIDNO:365)。該TN8-19-07肽以黑體字顯示，甘氨酸和丙氨酸接頭以斜體字顯示。圖3C顯示下文稱為Fc-環(huán)-EMP的Fc內(nèi)部肽體的氨基酸序列(SEQIDNO:615)。該肽體包括EPO-模擬肽(SEQIDNO:2)。該插入肽以黑體字顯示，甘氨酸接頭以斜體字顯示。形成二硫鍵的半胱氨酸以下劃線顯示。圖3D顯示下文稱為Fc-環(huán)-Amp2的Fc內(nèi)部肽體的氨基酸序列(SEQIDNO:616)。生物活性的肽(SEQIDNO:28)以黑體字突出顯示，甘氨酸接頭以斜體字顯示。在AMP-2肽插入中沒有二硫鍵的束縛。圖3E顯示下文稱為Fc-環(huán)-AMP2-二聚體的C-末端連接的肽體的氨基酸序列(SEQIDNO:617)。該串聯(lián)連接的治療性肽二聚體以黑體字顯示治療性肽序列(SEQIDNO:28)，以斜體字顯示接頭。該分子包括與在Fc-環(huán)-AMP-2中發(fā)現(xiàn)的肽序列相同的串聯(lián)肽二聚體。圖4A和4B顯示采用SDS-PAGE(4-20。/。)的Fc-環(huán)-myo7和TN8-19-07在大腸桿菌中的表達。Fc-環(huán)-Myo7(#6951)和TN8-19-07(#6826)的粗細胞裂解物，不可溶部分(insol)和可溶(sol)部分樣本都在還原膠中示出。SeeBlue和分子量標記物(泳道l)，全部的細胞裂解物(泳道2)，不可溶部分(泳道3)和不可溶部分(泳道4)。圖5顯示Fc-環(huán)-Myo7(弁6951)和TN8-19-07(弁6826)的未純化的重折疊反應的反相高效液相層析(RP-HPLC)比較。將直接來自重折疊反應的約10嗎肽體加至VydakC4柱(5^M，300A，4.6x250mm)，用線性40-50%ACN以0.5%/分鐘梯度洗脫。圖6顯示Fc-環(huán)TN8-19-07(弁6951)和羧基端FcTN8-19-07(站826)的最終純化物(pool)的反相高效液相層析(RP-HPLC)比較。將10昭純化的肽體加至VydakC4柱(5pM，300A，4.6x250mm)，用線性40-50。/。ACN以0.5%/分鐘梯度洗脫。圖7顯示采用SDS-PAGE(4-20%凝膠)，F(xiàn)c-環(huán)TN8-19-07(#6951)和羧基端FcTN8-19-07(#6826)最終純化物分析。以下列順序?qū)⒏鳂悠?嗎上樣#6951(泳道1)，#6826(泳道2)，SeeBlue+標記物(泳道M)，還原的#6951(泳道3)，還原的粘826(泳道4)。圖8顯示用于測定肌肉生長抑制素抑制化合物的基于體外細胞的生物分析。Fc-環(huán)TN8-19-07(弁6951)保留了與羧基端TN8-19-07肽體(#6826)相關(guān)的全部抑制活性。圖9顯示研究Fc-環(huán)TN8-19-07(弁6951)和羧基端TN8-19-07肽體(弁6826)體內(nèi)穩(wěn)定性的western印跡分析。在各時間點(O，4，24和48小時)對五只小鼠的血清庫進行評價。泳道1-3分別是2ng，5ng和10ng的Fc-環(huán)TN8-19-07標準物。泳道4和5分別是4小時的Fc-環(huán)與羧基端肽體。泳道6和7分別是24小時的Fc-環(huán)與羧基端肽體。泳道8和9分別是48小時的Fc-環(huán)與羧基端肽體。泳道10-12分別是2ng，5ng和10ng的羧基端肽體標準物。凝膠是1mm4-12%SDS-PAGE凝膠，在MES還原緩沖液中進行電泳，所述western印跡利用羊抗人IgGFc-HRP偶聯(lián)物進行顯影。圖10A顯示含有插入的Ang2結(jié)合肽(SEQIDNO:147)的人IgGlFc結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:618)。在下文中，該分子稱為"Ang2環(huán)肽體"或"Fc-環(huán)-Ang2"。該生物活性肽以黑體突出顯示，甘氨基接頭以斜體顯示。圖10B顯示C末端連接肽體的氨基酸序列(SEQIDNO:619)，本文稱為TN8-Con4。該分子含有與Fc-環(huán)-ang2(SEQIDNO:147)相同的肽序列。該生物活性肽用黑體突出顯示，甘氨基酸接頭用斜體顯示。圖11顯示利用SDS-PAGE，F(xiàn)c-環(huán)TN8-Con4(存6888)和羧基端TN8-Con4(#5564)肽體在大腸桿菌中的表達和分布。Fc-環(huán)-Tn8-Con4(#6888)和TN8-Con4^5564)的粗細胞裂解物(lys)，不可溶部分(insol)和可溶部分(sol)顯示在還原凝膠內(nèi)。圖12顯示Fc-環(huán)Ang2(弁6888)和羧基端FcTN8-19-07(弁5564)重折疊產(chǎn)物的RP-HPLC比較。將20pl重折疊產(chǎn)物上樣至VydakC4柱(5300埃，4.6x250mm)，并用線性40-50%CAN以0.5%/min梯度洗脫。圖13顯示Fc-環(huán)Ang2(糾888)和羧基端FcTN8-Con4(弁5564)最終純化物的RP-HPLC比較。將10昭純化肽體上樣至VydakC4柱(5^M,300埃,4.6x250mm)，并用線性40-50%CAN以0.5°/。/min梯度洗脫。圖14顯示純化的Fc-環(huán)-myo7和TN8-19-7。圖15顯示Fc-環(huán)-ang2和Fc-ang2-串聯(lián)的Biacore結(jié)合分析。圖16顯示Fc-環(huán)-ang2，TN8-Con4，和Fc-ang2-串聯(lián)的體外酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)結(jié)果。圖17顯示Fc-環(huán)-EMP的UT7促紅細胞生成素增殖分析結(jié)果。在該分析中，對兩種不同F(xiàn)c-環(huán)-EMP分子的活性與促紅細胞生成素a(epoetinalfe)的活性進行了比較。圖18顯示利用SDS-PAGE，F(xiàn)c-環(huán)TN8-Amp2(弁6875)肽體在大腸桿菌中的表達和分布。Fc-環(huán)-Amp2^6888)的粗細胞裂解物(lys)，不可溶部分(insol)和可溶部分(sol)顯示在還原凝膠內(nèi)。圖19顯示利用SDS-PAGE(4-20。/。凝膠)，F(xiàn)c-環(huán)AMP2(糾875)最終純化物的分析。泳道2上樣5嗎Fc-環(huán)AMP2肽體，泳道4上樣5嗎還原的Fc-環(huán)AMP2肽體；泳道1和3上樣SeeBlue和兩種分子量標記物。圖20顯示Fc-環(huán)AMP2(#6875)最終純化物的RP-HPLC分析。將10(ig純化的肽體加至VydakC4柱(5^M，300埃，4.6x250mm)上，并用線性40-50%CAN以0.5%/min梯度洗脫。圖21顯示Fc-環(huán)AMP2和AMG531肽體的鼠體內(nèi)生物分析。小鼠單純以皮下注射50pg/kg劑量的肽體或單獨的載體。參見實施例9的分析方法。圖22顯示將2個生物活性肽引入Fc-環(huán)肽體的多種策略。圖23顯示純化的Fc-環(huán)構(gòu)建體的SDS-PAGE凝膠。樣品(2ug/泳道)在4-20%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠上，+/-還原緩沖液進行電泳。圖24顯示Fc-環(huán)構(gòu)建體的RP-HPLC。發(fā)明詳述術(shù)語的定義在整個本說明書中使用的術(shù)語定義如下，除非在具體情況下另外限定。當與氨基酸序列相關(guān)聯(lián)使用時，術(shù)語"包含"或"包括"是指化合物可以在給定序列的N末端或C末端上包括另外的氨基酸。"抗體"或"抗體肽"是指完整抗體，或其能與完整抗體競爭來特異性結(jié)合的結(jié)合片段，包括嵌合、人源化、完全人和雙特異性抗體。在某些實施方案中，結(jié)合片段是通過重組DNA技術(shù)制備而成的。在其它實施方案中，結(jié)合片段是通過酶或化學裂解完整抗體而制成的。結(jié)合片段包括，但不限于，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')2，F(xiàn)v和單鏈抗體。術(shù)語"天然Fc"是指包含通過消化完整抗體產(chǎn)生的、無論是單體形式或是多聚體形式的非抗原結(jié)合片段序列的分子或序列，其可通過插入和置換環(huán)區(qū)而將肽序列添加到所述天然Fc中。天然Fc的原始免疫球蛋白源優(yōu)選來源于人類，可以是所述免疫球蛋白中的任一種，盡管優(yōu)選IgGl和lgG2。天然Fc由可以通過共價連接(例如二硫鍵)和非共價連接而連接為二聚體或多聚體形式的單體多肽構(gòu)成。天然Fc分子單體亞基之間的分子間二硫鍵數(shù)目在1-4內(nèi)變動，取決于類別(例如IgG、IgA、IgE)或亞類(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgAl、IgGA2)。天然Fc的一個實例是通過用木瓜蛋白酶消化IgG產(chǎn)生的二硫鍵連接的二聚體(參見Ellison等(1982)，NucleicAcidsRes.10:4071-9)。本文所用的術(shù)語"天然Fc"—般是指單體、二聚體和多聚體形式。術(shù)語"Fc變體"是指由天然Fc修飾、但仍包含補救受體(salvagereceptor)FcRn結(jié)合位點的分子或序列。國際申請WO97/3463l(于1997年9月25日公開)和WO96/32478描述了典型的Fc變體以及與所述補救受體的相互作用，所述國際申請引入本文供參考。因此，術(shù)語"Fc變體"包括從非人類天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以去除的位點，因為所述位點提供本發(fā)明融合分子不需要的結(jié)構(gòu)特征或生物活性。因此，術(shù)語"Fc變體"包括缺乏影響或參與下列作用的一個或多個天然Fc位點或殘基的分子或序列(l)二硫鍵的形成，(2)與選定宿主細胞不親和性，(3)在選定宿主細胞中表達時N末端異質(zhì)性，(4)糖基化，(5)與補體相互作用，(6)與Fc受體結(jié)合，而不與補救受體結(jié)合，或C0依賴抗體的細胞的細胞毒性(ADCC)。在下文進一步描述Fc變體。術(shù)語"Fc結(jié)構(gòu)域"包括以上定義的天然Fc和Fc變體分子和序列。關(guān)于Fc變體和天然Fc，術(shù)語"Fc結(jié)構(gòu)域"包括單體或多聚體形式的分子，無論其通過消化完整抗體產(chǎn)生還是用其它方法產(chǎn)生。應用于Fc結(jié)構(gòu)域或包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的分子的術(shù)語"多聚體"是指具有兩條或更多條通過共價、非共價或通過共價和非共價相互作用結(jié)合的多肽鏈的分子。IgG分子通常形成二聚體；IgM形成五聚體；IgD形成二聚體；而IgA形成單體、二聚體、三聚體、或四聚體。通過利用Fc天然Ig源的所述序列和所產(chǎn)生的活性、或通過衍生(如下定義)這種天然Fc，可以形成多聚體。應用于Fc結(jié)構(gòu)域或包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的分子的術(shù)語"二聚體"是指具有兩條共價或非共價連接的多肽鏈的分子。在本發(fā)明范圍內(nèi)的典型二聚體示于美國專利No.6，660843圖2中，將其引入本文以供參考。術(shù)語"衍生"和"衍生物"或"衍生的"分別包括這樣的過程和所產(chǎn)生的化合物，其中(l)該化合物具有環(huán)狀部分；例如在該化合物內(nèi)的半胱氨酰殘基之間交聯(lián)；(2)該化合物是交聯(lián)的或具有交聯(lián)位點；例如，該化合物具有半胱氨酰殘基并因此在培養(yǎng)中或在體內(nèi)形成交聯(lián)的二聚體;(3)一個或多個肽鍵被非肽鍵取代；(4)N末端被-NRR1、NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、-NRS(0)2R1、-NHC(O)NHR、琥珀酰亞胺基團、或取代或未取代的芐氧羰基-NH-取代，其中R和R1和所述環(huán)取代基如下文定義；(5)C末端被-C(0)I^或-NRSrA取代，其中r2、W和r"如下文定義；和(6)其中個別氨基酸部分通過用能夠與選定側(cè)鏈或末端殘基反應的試劑處理來修飾的化合物。衍生物將在下面被進一步描述。術(shù)語"多肽"是指具有多于40個氨基酸的分子，無論是否是天然存在的，條件是所述分子不是膜結(jié)合的。示例性多肽包括IL-lm，leptin，可溶的1型和2型TNF受體(sTNF-Rl，sTNF-R2)，KGF，EPO，TPO，G-CSF，darbepoietin，F(xiàn)ab片段等。術(shù)語"肽"是指具有2-40個氨基酸的分子，優(yōu)選具有3-20個氨基酸的分子，最優(yōu)選具有6-15個氨基酸的分子。通過任一上述方法、在肽文庫(例如噬菌體展示文庫)中進行或通過消化蛋白衍生，可以隨機產(chǎn)生典型的肽。用來指肽序列的術(shù)語"隨機化"是指完全隨機的序列(例如通過噬菌體展示法選擇的)和其中天然存在的分子的一個或多個殘基被不出現(xiàn)在天然存在的分子中該位置的氨基酸殘基取代的序列。鑒定肽序列的典型方法包括噬菌體展示、大腸桿菌展示、核糖體展示、基于酵母的篩選，RNA-肽篩選、化學篩選，合理設計，蛋白結(jié)構(gòu)分析等。術(shù)語"藥理學活性"是指如此描述的物質(zhì)被確定具有影響醫(yī)學參數(shù)(例如血壓、血細胞計數(shù)、膽固醇水平)或疾病狀態(tài)(例如癌癥、自身免疫病)的活性。因此，藥理學活性肽包括如下定義的激動肽或模擬肽和拮抗肽。術(shù)語"-模擬肽"和"-激動肽"指生物活性同與目的蛋白相互作用的蛋白(例如EPO、TPO、G-CSF)相當?shù)碾摹＿@些術(shù)語還包括間接模擬目的蛋白活性的肽，例如通過增強目的蛋白的天然配體效應；參見例如本文表2和美國專利No.6,660,843表7中所列出的G-CSF-模擬肽，將其引入本文以供參考。因此，術(shù)語"EPO-模擬肽"包括可以如Wrighton等(1996)，Science273:458-63，Naranda等(1999)'Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:7569-74，或表2中鑒定為具有EPO-模擬主題的任何其它參考文獻中描述能鑒定或衍生的肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，這些參考文獻中的每一個均使得人們能夠采用所公開的方法，利用不同的肽文庫，選擇不同于文獻中實際公開的肽。術(shù)語"-拮抗肽"或"抑制肽"是指阻斷或以某些方式干擾所結(jié)合的目的蛋白生物活性的肽、或生物活性與所結(jié)合的目的蛋白的已知拮抗劑或抑制劑的活性相當?shù)碾摹Ｒ虼耍g(shù)語"TNF-拮抗肽"包括可以按以下參考文獻中的描述能鑒定或衍生的肽Takasaki等(1997)，NatureBiotech.15:1266-70或表2中鑒定為具有TNF-拮抗主題的任何其它參考文獻。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，這些參考文獻中的每一個均使得人們能夠采用所公開的方法，利用不同的肽文庫，選擇不同于文獻中實際公開的肽。術(shù)語"TPO-模擬肽"包括可以按以下參考文獻中的描述能鑒定或衍生的肽Cwirla等H997)Science276:1696-9;美國專利No.5,869,451和5,932，946;2003年9月18日公開的美國專利申請No.2003/0176352;2003年4月17日公開的WO03/031589和表2中鑒定為具有TPO-模擬主題的任何其它參考文獻，以及2000年5月4日公開的WO00/24770，將其引入本文以供參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，這些參考文獻中的每一個均使得人們能夠采用所公開的方法，利用不同的肽文庫，選擇不同于文獻中實際公開的肽。術(shù)語"ang-2-結(jié)合肽"包括可以按以下參考文獻中的描述能鑒定或衍生的肽2003年12月11日公開的美國專利申請No.2003/0229023;2003年7月17日公開的WO03/057134;2003年12月25日公開的U.S.2003/0236193;和表2中鑒定為具有與ang-2相關(guān)主題的任何其它參考文獻。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，這些參考文獻中的每一個均使得人們能夠采用所公開的方法，利用不同的肽文庫，選擇不同于文獻中實際公開的肽。術(shù)語"NGF-結(jié)合肽"包括可以按以下參考文獻中的描述能鑒定或衍生的肽2004年4月1日公開的WO04/026329;和表2中鑒定為具有與NGF相關(guān)主題的任何其它參考文獻。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，這些參考文獻中的每一個均使得人們能夠采用所公開的方法，利用不同的肽文庫，選擇不同于文獻中實際公開的肽。術(shù)語"肌肉生長抑制素-結(jié)合肽"包括可以按以下參考文獻中的描述能鑒定或衍生的肽2003年12月19日申請的美國系列號10/742,379和表2中鑒定為具有與肌肉生長抑制素相關(guān)主題的任何其它參考文獻。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，這些參考文獻中的每一個均使得人們能夠采用所公開的方法，利用不同的肽文庫，選擇不同于文獻中實際公開的肽。另外，本發(fā)明也包括本發(fā)明化合物的生理學上可接受的鹽。所謂"生理學上可接受的鹽"是指已知或以后發(fā)現(xiàn)為藥學上可接受的任何鹽。某些具體實例是乙酸鹽、三氟乙酸鹽、氫鹵酸鹽，例如鹽酸鹽和氫溴酸鹽；硫酸鹽；檸檬酸鹽；酒石酸鹽、羥乙酸鹽和草酸鹽?；衔锝Y(jié)構(gòu)通用結(jié)構(gòu)在按照發(fā)明制備的物質(zhì)組合物中，所述肽可以通過肽的N末端或C末端連接于所述載體。因此，本發(fā)明的載體-肽分子可以用以下式I描述:I(xVF、(X2)b其中1是？0修飾的結(jié)構(gòu)域，以使其在環(huán)區(qū)包括至少一個X、X1和X2分別獨立地選自.(L、-P1、-(L^-P^I^d-P2、-(LVP1-(L2)d-P2-(L3)e-P3，和-(LVP!-(LVP2-(L3)e-P3-(L4)rP4;X3獨立地選自畫(L5)c-P5、-(L5)c-P5-(L6)d-P6，-(L5)c-P5-(L6)d-P6-(L7)e-P7，和-(L5)c-p5國(LVP6—(L7)e—P7-(L8)rP8;P1、P2、？3和P"分別獨立地為藥理學活性多肽或藥理學活性肽的序列；P5、P6、f和ps分別獨立地為藥理學活性肽的序列；L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8分別獨立地為接頭；且a、b、c、d、e和f分別獨立地為0或l。在優(yōu)選的實施方案中，a和b都是0，即Xi或xS基團均不出現(xiàn)在Fc結(jié)構(gòu)域的N-末端或C-末端。本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員應該理解，多于一個XS取代基可以出現(xiàn)在Fc結(jié)構(gòu)域中，而且多個XS取代基可以是不同的；例如，包括不同的ps肽，連接到相同肽序列的不同接頭等。同樣，義和乂2可以相同或不同，X1，X^卩X3的整數(shù)c-f可以不同。因此，化合物I包括式II化合物及其多聚體IIX'-F1其中Fi與《的C末端連接；式III化合物及其多聚體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>III其中Fi與XS的N末端連接；式IV化合物及其多聚體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>IVf!畫(lVp1其中Fi與-(L、-pi的N末端連接；和式V化合物及其多聚體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>V其中F1與WLlAP2的N末端連接。肽結(jié)合本發(fā)明可以使用任何數(shù)目的肽。優(yōu)選的肽結(jié)合血管生成素-2(ang-2)，肌肉生長抑制素，神經(jīng)生長因子(NGF)，腫瘤壞死因子(TNF)，B細胞活化因子(BAFF，也稱為TALL-I)或模擬EPO，TPO,或G-CSF活性。引導肽也有價值，包括腫瘤尋靶肽、膜轉(zhuǎn)運肽等。采用本說明書中引用的參考文獻和其它參考文獻中描述的方法，可以發(fā)現(xiàn)所有這些類別的肽。噬菌體展示尤其可用于產(chǎn)生用于本發(fā)明的肽。已經(jīng)陳述了從隨機肽文庫中進行親和選擇可以鑒定用于任何基因產(chǎn)物的任何位點的肽配體。Dedman等(1993)，J.Biol.Chem.268:23025-30。噬菌體展示尤其適合于鑒定與諸如細胞表面受體的目的蛋白或具有線性表位的任何蛋白結(jié)合的肽。Wilson等(1998)，Can.J.Microbiol.44:313-29;Kay等(1998)，DrugDisc.Today3:370-8。在Herz等(1997)，J.Receptor&SignalTransductionRes.17(5):671-776中對這種蛋白進行了廣泛的綜述，該文獻通過引用納入到本文中。這種目的蛋白優(yōu)選用于本發(fā)明中。特別優(yōu)選的一組肽是與細胞因子受體結(jié)合的肽。最近已經(jīng)根據(jù)其受體代碼，對細胞因子進行了分類。參見Inglot(1997)，ArchivumImmunologiaeetTherapiaeExperimentalis45:353-7，其通過弓I用纟內(nèi)入至(J本文中。在這些受體中，最優(yōu)選CKR(表3中的家族I)。受體分類示于表3中。表3-根據(jù)受體代碼分類的細胞因子受體<table><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>1IL-17R-屬于CKR家族，但未分配到4個指定亞家族中的任何一個家族。2其它I型IFN亞型仍未確定。造血細胞因子、IL-10配體和干擾素不具有功能性內(nèi)在蛋白激酶。所述細胞因子的信號分子是JAK、STAT和相關(guān)的非受體分子。IL-14、IL-16和IL-18已被克隆，但根據(jù)受體代碼它們?nèi)晕创_定。STNF受體使用多個不同的胞內(nèi)分子來進行信號轉(zhuǎn)導，包括FASR的"死亡域"和參與其細胞毒性效應的55kDaTOF-aR。NGF/TNFR可以既結(jié)合NGF和相關(guān)因子，又結(jié)合TNF配體。趨化因子受體是7個跨膜(7TM，蛇狀的)結(jié)構(gòu)域的受體。它們是G蛋白偶聯(lián)的。4Duffy血型抗原(DARC)是可以結(jié)合幾種不同趨化因子的紅細胞受體。IL-lR屬于免疫球蛋白超家族，但其信號轉(zhuǎn)導事件的特征仍不清楚。在本發(fā)明肽產(chǎn)生過程中作為靶標的目的蛋白包括下述具體蛋白:av卩3aV卩l(xiāng)Ang扁2BAFF/TALL-1B7B7RP1CRP1降鈣素CD28CETPcMet補體因子BC4bCTLA4胰高血糖素胰高血糖素受體LIPGMPL肌肉生長抑制素在腫瘤細胞如CD44，CD30中優(yōu)先表達的分子剪接變體粘蛋白和LewisY表面糖蛋白的未糖基化變體CD19，CD20，CD33，CD45前列腺特異性膜抗原和前列腺特異性細胞抗原5神經(jīng)營養(yǎng)細胞因子也可結(jié)合NGF/TNF受體。6STKS可以包括許多其它仍未分配的TGF-p相關(guān)因子。該蛋白激酶是受體激酶家族(RKF)胞內(nèi)域的固有部分。所述酶參與通過所述受體的信號傳遞?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，分泌且膜結(jié)合的基質(zhì)金屬蛋白酶(如MMP-9)組織蛋白酶血管生成素-2TIE-2受體類肝素酶尿激酶纖溶酶原活化劑(UPA)，UPA受體甲狀旁腺激素(PTH)，甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)，PTH-RI，PTH-RIIHer2Her3胰島素本發(fā)明的典型的肽出現(xiàn)在美國專利No.6，660，843表4-20中，將該專利引入本文以供參考。其它優(yōu)選的肽出現(xiàn)在2003年12月11日公開的U.S.2003/0229023;2003年7月17日公開的WO03/057134;2003年12月25日公開的U.S.2003/0236193;2000年5月4日公開的WO00/24770;2003年9月18日公開的U.S.2003/0176352;2003年4月17日公開的WO03/031589;2003年9月18日申請的美國系列號10/666,480;2004年4月1日公開的WO04/026329;2003年12月19日申請的美國系列號10/742,379;2003年12月19日申請的PCT/US03/40781,將其引入本文以供參考。這些肽可以通過本領(lǐng)域公開的方法制備。具體的優(yōu)選肽出現(xiàn)在下表中。使用單字母氨基酸縮寫。這些肽中的任一種可以用或不用接頭串聯(lián)(即順序地)連接。任何含有一個半胱氨酰殘基的肽均可以與另一含Cys的肽或蛋白交聯(lián)。任何含有一個以上Cys殘基的肽也可以形成肽內(nèi)二硫鍵。這些肽中的任一種均可以按本文所述方法衍生。所有肽均通過肽鍵連接，除非另有說明。表4-EP0-模擬肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表5-TP0-模擬肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表6-Ang-2結(jié)合肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>lpkcthvpfdqggfclwy284fsscwspvsrqdmfcvfy285shkceysgwlqplcyrp286pwwcqdnyvqhmlhcdsp287wfrcml麗sfdapqcvsy288pdacrdqpwymfmgcmlg289flacfvefelcfds290SAYaiTESDPYVLCVPL291psicesystmwlpmcqhn292wldchddswawtkmcrsh293ylncvm廳tsp雨cvfn294ypwcdg匿qqgitcmfy295fdyctwlngfkdwkcwsr2%lplcnlkeishvqacvl;f297specafarwlgieqcqrd'298ypqcfnlhllewtecdwf299rwrceiydseflpkcwfp300lvgcdnvwhrcklf301agwchvwgemfgmgcsal302hhecewmarwmsldcvgl303fpmcgiagmkdfdfcvwy304rddctfwpewlwklcerp305ynfcsylfgvskeacqlp306ahwceqgpwrygniomay307nlvcgkisawgdeacajla308麗vctimgpsmkwfcwnd柳ndlcamwgwrn，cqns310ppfcqndndmlqslocll311wydcnvpnellsglcrlf312ygdcdqnhwmwpftclsl313gwmchfdlhdwgatcqpd314yfhcmfgghefevhcesf315aywcwhgqcvrf316sehwtftdwdgnewwvrpf317memldslfellkdmvpiska318sppeealmewlgwqygkft319spenllndlyilmtkqewyg320fhweegipfhwtpysy:d脂321krlleqf畫dl風vsghs322dtrdalfqefyefvrsrlvi323rmsaaprpltyrd細qywh324ndkahfeemfmfdvhnfves325qtqaqkidglwellqsirnq326mlsefeeflgnlvhrqea327<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>TQRDMSMLDGLLEVLDQLRQQR493TSRDMSLLWELLEELDRLGHQR494MQHDMSMLYGLVELLESLGHQI495雨RDMRMLESLFEVLDGLRQQV496GYRDMSMLEGLLAVLDRLGPQL497TQRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR498WYRDMSMLEGLLEVLDJRLGQQJR499HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ500TQNSRQMLLSDFMMLVGSMIQG501MQTSRHILLSEFMMLVGSIMHG502HDNSRQMLLSDLLHLVGTMIQG503MENSRQNLLRELIMLVG醒SHQ504QDTSRHMLLREF畫LVGEMIQG505DQNSRQMLLSDLMILVGSMIQG506EFFHWLHNHRSEVNHWLD畫507NWFQWVQKHGRWYQWLD匿508FDFLQWLQNHRSEVEHWLVMDV509表9-BAFF結(jié)合肽序列序列SEQIDNO:PGTCFPFPWECTHA510WGACWPFPWECFKE511VPFCDLLTKHCFEA512GSRCKYKWDVLTKQCFHH513LPGCKWDLLIKQWVCDPL514SADCYFDILTKSDVCTSS515SDDCMYDQLTRMHCSNL516DLNCKYDELTYKEWCQFN517FHDCKYDLLTRQMVCHGL518RNHCFWDHLLKQDICPSP519ANQCWWDSLTKKNVCEFF520YKGRQQMWDILTRSWWSL521QQDVGLWWDILTRAWMPNI522QQNAQRVWDLLIRTWVYPQ523G雨EAWWDELTKIWVLEQQ524RITCDTWDSLIKKCVPQQS525GAIMQQFWDSLTKTWLRQS526WLHSGWWDFLTKHWLQQKV527SEWFFWFDPLTRAQQLKFR528GVWFWWFDPLTKQWTQQAG529MQQCKGYYDILTKWCVTNG530LWSKEVWDILTKSWVSQQA531KAAGWWPDWLTKVWVPAP532<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>FC結(jié)構(gòu)域本發(fā)明需要存在包含肽序列的至少一種修飾的Fc結(jié)構(gòu)域。如上所述，天然Fc和Fc變體都是在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的合適Fc結(jié)構(gòu)域?？梢詫μ烊籉c進行廣泛的修飾，以形成本發(fā)明的Fc變體，前提是保持與補救受體的結(jié)合；參見例如WO97/34631和WO96/32478。在這種Fc變體中，人們可以去除天然Fc的提供本發(fā)明融合分子不需要的結(jié)構(gòu)特征或功能活性的一個或多個位點。通過例如置換或缺失殘基、將殘基插入該位點，或截去含所述位點的部分，人們可以去除這些位點。所插入或置換的殘基也可以是改變的氨基酸，例如肽模擬物或D-氮基酸?？梢杂捎诙喾N原因希望有Fc變體，以下描述其中幾個原因。典型的Fc變體包括這樣的分子和序列，其中1.去除參與二硫鍵形成的位點。這種去除可以避免與用來產(chǎn)生本發(fā)明分子的宿主細胞中存在的其它含半胱氨酸蛋白的反應。為此，可以截去N末端含半胱氨酸的區(qū)段，或可以缺失半胱氨酸殘基，或用其它氨基酸(例如丙氨酰、絲氨酰)置換半胱氨酸殘基。特別是，人們可以截去SEQIDNO:599的N末端20個氨基酸的區(qū)段，或缺失或置換SEQIDNO:599的位置7和10的半胱氨酸殘基。甚至當去除半胱氨酸殘基時，單鏈Fc結(jié)構(gòu)域仍可能形成非共價保持在一起的二聚Fc結(jié)構(gòu)域。2.對天然Fc進行修飾，以使其與選定的宿主細胞更加相容。例如，人們可以去除典型天然FcN末端附近的PA序列，該序列可能由大腸桿菌中的消化酶例如脯氨酸亞氨基肽酶識別。人們也可以加入一個N末端甲硫氨酸殘基，尤其是當該分子在細菌細胞例如大腸桿菌中重組表達時。SEQIDNO:599(圖2A)的Fc結(jié)構(gòu)域是一個這種Fc變體。3.去除天然FcN末端的一部分，以在選定的宿主細胞中表達時防止N末端異質(zhì)性。為此，人們可以缺失N末端的前20個氨基酸殘基中的任何一個，特別是位置1、2、3、4和5的氨基酸殘基。4.去除一個或多個糖基化位點。通常被糖基化的殘基(例如天冬酰胺)可以賦予溶細胞反應?？梢匀笔н@種殘基，或用非糖基化殘基(例如丙氨酸)置換這種殘基。5.去除參與與補體相互作用的位點，例如Clq結(jié)合位點。例如，人們可以缺失或置換人IgGl的EKK序列。對于本發(fā)明的分子而言，補體募集可能是不利的，因此可以用這樣的Fc變體避免補體募集。6.去除影響與Fc受體而非補救受體結(jié)合的位點。天然Fc可能具有本發(fā)明融合分子不需要的與某些白細胞相互作用的位點，因此可以去除這些位點。7.去除ADCC位點。ADCC位點是本領(lǐng)域已知的，參見例如Molec.Immunol.29(5):633-9(1992)有關(guān)IgGl中ADCC位點的內(nèi)容。這些位點也是本發(fā)明融合分子不需要的，因此可以除去。8.當天然Fc衍生自非人類抗體時，可以將所述天然Fc人源化。通常，為了將天然Fc人源化，人們可以用在人類天然Fc中通常發(fā)現(xiàn)的殘基取代非人類天然Fc中的選定殘基。用于抗體人源化的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。優(yōu)選的Fc變體包括以下變體。在SEQIDNO:599(圖2A)中，位置15的亮氨酸用谷氨酸取代；位置99的谷氨酸用丙氨酸取代；而位置101和103的賴氨酸用丙氨酸取代。另外，可以由苯丙氨酸殘基取代一個或多個酪氨酸殘基。輔助載體本發(fā)明進一步包括含一種或多種水溶性聚合物的共價修飾分子，所述聚合物如美國專利No.:4，640，835;4，496，689;4，301，144;4,670,417;4,791,192;和4,179,337中描述的聚乙二醇，聚氧化亞乙基二醇，聚丙二醇。本領(lǐng)域已知的其它可用聚合物還包括，單甲氧基聚乙二醇，葡聚糖，纖維素，和其它糖基聚合物，聚-(N-乙烯吡咯烷酮)-聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物/環(huán)氧乙烷共聚合物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇，以及所述聚合物的混合物。尤其優(yōu)選的是用聚乙二醇(PEG)亞基共價修飾的肽體。水溶性聚合物可以結(jié)合在特異性位點，如所述肽體的氨基酸末端，或隨機連接到所述多肽的一個或多個側(cè)鏈上。利用PEG來提高特異性結(jié)合劑如肽體的治療能力，特別是人源化抗體的治療能力，描述在2000年10月17日授予Gonzales等的美國專利No.6,133,426中。目前可利用連接可用作載體的化學部分的各種方法，參見例如題為"N-末端化學修飾蛋白組合物和方法"的專利合作條約("PCT")國際說明書W096/11953，該文獻通過引用完整地結(jié)合到本文中。該PCT說明書其中公開了將水溶性聚合物選擇性地連接于蛋白N末端。優(yōu)選的聚合物載體是聚乙二醇(PEG)。所述PEG基團可以是任何方便的分子量的PEG基團，并且可以是直鏈或支鏈的。所述PEG的平均分子量的范圍優(yōu)選為約2千道爾頓("kD")至約100kD，更優(yōu)選為約5kDa至約50kDa，最優(yōu)選為約5kD至約20kD。一般通過將PEG部分上的一個反應基(例如醛、馬來酰亞胺、氨基、巰基或酯基)?；蜻€原烷化至本發(fā)明化合物上的一反應基(例如醛、氨基、巰基或酯基)，將PEG基團與本發(fā)明化合物連接。將合成肽PEG化(PEGylation)的一個有用的策略包括通過在溶液中形成共軛鍵，將肽和PEG部分結(jié)合，所述肽和PEG部分各帶有一個相互之間可反應的特殊官能團。用常規(guī)的固相合成(參見例如圖5和6和其中伴有的內(nèi)容)，可以容易地制備所述肽。用合適的官能團于特定位點"預活化"所述肽。在與PEG部分反應之前，純化所述前體并對其進行全面鑒定。所述肽與PEG的連接通常在水相中進行，并且可以通過反相分析型HPLC容易地監(jiān)測。PEG化肽可以容易地經(jīng)制備型HPLC純化，并通過分析型HPLC、氨基酸分析和激光解吸質(zhì)譜來鑒定。多糖聚合物是另一種類型的可用于蛋白修飾的水溶性聚合物。葡聚糖是由主要通過cxl-6鍵連接的葡萄糖的單個亞單位構(gòu)成的多糖聚合物。葡聚糖本身可以在許多分子量范圍內(nèi)獲得，并且容易以約lkD至約70kD的分子量獲得。葡聚糖是一種在本發(fā)明中以其本身或與另一載體(例如Fc)結(jié)合作為載體的合適的水溶性聚合物。參見例如WO96/11953和WO96/05309。已經(jīng)報道了與治療性或診斷性免疫球蛋白綴合的葡聚糖的應用；參見例如歐洲專利公開No.0315456，其通過引用結(jié)合到本文中。當葡聚糖用作本發(fā)明的載體時，優(yōu)選約lkD至約20kD的葡聚糖。輔助載體也可以是蛋白、多肽、肽、抗體、抗體片段、或能夠結(jié)合于補救受體的小分子(例如肽模擬化合物)。例如，人們可以將1998年4月14日授予Presta等的美國專利No.5,739,277中描述的多肽作為載體。也可以根據(jù)與FcRn補救受體的結(jié)合，通過噬菌體展示選擇肽。這種補救受體-結(jié)合化合物也包括在本發(fā)明的"載體"含義中。應該根據(jù)半衰期增加(例如通過避免被蛋白酶識別的序列)和免疫原性降低(例如通過給予非免疫原性序列，如在抗體人源化中發(fā)現(xiàn)的)選擇這種載體。接頭任何"接頭"基團都是可選擇的。當存在時，其化學結(jié)構(gòu)不是關(guān)鍵，因為它主要用作間隔區(qū)。所述接頭優(yōu)選由通過肽鍵連接在一起的氨基酸構(gòu)成。因此，在優(yōu)選的實施方案中，所述接頭由通過肽鍵連接的l-20個氨基酸構(gòu)成，其中所述氨基酸選自20種天然存在的氨基酸。這些氨基酸中的某些氨基酸可以被糖基化，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解的。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述l-20個氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。甚至更優(yōu)選的是，接頭由許多非位阻氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸構(gòu)成。因此，優(yōu)選的接頭是聚甘氨酸(特別是(Gly)4、(Gly)5)、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。接頭的其它具體實例是(Gly)3Lys(Gly)4(SEQIDNO:595);(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQIDNO:596);(Gly)3Cys(Gly)4(SEQIDNO:597);和GlyProAsnGlyGly(SEQIDNO:598)。為了解釋上述命名法，例如(Gly)3Lys(Gly)4是指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly。也優(yōu)選Gly和Ala的組合。本文所示的接頭是示例性的；本發(fā)明范圍內(nèi)的接頭可以長得多，并且可以包括其它殘基。非肽接頭也是可能的。例如，可以使用垸基接頭例如-NH-(CH2)s-C(0)-，其中s=2-20。這些烷基接頭可以進一步用例如以下的任何非位阻基團取代低級烷基(例如d-C6)低級酰基、鹵素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。一個示例性的非肽接頭是PEG接頭，VI<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>其中n使得接頭分子量為100-5000kD，優(yōu)選為100-500kD?？梢愿淖兯鲭慕宇^，以與上述相同的方式形成衍生物。衍生物本發(fā)明還提供了"衍生物"，其包括具有除插入、刪除或取代氨基酸殘基之外修飾的分子。優(yōu)選，所述修飾是實質(zhì)上共價的，包括如化學結(jié)合聚合物，脂類，其它有機和無機部分?？蓪⒈景l(fā)明的衍生物制備成能改進分子的循環(huán)半衰期；改進分子靶定目的細胞、組織、或器官的能力；改進分子的溶解性或吸收；或消除或者減弱分子的不希望具有的副作用。示例性的衍生物包括這樣的化合物，其中1.所述化合物或其某部分是環(huán)狀的。例如，可以修飾所述肽部分，以使其含有兩個或更多的Cys殘基(例如在接頭中)，所述肽可以通過形成二硫鍵環(huán)化。關(guān)于對制備環(huán)化衍生物的參考文獻的引用，請參見表2。2.將所述化合物在分子之間交聯(lián)，或使其能夠在分子之間交聯(lián)。例如，可以修飾所述肽部分，以使其含有一個Cys殘基，并因此能夠與類似的分子形成分子間二硫鍵。也可以通過所述化合物的C末端使所述化合物交聯(lián)，如在以下所示的分子中。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>VII03.用非肽鍵取代一個或多個肽[-C(O)NR-]鍵。示例性的非肽鍵是-<^2-氨基甲酸酯[-012-0(:(0)服-]、膦酸酯、-12-氨磺酰、脲[-NHC(O)NH-]、-012-仲胺，和垸基化肽[-C(0)NR6-，其中W為低級烷基]。4.將N-末端衍生。通常，可以將N-末端?；蛐揎棡槿〈陌?。示例性N-末端衍生基團包括-NRR乂非-NH2-)、-NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、"NRS(0)2R1、-NHC(O)NHR1、琥珀酰亞胺，或芐氧羰基-NH-(CBZ-NH-)，其中R和R1分別獨立地為氫或低級垸基，且其中所述苯環(huán)可以用1-3個選自d-C4烷基、d-Ct烷氧基、氯基和溴基的取代基取代。5.將游離C-末端衍生。通常，將C-末端酯化或酰胺化。例如，人們可以使用本領(lǐng)域描述的方法，將(NH-CH2-CH2-NH2)2加入本發(fā)明的化合物中。同樣，人們可以利用本領(lǐng)域描述的方法，將-NH2加入本發(fā)明的化合物中。示例性的C末端衍生基團包括，例如-C(0)W其中f是低級垸氧基，或-NR3114，其中W和R4獨立地為氫或d-C8烷基(最好為d-CV烷基)。6.用另一交聯(lián)部分、優(yōu)選更穩(wěn)定的交聯(lián)部分(例如亞垸基)取代二硫鍵。參見例如Bhatnagar等(1996)，J.Med.Chem.39:3814-9;Alberts等(1993)ThirteenthAm.Pep.Symp.,357-9。7.修飾一個或多個個別氨基酸殘基。已知各種衍生劑與選定的側(cè)鏈或末端殘基特異性反應，如以下詳述的。賴氨酰殘基和氨基末端殘基可以與琥珀酸酐或其它羧酸酐反應，這將賴氨酰殘基的電荷逆轉(zhuǎn)。用于衍生含(x-氨基的殘基的其它合適試劑包括亞氨酸酯，例如吡啶甲亞氨酸甲酯(methylpicolinimidate);磷酸吡哆醛；吡口多醛；氯硼氫化物(chloroborohydride);三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4戊二酮；和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應。精氨酰殘基可以通過幾種常規(guī)試劑中的任一種或組合來修飾，所述常規(guī)試劑包括苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環(huán)己二酮，和茚三酮。精氨酰殘基的衍生需要在堿性條件下進行該反應，因為胍官能團的pKa高。此外，這些試劑可以與賴氨酸的基團以及精氨酸s-氨基反應。已經(jīng)廣泛研究了酪氨酰殘基的特異性修飾，特別感興趣的是通過與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入酪氨酰殘基中。最常見的是分別使用N-乙酰咪唑和四硝基甲垸來生成O-乙酰酪氨酰物質(zhì)和3-硝基衍生物。通過與碳二亞胺(R'-NON-R')反應，可以選擇性地修飾羧基側(cè)鏈基團(天冬氨酰或谷氨酰)，所述碳二亞胺例如l-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4,4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，通過與銨離子反應可以將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉(zhuǎn)化為天冬酰胺酰和谷酰胺酰殘基。可以將谷酰胺酰和天冬酰胺酰殘基脫酰胺為相應的谷氨酰和天冬氨酰殘基。或者，可以將這些殘基在溫和的酸性條件下脫酰胺。這些殘基中的任一種形式均屬于本發(fā)明范圍。半胱氨酰殘基可以用氨基酸殘基或其它部分取代，以獲得消除二硫鍵，或者相反地使交聯(lián)穩(wěn)定化。參見例如Bhatnagar等(1996)，J.Med.Chem.39:3814-9。用雙官能試劑衍生可用于使所述肽或其功能衍生物與水不溶性支持基質(zhì)或其它大分子載體交聯(lián)。常用的交聯(lián)劑包括，例如l,l-雙(重氮乙酰)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯例如與4-重氮水楊酸的酯；同雙官能亞氨酸酯，包括雙琥珀酰亞胺基酯，例如3,3，-二硫代雙(丙酸琥珀酰亞胺基酯)，和雙官能馬來酰亞胺，例如雙-N-馬來酰亞胺基-l,8-辛烷。衍生劑例如甲基-3-[(對-重氮苯基)二硫代]丙亞胺酸酯產(chǎn)生能夠在光存在下形成交聯(lián)的光可活化中間體?；蛘撸瑢τ诘鞍坠潭ɑ?，可使用美國專利No.3,969,287;3,691,016;4,195,128;4,247,642;4,229,537;和4,330,440中描述的反應性水不溶性基質(zhì)，例如溴化氰活化的糖類和反應底物。糖(寡糖)基團可以方便地連接于已知在蛋白中為糖基化位點的位點。一般而言，當絲氨酸、蘇氨酸和天冬酰胺是序列Asn-X-Ser/Thr的部分，其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸時，O-聯(lián)寡糖連接于絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基上，而N-聯(lián)寡糖連接于天冬酰胺(Asn)殘基上。X優(yōu)選是除脯氨酸外19種天然存在的氨基酸中的任何一種。在每種類型中發(fā)現(xiàn)的N-聯(lián)寡糖和O-聯(lián)寡糖和所述糖殘基的結(jié)構(gòu)是不同的。在N-聯(lián)寡糖和O-聯(lián)寡糖中通常發(fā)現(xiàn)的一種類型的糖是N-乙酰神經(jīng)氨酸(稱為唾液酸)。唾液酸通常是N-聯(lián)寡糖和O-聯(lián)寡糖兩者的末端殘基，并且由于其帶有負電荷，可以賦予糖基化化合物酸性特性。這種位點可以加入本發(fā)明化合物的接頭中，并且優(yōu)選在重組產(chǎn)生所述多肽化合物期間由細胞(例如在哺乳動物細胞，例如CHO、BHK、COS)糖基化。然而，這種位點可以通過本領(lǐng)域已知的合成法或半合成法進一步糖基化。其它可能的修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷酸化，Cys中硫原子的氧化，賴氨酸、精氨酸的a-氨基和組氨酸側(cè)鏈的甲基化。Creighton，Proteins:StructureandMoleculeProperties(W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco),第79-86頁(1983)。所述衍生的部分優(yōu)選可以改進所述化合物的一種或多種特征，包括抗血管生成性，溶解性，吸收，生物半衰期等?；蛘?，衍生的部分可以使得化合物具有與非衍生化合物相同，或基本相同的特征和/或特性。所述部分可以或者消除或者減弱所述化合物的不希望有的副化合物作用等。本發(fā)明的化合物也可以在DNA水平上改變?？梢詫⑺龌衔锶魏尾糠值腄NA序列改變?yōu)榕c選定宿主細胞更相容的密碼子。對于為優(yōu)選宿主細胞的大腸桿菌而言，優(yōu)化密碼子是本領(lǐng)域已知的。可以將密碼子置換以消除限制位點或包括沉默限制位點，這可能有助于該DNA在選定宿主細胞中的加工?？梢孕揎椝鲚d體、接頭和肽DNA序列，以包括任何上述序列變化。同位素-和毒素-偶聯(lián)衍生物。另外一套有用的衍生物是與毒素、示蹤劑，或放射性同位素偶聯(lián)的上述分子。所述偶聯(lián)物尤其對包括結(jié)合腫瘤細胞或病原體的肽序列的分子有用。所述分子可以用作治療劑或輔助外科治療(如放射免疫導向的外科治療或RIGS)，或用作診斷劑(如放射免疫診斷或RID)。作為治療劑，這些偶聯(lián)衍生物具有許多優(yōu)點。它們便于利用毒素和放射同位素，而這些毒素和放射同位素如果沒有由所述肽序列提供的特異性結(jié)合就施用將會有毒。它們還能通過促進較低有效量的偶聯(lián)伴侶，而降低由使用發(fā)射和化學療法而引起的副作用。有用的偶聯(lián)伴侶包括放射同位素，如90釔、131碘、225錒、和213鉍;蓖麻毒A毒素，微生物衍生毒素如假單胞菌內(nèi)毒素(如PE38、PE40)等；.捕獲系統(tǒng)(見下文)中的伴侶分子；.生物素、抗生物素蛋白鏈菌素(可用作捕獲系統(tǒng)中的伴侶分子或作為示蹤劑，尤其適合診斷用途)；和.細胞毒性劑(如阿霉素)。這些偶聯(lián)衍生物的一種有用調(diào)整是在捕獲系統(tǒng)中使用。在所述系統(tǒng)中，本發(fā)明的分子包括一良性捕獲分子。該捕獲分子能特異性地結(jié)合個別效應分子，包括如毒素或放射性同位素。載體-偶聯(lián)分子和效應分子都將會被施予患者。在所述系統(tǒng)中，除了當效應分子與載體-偶聯(lián)的捕獲分子結(jié)合外，所述效應分子的半衰期會很短，這樣就能將任何毒副作用最小化。所述載體-偶聯(lián)分子具有相對長的半衰期，而且是健康無害且無毒的。這兩種分子的特異性結(jié)合部分可以是部分已知的特異性結(jié)合對(如生物素，抗生物素蛋白鏈菌素)或者從如本文所述的肽生產(chǎn)方法獲得。所述偶聯(lián)衍生物可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備。就蛋白效應分子(如假單胞菌內(nèi)毒素)而言，所述分子可以從相關(guān)DNA構(gòu)建體中以融合蛋白表達出來。放射同位素偶聯(lián)衍生物可以如以對BEXA抗體(Coulter)所述來制備。衍生物包括細胞毒性劑或細菌毒素，可按照如對BR96抗體(Bristol-MyersSquibb)所述來制備。在捕獲系統(tǒng)中使用的分子可以按照如來自NeoRx的專利，專利申請，和公開物來制備。用于RIGS和RID的分子可以按照如來自NeoProbe的專利，專利申請，和公開物來制備。制備偶聯(lián)衍生物的方法也是設想的。腫瘤細胞，例如顯示表位，就沒有在它們的正常對應體中就發(fā)現(xiàn)。所述表位包括如從其快速增殖中獲得的不同翻譯后修飾。因此，本發(fā)明的一方面是包括下述步驟的過程a)選出至少一種特異性結(jié)合耙表位的隨機化肽；和b)制備包括下述成分的藥劑(i)至少一種載體(優(yōu)選Fc結(jié)構(gòu)域)，(ii)至少一種選定肽的氨基酸序列，和(iii)一種效應分子。所述靶表位優(yōu)選是腫瘤特異性表位或?qū)Σ≡⑸锾禺惖谋砦?。所述效應分子可以是上述偶?lián)伴侶中的任一種，優(yōu)選是放射同位素。變體變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。包括的變體是插入，刪除，和置換的變體。應理解，本發(fā)明的具體分子可以包括一種，兩種或所有三種類型的變體。插入和置換的變體可以包括天然氨基酸，非常用氨基酸(如下文所述)，或者這兩者。在一個實施例中，提供了插入的變體，在該變體中一個或多個氨基酸殘基，無論天然存在的氨基酸還是非常用氨基酸，添加到肽或肽體氨基酸序列。插入可以位于所述蛋白的一個末端或者兩個末端，或可以位于所述肽體氨基酸序列的內(nèi)部區(qū)域中。在一末端或兩末端含有添加的殘基的插入變體，可以包括如含氨基酸標簽或標記的融合蛋白和蛋白。插入的變體包括其中有一個或多個氨基酸殘基添加到所述肽或肽體氨基酸序列，或其片段內(nèi)的肽和肽體。本發(fā)明的變體還包括成熟肽和肽體，其前導或信號序列被除去，和含有添加的氨基末端殘基的獲得蛋白，該殘基的氨基酸可以是天然或非天然的。設想了本發(fā)明分子(如肽體)的第1位氨基酸是添加的甲硫氨酰殘基(Met"-肽體)，同樣還設想了在位置-2和-l含有添加的甲硫氨酸和賴氨酸殘基的特異性結(jié)合劑(Met殳Lys"-)。含有添加的Met，Met-Lys，Lys殘基的變體尤其對于提高在細菌宿主細胞中的重組蛋白制備是有利的。本發(fā)明還包括利用特異性表達體系獲得的含添加的氨基酸殘基的變體。例如，商購載體表達目的多肽作為部分谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合產(chǎn)物，在從所述目的多肽切除了GST組分后，就會獲得氨基酸位置-l是添加的甘氨酸殘基的目的多肽。設想了在其它載體系統(tǒng)中表達獲得的變體，該變體包括那些通常在所述序列的羧基和/或氨基末端添加多組氨酸標記，而將多組氨酸引入所述氨基酸序列中的變體。插入的變體還包括融合蛋白，其中所述肽或肽體的氨基和/或羧基末端與另一個多肽、其片段或氨基酸融合，而該氨基酸通常不被認為是任何具體蛋白序列的一部分。所述融合蛋白的實例是含有長循環(huán)半衰期，如免疫球蛋白恒定區(qū)、標記蛋白、便于所述目的蛋白或肽體純化的蛋白或多肽、和促進多聚體蛋白形成的多肽序列(如在二聚體形成/穩(wěn)定性中有用的亮氨酸拉鏈基元)的免疫原性多肽、蛋白。這種類型的插入變體通常是讓全部或大部分的所述天然分子以N-或C-末端連接到第二個多肽的全部或部分。例如，融合蛋白通常使用來自其它物種的前導序列，以便讓蛋白在異源宿主中重組表達。另一種有用的融合蛋白包括添加免疫活性結(jié)構(gòu)域，如抗體表位，以便純化該融合蛋白。在所述融合接合處或者附近包括切割位點便于在純化后除去外來多肽。其它有用的融合包括連接功能結(jié)構(gòu)域，如酶的活性位點，糖基化結(jié)構(gòu)域，細胞靶定信號或跨膜區(qū)。有許多可在本發(fā)明使用的可商購融合蛋白表達系統(tǒng)。尤其有用的系統(tǒng)包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)系統(tǒng)(Pharmacia)，麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng)(NEB，Beverley,MA)，F(xiàn)LAG系統(tǒng)(IBI,NewHaven,CT)，和6xHis系統(tǒng)(Qiagen,Chatsworth，CA)。這些系統(tǒng)能夠制備僅含有少量添加的氨基酸的重組肽和/或肽體，而所添加的氨基酸不太可能明顯地影響所述肽或肽體的活性。例如，F(xiàn)LAG系統(tǒng)和6xHis系統(tǒng)都僅添加短序列，而這兩種短序列已知不具有抗原性而且不會不良地影響多肽折疊為其天然構(gòu)象。另一種設想有用的N-末端融合是在所述蛋白或肽的N-末端區(qū)與Met-Lys二肽融合。這種融合可能會有利地增強蛋白表達或活性。其它融合系統(tǒng)制備的多肽雜合體易于從所述目的肽或肽體上切除所述融合伴侶。在一個實施方案中，所述融合伴侶通過肽序列與所述重組肽體連接，所述肽序列含有蛋白酶的特異性識別序列。合適序列的實例是那些被TobaccoEtchVirus蛋白酶(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)或FactorXa(NewEnglandBiolabs,Beverley,MA)識別的序列。本發(fā)明還提供了融合多肽，其包括全部或部分本發(fā)明的肽體或肽，并且與截短的組織因子(tTF)結(jié)合。tTF是血管導向劑，由截短型的人凝結(jié)誘導蛋白組成，該蛋白作為腫瘤血管凝結(jié)劑，如美國專利No.:5,877,289;6,004,555;6,132,729;6,132,730;6,156,321;合歐洲專利No.EP0988056所述。tTF與抗-Ang-2肽體或肽，或其片段融合便于將抗-Ang-2運送至耙細胞。在另一方面，本發(fā)明提供了肽或肽體的一個或多肽氨基酸殘基被除去的刪除變體。刪除可以是在所述肽體的一個末端或兩個末端實現(xiàn)的，或者在所述肽體氨基酸序列中去除了一個或多個殘基。刪除變體必然包括肽或肽體的所有片段。在另一個方面中，本發(fā)明提供了肽和肽體的置換變體。置換變體包括其中一個或多肽氨基酸殘基被去除并且用一個或多個可選氨基酸取代的肽或肽體，所述可選氨基酸可以是天然存在或非天然存在的氨基酸。置換變體產(chǎn)生的肽或肽體"相似于"所述原始肽或肽體，因為這兩種分子中相同氨基酸的百分比是一定的。置換變體包括在肽或肽體內(nèi)置換1，2，3，4，5，6，7,8，9，10，15，20，25，30個氨基酸，其中置換的數(shù)量可以高至所述肽或肽體氨基酸的10%或更高。在一方面，所述置換是天然保守性的，但本發(fā)明也包括非保守性的置換，也包括非常用氨基酸。相關(guān)肽或肽體的同一性和相似性可以通過已知方法很容易地計算。所述方法包括但不限于下述方法ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.，OxfordUniversityPress,NewYork(1988);Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.，ed,,AcademicPress,NewYork(1993);ComputerAnalysisofSequenceData,Part1,Griffin,A.M.禾口Griffin,H.G"eds"HumanaPress,NewJersey(1994);SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.，AcademicPress(1987);SsqusncsAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,M.StocktonPress,NewYork(1991);和Carillo等，SIAMT.AppliedMath.,48:1073(1988)。測定兩種肽或多肽，或多肽和肽的相關(guān)度或百分比同一性的優(yōu)選方法被設計成在兩個測試序列之間提供最大的匹配。測定同一性的方法在公眾可獲得的計算機程序中有所描述。優(yōu)選的測定兩個序列之間的同一性的計算機程序方法包括，但不限于GCG程序包，包括GAP(Devereux等，Nucl,Acid.Rss.，12:387(1984);GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,WI,BLASTP,BLASTN，和FASTA(Altschul等，T.Mol.Biol.，215:403-410(1990))。BLASTX程序可從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)和其它來源獲得(BLASTManual,Altschul等NCB/NLM/NIHBethesda,MD20894;Altschuletal,supra(1990))。已知的SmithWaterman算法也可用于測定同一性。用于比較兩種氨基酸序列的一些比對方案可能給出這兩種序列的很短區(qū)域的匹配，這段比對的小區(qū)域甚至在全長序列之間沒有明顯相關(guān)性的情況下也可以具有非常高的序列同一性。因此，在某些實施方案中，選擇的比對方法(GAP程序)可以產(chǎn)生跨度至少為所比較的靶多肽全長10%的比對結(jié)果，即所比較的至少400個氨基酸序列中的至少40個連續(xù)氨基酸，所比較的至少300至約400個氨基酸序列中的30個連續(xù)氨基酸，所比較的200至約300個氨基酸序列中的至少20個連續(xù)氨基酸，和所比較的約100至200個氨基酸序列中的至少10個連續(xù)氨基酸的比對結(jié)果。例如，使用計算機算法GAP(GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison，WI)，將待測定序列百分比序列同一性的兩個多肽進行比對，使各自的氨基酸最佳匹配("匹配的跨距"，通過算法測定)。在某些實施方案中，缺口開放罰分(通常按照平均對角線的3倍計算；"平均對角線"是所用比較矩陣的對角線的平均值；"對角線"是根據(jù)特定比較矩陣得到的每個完全氨基酸匹配的值或數(shù))和缺口伸展罰分(它通常是缺口開放罰分的1/10)，以及比較矩陣，如PAM250或BLOSUM62是與算法聯(lián)合使用的。在某些實施方案中，標準比較矩陣(PAM250比較矩陣見Dayhoff等，AtlasofProteinSequenceandStructure,5(3)(1978);BLOSUM62比較矩陣見Henikoff等，Pro"Natl,Acad.SciUSA，89:10915-10919(1992))也被算法使用。在某些實施方案中，用于多肽序列比較的參數(shù)包括以下這些算法Needleman等，J.Mol.Biol.,48:443-453(1970);比較矩陣BLOSUM62，獲自Henikoff等，見上(1992);缺口罰分12缺口長度罰分4相似性閾值0GAP程序與上述參數(shù)一起使用。在某些實施方案中，上述參數(shù)是使用GAP算法進行多肽對比的默認參數(shù)(再加上末端缺口沒有罰分)。在某些實施方案中，用于多核苷酸分子序列(與氨基酸序列相比)比較的參數(shù)包括以下這些算法Needleman等，見上(1970);比較矩陣匹配=+10，不匹配=0缺口罰分50缺口長度罰分3GAP程序也與上述參數(shù)一起使用。上述參數(shù)是用于多核苷酸分子比較的默認參數(shù)。也可以使用其他示例性的算法、缺口開放罰分，缺口延伸罰分，比較矩陣，相似性閾值等，包括ProgramManual(程序手冊)，WisconsinPackage,第9版，1997年9月中列出的那些。要作出的特定選擇對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，并將取決于要進行的具體比較，諸如DNA與DNA、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA;以及此外，該比較是否是給定序列對之間的(在這種情況下GAP或BestFit—般是優(yōu)選的)或者是一個序列與一個大序列資料庫之間的(在這種情況下FASTA或BLASTA是優(yōu)選的)。如本文所用，20個常用氨基酸和其縮寫遵照傳統(tǒng)用法。參見Immunology-ASynthesis(第二版，E.S.Golub禾口D.R.Gren,Eds"SinauerAssociates,Sunderland,Mass,(1991))，其引入本文供參考用于任何目的。氨基酸可以具有L或D立體化學(除了Gly既無L也無D立體化學)，而且本發(fā)明的多肽和組合物可以包括組合的立體化學。但優(yōu)選L立體化學。本發(fā)明還提供了反向分子，該分子中氨基酸的氨基末端到羧基末端序列是相反的。例如，具有正常序列Xl-X2-X3的分子反向?qū)⑹荴3-X2-X1。本發(fā)明還提供了逆反向分子，其中，如上所述，氨基酸的氨基末端到羧基末端序列是反向的，而且正常"L"對映體殘基改變成"D"型立體異構(gòu)體。20個常用氨基酸的立體異構(gòu)體(如D-氨基酸)，非天然氨基酸如a-，a-二取代的氨基酸，N-垸基氨基酸，乳酸，及其它非常用氨基酸也可以是本發(fā)明多肽的合適組分。非常用氨基酸的實例包括，但不限于氨基已二酸，卩-丙氨酸，卩-氨基丙酸，氨基丁酸，哌啶酸，氨基己酸，氨基庚酸，氨基異丁酸，氨基庚二酸，二氨基丁酸，鎖鏈素，二氨基已酸，二氨基丙酸，N-乙基甘氨酸，N-乙基天冬酰胺，羥基賴氨酸，別羥基賴氨酸，羥基脯氨酸，異鎖鏈賴氨素，別異亮氨酸，N-甲基甘氨酸，肌氨酸，N-甲基異亮氨酸，N-甲基纈氨酸，正纈氨酸，正亮氨酸，orithine，4-羥脯氨酸，Y-羧基谷氨酸，e-N，N，N-三甲基賴氨酸，e-N-乙酰賴氨酸，O-磷酸絲氨酸，N-乙酰絲氨酸，N-甲酰甲硫氨酸，3-甲基組氨酸，5-羥基賴氨酸，(T-N-甲基精氨酸及其它類似氨基酸(如4-羧脯氨酸)。同樣，除非特殊說明，單鏈多核苷酸序列的左端為5'端；雙鏈多核苷酸序列的左向指5'方向。新合成RNA轉(zhuǎn)錄物的5'到3'的添加方向被稱為轉(zhuǎn)錄方向；位于與RNA序列相同的DNA鏈上的、其5'端對應RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5，端的序列區(qū)被稱為"上游序列";位于與RNA序列相同的DNA鏈上的、其3'端對應RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'端的序列區(qū)被稱為"下游序列"。應理解，氨基酸殘基可以在其常規(guī)側(cè)鏈特性的基礎(chǔ)上劃分為以下類型..1.中性疏水性丙氨酸(Ala;A)，纈氨酸(Val;V)，亮氨酸(Leu;L)，異亮氨酸(Ile;I)，脯氨酸(Pro;P)，色氨酸(Trp;W)，苯丙氨酸(Phe;F)，和蛋氨酸(Met,M)。2.中性的極性甘氨酸(Gly;G)，絲氨酸(Ser;S)，蘇氨酸(Thr;T)，酪氨酸(Tyr;Y)，半胱氨酸(Cys;C)，谷氨酰胺(Glu;Q)，天冬酰胺(Asn;N)，和正亮氨酸。3.酸性天冬氨酸(Asp;D)，谷氨酸(Glu;E);4.堿性賴氨酸(Lys;K)，精氨酸(Arg;R)，組氨酸(His;H)。參見Lewin,B.，GenesV,OxfordUniversityPress(1994)，第11頁。保守性氨基酸取代可包括非常規(guī)氨基酸殘基，所述非常規(guī)氨基酸殘基通常通過化學肽合成，而非在生物系統(tǒng)中合成來將其引入。非常規(guī)氨基酸殘基包括但不限于，肽模擬物和其反向或插入型氨基酸部分。非保守性取代可包括用一種所述類型的氨基酸成員取代成另一種類型的氨基酸成員。為產(chǎn)生相當性質(zhì)的改變，按照某些實施方案，應考慮氨基酸的親水指數(shù)。每一氨基酸以其疏水性和電荷特性為基礎(chǔ)被確定一個親水指數(shù)。這些是異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/甘氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。親水性氨基酸指數(shù)在討論一個蛋白的相互作用的生物學功能是很重要的，這一重要性在本領(lǐng)域中一般是能夠理解的。Kyte等，J.Mol.Biol.，157:105-131(1982)。眾所周知，一定的氨基酸可被其它具有相似親水指數(shù)或比數(shù)(score)的氨基酸所替換，并且仍然可以保錄擔似的生物學活性。進行基于親水指數(shù)的改變，在某些實施方案中，氨基酸的替換，其親水指數(shù)在士2的是被選的，在某些實施方案中，那些親水指數(shù)在士l的是被選的，在某些實施方案中，那些在士0.5的是被選的。本領(lǐng)域中也能理解，以親水性為基礎(chǔ)的相似氨基酸的替換會更有效，特別是由此產(chǎn)生的生物學功能相當?shù)碾捏w或肽，欲用于免疫實施方案，如本例的情況。在某些實施方案中，一個蛋白的最大的局部平均親水性是由其鄰近氨基酸的親水性支配，與其免疫原性和抗原性相關(guān)，即和該蛋白的一種生物學特性有關(guān)。以下親水性值賦予下述氨基酸殘基精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0士l);谷氨酸(+3.0土l);絲氨酸(+0.3);天冬酰氨(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);蘇氨酸(-0,4);脯氨酸(-0.5+l);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-l.5》亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。以相似疏水性值作為改變的基礎(chǔ)，在某些實施方案中，氨基酸的替換，其親水值在±2的是被選的，在某些實施方案中，那些親水指數(shù)在士l的是被選的，在某些實施方案中，那些在士0.5的是被選的。人們還可以以親水性為基礎(chǔ)，從原始氨基酸序列來鑒定表位。這些區(qū)也被稱為"表位核心區(qū)"。示例性的氨基酸取代示于表10中。表IO氨基酸取代<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>熟練的技術(shù)人員都能夠用眾所周知的技術(shù)來確定本文所述多肽的適當變體。在某些實施方案中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過靶定不認為對活性具有重要作用的區(qū)域，可以確定該分子中能夠被改變而不破壞其活性的適合區(qū)域。在某些實施方案中，技術(shù)人員可以確定該分子在類似肽或多肽中保守的殘基和部分。在某些實施方案中，即使是對生物活性或結(jié)構(gòu)具有重要作用的區(qū)域，也可以進行保守氨基酸取代而不破壞多肽結(jié)構(gòu)的生物活性或不對多肽結(jié)構(gòu)產(chǎn)生負面影響。此外，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以回顧有關(guān)鑒定類似多肽中對活性或結(jié)構(gòu)具有重要作用的殘基的結(jié)構(gòu)-功能研究。通過這種比較，技術(shù)人員可以預測與類似蛋白中對活性或結(jié)構(gòu)具有重要作用的氨基酸殘基相對應的蛋白中的氨基酸殘基的重要性。該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇將這種可能具有重要作用的氨基酸殘基取代成化學性質(zhì)類似的氨基酸殘基。該領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以分析類似多肽中的三維結(jié)構(gòu)以及與該結(jié)構(gòu)有關(guān)的氨基酸序列。根據(jù)這些信息，技術(shù)人員可以預測抗體與其三維結(jié)構(gòu)有關(guān)的氨基酸殘基的排列。在某些實施方案中，對于可能處在蛋白表面的氨基酸殘基，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇不進行根本的改變，因為這些殘基可能涉及與其他分子的重要相互作用。此外，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可制備對每個目的氨基酸殘基進行單個氨基酸取代的測試變體。并用本領(lǐng)域已知的活性測試方法對這些變體進行篩選。由這些變體可以收集關(guān)于適當變體的信息。例如，若發(fā)現(xiàn)特定氨基酸殘基的改變會導致活性喪失，或?qū)е虏槐匾幕钚越档停驅(qū)е虏贿m當?shù)幕钚詴r，則可以排除含有這種改變的變體。也就是說，根據(jù)這些常規(guī)實驗收集的信息，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地確定應避免再進行單獨取代或結(jié)合其他突變進行取代的氨基酸。有許多科技出版物專門研究二級結(jié)構(gòu)的預觀U。參考MoultJ.,^i^Q^inBiotech.,7(4):422-427(1996)，Chou等，Biochemistry,13(2):222-245(1974);Chou等，Biochemistry,113(2):211-222(1974);Chou等，Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol"47:45-148(1978);Chou等，Ann.Rev.Biochem,,47:251-276和Chou等，Biophys.J.,26:367-384(1979)。另夕卜，如今還可以用計算機程序來輔助進行二級結(jié)構(gòu)預測。預測二級結(jié)構(gòu)的一種方法是以同源性建模為基礎(chǔ)。例如，序列同一性大于30%，或相似性大于40%的兩種多肽或蛋白通常具有類似的拓撲結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)的近期發(fā)展加強了預測二級結(jié)構(gòu)的能力，其中包括多肽或蛋白結(jié)構(gòu)中可能的折疊數(shù)量。參考Holm等，Nucl.Acid,Res.,27(l):244-47(1999)。研究表明(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.7(3):369-3760997))，特定多肽或蛋白中的折疊數(shù)量十分有限，一旦確定了結(jié)構(gòu)的臨界值，結(jié)構(gòu)預測的準確性將會急劇提高。二級結(jié)構(gòu)預測的其他方法還包括"穿線法"(Jones,D.,Curr.Opin.Struct.Biol.,7(3):377-870997):Sippl等，Structure4(1):15-19(1996))、"輪廓分析法"(Bowie等，Science,253:164-170(1991);Gribskov等，Meth.Enzvm.183:146-159(1990);Gribskov等，Proc.NatAcad.Sci.,84(13):4355-4358(1987))，禾口"進化連鎖法"(參考Holm，見上(1999)，和Brenner，見上(1997))。在某些實施方案中，肽體變體包括糖基化變體，其中一個或多個糖基化位點，如N聯(lián)糖基化位點(N-linkedglycosylationsite)已添加到所述肽體上。N聯(lián)糖基化位點的特征是具有序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中標為X的氨基酸殘基可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸殘基?？尚纬蛇@種序列的氨基酸殘基取代或添加將產(chǎn)生新的添加N聯(lián)糖鏈的潛在位點。反之，破壞這種序列的取代將去除已有的N聯(lián)糖鏈。也可以去除一個或多個N聯(lián)糖基化位點(通常是天然存在的糖基化位點)，同時創(chuàng)建一個或多個新的N聯(lián)位點，從而導致N聯(lián)糖鏈的重排。本發(fā)明的化合物也可以在DNA水平上改變?？梢詫⑺龌衔锶魏尾糠值腄NA序列改變?yōu)榕c選定宿主細胞更相容的密碼子。對于為優(yōu)選宿主細胞的大腸桿菌而言，優(yōu)化密碼子是本領(lǐng)域已知的?？梢詫⒚艽a子置換以消除限制位點或包括沉默限制位點，這可能有助于該DNA在選定宿主細胞中的加工?？梢孕揎椝鲚d體、接頭和肽DNA序列，以包括任何上述序列變化。因此，本文所討論的所有修飾，取代，衍生等都應用于本發(fā)明的全部方面時都是等同地，包括但不限于肽，肽二聚體和多聚體，接頭和載體。親和力成熟本發(fā)明的一個實施方案包括"親和力成熟的"肽和肽體。該方法期待利用噬菌體顯示或其它篩選技術(shù)，增加本發(fā)明肽和肽體的親和力或生物活性。在共有序列(其產(chǎn)生用于收集相關(guān)的肽)的基礎(chǔ)上，可以獲得指導性的二級噬菌體顯示文庫，其中所述"核心"氨基酸(從所述共有序列確定)保持不變或者出現(xiàn)頻率偏好。另外，個別肽序列可用于產(chǎn)生偏愛的，指導性噬菌體顯示文庫。對所述文庫進行淘選，可以獲得結(jié)合靶標改善的肽或具有高生物活性的肽(其可轉(zhuǎn)化為肽體)。非肽類似物/蛋白模擬物另外，提供穩(wěn)定結(jié)構(gòu)或減少生物降解的肽的非肽類似物也是設想的。通過用一個或多個殘基置換非肽部分，肽模擬類似物可以在選定的抑制肽基礎(chǔ)上來制成。優(yōu)選，所述非肽部分可以讓該肽保持其天然構(gòu)象，或者穩(wěn)定優(yōu)選的諸如生物活性的構(gòu)象，從而保持該活性以識別和結(jié)合Ang-2。一方面，獲得的類似物/模擬物顯現(xiàn)提高的結(jié)合Ang-2的親和力。從肽制備非肽模擬類似物方法的一個實例描述于Nachman等，Regul.Pept.57:359-370(1995)中。如果需要，可以如通過糖基化，酰胺化，羧化，或磷酸化，或通過制備本發(fā)明肽的酸性加成鹽，酰胺，酯，尤其是C端酯，和N-?；苌飦韺Ρ景l(fā)明的肽進行修飾。還可對所述肽進行修飾，通過與其它部分形成共價鍵或非共價鍵絡合物來獲得肽衍生物。共價鍵絡合物可通過將化學部分與含所述肽的氨基酸側(cè)鏈上的功能團，或者N-或C-端的功能團連接來制備。尤其期望所述肽可與報告基團偶聯(lián)，包括但不限于，放射性同位素，熒光標記，和酶(如催化比色或熒光反應)，底物，固體基質(zhì)，或載體(如生物素或抗生物素蛋白)。因此，本發(fā)明提供了包含肽體分子的分子，其中所述分子優(yōu)選進一步包括選自下組的報告基團放射性同位素，熒光標記，酶，底物，固體基質(zhì)，和載體。所述標記是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如生物素標記尤其優(yōu)選。所述標記的使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，描述于如美國專利No.3，817，837;3，850，752;3,996，345;和4,277,437。其它有用的標記包括但不限于放射性標記，熒光標記和化學發(fā)光標記。有關(guān)使用所述標記的美國專利包括，如美國專利No.3,817,837;3,850,752;3,939,350;和3,996,345。本發(fā)明的任何肽體可以包括一種，兩種，或多種任何所述標記。制備方法主要采用重組DNA技術(shù)，在轉(zhuǎn)化宿主細胞中制備本發(fā)明化合物。為此，制備編碼該肽的重組DNA分子。.制備這種DNA分子的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以采用合適的限制性內(nèi)切酶從DNA切下編碼該肽的序列?；蛘?，可以采用化學合成技術(shù)，例如氨基磷酸酯法，合成所述DNA分子。也可以采用這些技術(shù)的組合。本發(fā)明也包括能夠在合適宿主中表達所述肽的載體。該載體包含有效連接于合適表達控制序列的、編碼該肽的DNA分子。在將該DNA分子插入載體之前或之后實現(xiàn)這種有效連接的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。表達控制序列包括啟動子、激活子、增強子、操縱基因、核糖體結(jié)合位點、起始信號、終止信號、加帽信號、聚腺苷酸化信號，和涉及轉(zhuǎn)錄或翻譯控制的其它信號。所產(chǎn)生的具有所述DNA分子的載體用來轉(zhuǎn)化合適的宿主。這種轉(zhuǎn)化可以采用本領(lǐng)域眾所周知的方法進行。許多可利用和熟知的宿主細胞中的任一種均可以用于實施本發(fā)明。具體宿主的選擇取決于本領(lǐng)域公認的許多因素。這些包括，例如與選定表達載體的相容性、該DNA分子所編碼的肽的毒性、轉(zhuǎn)化率、所述肽回收的容易程度、表達特性、生物安全性和費用。對于表達具體DNA序列而言，不是所有的宿主均是同等有效的，根據(jù)這一理解必須保持這些因素的平衡。在這些一般指導中，有用的微生物宿主包括細菌(例如大腸桿菌菌種)、酵母(例如酵母屬菌種)和其它真菌、昆蟲、植物、哺乳動物(包括人類)的培養(yǎng)細胞，或本領(lǐng)域已知的其它宿主。接下來，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主并將其純化。宿主細胞可以在常規(guī)發(fā)酵條件下培養(yǎng)，使得表達所需的化合物。這種發(fā)酵條件是本領(lǐng)域眾所周知的。最后，采用本領(lǐng)域熟知的方法，從培養(yǎng)物中純化所述肽。所述化合物也可以通過合成法制備。例如，可以使用固相合成技術(shù)。合適的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，包括描述于以下文獻的方法Merrifield(1973),Chem.Polypeptides,第335-61頁(Katsoyannis和Panayotis編輯)；Merrifield(1963),J,Am.Chem.Soc,85:2149;Davis等(1985)，Biochem.Intl,10:394-414;Stewart禾口Young(1969),SolidPhasePeptideSynthesis:美國專利第3,941,763號Finn等(1976)，TheProteins(第三版)2:1.05-253;和Erickson等(1976)，TheProteins,(第三版)2:257-527。固相合成是制備個別肽的優(yōu)選技術(shù)，因為它是制備小肽最經(jīng)濟的方法。含有衍生肽或含有非肽基團的化合物可以眾所周知的有機化學技術(shù)合成?；衔锏膽酶攀?。由于本發(fā)明化合物結(jié)合目的蛋白的能力，因此本發(fā)明化合物具有作為這種目的蛋白天然配體的激動劑、模擬物或拮抗劑的藥理學活性。具體化合物的用途示于表2。這些化合物的活性可以通過本領(lǐng)域已知的分析來測量。對于TPO-模擬化合物和EPO-模擬化合物，在本文實施例一節(jié)進一歩描述旌fi測定。除治療用途外，本發(fā)明化合物可用于診斷特征為其相關(guān)的目的蛋白功能異常的疾病。在一個實施方案中，在生物樣品中監(jiān)測能夠被活化的目的蛋白(如受體)的方法包括以下步驟(a)使所述樣品與本發(fā)明化合物接觸；和(b)檢測該化合物對所述蛋白的活化。所述生物樣品包括組織標本、完整細胞，或它們的提取物。本發(fā)明的化合物可以用作診斷試劑盒的部分，以檢測在生物樣品中其相關(guān)目的蛋白的存在。這種試劑盒使用具有便于檢測的標記的本發(fā)明化合物。所述化合物可用來鑒定正?；虍惓５哪康牡鞍?。例如對于EPO-模擬化合物，生物樣品中異常目的蛋白的存在指示諸如先天性再生障礙性貧血的疾病，據(jù)信在該病中EPO受體的功能異常。EPO-模擬化合物的治療用途本發(fā)明的EPO-模擬化合物可用來治療特征為紅細胞水平低的疾病。本發(fā)明包括調(diào)節(jié)哺乳動物中EPO受體內(nèi)源活性的方法，優(yōu)選是提高EPO受體活性的方法。一般而言，可用紅細胞生成素治療的任何病癥例如貧血也可以用本發(fā)明的EPO-模擬化合物治療。通過適合于該治療病癥性質(zhì)和嚴重程度、并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的傳遞量和傳遞途徑給予這些化合物。優(yōu)選通過注射給予，即或者皮下注射、肌內(nèi)注射，或靜脈內(nèi)注射給予。TPO-模擬化合物的治療用途對于所述TPO-模擬化合物，人們可以利用諸如描述于題為"剌激巨核細胞生長和分化的組合物和方法"的W095/26746中描述的標準測定。皿測定也示于下文的實施例中。治療的病癥一般是涉及存在的巨核細胞/血小板缺乏或預期巨核細胞/血小板缺乏的病癥(例如由于計劃的手術(shù)或血小板捐獻)。這種病癥通常是體內(nèi)缺乏活性Mpl配體的結(jié)果。血小板缺乏的術(shù)語是血小板減少，因此，本發(fā)明的方法和組合物一般可用來治療需要治療的患者的血小板減少。血小板減少(血小板缺乏)可以因各種原因出現(xiàn)，包括化療和其它使用多種藥物的治療、放療、手術(shù)、意外失血，和其它特定的病癥。涉及血小板減少并且可以按照本發(fā)明治療的典型的特定病癥是再生障礙性貧血、血小板減少、導致血小板減少的轉(zhuǎn)移性腫瘤、全身性紅斑狼瘡、脾大、Fanconi綜合征、維生素B12缺乏、葉酸缺乏、May-Hegglin異常、Wiskott-Aldrich綜合癥，和陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿。此外，對AIDS的某些療法導致血小板減少(例如AZT)。某些傷口愈合性疾病也可能得益于血小板數(shù)目的增加。關(guān)于預期的血小板缺乏，例如由于未來的手術(shù)，可以在需要血小板之前數(shù)天至數(shù)小時給予本發(fā)明的化合物。關(guān)于急性情況，例如意外失血和大量失血，可以將本發(fā)明化合物與血液或純化的血小板一起給予。本發(fā)明的TPO-模擬化合物也可以用來刺激非巨核細胞的某些細胞類型，只要發(fā)現(xiàn)這種細胞表達Mpl受體。與表達Mpl受體的這種細胞相關(guān)、對Mpl配體刺激反應的病癥也在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明的TPO-模擬化合物可用于需要產(chǎn)生血小板或血小板前體細胞或需要刺激c-Mpl受體的任何情況。因此，例如本發(fā)明的化合物可以用來在哺乳動物中治療需要血小板、巨核細胞等的任何病癥。這種病癥詳細描述于以下示例性來源W095/26746、W095/21919、W095/18858、WO95/21920,它們通過引用結(jié)合至本文中。本發(fā)明的TPO-模擬化合物也可以用來維持血小板和/或巨核細胞和相關(guān)細胞的活力和保存期限。因此，它可以用來在含這種細胞的組合物中包含有效量的一個或多個這種化合物。Ang-2結(jié)合分子的治療用途介導Ang-2結(jié)合活性，或其它細胞活性的制劑可與其它治療劑組合使用，以提高其治療效力或降低潛在的副作用。一方面，本發(fā)明提供了用于治療特征為細胞中的Ang-2活性水平不合理或異常的疾病和病癥的試劑和方法。所述疾病包括癌癥，和其它增生過多癥，如增生，銀屑病，接觸性皮炎，免疫學疾病，和不孕。本發(fā)明還提供了治療包括人的動物中的癌癥的方法，包括給動物施用有效量的抑制或降低Ang-2活性的特異性結(jié)合劑，如肽體。本發(fā)明進一步涉及抑制癌細胞生長的方法，所述癌細胞生長包括在生物系統(tǒng)內(nèi)細胞增殖，侵入，和轉(zhuǎn)移的過程。方法包括利用本發(fā)明的化合物作為癌細胞生長抑制劑。優(yōu)選用所述方法抑制或降低活動物諸如哺乳動物內(nèi)的癌細胞生長，侵入，轉(zhuǎn)移或腫瘤發(fā)病率。本發(fā)明的方法還可很容易地適于在分析系統(tǒng)中使用，如分析癌細胞生長和其特性，以及鑒定影響癌細胞生長的化合物。利用本發(fā)明方法可治療的癌優(yōu)選是發(fā)生在哺乳動物內(nèi)的。哺乳動物包括，如人和其它靈長類，以及寵物如狗和貓，實驗室動物如大鼠，小鼠和兔子，和農(nóng)場動物如馬，豬，羊和牛。腫瘤或贅生物包括組織細胞的生長，其中所述細胞的增殖不受控制并且是進行性的。這種生長的某些是良性的，但另一些就被稱為惡性的,會導致生物死亡。惡性腫瘤或癌與良性生長的區(qū)別在于，除了顯現(xiàn)侵入性細胞繁殖外，癌還會侵入周圍組織并轉(zhuǎn)移。另外，惡性腫瘤的特征是其表現(xiàn)出分化的較大喪失(較大的去分化性)，以及它們相對彼此之間和周圍組織的組織機構(gòu)的較大喪失。這種特性也被稱為"間變"。利用本發(fā)明可治療的腫瘤還包括實體瘤，即癌和肉瘤。癌包括由上皮細胞產(chǎn)生的惡性腫瘤，這種腫瘤滲透到(侵入)周圍的組織，并發(fā)生轉(zhuǎn)移。腺癌是腺組織產(chǎn)生的癌，或者其中的腫瘤細胞形成可識別的腺結(jié)構(gòu)。另一種較大類型的癌癥包括肉瘤，它是這樣的腫瘤，其細胞被包埋在纖維狀或同源物質(zhì)中，如胚性結(jié)締組織。本發(fā)明還能夠治療骨髓或淋巴系統(tǒng)的癌癥，包括白血病、淋巴瘤和其他癌癥，所述其他癌癥通常不是以腫塊存在，而是分布于血管或淋巴網(wǎng)狀細胞系統(tǒng)中。這樣，本發(fā)明的ang-2結(jié)合分子可用于治療多種癌癥，包括實體瘤和白血病?？梢杂帽景l(fā)明治療的癌癥或腫瘤包括如ACTH生成腫瘤；急性淋巴細胞性白血??；急性非淋巴細胞性白血??；腺瘤；腎上腺皮質(zhì)癌；乳腺癌，前列腺癌，和結(jié)腸癌；成釉細胞瘤；apud瘤(apudoma);膀胱癌；腦癌；鰓原性瘤；乳腺癌；所有形式的肺支氣管癌；類癌瘤心臟??；癌(如Walker，基細胞，basosquamous，Brown-Pearce，導管，Ehrlich腫瘤，Krebs2，merkd細胞，粘蛋白狀，非小細胞肺，oat細胞，乳頭，硬癌，細支氣管的，支氣管原的，扁平細胞，和移行細胞)；惡性類癌瘤綜合征；免疫增殖性小肺細胞癌；牙骨質(zhì)瘤；宮頸癌；成軟骨細胞瘤；軟骨瘤；軟骨肉瘤；迷芽瘤；慢性淋巴細胞性白血??；慢性髓細胞性白血??；結(jié)腸直腸癌；脊索瘤；顱咽管瘤；皮膚T細胞淋巴瘤；無性細胞瘤；子宮內(nèi)膜癌；食道癌；Ewing'S肉瘤；纖維瘤；纖維肉瘤；膽囊癌；巨大細胞瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；毛細胞白血??；錯構(gòu)瘤；頭脖癌；肝癌；組織細胞癥；Hodgkin'S淋巴瘤；Kaposi's肉瘤；腎癌；脂肪瘤；脂肪肉瘤；肝癌；肺癌(小和非小細胞)；惡性腹膜滲出；惡性胸膜滲出；黑素瘤；間質(zhì)瘤；中腎瘤；間皮瘤；多發(fā)性骨髓瘤；肌肉瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；成神經(jīng)細胞瘤；非Hodgkin'S淋巴瘤；牙瘤；骨瘤；骨肉瘤；卵巢癌；卵巢(生殖細胞)癌；胰腺癌；乳頭狀瘤；陰莖癌；漿細胞瘤；前列腺癌；網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增生??；成視網(wǎng)膜細胞瘤；皮膚癌；軟組織肉瘤；扁平細胞癌；胃癌；畸胎瘤；睪丸癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；滋養(yǎng)層腫瘤；子宮癌；陰道癌；外陰癌；Wilm's腫瘤。另外，下述癌癥也可以治療膽管瘤；膽脂瘤；cyclindroma;囊腺癌；囊腺瘤；粒細胞腫瘤；卵巢兩性母細胞瘤；汗腺腺瘤；小島細胞腫瘤；間質(zhì)細胞腫瘤；乳頭狀瘤；塞爾托利細胞腫瘤；鞘細胞腫瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；成肌細胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；橫紋肌瘤；橫紋肌肉瘤；室管膜瘤；神經(jīng)節(jié)細胞瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；成神經(jīng)管細胞瘤；脊膜瘤;神經(jīng)鞘瘤；成神經(jīng)細胞瘤；神經(jīng)上皮瘤；纖維神經(jīng)瘤；神經(jīng)瘤；副神經(jīng)節(jié)瘤；非嗜鉻性副神經(jīng)節(jié)瘤；血管角質(zhì)瘤；血管淋巴樣增生伴嗜酸細胞增多；硬化性血管瘤；血管瘤??；血管球瘤；血管內(nèi)皮瘤；血管瘤；血管外皮瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果體瘤；癌肉瘤；軟骨肉瘤；囊性肉瘤；纖維肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；橫紋肌肉瘤；肉瘤；瘤；神經(jīng)纖維瘤?。缓妥訉m頸非典型增生。NGF結(jié)合分子的治療用途NGF結(jié)合分子可用于預防或治療NGF-相關(guān)性疾病和病癥。所述適應癥包括但不限于疼痛(包括但不限于炎性痛并伴有痛覺過敏和異常性疼痛，神經(jīng)性疼痛并伴有痛覺過敏和異常性疼痛，糖尿病神經(jīng)病變疼痛，灼痛，交感性持續(xù)疼痛，傳入神經(jīng)阻滯綜合癥，急性痛，肌緊張性頭痛，偏頭痛，牙痛，外傷所致疼痛，手術(shù)疼痛，截肢或膿腫所致疼痛，灼痛，脫髓鞘癥，和三叉神經(jīng)痛)。本發(fā)明的肽或修飾肽具有用作預防或治療其它NGF相關(guān)疾病的病因劑的治療價值，包括但不限于哮喘，緊急失禁(如機能亢進性膀胱)，銀屑病，癌(尤其是胰腺癌和黑素瘤)，慢性酒精中毒，中風，丘腦性疼痛癥，糖尿病，獲得性免疫缺陷癥("AIDS")，毒素和化學療法，一般性頭痛，偏頭痛，叢集性頭痛，混合血管性和非血管性綜合癥，一般炎癥，關(guān)節(jié)炎，風濕病，狼瘡，骨關(guān)節(jié)炎，腸炎，眼炎，炎性或不穩(wěn)定性膀胱病，銀屑病，皮膚病伴有炎癥，曬斑，心炎，皮炎，肌炎，神經(jīng)炎，膠原血管癥，慢性炎癥，哮喘，上皮組織損壞或功能失調(diào)，單純性皰疹，呼吸、泌尿生殖、胃腸或血管區(qū)域的內(nèi)臟運動紊亂，創(chuàng)傷，燒傷，過敏性皮膚反應，瘙癢癥，白癜風，一般性胃腸不適，結(jié)腸炎，胃潰瘍，血管舒張縮性或過敏性鼻炎，或支氣管不適。肌肉生長抑制素結(jié)合分子的治療用途本發(fā)明的肌肉生長抑制素結(jié)合劑與肌肉生長抑制素結(jié)合，并且阻斷或抑制肌肉生長抑制素在靶定細胞內(nèi)的信號傳導。本發(fā)明提供了通過將有效劑量的一種或多種肌肉生長抑制素結(jié)合劑施用給動物，而降低動物中肌肉生長抑制素的量或活性的方法和試劑。在一方面，本發(fā)明提供了治療動物內(nèi)的肌肉生長抑制素相關(guān)病癥的方法和試劑，包括將有效劑量的一種或多種結(jié)合劑施給動物。這些肌肉生長抑制素相關(guān)病癥包括但不限于各種形式的肌肉消耗病癥，以及代謝紊亂如糖尿病和相關(guān)疾病，和骨退變性疾病如骨質(zhì)疏松癥。如美國系列No.10/742,379的實施例8所示，本發(fā)明的示例性肽體明顯使CD1nu/nu小鼠模型的痩肌肉量增力[]。這種體內(nèi)活性和下文描述的相同肽體的體外結(jié)合和抑制活性有關(guān)。肌肉消耗病癥包括營養(yǎng)不良如Duchenne's肌肉萎縮癥，進行性肌營養(yǎng)障礙，Becker's型肌肉萎縮癥，Dejerine-Landouzy肌肉萎縮癥，Erb's肌肉萎縮癥，和幼兒神經(jīng)軸索性營養(yǎng)不良。例如，通過利用體內(nèi)抗體阻斷肌肉生長抑制素，改善了Duchenne肌肉萎縮癥的mdx小鼠模型的營養(yǎng)不良表型(Bogdanovich等(2002),Nature420:28)。利用示例性的肽體使得痩肌肉量增加，并且加大了mdx小鼠模型中的瘦肌肉與脂肪比例，如下述實施例9所述。另外的肌肉消耗病癥是由慢性病引起的，如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥，充血性阻塞性肺疾病，癌，AIDS,腎衰竭，和類風濕性關(guān)節(jié)炎。例如，由于全身性施用肌肉生長抑制素，導致無胸腺裸鼠惡疾或肌肉消耗，和體重減輕(Zimmers等，皿)。在另一個實施例中，發(fā)現(xiàn)在顯現(xiàn)AIDS-相關(guān)肌肉消耗病癥的人中，肌肉生長抑制素-免疫反應性蛋白的血清和肌肉濃度增高，相反非脂肪量降低(Gonzalez-Cadavid等(1998),PNASUSA95:14938-14943)。肌肉消耗癥導致的其它癥狀可能是由于病廢如限制在輪椅內(nèi)而不活動，由于中風，疾病，骨折或外傷而長期臥床休息，和在微重力環(huán)境(太空飛行)中肌肉萎縮引起的。例如，發(fā)現(xiàn)在長期臥床休息后，血漿肌肉生長抑制素免疫活性蛋白明顯增加(Zachwieja等JGravitPhvsiol.6(2):11(1999)。還發(fā)現(xiàn)在太空穿梭飛行過程中，大鼠肌肉與微重力環(huán)境接觸，相比不接觸微重力環(huán)境的大鼠肌肉，其肌肉生長抑制素的量明顯增加(Lalani等(2000),J.Endocrin.167(3):417-28)。另外，脂肪和肌肉的比與年齡有關(guān)的增長，和與年齡有關(guān)的肌肉萎縮似乎與肌肉生長抑制素有關(guān)系。例如，隨著年齡組為青年(19-35歲)，中年(36_75歲)，和老年(76-92歲)的男人和女人變化，平均的血清肌肉生長抑制素-免疫活性蛋白增加，同時隨著所述組別的年齡變化，平均肌肉量和非脂肪量降低(Yarasheski等JNutrAging6(5):343-8(2002))。它還顯示在小鼠中敲除肌肉生長抑制素基因，導致肌生成增加，脂肪生成降低(Lin等(2002)，BiochemBiophysResCommun291(3):701-6)，從而使得成年人的肌肉量增加，脂肪量和瘦素分泌減少。改善老齡mdx小鼠內(nèi)痩肌肉量與脂肪比的示例性分子如下所示。另外，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)肌肉生長抑制素能以低水平在心肌內(nèi)表達，而且該表達由梗死后的心肌細胞上調(diào)節(jié)(Sharma等(1999),JCellPhvsiol.180(l):l-9)。因此，降低心肌內(nèi)的肌肉生長抑制素水平可以在梗死后促進心肌恢復。肌肉生長抑制素似乎還能影響代謝紊亂，包括2型糖尿病，非胰島素依賴性糖尿病，高血糖癥，和肥胖病。例如，已顯示缺少肌肉生長抑制素能改善兩小鼠模型的肥胖和糖尿病表型(Yen等，l匕)。另外，通過降低肌肉生長抑制素水平來增加肌肉量可以改善骨強度，減少骨質(zhì)疏松癥和其它退變性骨疾病。如已發(fā)現(xiàn)，肌肉生長抑制素-缺陷性小鼠的小鼠肱骨的礦物質(zhì)含量和密度增加，肌肉接觸區(qū)域的脊柱骨和皮層骨的礦物質(zhì)含量都提高，且肌肉量增加(Hamrick等(2002),CalcifTissueInt71(11:63-81)。在本發(fā)明中，如下所示，在mdx小鼠模型中，示例性肽體增加了瘦肌肉量與脂肪的比。本發(fā)明還提供了通過將有效劑量的肌肉生長抑制素結(jié)合劑施給動物，增加食用動物肌肉量的方法和試劑。由于成熟C末端肌肉生長抑制素多肽在所有檢測物種中都是一樣的，因此期望肌肉生長抑制素結(jié)合劑能在任何農(nóng)業(yè)上重要物種中有效增加肌肉量并減少脂肪，所述物種包括牛，雞，火雞，和豬。本發(fā)明的肌肉生長抑制素-結(jié)合分子可單獨使用或者與其它治療劑組合使用，以提高其治療效力或降低潛在的副作用。本發(fā)明的分子擁有一種或多種期望且意料之外的特性組合，從而提高該制劑的治療價值。這些特性包括活性增強，溶解性增強，降解性降低，半衰期增長，毒性降低，和免疫原性降低。因此，本發(fā)明的分子可用于大范圍的治療方法。另外，本發(fā)明化合物的親水性和疏水性特性是很適中的，這樣就能提高它們在體外和尤其是體內(nèi)使用的實用性。具體地說，本發(fā)明的化合物具有合適程度的水媒介溶解性，該溶解性可允許在體內(nèi)吸收和生物利用率，同時該化合物還具有一定程度的脂質(zhì)體溶解性，該溶解性可允許該化合物穿過細胞膜到假定的作用位點，如特定的肌肉群。本發(fā)明的肌肉生長抑制素結(jié)合分子可用于當在適合的組合物中以有效量施用時，治療"對象"或任何動物，包括人。另外，本發(fā)明的肌肉生長抑制素-結(jié)合分子可用于對許多分析中的肌肉生長抑制素進行檢測和定量。所述分析具體描述在美國系列No.10/742,379中。通常，本發(fā)明的肌肉生長抑制素-結(jié)合分子可用作結(jié)合和固定各種分析中的肌肉生長抑制素的捕獲劑，相似于下述文獻中所述，如Asai，編輯,MethodsinCellBiology,37,AntibodiesinCellBiology,AcademicPress,Inc.,NewYork(1993)?？蓪⑺黾∪馍L抑制素-結(jié)合分子以某種方式用標簽標記，或者與被標記的第三種分子如抗-結(jié)合分子抗體反應，從而能對肌肉生長抑制素進行檢測和定量。例如，可以用可測定部分諸如生物素對肌肉生長抑制素-結(jié)合分子或第三分子進行修飾，然后所述分子就能與第四分子，如酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素，或其它蛋白結(jié)合(Akerstrom(1985)，JImmunol135:2589;Chaubert(1997),ModPathol10:585)。對于任何特定分析來說，都需要在結(jié)合試劑后進行孵育和/或洗滌步驟。孵育步驟可以從約5秒變化到數(shù)小時，優(yōu)選從約5分鐘變化到約24小時。而且所述孵育時間將由分析形式，溶解體積，濃度等來決定。通常，雖然分析可在一定范圍的溫度下進行，但所述分析將在室溫下進行。BAFF-結(jié)合分子的治療用途。本發(fā)明的BAFF-結(jié)合分子尤其適用于治療B-細胞介導的自身免疫性疾病。具體地說，它們可用于治療，防御，改善，診斷或預測狼瘡，包括全身性紅斑狼瘡(SLE)，和狼瘡相關(guān)性疾病和病癥。其它優(yōu)選的病癥包括B-細胞介導的癌癥，包括B-細胞淋巴瘤。本發(fā)明的化合物還可用于治療關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)的炎癥性疾病是慢性關(guān)節(jié)疾病，在不同程度上使全世界上百萬人痛苦和殘廢。類風濕性關(guān)節(jié)炎是軟骨和骨被稱為關(guān)節(jié)翳(由滑膜衍生)的增生性的侵入性結(jié)締組織慢慢侵蝕掉的關(guān)節(jié)疾病。該疾病可能涉及諸如肌囊、腱鞘和腱的關(guān)節(jié)周結(jié)構(gòu)以及關(guān)節(jié)外組織，諸如皮下組織、心血管系統(tǒng)、肺、脾、淋巴結(jié)、骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)(中樞和外周)和眼(Silberberg(1985)，Anderson'sPathology,Kissane(編輯),11:1828)。骨關(guān)節(jié)炎是一種特征為關(guān)節(jié)軟骨的變性性變化和損傷關(guān)節(jié)周圍骨和軟骨的反應性增生的常見關(guān)節(jié)疾病。骨關(guān)節(jié)炎是細胞介導的活性過程，可能由軟骨細胞對異化和同化刺激物的不當反應引起的。報道了在早期骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨的某些基質(zhì)分子的變化(Thonar等(1993),RheumaticdiseaseclinicsofNorthAmerica,Moskowitz(編輯)，19:635-657和Shinmei等(1992),ArthritisRheum.，35:1304-1308)。骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，其特征是關(guān)節(jié)軟骨的退化改變和關(guān)節(jié)周圍的骨頭和軟骨的活躍增殖。骨關(guān)節(jié)炎是一種細胞介導的活性過程，它有可能是因為軟骨細胞對分解代謝和合成代謝刺激作出的不適當?shù)姆磻鶎е碌?。?jù)報導，關(guān)節(jié)軟骨的某些基質(zhì)分子的改變出現(xiàn)在早期骨關(guān)節(jié)炎中(Thonar等(1993),RheumaticdiseaseclinicsofNorthAmerica,Moskowitz(編輯)，19:635-657和Shinmei等(1992)'ArthritisRheum.，35:1304-1308)。TALL-l，TALL-1R和其調(diào)節(jié)劑被認為可用于治療所述癥狀和相關(guān)癥狀。BAFF-結(jié)合分子還可用于治療多種其他疾病和病癥，包括急性胰腺炎；ALS;Alzheimer's?。幌?；動脈硬化；自身免疫溶血性貧血；癌癥，特別是與B細胞相關(guān)的癌癥；惡病質(zhì)/厭食；慢性疲勞綜合癥；硬變(如原發(fā)性膽汁肝硬變)；糖尿病(如胰島素糖尿病)；發(fā)熱；腎小球腎炎，包括IgA腎小球腎炎和原發(fā)性腎小球腎炎；Goodpasture's綜合癥；Guillain-Barre綜合癥；移植物抗宿主??；Hashimoto's甲狀腺炎；出血性休克；痛覺過敏；炎性腸炎；關(guān)節(jié)的炎性癥狀，包括骨關(guān)節(jié)炎，牛皮癬關(guān)節(jié)炎和類風濕關(guān)節(jié)炎；由拉傷，扭傷，軟骨損傷，創(chuàng)傷，整形手術(shù)，感染或其他病變過程導致的炎性癥狀；胰島素依賴型糖尿??；缺血性損傷，包括大腦缺血(如由創(chuàng)傷、癲癇、出血或中風所導致的大腦損傷，上述每一種疾病都可能導致神經(jīng)變性)；認知障礙；肺病(如ARDS);狼瘡，尤其是全身性紅斑狼瘡(SLE);多發(fā)性骨髓瘤；多發(fā)性硬化；重癥肌無力；骨髓性(如AML和CML)和其他白血病；肌病(如肌肉蛋白代謝，特別是敗血癥)；神經(jīng)毒性(如通過HIV誘導的神經(jīng)毒性)；骨質(zhì)疏松；疼痛；帕金森?。惶彀挴?；多發(fā)性肌炎/皮膚肌炎；肺炎，包括自身免疫肺炎；未足月產(chǎn)(pre-termlabor);牛皮癬；Reiter's??；再灌注損傷；膿毒性休克；由放射治療產(chǎn)生的副作用；Sjogren's綜合癥；睡眠紊亂；臨時性下頜骨關(guān)節(jié)??；血小板減少癥，包括特發(fā)性血小板減少癥和自身免疫新生兒血小板減少癥；腫瘤轉(zhuǎn)移；眼色素層炎；和脈管炎。聯(lián)合療法。本發(fā)明的治療方法、組合物和化合物也可以單獨地或與其它細胞因子、可溶性Mpl受體、造血因子、白介素、生長因子或抗體聯(lián)合用來治療特征為其它癥狀以及血小板缺乏的疾病狀態(tài)。預期在與血細胞生成的一般刺激物結(jié)合治療某些形式的血小板減少方面，將證明本發(fā)明的化合物是有用的，所述一般刺激物例如IL-3或GM-CSF。其他巨核細胞剌激因子，即meg-CSF、干細胞生長因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)，或具有巨核細胞剌激活性的其它分子也可以與Mpl受體一起使用。用于這種共給予的其它示例性細胞因子或造血因子包括IL-a、IL-P、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-ll、集落刺激因子-l(CSF-l)、SCF、GM-CSF、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-a(IFN-a)、復合干擾素、IFN-卩，或IFN-y?；蛘咄瑫r或者順序給予有效量的可溶性哺乳動物Mpl受體也可以是有用的，這看來具有當巨核細胞達到成熟形式后立即使得巨核細胞分裂為血小板的效應。因此，預期給予本發(fā)明化合物(以增加成熟巨核細胞數(shù))，然后給予可溶性Mpl受體(以使所述配體失活并使成熟巨核細胞可以產(chǎn)生血小板)是一種特別有效的剌激血小板產(chǎn)生的方法。可以調(diào)節(jié)上述劑量，以補償所述治療組合物中的這種額外組分。所治療的患者的進程可以通過常規(guī)方法監(jiān)測。在將本發(fā)明化合物加入血小板和/或巨核細胞和相關(guān)細胞的組合物中的情況下，其包含的量一般采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)和測定來確定。典型的量的范圍為0.1嗎-lmg本發(fā)明化合物/l(^細胞。藥用組合物概述本發(fā)明也提供本發(fā)明化合物的藥用組合物的用法。這種藥用組合物可以用于注射施用，或用于口、肺、鼻、經(jīng)皮或其它形式施用。一般而言，本發(fā)明包括這樣的藥用組合物，所述藥用組合物包含有效量的本發(fā)明化合物以及藥學上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。這種組合物包括各種緩沖劑內(nèi)容物(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑;添加劑，如去垢劑和增溶劑(例如Tween80、多乙氧基醚80)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇)和填充物質(zhì)(例如乳酸、甘露醇)；將所述物質(zhì)加入聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等的顆粒制劑中或加入脂質(zhì)體中?？梢允褂猛该髻|(zhì)酸，這可能具有促進循環(huán)時間持久的效應。這種組合物可以影響本發(fā)明蛋白和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。參見如Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版(1990，MackPublishingCo.，Easton,PA18042)第1435-1712頁，將其通過引用結(jié)合到本文中?？梢灾苽湟后w形式的所述組合物，或可以制備干粉形式例如凍干形式的所述組合物。設想了可植入可持久釋放組合物，也設想了經(jīng)皮制劑?？诜┬蛯τ谄渲械膽?，設想了口服固體劑型，其一般描述于Remington'sPharmaceuticalSciences(1990)，第18版的第89章，MackPublishingCo.EastonPA18042，將其通過引用結(jié)合到本文中。固體劑型包括片劑、膠囊、丸劑、錠劑或糖錠劑、小藥囊或彈丸劑。此外，可以用脂質(zhì)體或類蛋白包囊來配制本發(fā)明組合物(如例如美國專利No.4,925,673中報道的類蛋白微球)。也可以使用脂質(zhì)體包囊，并且所述脂質(zhì)體也可用各種聚合物衍生(如美國專利No.5,013,556)。在Marshall,K.，ModemPharmaceutics(1979)，G.S.Banker禾nC.T.Rhodes編輯，第10章，其通過引用結(jié)合到本文中，給出了用于所述治療藥的可能的固體劑型的描述。一般而言，該制劑包括本發(fā)明化合物以及提供保護抵抗胃環(huán)境且在腸中釋放所述生物活性材料的惰性組分。也特別設想了上述本發(fā)明化合物的口服劑型。如有必要，可以化學修飾所述化合物以使口服傳遞有效。一般來說，設想的化學修飾是將至少一個部分連接于該化合物分子自身，其中所述部分允許o)抑制蛋白水解；和(b)從胃或腸吸收到血液中。也需要該化合物總穩(wěn)定性的增加和在機體循環(huán)時間的增加。在本發(fā)明中用作共價連接載體的部分也可用于該目的。這種部分的實例包括PEG、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。參見例如Abuchowski禾口Davis，SolublePolymer-EnzymeAdducts，EnzymesasDrugs(1981)，Hocenberg禾口Roberts編輯，Wiley-Interscience，NewYork,NY.，第367-83頁；Newmark等(1982)，J.Appl.Biochem.4:185-9?？梢允褂玫钠渌酆衔锸蔷?l，3-二氧戊環(huán)和聚-l,3,6-三氧戊環(huán)。如上所述，對于藥物用途優(yōu)選PEG部分。對于口服傳遞劑型，也可能使用修飾的脂肪族氨基酸的鹽，例如N-(8-[2-羥基苯甲?；鵠氨基)辛酸鈉(SNAC)作為增強本發(fā)明治療化合物吸收的載體。在EmisphereTechnologies進行的II期實驗中已經(jīng)證明了采用SNAC的肝素制劑的臨床效力。參見美國專利No.5,792,451"口服藥物傳遞組合物和方法"。本發(fā)明的化合物可作為粒徑約lmm的顆粒或彈丸形式的細小的多粒子包括在所述制劑中。用于膠囊給藥的該材料的制劑也可以作為粉劑、輕輕壓制的塞型物(plug)或甚至作為片劑?？赏ㄟ^壓縮制備所述治療藥。可以包括著色劑和調(diào)味劑。例如，可以配制(例如通過脂質(zhì)體或微球包囊)所述蛋白(或衍生物)，然后進一步包含在可食用制品中，例如含有著色劑和調(diào)味劑的冷藏飲料。人們可以用惰性材料稀釋本發(fā)明化合物，或增加其體積。這些稀釋劑可包括糖類，尤其是甘露醇、(x-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些無機鹽也可用作填充劑，包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。某些市售稀釋劑是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress禾口Avicell。崩解劑可以包括在配制為固體劑型的該治療藥制劑中。用作崩解劑的材料包括但不限于淀粉，包括市售的基于淀粉的崩解劑Explotab。淀粉乙醇酸鈉、Amberlite、羧甲基纖維素鈉、超支鏈淀粉(ultramylopectin)、藻酸鈉、明膠、橙皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿和膨潤土都可以使用。另一種形式的崩解劑是不溶性的陽離子交換樹脂。粉狀膠可以用作崩解劑和粘合劑，它們可以包括粉狀膠，例如瓊脂、Karaya或西黃蓍膠。藻酸及其鈉鹽也可以用作崩解劑。粘合劑可以用來將所述治療劑保持在一起，形成硬的片劑，包括得自天然產(chǎn)物的材料，例如阿拉伯膠、西黃蓍膠、淀粉和明膠。其它包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯垸酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)均可以用于醇溶液，以便使所述治療劑顆?；？梢栽谠撝委焺┲苿┲刑砑涌鼓Σ羷?，以防止配制過程中發(fā)生粘連?？梢詫櫥瑒┯米髟撝委焺┖湍＞弑谥g的一個層，所述潤滑劑可包括但不限于硬脂酸包括其鎂鹽和鈣鹽、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。也可以使用可溶性潤滑劑，如十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鎂、各種分子量的聚乙二醇、Carbowax4000和6000?？梢蕴砑痈倪M配制期間藥物流動特性，并有助于壓縮期間重新排列的助流劑。助流劑可以包括淀粉、滑石粉、火成硅和水合硅鋁酸鹽。為了幫助本發(fā)明化合物溶解于水性環(huán)境中，可以加入表面活性劑作為潤濕劑。表面活性劑可以包括陰離子去坭劑，如月桂基硫酸鈉、丁二酸二辛酯磺酸鈉，和二辛基磺酸鈉?？梢允褂藐栯x子去垢劑，陽離子去垢劑可以包括苯扎氯銨或芐索氯銨。在所述制劑中可以作為表面活性劑使用的潛在非離子去垢劑包括lauromacrogol400、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、甘油單硬脂酸酯、多乙氧基醚40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可以單獨或作為不同比率的混合物存在于該蛋白或衍生物的制劑中。添加劑也可以包括在該制劑中，以增強該化合物的攝入。潛在具有該特性的添加劑是例如脂肪酸油酸、亞油酸和亞麻酸。可能需要控制釋放制劑。可將本發(fā)明的化合物整合到惰性基質(zhì)中，所述惰性基質(zhì)可以通過擴散或者浸出機制釋放，例如樹膠。還可將緩慢降解的基質(zhì)整合到該制劑中，例如藻酸鹽、多糖。本發(fā)明化合物的另一種形式的控制釋放是一種基于Oros治療系統(tǒng)(AlzaCorp.)的方法，艮卩，將所述藥物包在半透膜中，由于滲透作用，這種膜使得水能夠進入并且通過單一的小孔將藥物從里面推出。某些腸包衣也具有緩釋效果?？梢詫⑵渌聞┯糜谠撝苿＿@些包括可用于包衣鍋的多種糖類。所述治療劑也可以以薄膜包衣的片劑的形式提供，將用于這種情況的材料分為2組。第一組是非腸衣材料，包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基羥基乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、吡咯烷酮和聚乙二醇。第二組包括腸衣材料，它們一般為鄰苯二甲酸酯。可以將材料的混合物用于提供最佳的薄膜包衣。薄膜包衣可以在衣鍋包衣機(pancoater)或流化床中進行，或者通過壓片包衣進行。肺傳遞形式本文也設想了本發(fā)明蛋白(或其衍生物)的肺傳遞。所述蛋白(或衍生物)是通過吸入輸送到哺乳動物肺中的，并且通過肺上皮襯層傳遞至血流。(這種形式的其它報道包括Adjei等，Pha畫.Res.(1990、7:565-9;Adjei等(1990)'Internatl.J.Pharmaceutics63:135_44(leuprolideacetate);Braquet等(1989)，J.Cardiovasc.Pharmacol.D(增刊5):第143-146頁(內(nèi)皮縮血管肽-l);Hubbard等(1989)，AnnalsInt.Med.3:206-12(al-抗胰蛋白酶)；Smith等(1989)J.Clin.Invest.84:1145-6(al-蛋白酶)；Oswein等(1990年3月)，"蛋白的氣化"，Proc.Symp.Resp.DrugDeliveryII，Keystone,Colorado(重組人生長激素)；Debs等(1988)J.Immunol.140:3482-8(干擾素和腫瘤壞死因子a)和Platz等的美國專利NO.5,284,656(粒細胞集落刺激因子)。設想用于實施本發(fā)明的是為了肺傳遞治療制品而設計的多種機械裝置，包括但不限于噴霧器、計量劑量吸入器，和粉末吸入器，所有這些裝置都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。適用于實施本發(fā)明的市售裝置的某些具體實例是Ultravent噴霧器，Mallinckrodt,Inc.,St.Louis,Missouri制造；AcornII噴霧器，MarquestMedicalProducts,Englewood，Colorado制造；Ventolin計量齊U量吸入器，GlaxoInc.,ResearchTrianglePark,NorthCarolina制造；和Spinhaler粉末吸入器，F(xiàn)isonsCorp.,Bedford,Massachusetts帝隨。所有這些裝置均需要使用適合分配本發(fā)明化合物的制劑。通常，每種制劑對于所用裝置類型是專一的，除用于治療的稀釋劑、輔助劑和/或載體外可以使用合適的推進劑材料。本發(fā)明化合物最優(yōu)選以顆粒形式制備，為了最有效輸送至肺的遠端，平均粒徑小于10nm(或微米)，最優(yōu)選為0.5-5拜。藥學上可接受的載體包括糖類，例如海藻糖、甘露糖醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。用于制劑中的其它組分可以包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC?？梢允褂锰烊换蚝铣傻谋砻婊钚詣??？梢允褂肞EG(甚至不考慮其用于對該蛋白或類似物進行衍生化)?？梢允褂闷暇厶?，例如環(huán)葡聚糖?？梢允褂媚懼}和其它相關(guān)的增強劑。可以使用纖維素和纖維素衍生物?？梢允褂冒被?，例如用于緩沖劑制劑中。此外，還可以使用脂質(zhì)體、微膠囊或微球體、包含復合物，或其它類型的載體。適于與噴射型或者超聲波型噴霧器一起使用的制劑通常包含溶于水中的本發(fā)明化合物，其濃度約為約0.1-25mg生物活性蛋白/ml溶液。該制劑也可以包括緩沖劑和簡單的糖(例如用于穩(wěn)定蛋白和調(diào)節(jié)滲透壓)。噴霧器制劑也可以含有表面活性劑，以減小或防止由表面誘導的蛋白的聚集，該聚集是在形成氣霧劑時溶液的霧化所導致的。與計量劑量吸入器裝置一起使用的制劑一般將包含細碎的粉末，其含有在表面活性劑幫助下懸浮于推進劑的本發(fā)明化合物。所述推進劑可以是任何用于該目的常規(guī)材料，例如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴、或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲垸、二氯四氟乙醇，和1,1,1,2-四氟乙烷，或它們的組合。合適的表面活性劑包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性劑。用于從粉末吸入裝置中分配的制劑將包括含本發(fā)明化合物的細碎的干粉，還可以包括填充劑，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或木糖醇，其用量有利于所述粉末從該裝置中分散，如占該制劑重量的50-90%。其它傳遞形式還設想了本發(fā)明化合物的鼻腔傳遞。鼻腔傳遞可以使在將所述治療制品施用到鼻腔之后，使所述蛋白直接傳遞到血液中，而不需要使所述制品沉積在肺中。用于鼻腔傳遞的制劑包括含有葡聚糖或環(huán)葡聚糖的制劑。通過跨越其它粘膜轉(zhuǎn)運的傳遞也是可行的。還設想了本發(fā)明化合物的口腔傳遞。同肽一起使用的口腔傳遞制劑是本領(lǐng)域所熟知的。劑量治療上述病癥的方法中所涉及給藥方案將由主治醫(yī)師確定，考慮改變藥物作用的各種因素，例如患者的年齡、病癥、體重、性別和飲食、任何感染的嚴重程度、給藥時間和其它臨床因素。一般而言，每日方案的范圍應該為0.1-1000微克本發(fā)明化合物/kg體重，最好為0.1-150微克/kg。具體的優(yōu)選實施方案本發(fā)明人已經(jīng)確定了具有許多不同種類活性的分子的優(yōu)選肽序列。本發(fā)明人已經(jīng)進一步確定了與優(yōu)選接頭和載體結(jié)合的這些優(yōu)選肽的優(yōu)選結(jié)構(gòu)。這些優(yōu)選肽的優(yōu)選結(jié)構(gòu)列于下表ll中。接頭序列以黑體顯示?；钚噪男蛄幸院隗w和下劃線顯示。表11-優(yōu)選的實施方式<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>工作實施例如下所述制備上述化合物。這些實施例包括本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，這些實施例是說明性的而不是限制性的。實施例l制備Fc-環(huán)-ang2在本發(fā)明的該實施例中，將二硫鍵束縛的肽TN8-Con4插到人IgGlFc-環(huán)結(jié)構(gòu)域中，所述人IgGlFc-環(huán)結(jié)構(gòu)域由序列D137E138L139T14()K141限定(圖2A)。TN8-Con4QEE￡EWDPWT￡EHM(SEQIDNO:147)肽插入位于Fc殘基Leu^和Thr副之間，包括作為接頭的2個Gly殘基，這2個Gly殘基在插入的肽的兩個側(cè)翼(圖IOA)。將所述Fc-環(huán)TN8-Con4構(gòu)建體標記為Amgen克隆#6888。羧基端TN8-Con4融合肽體(圖IOB)包括5個Gly接頭，標記為Amgen克隆弁5564。用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法將這兩個克隆#6888和#5564都轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)。發(fā)現(xiàn)這兩個克隆都以高水平表達，而且?guī)缀跞吭诓豢扇艿陌w部分內(nèi)(圖11)。在室溫下，將分離的包涵體部分(lg)溶解在6M胍-HC1，50mMTris，8mMDTT，pH9(10ml)中，攪拌混合1小時。通過以1:25(v/v)稀釋于2M脲，50mMTris，4mM半胱氨酸，lmM胱胺，pH8.5中，從溶解的包涵體組分中將變性和還原的肽體重折疊。于4"C下，將溶解的肽體滴加到重折疊緩沖液中，不斷攪拌。攪拌48小時來進行重折疊反應，然后用SDS-PAGE和反相HPLC測定等分試樣。很明顯在重折疊反應中，所述Fc-環(huán)TN8-Con4(#6888)比羧基端FcTN8-Con4肽體(#5564)具有更好的均一性，如RP-HPLC所示(圖12)。利用2-柱法來實現(xiàn)對重折疊的Fc-環(huán)TN8-Con4和羧基端FcTN8-Con4進行純化。首先將重組的Protein-A柱用2M脲，50mMTris，pH8.5平衡，并將過濾的肽體重折疊產(chǎn)物上樣。然后，將該柱用2倍柱體積的平衡緩沖液洗滌，接著用2倍柱體積的PBS洗滌。所述肽體組分用50mMNaOAc，pH3洗脫，以1:4稀釋于10mMNaOAc，50mMNaCl，pH5中進行快速中和。將稀釋的Protein-A洗出液再次過濾，并上樣到SP瓊脂糖HP陽離子交換柱(Pharmacia)上，該陽離子交換柱用10mMNaOAc，50mMNaCl，pH5平衡。然后，將所述肽體組分用線性50-500mMNaCl梯度洗脫，收集濃縮至約2mg/ml。Fc-環(huán)TN8-Con4(^6888)和羧基端FcTN8-Con4(弁5564)的最終收集物用RP-HPLC(圖13)和SDS-PAGE(圖14)來進行評價。RP-HPLC和SDS-PAGE顯示相對對比的羧基端融合肽體(#5564)來說，F(xiàn)c-環(huán)TN8-Con4(A6888)的產(chǎn)物均一性都獲得了提高。進一步在體外ELISA中對Fc-環(huán)TN8-Con4和羧基端融合的TN8-Con4肽體對血管生成素2受體的競爭性抑制進行評價。在該形式中，所述肽體與血管生成素2受體-Fc融合體競爭結(jié)合固定的血管生成素2。利用酶聯(lián)免疫檢測法通過熒光對血管生成素2受體-Fc融合體的結(jié)合進行監(jiān)測，并以50。/。抑制率下的抑制常數(shù)(IC50)來進行報告。該實驗顯示相比羧基端FcTN8-Con4，F(xiàn)c-環(huán)TN8-Con4是完全活躍的(圖15)。在小鼠中，對Fc-環(huán)TN8-Con4肽體與羧基端TN8-Con4肽體的體內(nèi)穩(wěn)定性進行比較。在該研究中，將兩種肽體以5mg/kg對15只小鼠群體皮下給藥。在注射后4小時時，殺死5只小鼠，采集血清。24小時時，殺死另外5只小鼠采集血清，48小時時也一樣。用western印跡分析各個血清樣品中的可測人IgG-Fc肽體。由于每組5只小鼠內(nèi)的所有血清都非常相似，所以將這些組收集形成代表樣品，以便在單個凝膠/印跡上進行電泳。分析結(jié)果(圖16)清楚地顯示Fc-環(huán)TN8-Con4肽體和羧基端TN8-Con4肽體在整個48小時過程中都存留在收集的小鼠血清內(nèi)，沒有明顯減少。該結(jié)果說明由于插入肽并沒有使得Fc-環(huán)設計肽在體內(nèi)變得不穩(wěn)定。實施例2制備Fc畫環(huán)-myo7在本發(fā)明的另一個實施方案中，將一種新的，二硫鍵束縛的肽TN8-19-7(美國專利申請2004-0181033-Al，其引入以供參考)，序列TN819-07LADHGQ￡IRWPWM￡P(guān)PEGWE(SEQIDNO:365)設計在IgGlFc序列的假定Fc-環(huán)序列DELTK的Leul39和Thrl40之間作為內(nèi)部融合體(Fig2A)。還將另外的兩個Gly殘基加到TN8-19-07肽的兩端作為翼側(cè)接頭。最終的Fc-環(huán)TN8-19-07序列在圖3A中給出，標記為克隆#6951。另外，制備TN8-19-07與相同IgGlFc序列的羧基端融合體作為對照(圖3B)，標記為克隆#6826。羧基端融合體在Fc和TN8-19-07之間包括5個Gly殘基，作為接頭。用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法將克隆#6951和#6826都轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這兩個克隆都以高水平表達，而且?guī)缀跞吭诓豢扇艿陌w部分內(nèi)(圖4A和4B)。在室溫下，將分離的包涵體部分(lg)溶解在6M胍-HC1，50mMTris，8mMDTT，pH9(10ml)中，攪拌混合1小時。通過以1:25(v/v)稀釋于2M脲，50mMTris，4mM半胱氨酸，lmM胱胺，pH8.5中，從溶解的包涵體組分中將變性和還原的肽體重折疊。于4。C下，將溶解的肽體滴加到重折疊緩沖液中，不斷攪拌。攪拌48小時來進行重折疊反應，然后用SDS-PAGE和反相HPLC測定等分試樣。明顯發(fā)現(xiàn)在重折疊反應中采用RP-HPLC(圖5)，所述Fc-環(huán)TN8-19-07(弁6951)比羧基端FcTN8-19-07肽體(#6826)具有更好的均一性。利用2-柱法來實現(xiàn)純化。首先將重組的Protein-A柱用2M脲，50mMTris，pH8.5平衡，并將過濾的肽體重折疊產(chǎn)物上樣。然后，將該柱用2倍柱體積的平衡緩沖液洗滌，接著用2倍柱體積的PBS洗滌。所述肽體組分用50mMNaOAc，pH3洗脫，以1:4稀釋于10mMNaOAc，50mMNaCl，pH5中進行快速中和。將稀釋的Protein-A洗出液再次過濾，并上樣到SP瓊脂糖HP陽離子交換柱(Pharmacia)上，該陽離子交換柱用10mMNaOAc，50mMNaCl，pH5平衡。然后，將所述肽體組分用線性50-500mMNaCl梯度洗脫，收集濃縮至約2mg/ml。Fc-環(huán)TN8-19-07(弁6951)和羧基端Fc頂8-19-07(#6826)的最終收集物用RP-HPLC(圖6)和SDS-PAGE(圖7)來進行評價。RP-HPLC和SDS-PAGE顯示相對對比的羧基端融合肽體(#6826)來說，F(xiàn)c-環(huán)TN8-19-07(賴951)的終產(chǎn)物均一性都獲得了提高。利用基于體外細胞的試驗，該試驗測定對肌肉生長抑制素信號傳導活性的抑制，來確定Fc-環(huán)頂8-19-07(#6951)相比羧基端融合體(#6826)的生物活性。在該試驗中，兩個構(gòu)建體都用4nM肌肉生長抑制素進行滴定，按照熒光素酶報告系統(tǒng)所測定的來對這兩個構(gòu)建體抑制肌肉生長抑制素信號傳導活性的能力進行評價。相對的肽體活性以50%抑制率的有效濃度來進行報告(EC50)。該試驗顯示Fc-環(huán)TN8-19-07肽體(#6951)保持著完整的體外生物活性(圖8)。在小鼠中，對Fc-環(huán)TN8-19-07肽體與羧基端TN8-19-07肽體的體內(nèi)穩(wěn)定性進行比較。在該研究中，將兩種肽體構(gòu)建物以5mg/kg對15只小鼠群體皮下給藥。在注射后4小時時，殺死5只小鼠，采集血清。24小時時，殺死另外5只小鼠采集血清，48小時時也一樣。用western印跡分析各個血清樣品中的可測人IgG-Fc肽體。由于每組5只小鼠內(nèi)的所有血清都非常相似，所以將這些組收集形成代表樣品，以便在單個凝膠/印跡上一起進行電泳。分析結(jié)果(圖9)清楚地顯示Fc-環(huán)TN8-19-07肽體在整個48小時過程中都存留在收集的小鼠血清內(nèi)，沒有明顯減少。相反，在該過程中羧基端TN8-19-07肽體的濃度平穩(wěn)下降，直到在48小時時間點時幾乎檢測不到。該結(jié)果說明Fc-環(huán)設計方案可能賦予了TN8-19-07肽體額外的體內(nèi)穩(wěn)定性。實施例3制備TN8-Con4該分子如實施例1和美國專利申請No.2003/0236192(PCT/US04/10989)所述來制備，所述專利引入本文以供參考。實施例4制備Fc-ang2-串聯(lián)該分子如2003年12月25日公開的U.S.2003/0236193(2004年4月8日申請的PCT/US04/10989)所述來制備，所述專利引入本文以供參考。實施例5制備TN8-19-7該分子如實施例2和2003年12月19日申請的美國系列No.10/742,379(2003年12月19日申請的PCT/US03/40781)所述來制備，所述專利引入本文以供參考。實施例6制備Fc-環(huán)-EMP該分子如前面實施例1所述來制備。實施例7制備Fc-環(huán)-Amp2在本發(fā)明的另一個實施方案中，將線性的非束縛肽，AMP2插入到人Fc—環(huán)結(jié)構(gòu)域中，稱為D137E138L139T14()K141(^2A)。AMP-2:IEGPTLRQWLAARA(SEQIDNO:28)Fc插入是位于Leuw和Thn4o之間，包括2個Giy殘基作為接頭，這2個Gly殘基在插入的肽的兩個側(cè)翼(圖3D)。將該Fc-環(huán)AMP2構(gòu)建體標記為Amgen克隆#6875。用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法將Fc-環(huán)AMP2克隆(#6875)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這個克隆以高水平表達，而且?guī)缀跞吭诓豢扇艿陌w部分內(nèi)(圖17)。在室溫下，將分離的包涵體部分(lg)溶解在6M胍-HCl，50mMTris，8mMDTT，pH9(10ml)中，攪拌混合1小時。通過以l:25(v/v)稀釋于2M脲，50mMTris，4mM半胱氨酸，lmM胱胺，pH8.5中，從溶解的包涵體組分中將變性和還原的肽體重折疊。于4'C下，將溶解的肽體滴加到重折疊緩沖液中，不斷攪拌。攪拌48小時來進行重折疊反應，然后用SDS-PAGE和反相HPLC測定等分試樣。利用2-柱法來實現(xiàn)純化。首先將重組的Protein-A柱用2M脲，50mMTris，pH8.5平衡，并將過濾的肽體重折疊反應物上樣。然后，將該柱用2倍柱體積的平衡緩沖液洗滌，接著用2倍柱體積的PBS洗滌。所述肽體組分用50mMNaOAc，pH3洗脫，以1:4稀釋于10mMNaOAc，50mMNaCl，pH5中進行快速中和。將稀釋的Protein-A洗脫物再次過濾，并上樣到SP瓊脂糖HP陽離子交換柱(Pharmacia)上，該陽離子交換柱用10mMNaOAc，50mMNaCl，pH5平衡。然后，將所述肽體組分用線性50-500mMNaCl梯度洗脫，收集濃縮至約2mg/ml。Fc-環(huán)AMP2(賴875)的最終收集物用SDS-PAGE(圖19)和RP-HPLC(圖20)來進行評價。在體內(nèi)小鼠生物分析中，對最終制備的Fc-環(huán)AMP2進行測定，對比于兩個AMP2序列串聯(lián)連接的羧基端肽體融合體(Fc串聯(lián)AMP2)。在該比較中，所述Fc-串聯(lián)-AMP2含有完整效價的4個AMP2肽，相比Fc-環(huán)AMP2只有兩個肽。小鼠進行各肽體5ug/kg的單獨皮下注射，過15天后監(jiān)測其血小板水平(圖21)。Fc-串聯(lián)-AMP2的誘導導致開始的血小板明顯增加，全部反應在第9天完成。相反，所述Fc-環(huán)AMP2引起的反應更小，峰值在第8天，并持續(xù)了15天。該結(jié)果說明Fc-環(huán)AMP2肽體的有效半衰期可能比常規(guī)的羧基端融合肽體更長。反應全部振幅的差異可能是由Fc-串聯(lián)-Amp2效價更高引起的。實施例8制備Amp2該分子如上述實施例7和美國專利No.6,660,843所述來制備。實施例9肌肉生長抑制素-信號活性的體外細胞分析和測定(圖8)為了對肌肉生長抑制素活性和其阻斷進行定量，開發(fā)了稱為pMARE-Luc的熒光素酶報告系統(tǒng)，其感應肌肉生長抑制素/苯丙酸諾龍信號強度。通過將Smad-應答的CAGA串聯(lián)重復序列亞克隆至基本的報告質(zhì)粒pLuc-MCS中構(gòu)建成pMARE-luc載體，所述報告質(zhì)粒含有最小的啟動子元件(TATA盒)。將所述pMARE-luc載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至骨骼肌衍生的C2C12細胞系(鼠)中。所述穩(wěn)定克隆的肌肉生長抑制素反應特性可以鑒定基于C2C12克隆的報告細胞系，在96孔板中，以高敏感度和可繁殖方式，該細胞系能對肌肉生長抑制素和苯丙酸諾龍信號活性進行檢測。實施例10體外HTRF(均相時間分辨熒光)A股-2結(jié)合分析(圖15)在整個96孔板上，從濃度100nM開始，將Fc-環(huán)肽體和適合的對照連續(xù)稀釋于HTRF緩沖液中3倍，9次。然后，在96孔黑色原底分析平板上，將下述試劑與稀釋液混合抗生物素蛋白鏈菌素-銪(1.6nM)，生物素化人血管生成素-2(8.0nM)，人Tie2-Fc-APC(10nM)。然后，在室溫下孵育分析平板，晃動2小時。接著，在Rubystarmicroplatereader上讀取平板(BMGLabtechnologiesInc.)。將結(jié)果轉(zhuǎn)化為％抑制率，然后利用程序GRAFIT5.0(IC50，0-100%參數(shù))分析％抑制率數(shù)值來計算IC50。實施例11體內(nèi)AMP-2效力分析(圖21)雌性BDF1小鼠用載液(含0.1%BSA的1xPBS)，50mcg/kgFc-串聯(lián)-AMP2,或50mcg/kgFc-環(huán)-AMP2分別皮下注射。通過逆向眼眶穿刺從每只小鼠上采集血液至用肝素處理的毛細管，然后轉(zhuǎn)移至含EDTA的微量采血管內(nèi)。包括不同白血細胞計數(shù)的全血計數(shù)(CBC)利用針對小鼠血液校準的ADVIA120血液分析儀來獲得(BayerCorp.,Tarrytown,NY)。標準的采血日期是0，3，5，7和10天。將血小板數(shù)量與注射后時間繪制函數(shù)。實施例12測定EMP活性的UT-7EPO增殖分析(圖18)UT-7Epo增殖分析利用人巨核細胞白血病細胞系，該細胞系應答鼠EPO(mEPO)和人EPO(huEPO)或其它用于生長和存活的EPO樣分子。在整個96孔板上，在100W10%FBS-IscovesModifiedDulbelcco's培養(yǎng)基(IMDM)中將生長因子以3倍連續(xù)從1000ng/ml稀釋到0.488ng/ml。將15000細胞/孔加至96孔板100W10Q/。FBSIMDM中。每孔的總體積是每孔20014培養(yǎng)基含15000個細胞。細胞和培養(yǎng)基單獨作為零對照。于37"C，潮濕腔室內(nèi)孵育細胞。在同待測生長因子共同孵育72小時后，利用MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)211-四唑，內(nèi)鹽)摻入(5+/-1小時，37'C)來進行檢測，生長用OXM:490nm吸光度)來測定，限制不大于4.0O.D。參考文獻YasusadaMiura,KeitaKirito，禾口NorioKomatsu(1998),"RegulationofBothErythroidandMegakaryocyticDifferentiationofaHumanLeukemiaCellLine,UT-7,"ActaHaematologica,99:180-184。實施例13其它的Fc-環(huán)插入位點已利用多種不同肽證明了含有L139/T140插入位點的Fc-環(huán)插入型肽體的可行性，在Fc晶體結(jié)構(gòu)中對其它環(huán)進行了考察。利用Fc-結(jié)構(gòu)域同源性模型，在溶劑可接近表面暴露，環(huán)內(nèi)空間束縛，接近Fc二聚體接觸面和與已知效應子功能位點毗鄰的基礎(chǔ)上選出了12種不同的潛在插入位點。對鑒定作潛在插入位點的Fc環(huán)位點進行了描述和歸類。參見圖2A和下表12。表12人IgGlFc序列的特異'性插入位點結(jié)合域環(huán)插入注釋CH2P25-P26不優(yōu)選緊密轉(zhuǎn)角CH2D46"E53H49/E50-IstE50/D51-2nd無同源H/E位點CH2V65-A68不優(yōu)選FcRn相互作用CH2E74-丁80Y77/N78-1stN78/S79-2nd低同源Y/N位點CH2不優(yōu)選FcRn相互作用CH2-CH3接頭Ni06"Pl27K107/A108-i:tNO6/K107—2暴露的轉(zhuǎn)角CH3Di37《141L139/T140—1st成功試驗的L139/T140CH3N165-N177E169/N170—I"N170/N171-2nd消除緊密轉(zhuǎn)角N165-P168，無同源E/N位點CH3Tl75-Sl84Vi7s/Li79—2無同源V/L位點，S/D位點可能有更好的暴露性CH3K195畫V203G20i/N202--1"N202/V203_-2nda/p成分，暴露的G/N位點，低同源性N/V位點CH3NAQl67/P168IgA,IgM插入位點CH3NAIgA，IgM插入位點這些潛在的插入位點中，六個位點利用TN8-19-7肽插入(實施例2)來表達，并且評定了其重折疊效力和體外活性。加上另一個構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有合成到前述的原始環(huán)插入位點(L139/T140)內(nèi)一個不對稱接頭系統(tǒng)Gly4/Gly6?？偣?，有7種新型Fc環(huán)肌肉生長抑制素構(gòu)建體重折疊，純化，并測定了活性。上述檢測的7種新Fc-環(huán)TN8-19-7構(gòu)建體包括在人IgGlFc的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域均有插入。具體地說，這些插入是G201/N202(CH3)，E16痛170(CH3)，S18薩82(CH3)，H49/E50(CH2)，L139/T140(G4-6)(CH3)，Y77/N78(CH2)，和K107/A108(CH2-CH3接頭結(jié)構(gòu)域)。利用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些構(gòu)建體幾乎全在不可溶的包涵體部分內(nèi)表達。有意思地是，H49/E50,L139/T140(G4-6)和Y77/N78構(gòu)建體的表達水平最高。E169/N170，S181/D182,K107/108表達適中，G201/202構(gòu)建體僅有一些表達且非常少。這些Fc-環(huán)TN8-19-7構(gòu)建體，其在大腸桿菌中良好表達，通過首先在室溫下，在6M胍-HC1，50mMTris，8mMDTTpH9.0(10mL/lg包涵體)中將分離的包涵體溶解，攪拌1小時來進行純化。然后，對適合每種變性和還原的Fc-環(huán)TN8-19-7構(gòu)建體的各種重折疊條件進行評價，以便確定最佳的重折疊條件。三個G201/N202，E169/N170，和S181/D182構(gòu)建體在任何檢測條件下的重折疊都不好。剩下的4個Fc-環(huán)TN8-19-7構(gòu)建體，L139/T140(G4-6)的重折疊最好，而其它3個H49/E50，Y77/N78和K107/A108的重折疊產(chǎn)量均足夠進行下一步的純化。利用最佳的重折疊條件，將變性和還原的Fc-環(huán)TN8-19-7構(gòu)建體以l:25(v/v)稀釋于4M脲，50mMTris-HCl，0.16MArg-HCl，20°/。甘油，3M胱氨酸，5mM胱胺，pH8.5中從可溶的包涵體組分中重折疊。于4"C下，將溶解的肽體滴加到重折疊緩沖液中，不斷攪拌。攪拌48小時來進行重折疊反應，接著通過層析進行純化。利用2-柱層析法獲得最終的純化物，如實施例2所述。利用RP-HPLC和SDS-PAGE測定L139/T140(G4-6)，H49/E50，Y77/N78，和K107/108的終收集物，如圖23和24所示。從這4種構(gòu)建體獲得的產(chǎn)量列于表13中。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>在4種純化的類似物中，L139/T140(G4-6)插入位點類似物獲得的純化度最好，產(chǎn)量最高。利用體外細胞抑制試驗，進一步對純化的Fc-環(huán)插入位點類似物的功能性肌肉生長抑制素受體結(jié)合活性進行分析，如實施例9所述。結(jié)果示于表14中。表14基于體外細胞的肌肉生長抑制素分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>利用Biocore試驗體系，進一步對純化的Fc-環(huán)插入位點類似物的FcRn結(jié)合性進行分析。因為分析后殘留的樣品不足，所以沒有測定樣品K107/A108。利用基于體外細胞的肌肉生長抑制素抑制試驗測定的IC5o值與L139/T140(G4-6)插入體和原始的Fc-環(huán)弁6951相似，而在H49/E50和Y77/N78的Fc-環(huán)插入體的抑制肌肉生長抑制素的能力就降低(圖30)。BiocoreFcRn結(jié)合試驗顯示結(jié)合Fc受體的H49/E50和Y77/N78，相比對照(Fc-環(huán)-lxTN8-19-7，弁6951)的EC50為約680nM，而L139/T140(G4-6)的EC5o就較低且更好為約220nM?？傊?，在評價的6個新插入位點中，3個不能有效地重折疊。在回收的3個新插入位點類似物中，K107/A108的折疊不好，H49/E50(CH2結(jié)構(gòu)域)的重折疊還可以，剩下的2個具有延長的不對稱接頭的位點在Y77/N78(CH2結(jié)構(gòu)域)和原始插入位點在L139/T140(CH3結(jié)構(gòu)域)的折疊效力最高。有意思地是，所有這些新插入位點類似物的重折疊產(chǎn)量都明顯低于原始Fc-環(huán)構(gòu)建體(站951)，該構(gòu)建體在L139/T140位置使用對稱Gly2接頭含有TN8-19-7。當對FcRn結(jié)合能力的保持進行檢測時，所有的Fc-環(huán)分子顯示與可能的除延長的非對稱接頭構(gòu)建體之外都具有相似的親和力，該構(gòu)建體的結(jié)合能力保持好像稍強些。這與設計示例一致，以便將插入的肽和FcRn結(jié)合界面間的空間相互作用最小化。雖然利用基于體外細胞的功能試驗(表14)，所有純化的Fc-環(huán)構(gòu)建體都是有活性的，原始插入位點(L139/T140)和在相同位點插入延長的非對稱接頭好像最有利。該工作說明在人IgGlFc內(nèi)的多個環(huán)結(jié)構(gòu)域，如圖23所確定的，可以允許插入生物活性的肽，并且保持肽和Fc效應子功能如Fc結(jié)合的活性。利用這些Fc-環(huán)結(jié)構(gòu)域的肽插入類似物可能在重折疊效力和肽活性方面顯著地不同?？梢愿鞣N肽/插入組合單獨優(yōu)化以將回收和效力最大化。更優(yōu)選的是靶定圖23中下劃線所示的亞結(jié)構(gòu)域的肽插入。最優(yōu)選是插入位點(L139/T140)和在CH2結(jié)構(gòu)域(H49/E50和Y77/N78)中的兩個額外環(huán)?？s寫在整個本說明書中使用的縮寫定義如下，除非在具體情況下另有說明。Ac乙酰(用來指乙?；瘹埢?AcBpa乙?；膶Ρ郊柞?L-苯丙氨酸ACN乙腈ADCC依賴于抗體的細胞的細胞毒性Aib氨基異丁酸bAP-丙氨酸Bpa對苯甲酰-L-苯丙氨酸BrAc溴乙酰(BrCH2C(0)BSA牛血清白蛋白Bzl芐基Cap己酸CTL細胞毒性T淋巴細胞CTLA4細胞毒性T淋巴細胞抗原4DARCDuffy血型抗原受體DCC二環(huán)己基碳二亞胺Ddel-(4,4-二甲基-2，6-二氧代-亞環(huán)己基)乙基EDTA乙二胺四乙酸EMP促紅細胞生成素-模擬肽ESI-MS電噴霧電離質(zhì)譜EPO促紅細胞生成素Fmoc芴基甲氧羰基G-CSF粒細胞集落刺激因子GH生長激素HCT血細胞比容HGB血紅蛋白hGH人生長激素HOBt1-羥基苯并三唑HPLC高效液相色譜IL白介素IL-R白介素受體IL-1R白介素-1受體IL國lra白介素-1受體拮抗劑Eau月桂酸LPS脂多糖LYMPH淋巴細胞MALDI-MS基質(zhì)輔助的激光解吸電離質(zhì)譜Me甲基MeO甲氧基MES(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)MHC主要組織相容性復合體MMP基質(zhì)金屬蛋白酶MMPI基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑NaOAc乙酸鈉l曙Nap1-萘基丙氨酸(l-napthylalanine)NEUT嗜中性粒細胞NGF神經(jīng)生長因子Nle正亮氨酸NMPN-甲基-2-吡咯烷酮PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳PBS磷酸緩沖鹽溶液Pbf2,2,4,6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰PCR聚合酶鏈式反應Pec2-哌啶酸PEG聚乙二醇pGlu焦谷氨酸Pic吡啶甲酸PLT血小板pY磷酸酪氨酸PTFE聚四氟乙烯RBC紅細胞RBS核糖體結(jié)合位點RT室溫(25。C)Sar肌氨酸SDS十二烷基硫酸鈉STK絲氨酸-蘇氨酸激酶t-Boc叔丁氧羰基tBn叔丁基TGF組織生長因子THF胸腺體液因子TK酪氨酸激酶TMP血小板生成素-模擬肽TNF組織壞死因子TPO血小板生成素TRAIL誘導TNF-相關(guān)的細胞凋亡的配體Trt三苯甲基UK尿激酶UKR尿激酶受體VEGF血管內(nèi)皮細胞生長因子VIP血管活性腸肽WBC白細胞權(quán)利要求1、一種下式的組合物(X1)a-F1-(X2)b和其多聚體，其中F1是被修飾的Fc結(jié)構(gòu)域，以使其在環(huán)區(qū)包括至少一個X3；X1和X2分別獨立地選自-(L1)c-P1、-(L1)c-P1-(L2)d-P2、-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3，和-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4；X3獨立地選自-(L5)c-P5、-(L5)c-P5-(L6)d-P6，-(L5)c-P5-(L6)d-P6-(L7)e-P7，和-(L5)c-P5-(L6)d-P6-(L7)e-P7-(L8)f-P8；P1、P2、P3和P4分別獨立地為藥理學活性多肽或藥理學活性肽的序列；P5、P6、P7和P8分別獨立地為藥理學活性肽的序列；L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8分別獨立地為接頭；且a、b、c、d、e和f分別獨立地為0或1。2、權(quán)利要求1所述的組合物，其中a和b都是0。3、權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域含有IgGFc結(jié)構(gòu)域。4、權(quán)利要求3戶做的組合物，其中戶;MFc結(jié)構(gòu)域含有選自SEQIDNO:599和603至607的序列。5、權(quán)利要求l所述的組合物，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域含有IgGlFc結(jié)構(gòu)域。6、權(quán)利要求5臓的組合物，其中臓IgGlFc結(jié)構(gòu)域含有SEQIDNO:599且X3插入或者取代選自SEQIDNO:621，622，624，625，627，628，630，632，634，和636中的一禾中序列的全部或部分序列。7、權(quán)利要求6所述的組合物，其中X3插入或者取代選自SEQIDNO:623，626，629,631,633，635和637中的一種序列的全部或部分序列。8、權(quán)利要求7所述的組合物，其中X3插入在Leu!39/Thr,40。9、權(quán)利要求5戶腿的組合物，其中戶脫IgGlFc結(jié)構(gòu)域含有SEQIDNO:603且X3插入或者取代選自SEQIDNO:621，622，624，625，627，628，630，632，634，和636中的一種序列的全部或部分序列。10、權(quán)利要求9所述的組合物，其中X3插入在H53/E54，Y81/N82，Nii(/Km，Lw/TwQl7l/P172，E173/Nn4，Si86/D187，G188/Si89，或G205/N206°11、權(quán)利要求5戶;M的組合物，其中戶艦IgGlFc結(jié)構(gòu)域含有SEQIDNO:604且X3插入或者取代選自SEQIDNO:621,622，624，625，627，628，632，634，636，和644中的一種序列的全部或部分序列。12、權(quán)利要求ll所述的組合物，其中X3插入在H53/E54，Y81/N82，N"(/Km，L143/T144，Qni/P172，Ei73/N174,S186/D187，G咖/Sig9，或G205/N206013、權(quán)利要求1所述的組合物，其中0MFc結(jié)構(gòu)域含有IgG3Fc結(jié)構(gòu)域。14、權(quán)利要求13戶脫的組合物，其中所述IgG3Fc結(jié)構(gòu)域含有SEQIDNO:605且X3插入或者取代選自SEQIDNO:614，621，622，624，627，639，641，644，645，和646中的一種序列的全部或部分序列。15、權(quán)利要求14所述的組合物，其中x3插入在Hkx)/Ekh，F(xiàn)128/N129，Ni57/K158，M190/T191，Q2i8/P219，E22(/N221，S232/D233，G234/S235，或G252/N253。16、權(quán)利要求1戶皿的組^tl，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域含有IgG2Fc結(jié)構(gòu)域。17、權(quán)利要求16戶脫的組合物，其中戶;MFc結(jié)構(gòu)域含有SEQIDNO:606且X3插入或者取代選自SEQIDNO:621，622，624，632，636，639，640，642，644，和646中的一種序列的全部或部分序列。18、權(quán)利要求17所述的組合物，其中X3插入在H49/E50，F(xiàn)77/N78，Ni06/K107，M139/T140，Qi67/P168，Ei69/Nno，Sisi/D182，Gi83/S184，或G2oi/N202。19、權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域含有IgG4Fc結(jié)構(gòu)域。20、權(quán)利要求19lM的組^t/，其中戶，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域含有SEQIDNO:607且X3插入或者取代選自SEQIDNO:620，621，624，627，632，634，638，639，643，和644中的一種序列的全部或部分序列。21、權(quán)利要求20所述的組合物，其中x3插入在Q5o/E^，F(xiàn)78/N79，Nio7/KK)8，Mi4(/Ti4i，Qi68/P169，Ei7(/N171,Siss/D,G^/Sw或G202/N203。22、權(quán)利要求1戶腿的組合物，其中戶;MFc結(jié)構(gòu)域含有SEQIDNO:608且X3插入或者取代選自SEQIDNO:621，622，628，624，627，632，636，639，644，和646中的一種序列的全部或部分序列。23、權(quán)利要求22所述的組合物，其中x3插入在Hu2/En3，F(xiàn)14Q/N141，Ni69/K170，M204/T205，Q232/P233，E234/N235，S246/D247，G248/S249,或G268^N269。24、權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述X3含有血管緊張素-2(ang-2)結(jié)合肽序列。25、權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述ang-2結(jié)合肽序列選自SEQIDNO:100至189。26、權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述ang-2結(jié)合肽序列是SEQIDNO:147。27、權(quán)利要求26所述的組合物，其中^含有IgGlFc結(jié)構(gòu)域。28、權(quán)利要求27戶誠的組合物，其具有序列SEQIDNO:618。29、權(quán)利要求1戶，的組合物，其中X3含有肌肉生長抑制素結(jié)合肽序列。30、權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述肌肉生長抑制素結(jié)合肽序列選自SEQIDNO:218至509。31、權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述肌肉生長抑制素結(jié)合肽序列是SEQIDNO:365。32、權(quán)利要求31戶腿的組合物，其中F1含有IgGlFc結(jié)構(gòu)域。33、權(quán)利要求32戶腿的組合物，其具有序列SEQIDNO:612。34、權(quán)利要求l所述的組合物，其中f含有促紅細胞生成素-模擬(EPO-模擬)肽序列。35、權(quán)利要求34戶脫的組合物，其中戶腿EPO-模擬肽序列選自SEQIDNO:1至27。36、權(quán)利要求35所述的組合物，其中EPO-模擬肽序列是SEQIDNO:2。37、權(quán)利要求36所述的組^tl，其中^含有IgGlFc結(jié)構(gòu)域。38、權(quán)利要求37臓的組合物，其具有序列SEQ腿O:615。39、權(quán)利要求1戶M的組合物，其中X3含有血小板生成素-模擬(TPO-模擬)肽序列。40、權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述TPO-模擬肽序列選自SEQ4IDNO:28至99。41、權(quán)利要求40所述的組合物，其中TPO-模擬肽序列是SEQIDNO:28。42、權(quán)利要求41所述的組合物，其中F1含有IgGlFc結(jié)構(gòu)域。43、權(quán)利要求42戶;M的組合物，其具有序列SEQIDNO:616。44、權(quán)利要求l所述的組合物，其中f含有神經(jīng)生長因子(NGF)結(jié)合肽序列。45、權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述NGF結(jié)合肽序列選自SEQIDNO:190至218。46、權(quán)利要求1戶脫的組合物，其中X3含有B細胞活化因子(BAFF)結(jié)合肽序列。47、權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述BAFF結(jié)合肽序列選自SEQIDNO:510至594。48、一種DNA，其編碼權(quán)利要求l臓的組她49、含有權(quán)利要求46戶，DNA的^ii載體。50、含有權(quán)利要求47所述,載體的宿主細胞。51、權(quán)利要求48戶腿的細胞，其中戶腿細胞是大腸桿菌細胞。52、藥理學活性化合物的制備方法，其包括a.選擇調(diào)節(jié)目的蛋白活性的至少一種隨機化肽；和b.制備一種藥物，其包含所選擇的肽的氨基酸序列作為Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的、非末端序列。53、權(quán)利要求50所述的方法，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部區(qū)域是環(huán)區(qū)。54、權(quán)利要求5o戶腿的方法，其中戶;M肽是包括一種或多種選自下述技術(shù)的方法選出的基于酵母的篩選，合理設計，蛋白結(jié)構(gòu)分析，或噬菌體展示文庫、大腸桿菌展示文庫、核糖體文庫、或者化學肽文庫的篩選。55、權(quán)利要求50所述的方法，其中所述藥物的制備是通過下述步驟實現(xiàn)的a.制備含有編碼Fc結(jié)構(gòu)域的核酸序列的基因構(gòu)建體，其中所選擇的肽的氨基酸序列被插入到Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)，或置換了FC結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個或多個氨基酸；和b.表達該基因構(gòu)建體。56、權(quán)利要求53所述的方法，其中所述基因構(gòu)建,大腸桿菌細胞中鋭。57、權(quán)利要求50所述的方法，其中所述目的蛋白是細胞表面受體。58、權(quán)利要求50戶腿的方法，其中戶誠目的蛋白具有線性表位。59、權(quán)利要求50所述的方法，其中所述目的蛋白是細胞因子受體。60、權(quán)利要求50戶腿的方法，其中戶脫Fc結(jié)構(gòu)i^IgGFc結(jié)構(gòu)域。61、一種傲布的抗體，其含有傲布的Fc結(jié)構(gòu)域，以使雜環(huán)區(qū)中包括至少一個X3，其中X3獨立地選自-(L5)e-P5、-(L5)e-P5-(L6)d-P6，-(L5)c-P5-(L6)d-P6-(L7)e-P7,和-(L5)c-p5-(LVp6-(L7)e-p7匿(L8yp8;P5、P6、P和PS分別獨立地為藥理學活性肽的序列；L5、L6、17和LS分別獨立地為接頭；且c、d、e和f分別獨立地為O或l。62、一種制備j針布抗體的方法，其包括a)選擇調(diào)節(jié)目的蛋白活性的至少一種肽；和b)制備抗體，所述抗體在該抗體的Fc結(jié)構(gòu)域環(huán)區(qū)內(nèi)含有所選擇的肽的氨基酸序列，所述環(huán)區(qū)處于Fc結(jié)構(gòu)域的非末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)。全文摘要本發(fā)明涉及其中有一種或多種生物活性肽摻入到Fc結(jié)構(gòu)域中的分子和方法。在本發(fā)明中，藥理學活性化合物可以通過下述方法來制備，包括(a)選擇調(diào)節(jié)目的蛋白活性的至少一種肽；和(b)制備一種藥物，其在Fc結(jié)構(gòu)域環(huán)區(qū)內(nèi)包含選定肽的氨基酸序列。可以用該方法來對已經(jīng)通過N-末端或C-末端或側(cè)鏈與肽或多肽(例如依那西普(etanercept))連接的Fc結(jié)構(gòu)域進行修飾。該方法還可用于對抗體部分的Fc結(jié)構(gòu)域進行修飾(如adalimumab，epratuzumab，infiiximab，Herceptin^等)。在該方式中，可以將不同分子制成具有額外的功能性，比如結(jié)合不同表位的結(jié)構(gòu)域，或者結(jié)合前體分子現(xiàn)有表位的額外結(jié)構(gòu)域。所述肽可以是例如通過噬菌體展示，大腸桿菌展示，核糖體展示，RNA-肽篩選，基于酵母的篩選，化學的肽篩選，合理設計，或蛋白結(jié)構(gòu)分析來選定的。文檔編號C12N15/62GK101103045SQ200580038596公開日2008年1月9日申請日期2005年9月23日優(yōu)先權(quán)日2004年9月24日發(fā)明者卡倫·C.·希特內(nèi),飛熊,科林·蓋格申請人:安姆根有限公司