檢測梅毒螺旋體抗體的試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及體外診斷檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測梅毒螺旋體抗體的試劑 盒及其檢測方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 梅毒（Syphilis)是由蒼白（梅毒）螺旋體（Treponema pallidum)引起的慢性、 系統(tǒng)性性傳播疾病。亦稱蒼白螺旋體（Tr印onemia pallidum，TP)，1905年由法國科學(xué)家 Schaudinn與Hoffmanu發(fā)現(xiàn)并報告的。在分類學(xué)上屬螺旋體體目（Spirochaetales)，密螺 旋體科（Treponemataceae)，密螺旋體屬（Genus Treponema)。菌體細(xì)長，帶均勾排列的6~ 12個螺旋，長5~20 y m，平均長6~10 y m，橫徑0. 15 y m上下，運動較緩慢而有規(guī)律，實 驗室常用染料不易著色，可用暗視野顯微鏡或相差顯微鏡觀察菌體。主要通過性途徑傳播， 臨床上可表現(xiàn)為一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、潛伏梅毒和先天梅毒（胎傳梅毒）等。梅 毒是人類獨有的疾病，顯性和隱性梅毒患者是傳染源，感染梅毒的人的皮損及其分泌物、血 液中含有梅毒螺旋體。感染后的頭2年最具傳染性，而在4年后性傳播的傳染性大為下降。
[0003] 梅毒侵入人體后經(jīng)過2-3周潛伏期，即發(fā)生皮膚損害（典型損害為硬下疳）這是 一期梅毒。發(fā)生皮膚損害后機體產(chǎn)生抗體，從兔實驗性梅毒的研宄證明，梅毒初期的組織學(xué) 特征是單核細(xì)胞侵潤在感染的第6天，即有淋巴細(xì)胞浸潤，此時梅毒螺旋體見于硬下疳中 的上皮細(xì)胞間隙中，以及位于上皮細(xì)胞的內(nèi)陷或吞噬體內(nèi)，或成纖維細(xì)胞漿細(xì)胞、小的毛細(xì) 血管內(nèi)皮細(xì)胞之間及淋巴管和局部淋巴結(jié)中。由于免疫的作用使梅毒螺旋體迅速地從病 灶中消除，在感染的第24天后，免疫熒光檢測未發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體的存在螺旋體大部分被殺 死，進(jìn)入無癥狀的潛伏期此即一期潛伏梅毒?，F(xiàn)在應(yīng)用基因診斷能快速準(zhǔn)確的檢測出來。
[0004] 梅毒患者的皮膚、粘膜中含梅毒螺旋體，未患病者在與梅毒患者的性接觸中，皮膚 或粘膜若有細(xì)微破損則可得病，而性接觸是梅毒的主要傳播途徑，約占其95%以上。感染 TP的早期傳染性最強。如果是顯性梅毒，可發(fā)生性行為接觸的任何部位的硬下疳，如生殖 器、肛周、直腸、乳頭、舌、咽、手指等部位的硬下疳。隨著病期的延長傳染性越來越小，一般 認(rèn)為感染后2年以上性接觸就不再有傳染性。
[0005] 一期梅毒患者，如果沒有及時科普治療、或者沒有在正規(guī)醫(yī)院里治療，梅毒螺旋體 就會由淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)，并大量繁殖、播散，侵犯皮膚、粘膜、骨、內(nèi)臟、心血管及神經(jīng) 系統(tǒng)，進(jìn)而出現(xiàn)多種癥狀。在這個階段，通常可能先出現(xiàn)流行性感冒一樣的全身癥狀，隨后 會有全身淋巴結(jié)的腫大及皮膚粘膜的多種損害。皮膚損害有斑瘆、斑丘瘆、膿皰瘆；黏膜損 害有梅毒性咽炎、粘膜斑、梅毒性禿發(fā)等癥狀；部分患者會出現(xiàn)聲音撕啞，甚至完全無法發(fā) 音。90%的患者都會出現(xiàn)梅毒瘆，這是二期梅毒的基本特征。
[0006] 二期梅毒的主要表現(xiàn)可以概括為三個特點：類感冒癥狀、梅毒瘆和全身淋巴結(jié)腫 大?；济范警}時由于無明顯痛苦，常易被患者忽略。臨床上如見到分布廣泛、對稱，而自覺 癥狀輕微的皮瘆時，就要詳細(xì)詢問病史，以免漏診。二期梅毒瘆表面梅毒螺旋體很多，因此 傳染性也最強。
[0007] 梅毒螺旋體可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可引發(fā)脊髓癆、麻痹性癡呆、視神經(jīng)萎縮等；也 會侵害心血管系統(tǒng)，可導(dǎo)致主動脈炎、主動脈瓣閉鎖不全、主動脈瘤等；當(dāng)螺旋體侵害骨骼 系統(tǒng)，引起組織和器官破壞，功能喪失，導(dǎo)致殘疾或死亡。梅毒螺旋體還有很強的變異性，而 且變異后毒性增強，對身體器官的損傷程度加重，變異后病情發(fā)展迅速，加之傳統(tǒng)治療效果 差，致使梅毒對身體的致殘率和致死率增加。不及時治療將導(dǎo)致器官的功能喪失，甚至危及 生命。目前來說，"早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療"成為預(yù)防治療梅毒的關(guān)鍵，針對梅毒的快速有效 的檢測手段更加顯得重要。
[0008] 目前，梅毒的檢測通常采用血清學(xué)檢查，免疫血清學(xué)檢查具有方便、快捷和準(zhǔn)確等 優(yōu)點，已經(jīng)普遍應(yīng)用于醫(yī)療檢測和診斷領(lǐng)域。較常見的免疫血清學(xué)檢查方法有免疫熒光技 術(shù)（ABS)、放射免疫分析法（RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)、免疫膠金體技術(shù)（ICA)及化 學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA)等。
[0009] 其中，酶聯(lián)免疫法價格便宜，但靈敏度較低，是目前國內(nèi)應(yīng)用最多的方法，而且酶 免只可以作為定性判斷，且手工操作誤差較大，難以適應(yīng)市場發(fā)展的需求。膠體金法的優(yōu)點 是及時、快速，適宜于現(xiàn)場檢測，其特異性和靈敏度遠(yuǎn)差于酶聯(lián)免疫法。化學(xué)發(fā)光法可用于 定量測定，無論從方法學(xué)和自動化程度看，都要優(yōu)于酶聯(lián)免疫法。
[0010] 常規(guī)技術(shù)中，還有采用電化學(xué)發(fā)光法檢測梅毒的，電化學(xué)發(fā)光法是通過在電極表 面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。也有采用雙抗原夾心法進(jìn)行測定的，即一株重 組抗原包被固相，另一株重組抗原標(biāo)記發(fā)光物，通過測定發(fā)光信號，計算出樣本中梅毒抗體 (Treponema pallidum antibodies, TP)的含量。
[0011] 但是，常規(guī)技術(shù)中的TP檢測常存在靈敏度低、特異性差的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 基于此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種檢測梅毒螺旋體抗體 的試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用，采用該試劑盒及檢測方法，能夠提高檢測靈敏度。
[0013] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：
[0014] 一種檢測梅毒螺旋體抗體的試劑盒，包括以下組分：
[0015] 1)標(biāo)記物體系：包括直接連接或間接連接標(biāo)記示蹤物的梅毒螺旋體重組抗原1， 或包括直接連接或間接連接標(biāo)記示蹤物的金黃葡萄球菌A蛋白；
[0016] 2)橋連物體系：包括直接連接第一橋連物的梅毒螺旋體重組抗原2 ;
[0017] 3)磁性微球體系：包括直接連接第二橋連物的磁性微球；
[0018] 所述梅毒螺旋體重組抗原1和梅毒螺旋體重組抗原2與待測梅毒螺旋體抗體結(jié)合 的位點互不相同，所述第一橋連物可與第二橋連物結(jié)合。
[0019] 上述"直接連接"為直接結(jié)合的連接，上述"間接連接"為通過生物素和鏈霉親和 素，或異硫氰酸熒光素和抗異硫氰酸熒光素抗體等能夠相互結(jié)合的搭橋物以間接結(jié)合的方 式連接。上述第一橋連物與第二橋連物為常規(guī)可用的搭橋物質(zhì)對，如生物素和鏈霉親和素， 硫氰酸熒光素（FITC)和抗異硫氰酸熒光素抗體，標(biāo)簽蛋白和標(biāo)簽蛋白抗體等。其中，抗異 硫氰酸熒光素抗體既可以為單克隆抗體，也可以為多克隆抗體。
[0020] 本發(fā)明人通過大量研宄實驗考察后發(fā)現(xiàn)，常規(guī)技術(shù)的梅毒螺旋體抗體（TP)檢測 中，如使用磁性微球作為固相載體，是將梅毒螺旋體重組抗原包被于磁性微球中，加樣反應(yīng) 時使待測抗體直接與包被于磁性微球的重組抗原結(jié)合，而由于磁性微球相對體積較大，具 有較大的空間位阻，常常導(dǎo)致抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)并不充分，致使檢測靈敏度低。
[0021] 在上述研宄發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明對常規(guī)技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，測定時，先不將重組抗 原包被到磁性微球，而是通過一個小分子的第一橋連物標(biāo)記重組抗原，讓連接標(biāo)記示蹤物 的梅毒螺旋體重組抗原1，和連接第一橋連物的梅毒螺旋體重組抗原2先與待測抗體（TP) 反應(yīng)，形成雙抗原夾心結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，由于此時重組抗原上連接的標(biāo)記示蹤物和橋連物的 體積均小于磁性微球，空間位阻較小，能夠促進(jìn)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)充分進(jìn)行，使所有待測 抗體均與抗原形成雙抗原夾心復(fù)合物，在不清洗的前提下，加入磁性微球，依賴磁性微球上 包被的橋連物與上述形成的雙抗原夾心復(fù)合物結(jié)合，磁性微球起到作為固相載體固定待測 物和標(biāo)記示蹤物的作用，此時，外加磁場固定磁性微球，清洗掉沒有通過待測抗體形成雙抗 原夾心復(fù)合物的連接標(biāo)記示蹤物的重組抗原。最后通過發(fā)光底物與標(biāo)記示蹤物作用發(fā)出的 相對光強度，計算出待測抗體的含量。
[0022] 本發(fā)明的試劑盒，由于在形成雙抗原夾心復(fù)合物的過程中，與標(biāo)記重組抗原的都 是小分子物質(zhì)，其空間位阻遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于磁性微球的空間位阻，能夠促進(jìn)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng) 充分進(jìn)行，使所有待測抗體均與抗原形成雙抗原夾心復(fù)合物，從而提高了檢測靈敏度。
[0023] 在上述技術(shù)方案中，標(biāo)記物體系中，標(biāo)記示蹤物的工作濃度優(yōu)選5ng/ml-500ng/ ml，梅毒螺旋體重組抗原1的工作濃度優(yōu)選50ng/ml-5000ng/ml ;橋連物體系中，第一橋連 物（如生物素等）的工作濃度優(yōu)選5ng/ml-500ng/ml，梅毒螺旋體重組抗原2的工作濃度優(yōu) 選50ng/ml-5000ng/ml