一種甲狀腺過氧化物酶抗體磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甲狀腺過氧化物酶抗體(TPO-Ab)磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：甲狀腺過氧化物酶抗體校準(zhǔn)品；偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁微粒懸浮液；生物素標(biāo)記的甲狀腺過氧化物酶抗原；鼠抗人酶標(biāo)結(jié)合物，所用的酶為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶純度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；甲狀腺過氧化物酶抗體質(zhì)控品；化學(xué)發(fā)光液A液和B液；20倍濃縮洗液；反應(yīng)管。另外本發(fā)明還公開了本發(fā)明試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有試劑盒相比靈敏度高、可測(cè)定濃度范圍寬、試劑有效期長、操作簡單、檢測(cè)自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】-種甲狀腺過氧化物酶抗體磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè) 試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明提供了一種甲狀腺過氧化物酶抗 體（TPO-Ab)磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 甲狀腺過氧化物酶（TPO)是催化甲狀腺激素的重要酶。TPO由甲狀腺濾泡細(xì)胞合 成，它是由933個(gè)氨基酸殘基組成的分子量為103kD的10%糖化的血色素樣蛋白質(zhì)，在濾 泡腔面的微絨毛處分布最為豐富。甲狀腺過氧化物酶抗體（TPO-Ab)是甲狀腺自身抗體的 一種，TPO-Ab作為甲狀腺疾病的主要自身抗體可引起甲狀腺濾泡損傷，導(dǎo)致甲狀腺功能減 退。臨床上對(duì)TPO-Ab進(jìn)行檢測(cè)，有助于對(duì)原發(fā)和繼發(fā)甲減進(jìn)行鑒別，且在自身免疫性甲狀 腺疾?。ㄈ缬袠虮炯谞钕傺?、Graves?。┑蔫b別和診斷中具有重要的臨床意義。通過檢測(cè) TPO-Ab可W提高對(duì)AITD的診斷率，具有重要的參考價(jià)值。
[0003] 目前，臨床領(lǐng)域應(yīng)用的TPO-Ab檢測(cè)方法主要有放射免疫法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法和化 學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法等。
[0004] 酶聯(lián)免疫測(cè)定法具備其操作簡單、試劑有效期長無污染、特異性好、結(jié)果可用儀器 測(cè)定等特點(diǎn)得W推廣，但由于敏感性相對(duì)較低，所用標(biāo)記酶與底物可定量測(cè)定范圍窄，及儀 器測(cè)定范圍窄等缺點(diǎn)，限制了其在微量免疫定量測(cè)定中的應(yīng)用。
[0005] 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定研究起步于80年代初，快速發(fā)展應(yīng)用于90年代，具有高靈敏 度、高特異性，操作簡便、快速，標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，同時(shí)無放射性同位素?fù)p傷和污染等特點(diǎn)， 因此近年來在臨床檢測(cè)分析中被廣泛推廣使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的問題是提供TPO-Ab的化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方 法，避免了測(cè)值重復(fù)性差，酶聯(lián)免疫法靈敏度低，檢測(cè)范圍窄，無全自動(dòng)化操作等缺陷。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是；TPO-Ab磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，包括： TPO-Ab校準(zhǔn)品；偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁微粒息浮液；生物素標(biāo)記的TPO-Ab ;鼠抗人抗體 酶結(jié)合物，所用的酶為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶純度RZ > 3.0,活性> 250U/血； TPO-Ab質(zhì)控品，質(zhì)控品包括濃度18IU/mL的低值質(zhì)控品和350IU/mL的高值質(zhì)控品；化學(xué) 發(fā)光液A液和B液，A液為5mmol/L，P服.6的Tris-肥1緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度 0. 7g/L魯米諾和終濃度0. 165g/L對(duì)楓酷；B液為0. 675g/L過氧化脈；20倍濃縮洗液；反應(yīng) 管。
[0008] 進(jìn)一步，所述的磁微粒是表面包裹帶有氨基或簇基活性基團(tuán)的四氧化^鐵，粒徑 100-500nm。
[0009] 進(jìn)一步，所述的反應(yīng)管的材料是透明聚苯己帰、聚己帰、聚丙帰或玻璃。
[0010] 試劑盒的制備方法，包括W下步驟：
[00川 （I) TPO-Ab校準(zhǔn)品的配制：
[0012] 將TPO-Ab用校準(zhǔn)品稀釋液配置成校準(zhǔn)品濃儲(chǔ)液，所述校準(zhǔn)品稀釋液是用含1% BSA的磯酸鹽緩沖液配制而成，W企業(yè)校準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)，將濃儲(chǔ)液用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至工 作濃度，分別為 0,10, 25,100, 200, 500IU/mL ;
[001引 （2) TPO-Ab質(zhì)控品的配制：
[0014] 用校準(zhǔn)品稀釋液將上述濃儲(chǔ)液稀釋至18IU/mL和350IU/mL，18IU/mL為低值質(zhì)控， 350IU/mL為高值質(zhì)控；
[0015] (4)生物素標(biāo)記的TPO-Ab的制備
[0016] 取0. 5mg TPO抗原，用測(cè)酸鹽緩沖液在2?8°C下透析1?化；將透析后的抗原加 入45ug生物素，同時(shí)加入二甲基亞諷，使二甲基亞諷最終濃度為5-10%，緩慢振蕩，避光反 應(yīng)化；在上述溶液中加入300UL1M氯化饋溶液，常溫避光反應(yīng)化；用0. OlM PBS溶液在2? 8C下透析2化，期間換液2-4次；
[0017] (5)鼠抗人酶結(jié)合物的制備
[0018] 采用改良高楓酸軸氧化法將鼠抗人抗體與辣根過氧化物酶進(jìn)行偶聯(lián)后，用酶稀 釋液（含12%854,0.5%。廁脂紅，9肖/1化(：1，1肖/106又付3111'-2000，1.1肖/11訊6611-20， 1%〇 ProClinOO)將其稀釋至工作濃度1:5000,并加入8%酶穩(wěn)定劑，儲(chǔ)存于2?8°C ;
[0019] (6) 20倍濃縮洗液的配制
[0020] 20倍濃縮洗液包括58g/L磯酸氨二軸，5. 92g/L磯酸二氨軸，180g/L化Cl, 10血/ LTween-20 和 2% Proclin300 ;
[0021] (7)化學(xué)發(fā)光液A液和B液的配制
[0022] A液為0. 7g/L魯米諾，0. 165g/L對(duì)楓酷，緩沖液為抑8. 6的5mmol/L Tris-HCl,避 光保存；B液為0. 675g/L過氧化脈，用工藝用水配制；
[0023] (8)組裝；將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2?8C，每種試劑各一瓶；
[0024] (9)對(duì)采用該方法制備的試劑盒進(jìn)行物理檢查，對(duì)準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線 性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。
[00巧]本發(fā)明的原理是，采用間接法測(cè)定血清或血漿中的TPO-Ab,在親和素-磁微粒息 浮液中加入生物素-TPO-Ab結(jié)合物，通過親和素和生物素的親和反應(yīng)，形成磁微粒-親和 素-生物素-TPO-Ag復(fù)合物，加入樣本和酶，通過抗原抗體反應(yīng)，形成磁微粒-親和素-生 物素-TPO-Ab-TPO-Ab-鼠抗人HRP復(fù)合物，用磁場(chǎng)將復(fù)合物吸附在試管底部，清洗掉游離的 成分，加入底物工作液，在氧化劑作用下，HRP催化魯米諾生成處于激發(fā)態(tài)的氨基鄰苯二甲 酸離子，其恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，釋放出425nm的光子，于第2分鐘測(cè)定各加樣管的發(fā)光值RLU。樣 本的RLU與樣本TPO-Ab濃度呈正相關(guān)。樣本中的TPO-Ab濃度依據(jù)由校準(zhǔn)品TPO-Ab濃度 和對(duì)應(yīng)的RLU建立的Log狂)-Log (Y)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量，從而檢測(cè)人血清、血漿中的TPO-Ab 含量。
[0026] 本專利發(fā)明的TPO-Ab磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫定量測(cè)定試劑盒，具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] (1)靈敏度高，本試劑盒的分析靈敏度不高于5IU/mL。
[0028] (2)特異性良好，本產(chǎn)品對(duì)甲狀腺球蛋白抗體（TG-Ab) (lOOOOIU/mL)未出現(xiàn)交叉 反應(yīng)。
[002引 做精密性良化批內(nèi)不精密度不高于5%，批間不精密度不高于10%。
[0030] (4)成本低，與市場(chǎng)上同類產(chǎn)品比較，本試劑盒性能良化成本低，具有臨床應(yīng)用價(jià) 值。
[003U 妨穩(wěn)定性良化本產(chǎn)品在37C可存放7天W上，在2?8°C可存放1年。
[0032] (6)本試劑盒可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化操作，檢測(cè)方便，快速。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1是本發(fā)明的試劑盒測(cè)定TPO-Ab與羅氏測(cè)定TPO-Ab的測(cè)定結(jié)果比較圖，其中 縱坐標(biāo)為本試劑盒測(cè)得的TPO-Ab值，橫坐標(biāo)為羅氏試劑盒測(cè)得的TPO-Ab值，兩種方法相關(guān) 系數(shù) r = 0. 9884,直線方程 y = 0. 9595X-2. 3137。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 實(shí)施例1 ;制備TPO-Ab磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫定量測(cè)定試劑盒 [00巧](1) TPO-Ab校準(zhǔn)品的配制：
[0036] 將TPO-Ab用校準(zhǔn)品稀釋液配置成校準(zhǔn)品濃儲(chǔ)液，所述校準(zhǔn)品稀釋液是用含1% BSA的磯酸鹽緩沖液配制而成，W企業(yè)校準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)，將濃儲(chǔ)液用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至工 作濃度，分別為 0,10, 25,100, 200, 500IU/mL ;
[0037] (2) TPO-Ab質(zhì)控品的配制：
[0038] 用校準(zhǔn)品稀釋液將上述濃儲(chǔ)液稀釋至18IU/mL和350IU/mL，18IU/mL為低值質(zhì)控， 350IU/mL為高值質(zhì)控；
[0039] (3)生物素標(biāo)記的TPO-b的制備
[0040] 取0. 5mg TPO抗原，用測(cè)酸鹽緩沖液在2?8°C下透析1?化；將透析后的抗原加 入45ug生物素，同時(shí)加入二甲基亞諷，使二甲基亞諷最終濃度為5-10%，緩慢振蕩，避光反 應(yīng)化；在上述溶液中加入300UL1M氯化饋溶液，常溫避光反應(yīng)化；用0. OlM PBS溶液在2? 8C下透析2化，期間換液2-4次；
[0041] (4)鼠抗人酶結(jié)合物的制備
[0042] 采用改良高楓酸軸氧化法將鼠抗人抗體與辣根過氧化物酶進(jìn)行偶聯(lián)后，用酶稀 釋液（含12%854,0.5%。廁脂紅，9肖/1化(：1，1肖/106又付3111'-2000，1.1肖/11訊6611-20， 1%〇口1'〇(：1111300)將其稀釋至工作濃度1:5000，并加入8%酶穩(wěn)定劑，儲(chǔ)存于2?81：;
[0043] (5) 20倍濃縮洗液的配制
[0044] 20倍濃縮洗液包括58g/L磯酸氨二軸，5. 92g/L磯酸二氨軸，180g/L化Cl, 10血/ LTween-20 和 2% Proclin300 ;
[0045] 做化學(xué)發(fā)光液A液和B液的配制
[0046] A液為0. 7g/L魯米諾，0. 165g/L對(duì)楓酷，緩沖液為抑8. 6的5mmol/L Tris-HCl,避 光保存；B液為0. 675g/L過氧化脈，用工藝用水配制；
[0047] (7)組裝；將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2?8C，每種試劑各一瓶；
[0048] (8)對(duì)采用該方法制備的試劑盒進(jìn)行物理檢查，對(duì)準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線 性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。
[004引實(shí)施例2 ;本發(fā)明試劑盒的檢查
[0050] (1)物理檢查：液體組分應(yīng)澄清，無沉淀或絮狀物；其他組分應(yīng)無包裝破損。
[0051] (2)準(zhǔn)確性：試劑盒校準(zhǔn)品與國家標(biāo)準(zhǔn)品系列同時(shí)進(jìn)行分析測(cè)定，用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué) 模型擬合，要求兩條劑量-反應(yīng)曲線不明顯偏離平行（t檢驗(yàn)，|t|<2.447) ;WTP〇-Ab企業(yè) 標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型擬合，試劑盒校準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)值與標(biāo)示值比值的平均值 應(yīng)在0. 90?1. 10范圍內(nèi)。
[005引 做劑量-反應(yīng)曲線的線性：用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型擬合，劑量-反應(yīng)曲線在5-500IU/ mL濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r絕對(duì)值不低于0. 9900。
[0053] (4)分析靈敏度；試劑盒分析靈敏度不高于5IU/mL。
[0054] (5)精密度；10孔平行測(cè)定高值和低值質(zhì)控品，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的平均濃度（X )與 標(biāo)準(zhǔn)差（SD)，批內(nèi)不精密度（CV %)= SD / ^X100%;使用3批產(chǎn)品進(jìn)行3次試驗(yàn)，計(jì)算 測(cè)定結(jié)果的平均濃度（X)與標(biāo)準(zhǔn)差（SD)，批間不精密度（CV %)= SD/ ^xioo%，結(jié)果應(yīng) 符合批內(nèi)不精密度（CV% )應(yīng)不高于5% ;批間不精密度（CV% )應(yīng)不高于10%。
[005引 做質(zhì)控品的測(cè)定值：平行測(cè)定10孔高值和低值的質(zhì)控品，用Log佩-Log(Y)數(shù) 學(xué)模型擬合，質(zhì)控品測(cè)值應(yīng)在允許范圍內(nèi)，低值質(zhì)控品測(cè)值在18IU/mU高值質(zhì)控品測(cè)值在 350IU/mL。
[005引 （7)特異性：
[0057] 交叉反應(yīng)符合下表要求：

【權(quán)利要求】
1. 一種甲狀腺過氧化物酶抗體磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒包括： 1. TP0-Ab 校準(zhǔn)品，濃度為 0,10,25,100,200,500IU/mL ; 2. TP0-Ab樣本稀釋液； 3) 偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁微粒懸浮液； 4) 生物素標(biāo)記的TPO-Ab抗原； 5) 鼠抗人酶標(biāo)結(jié)合物，所用的酶為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶純度RZ > 3. 0,活 性彡 250U/mL ; 6. TP0-Ab質(zhì)控品；質(zhì)控品包括濃度18IU/mL的低值質(zhì)控品和350IU/mL的高值質(zhì)控品； 7) 化學(xué)發(fā)光液A液和B液；A液為5mmol/L，pH8. 6的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中 含有終濃度〇. 7g/L魯米諾和終濃度0. 165g/L對(duì)碘酚；B液為0. 675g/L過氧化脲； 8) 20倍濃縮洗液； 9) 反應(yīng)管。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的TPO-Ab磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 所述的磁微粒是表面包裹帶有氨基或羧基活性基團(tuán)的四氧化三鐵，粒徑10_50nm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的TPO-Ab磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 所述的反應(yīng)管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的TPO-Ab樣本稀釋液，是含溴甲酚紫的Tris鹽酸緩沖液。
5. -種制備所述權(quán)利要求1-4任一權(quán)利要求所述的試劑盒的方法，其特征在于，包括 以下步驟： (1) TPO-Ab校準(zhǔn)品的配制： 將TPO-Ab用校準(zhǔn)品稀釋液配置成校準(zhǔn)品濃儲(chǔ)液，所述校準(zhǔn)品稀釋液是用含1% BSA的 磷酸鹽緩沖液配制而成，以企業(yè)校準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)，將濃儲(chǔ)液用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至工作濃 度，分別為 〇, 10, 25,100, 200, 500IU/mL ; (2) TPO-Ab質(zhì)控品的配制： 用校準(zhǔn)品稀釋液將上述濃儲(chǔ)液稀釋至18IU/mL和350IU/mL，18IU/mL為低值質(zhì)控， 350IU/mL為高值質(zhì)控； (3) 生物素標(biāo)記的TPO-Ab的制備 取0. 5mg TPO-Ab抗原，用硼酸鹽緩沖液在2?8°C下透析1?3h ;將透析后的抗原加 入45ug生物素，同時(shí)加入二甲基亞砜，使二甲基亞砜最終濃度為5-10 %，緩慢振蕩，避光反 應(yīng)3h ;在上述溶液中加入300UL1M氯化銨溶液，常溫避光反應(yīng)2h ;用0. 01M PBS溶液在2? 8°C下透析24h，期間換液2-4次； (4) 鼠抗人酶結(jié)合物的制備 采用改良高碘酸鈉氧化法將鼠抗人抗體與辣根過氧化物酶進(jìn)行偶聯(lián)后，用酶稀釋液將 其稀釋至工作濃度1:5000,并加入8%酶穩(wěn)定劑，儲(chǔ)存于2?8°C ; (5) 20倍濃縮洗液的配制 20倍濃縮洗液包括58g/L磷酸氫二鈉，5. 92g/L磷酸二氫鈉，180g/L NaCl，10mL/L Tween-20 和 2% Proclin300 ; (6) 化學(xué)發(fā)光液A液和B液的配制 A液為0. 7g/L魯米諾，0. 165g/L對(duì)碘酚，緩沖液為pH8. 6的5mmol/L Tris-HCl，避光保 存；B液為0. 675g/L過氧化脲，用工藝用水配制； (7) 組裝：將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2?8°C，每種試劑各一瓶； (8) 對(duì)采用該方法制備的試劑盒進(jìn)行物理檢查，對(duì)準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線性、精 密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。
【文檔編號(hào)】G01N33/573GK104237513SQ201410522895
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】劉萍, 欒大偉, 盛尚春, 俸家富 申請(qǐng)人:博奧賽斯（天津）生物科技有限公司