一種可擴展檢測范圍的捕獲抗體競爭夾心免疫檢測方法及生物傳感器的制造方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫檢測技術領域，更具體地，涉及一種可擴展檢測范圍的捕獲抗體競爭夾心免疫檢測方法及生物傳感器。
【背景技術】
[0002]免疫檢測是利用免疫學原理檢測樣本中待測物質，其方法可分為定性方法和定量方法。免疫檢測具有特異、簡便、快速、準確、靈敏的優(yōu)點，根據(jù)檢測原理的不同，免疫檢測可以分為間接法、夾心法（包括雙抗原夾心法和雙抗體夾心法）、捕獲法、競爭法等，每種方法有各自的優(yōu)點和局限性。
[0003]傳統(tǒng)的雙抗體夾心免疫反應（sandwich immunoassay)的原理是以抗原為檢測革巴標。將固相載體的表面進行化學處理，使固相載體表面覆蓋能結合抗體的材料，將捕獲抗體固定于固相載體上，形成固定捕獲抗體，然后將抗原和標記抗體與固定捕獲抗體相接觸，進而形成固定捕獲抗體-抗原-標記抗體三明治復合物，通過對標記抗體上標記物的檢測，實現(xiàn)對抗原的定量檢測。這種技術已經(jīng)廣泛應用于臨床、環(huán)境、食品、海關等的檢測中，然而該技術的缺點是檢測范圍窄，通常僅能滿足檢測樣本檢測下限靈敏度，但是無法滿足檢測上限的要求，在檢測上限存在HD-Hook區(qū)，無法給出準確的數(shù)值。因此，對于高濃度樣本必須通過高倍稀釋才能檢測，從而增加的檢測的步驟，引入較大的操作誤差，延長的檢測所用的時間。例如超敏C-反應蛋白，臨床上對其檢測靈敏度的要求一般在幾到幾十ng/ml，而對于檢測上限的要求是10 μ g/mL，而超敏C-反應蛋白的正常范圍是小于I μ g/mL，病理范圍是1-10 μ g/mL,因而如果傳統(tǒng)的一步雙抗體夾心免疫檢測方法給出的檢測結果在HD-Hook區(qū)，需要對樣本進行稀釋，然后再進行檢測，而因待測樣本的信號強度位于HD-Hook區(qū)時，因不能確定待測樣本的大概濃度，所以不能指示樣本的稀釋倍數(shù)。因而傳統(tǒng)的雙抗體夾心免疫檢測方法會有檢測步驟繁瑣、檢測時間長的問題。目前傳統(tǒng)的雙抗體夾心ELISA法，是將捕獲抗體固定于固相表面，并將待測樣本與捕獲抗體相接觸，形成捕獲抗體-抗原的二元復合物，進而將酶標記的抗體與該二元復合物相接觸，形成捕獲抗體-抗原-酶標記抗體的三元復合物，通過三元復合物中的酶與底物反應顯色來確定待測樣本中抗原的濃度，檢測范圍一般在l-1000ng/ml范圍，盡管酶聯(lián)免疫法對檢測上限具有明顯的擴展，但是對于有些抗原仍然不能滿足檢測的需要，同時由于其需要通過底物顯色，因而增加了步驟較多，增長了檢測時間，因此利用傳統(tǒng)的雙抗體夾心免疫法和酶聯(lián)免疫法進行臨床檢測時，存在檢測上限低，需要對樣本進行高倍稀釋，不能滿足高濃度樣本快速直接檢測要求的問題。
[0004]免疫競爭法原理是標本中的抗原和一定量的標記抗原競爭與固定捕獲抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固定捕獲抗體上的標記抗原愈少，最后的檢測信號越弱。結合于固定捕獲抗體上的標記抗原量與樣本中被檢抗原濃度呈負相關，此方法檢測上限高，但是無法實現(xiàn)檢測下限的靈敏度，不能簡化操作步驟。
[0005]因此需要提供一種靈敏度高，檢測范圍寬、操作簡便、檢測時間短、對檢測設備要求低的檢測方法。。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于建立一種檢測范圍寬，檢測時間短，容易操作且步驟少的方法。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的本發(fā)明提供了下述技術方案:捕獲抗體競爭雙抗體夾心免疫法，包括游離捕獲抗體、標記抗體和固定捕獲抗體。其中游離捕獲抗體，無標記，與標記抗體在抗原上結合的表位不同。固定捕獲抗體固定于固相載體上。首先用游離捕獲抗體與固定捕獲抗體競爭結合待測抗原，形成的抗原抗體復合物與標記抗體結合，反應過程中會形成四種復合物，即標記抗體-抗原的復合物、游離捕獲抗體-抗原的復合物、標記抗體-抗原-固定捕獲抗體夾心復合物、游離捕獲抗體-抗原-標記抗體復合物，其中只有標記抗體與抗原-固定捕獲抗體形成的夾心復合物能通過標記做進一步檢測，由于標記抗體-抗原的復合物、游離捕獲抗體-抗原的復合物和游離捕獲抗體-抗原-標記抗體的復合物不能被檢測，相當于減少了與待測液中捕獲抗體反應的抗原量，從而拓展了檢測范圍。
[0007]本發(fā)明所述的抗原是指具有免疫原性的物質，如蛋白質和多肽，代表性的抗原包括(但不限于):細胞因子、腫瘤標志物、金屬蛋白、非腫瘤疾病標志物或微生物表達的蛋白等。
[0008]本發(fā)明方法包括如下步驟:
[0009]I)將標記抗體與游離捕獲抗體混合，形成二者的混合液；
[0010]2)將待測樣本和所述混合液混合，形成三者的混合物；
[0011]3)所述三者的混合物與固定捕獲抗體反應；
[0012]4)去除反應液；
[0013]5)檢測所述固定捕獲抗體-抗原-標記抗體復合物中的標記抗體上的標記信號并計算抗原的濃度。
[0014]所述固定捕獲抗體固定于固相載體上；所述固相載體的材料為單晶硅、合成玻璃、聚苯乙烯、金膜、硝化纖維、氟化聚乙烯、聚陽離子樹脂、親水性聚合物薄膜或多孔化材料，優(yōu)選地，所述固相載體的材料為單晶硅、樹脂、玻璃、硝化纖維樹脂、氟化聚乙烯或聚苯乙烯。
[0015]用于固定捕獲抗體固定的材料表面需要化學處理，處理方法為硅化、氨基化、醛基化、巰基化、環(huán)氧化以及活性酯化，優(yōu)選環(huán)氧化或氨基化。
[0016]優(yōu)選地，固定捕獲抗體固定后，用含I % BSA的PBST溶液、5 %的脫脂奶粉或I %的魚皮膠封閉，更優(yōu)選地用含I %的BSA的PBST溶液封閉；
[0017]優(yōu)選地，捕獲抗體與標記抗體結合于目標抗原的不同表位；
[0018]所述游離捕獲抗體和固定捕獲抗體不能與待測抗原形成游離捕獲抗體-抗原-固定捕獲抗體復合物；游離捕獲抗體和固定捕獲抗體可以為不同的分子，也可以為相同的分子，優(yōu)選地，二者為相同的分子；
[0019]優(yōu)選地，游離捕獲抗體與固相捕獲抗體的摩爾比為1:1-1:4 ；
[0020]優(yōu)選地，標記抗體與固定捕獲抗體的摩爾比為3:1-1:1;
[0021 ] 優(yōu)選地，反應液孵育時間5-7分鐘；
[0022]優(yōu)選地，標記抗體的標記物為磁珠、化學發(fā)光、熒光、膠體金、膠體銀，更優(yōu)選地磁珠、化學發(fā)光或膠體金；
[0023]優(yōu)選地，游離捕獲抗體和標記抗體預先混合在一起，形成儲備液。
[0024]本發(fā)明還研制了可擴展檢測范圍的一步競爭夾心免疫檢測生物傳感器，其技術方案如下:
[0025]一種可擴展檢測范圍的捕獲抗體競爭夾心免疫檢測生物傳感器，其特征在于包括傳感器測試卡，所述傳感器測試卡包括蓋板、支撐板和底板，支撐板位于蓋板和底板之間，支撐板上設置有至少一條微通道，所述微通道包括試劑存儲區(qū)、免疫反應區(qū)和廢液區(qū)；所述免疫反應區(qū)包含固定捕獲抗體，所述試劑儲存區(qū)的位置所對應的蓋板上設有注液孔，廢液區(qū)的位置所對應的蓋板上設有排液孔。其中所述試劑儲存區(qū)包含游離捕獲抗體和標記抗體。
[0026]一種可擴展檢測范圍的捕獲抗體競爭夾心免疫檢測生物傳感器，包括傳感器測試卡，所述傳感器測試卡包括蓋板和底板，蓋板和底板之間形成微通道，所述微通道包括免疫反應區(qū)，所述免疫反應區(qū)包含固定捕獲抗體，所述蓋板每端有一個有注/排液孔和排/注液孔。
[0027]優(yōu)選地，底板尺寸為長度為40-100mm，寬度為25_40mm，厚度為l_5mm ；
[0028]優(yōu)選地，蓋板的尺寸與底板相同；
[0029]優(yōu)選地，微孔通道的深度為0.1-0.5mm，長度為6_9cm ；
[0030]優(yōu)選地，微孔通道設置有試劑存儲區(qū)和廢液區(qū)；
[0031]優(yōu)選地，免疫反應區(qū)用于固定捕獲抗體的固定，其材料為單晶硅、玻璃、聚苯乙烯、金膜、硝化纖維、氟化聚乙烯、聚陽離子樹脂、親水性聚合物薄膜、多孔材料、樹脂或硝化纖維樹脂，更優(yōu)選地為單晶硅、樹脂、玻璃、硝化纖維樹脂、氟化聚乙烯，聚苯乙烯、硝化纖維、樹脂或多孔材料；
[0032]優(yōu)選地，免疫反應區(qū)用于固定捕獲抗體固定的材料表面的化學處理為硅化、氨基化、醛基化、巰基化、環(huán)氧化或活性酯化，更優(yōu)選為氨基化或環(huán)氧化；
[0033]優(yōu)選地，底板和蓋板粘合方式為粘合劑粘合、紫外固化、熱壓或超聲焊接法。
[0034]本發(fā)明的有益效果如下:
[0035]本檢測方法具有檢測范圍寬、檢測靈敏度高、檢測時間短、操作簡便的優(yōu)點；通過本方法制成的傳感器測試卡所用樣本體積小、檢測靈敏度高、檢測范圍寬并可采用多種檢測方式。
【附圖說明】
[0036]下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0037]圖1a示出傳感器測試卡I主視圖。
[0038]圖1b示出傳感器測試卡I剖視圖。
[0039]圖2a示出傳感器測試卡2主視圖。
[0040]圖2b示出傳感器測試卡2剖視圖。
[0041]圖3a示出傳統(tǒng)雙抗夾心免疫反應法檢測CRP抗原時的檢測上限。
[0042]圖3b示出捕獲抗體競爭夾心免疫反應法檢測CRP抗原時的檢測上限。
[0043]圖4示出實施例2中的CRP抗原濃度-磁致電阻率變化量標準曲線。
[0044]圖中100,200傳感器測試卡；130、230蓋板；170支撐板;140、240底板；150、250微通道;160試劑存儲區(qū);120、220免疫反應區(qū)；180廢液；110注液孔；190排液孔；210排/注液孔；260傳感器區(qū)。
【具體實施方式】
[0045]為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。
[0046]實施例1:磁顆粒CRP生物傳感器測試卡的制備
[0047]1.磁顆粒標記抗體的制備:先用NHS-B1tin進行標記CRP抗體，NHS-B1tin通過NHS與抗體進行偶聯(lián)形成