吸附大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的免疫親和攪拌棒及其制備方法與應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種免疫親和攪拌棒及其制備方法與應 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活水平的日益提高，對各種動物源性食品的需求量 也逐漸增大，食品安全問題自然成為大家關(guān)注的焦點。近年來關(guān)于獸藥殘留引起的對人身 體健康造成危害的報道屢見不鮮，相關(guān)食品安全部門也致力于檢測方法的研宄。由于生物 樣品的成分復雜、藥物與樣品成分之間易互相結(jié)合和殘留藥物濃度低等均給樣品中藥物的 提取凈化帶來了很大的困難，因此分析方法的選擇性和靈敏度直接決定了檢測的成功與 否。
[0003] 免疫親和攪拌棒（Imunoaffinity stir bar)是免疫親和固相微萃取 (Immunoaffinity solid phase microextraction, Immunoaffinity SPME) 的一種 裝置形式，將固相微萃?。⊿olid phase microextraction, SPME)與免疫親和色譜 (IAC, immunoaff inity chromatography)相結(jié)合，既具有SPME易于操作、使用溶劑少和節(jié) 省時間的優(yōu)點，又有免疫親和色譜高度選擇性和高親和性的特點，使SPME在獸藥殘留分析 中，選擇性、親和性和靈敏度方面得到了很大的提升。Immunoaffinity stir bar常被用作 樣品的萃取，尤其適用于復雜基質(zhì)中痕量分析物的提取，與多種檢測手段結(jié)合使用進行分 析測定，具有廣闊的應用前景。
[0004] 泰樂菌素（Tylosin)，亦稱泰農(nóng)、泰樂霉素，是美國于1959年從弗氏鏈霉菌 (Streptomyces fradiae)的培養(yǎng)液中獲得的一種大環(huán)內(nèi)醋類抗生素。泰樂菌素為一種白 色板狀結(jié)晶，微溶于水，呈堿性。產(chǎn)品有酒石酸鹽、磷酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽及乳酸鹽，易溶于 水。替米考星（Tilmicosin)，是由泰樂菌素的一種水解產(chǎn)物半合成的畜禽專用抗生素，通常 用其磷酸鹽。
[0005] 泰樂菌素和替米考星均為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，在獸醫(yī)臨床上被廣泛用于治療畜禽 支原體、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌所引起的感染性疾病。由于其抗菌譜廣、吸收和排泄 速度快、均有良好的擴散能力和顯著的促生長作用，已倍受養(yǎng)殖戶的青睞。但是當養(yǎng)殖戶過 量或者不當使用這些抗生素時，會造成藥物在食品動物中殘留?？股丶捌浯x產(chǎn)物在動 物組織和器官內(nèi)蓄積到一定濃度，人食用后會對健康造成很大的影響?？蓪η巴ズ投伾?經(jīng)造成損傷，導致眩暈和聽力減退，甚至會嚴重損害肝、腎和造血系統(tǒng)。
[0006] 近幾十年來，各種食品安全監(jiān)測機構(gòu)、各類從事相關(guān)工作的研宄人員針對食品和 飼料中泰樂菌素和替米考星的殘留分析進行了深入全面的研宄。目前用于兩種藥物檢測的 主要技術(shù)有：酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA)、氣相色譜法（GC)、和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法 (GC/MS)及高效液相色譜（HPLC)等方法。ELISA法主要用于半定量快速篩選；GC和GC/MS 由于需衍生化，操作較為麻煩；HPLC分析較準確且過程相對較簡便，但檢測限比較高。 本由于樣品基質(zhì)成分復雜，在萃取過程中很容易將待測藥物與其他性質(zhì)相似的成分一起提 取出來，給檢測造成困難。因此，在檢測之前"凈化"工作是必不可少的，通常采用凈化方法 主要有液-液萃?。↙LE)和固相萃?。⊿PE)。LLE過程需要使用大量有機溶劑，而一些有機 溶劑性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，對環(huán)境造成污染，而且操作繁瑣。SPE操作簡單、省時，但特異性不 強是其主要的缺點。Immunoaffinity SPME技術(shù)首次于2001年被提出，用Immunoaffinity stir bar凈化大環(huán)內(nèi)醋類抗生素目前還尚未見報道，更無商品化的Immunoaffinity stir bar出售。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種吸附2種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的免疫親和攪拌棒及其制備 方法。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容： 一種吸附大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的免疫親和攪拌棒，其特征在于是由固相載體和與其偶聯(lián) 的泰樂菌素鼠單克隆抗體組成，其中固相載體與偶聯(lián)的泰樂菌素鼠單克隆抗體的偶聯(lián)長度 與重量比為1 cm :2 mg ;所述的單克隆抗體是由單克隆雜交瘤細胞株TYL-4E2注入小鼠腹 腔，純化小鼠腹水得到的；所述的固相載體為10 cmX4 mm玻璃棒，偶聯(lián)抗體的有效長度為 2. 5 cm〇
[0009] 單克隆雜交瘤細胞株TYL-4E2的解釋如下： TYL-4E2中TYL代表泰樂菌素，4代表細胞融合過程使用第4塊96孔板，E2中的字母 和數(shù)字分別代表96孔板的橫縱編號，96孔板中1-12為橫向編號，A-H為縱向編號。E2代 表融合后的雜交瘤細胞株在96孔板中的位置。
[0010] 本發(fā)明進一步公開了吸附大環(huán)內(nèi)酯類抗生素免疫親和攪拌棒的制備方法，其特征 在于按如下的步驟進行： (1)固相載體表面的處理：將玻璃棒下半部分浸入到雙氧水：濃硫酸（30:70, v/v) lh， 依次用超純水、無水乙醇和超純水徹底沖洗；其目的是為了進行清潔和形成粗糙表面。
[0011] (2)硅烷化反應：將玻璃棒下半部分浸入ATPES (3-氨丙基三乙氧基硅烷，有市 售。）乙醇溶液中，其中ATPES:超純水：無水乙醇的體積比為5:5:90,室溫下反應24h ; (3) 氨基的固定：超純水和純乙醇依次沖洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80°C并通入氮 氣氮吹15h ; (4)玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2. 5%的戊二醛PBS (磷酸鹽緩沖液，即1L中含有0. 2g KH2P04，0.2 g KC1，2.9 g Na2HP04. 12H20,8.8 g NaCl的溶液，配制緩沖液時所需的試劑均 有市售。）溶液中5h，之后用超純水沖洗； (5) 偶聯(lián)反應：玻璃棒浸入單克隆雜交瘤細胞株TYL-4E2分泌的單克隆抗體PBS溶液， 0? 5mg/mL抗體+0? 05 mg/mL似隊中4 °C輕微攬樣24 h ; (6) 將玻璃棒上未反應的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3M)去活化1 h ; (7) 穩(wěn)固共價鍵：置于PBS+0.05 mg/mL NaN3+0.2mg/mL恥0他113混合溶液中4°C反應 48h，將酰亞胺還原為胺使共價鍵結(jié)合更加牢固；所述固相載體為高硼硅玻璃棒、高純硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
[0012] 所述的單克隆抗體指的是對泰樂菌素和替米考星霉素有特異性反應的單克隆雜 交瘤細胞株TYL-4E2分泌的。
[0013] 本發(fā)明更進一步公開了吸附大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的免疫親和攪拌棒在制備吸附2 種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的應用。所述吸附大環(huán)內(nèi)酯類類藥物指的是泰樂菌素和替米考星。
[0014] 本發(fā)明的方法對組分凈化的同時還可提供定性信息。本發(fā)明的提純方法結(jié)合色 譜法可以使樣品中的待測組分得到有效分離和濃縮，便于2種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的含量的檢 測，彌補了單純免疫測定技術(shù)直接測定樣本的信息量太少、定量準確差，或理化方法選擇性 低等不足，體現(xiàn)了免疫學技術(shù)和常規(guī)理化技術(shù)在分析機制的互補性：
【主權(quán)項】
1. 一種吸附大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的免疫親和攪拌棒，其特征在于是由固相載體和與其偶 聯(lián)的泰樂菌素鼠單克隆抗體組成，其中固相載體與偶聯(lián)的泰樂菌素鼠單克隆抗體的偶聯(lián)長 度與重量比為I cm :2 mg ;所述的單克隆抗體是由單克隆雜交瘤細胞株TYL-4E2注入小鼠 腹腔，純化小鼠腹水得到；所述的固相載體為10 cmX4 mm玻璃棒，偶聯(lián)抗體的有效長度為 2. 5 cm〇
2. 權(quán)利要求1所述吸附大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的免疫親和攪拌棒的制備方法，其特征在于 按如下的步驟進行： (1) 固相載體表面的處理：將玻璃棒下半部分浸入到雙氧水和濃硫酸混合溶液中1 h,依次用超純水、無水乙醇和超純水徹底沖洗；其中所述的雙氧水和濃硫酸的體積比為 30:70 ； (2) 硅烷化反應：將玻璃棒下半部分浸入ATPES乙醇溶液中，其中ATPES:超純水：無水 乙醇的體積比為5:5:90,室溫下反應24 h; (3) 氨基的固定：超純水和純乙醇依次沖洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80 °C并通入氮 氣氮吹15h; (4) 玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2.5% (w/w)的戊二醛PBS溶液中5h，之后用超純水沖 洗； (5) 偶聯(lián)反應：玻璃棒浸入單克隆雜交瘤細胞株TYL-4E2分泌的單克隆抗體PBS溶液， 0? 5mg/mL抗體 +0? 05mg/mLNaN3* 4°C輕微攬樣 24h; (6) 將玻璃棒上未反應的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3M)去活化Ih; (7) 穩(wěn)固共價鍵：置于PBS+0. 05mg/mLNaN3+0. 2mg/mL恥0他113混合溶液中4°C反應 48h，將酰亞胺還原為胺使共價鍵結(jié)合更加牢固；所述固相載體為高硼硅玻璃棒、高純硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
3. 權(quán)利要求2所述吸附大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的免疫親和攪拌棒的制備方法，其特征在于 所述的固相載體表面使用雙氧水：濃硫酸（30:70,v/v)進行清潔和形成粗糙表面。
4. 權(quán)利要求2所述吸附大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的免疫親和攪拌棒的制備方法，其特征在于 所述的單克隆抗體指的是對泰樂菌素和替米考星霉素2種大環(huán)內(nèi)酯類藥物具有特異反應 的單克隆雜交瘤細胞株TYL-4E2分泌的單克隆抗體。
5. 權(quán)利要求1所述吸附大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的免疫親和攪拌棒在制備吸附2種大環(huán)內(nèi)酯 類藥物方面的應用；所述的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素指的是：泰樂菌素和替米考星。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種吸附大環(huán)內(nèi)酯類抗生素免疫親和攪拌棒及其制備方法與應用，它是由固相載體和與其偶聯(lián)的泰樂菌素鼠單克隆抗體組成，其中固相載體與偶聯(lián)的泰樂菌素鼠單克隆抗體的偶聯(lián)長度與重量比為1cm:2mg。本發(fā)明的提取方法結(jié)合色譜法可以使樣品中的待測組分得到有效分離和濃縮，便于氯霉素含量的檢測，彌補了單純免疫測定技術(shù)直接測定樣本的信息量太少、定量準確差，或理化方法選擇性低等不足，體現(xiàn)了免疫學技術(shù)和常規(guī)理化技術(shù)在分析機制的互補性。
【IPC分類】G01N33-577
【公開號】CN104698180
【申請?zhí)枴緾N201510117256
【發(fā)明人】李存, 張春元, 吳銀良, 張偉, 姚凱, 張建斌, 楊琳燕, 揚升
【申請人】天津農(nóng)學院
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月18日