專利名稱：蛋白質(zhì)支架的制作方法
蛋白質(zhì)支架1.相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2007年10月31日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/984，209的優(yōu)先權(quán)，該 申請(qǐng)通過(guò)引用全文納入本文。2.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及特異性結(jié)合靶標(biāo)的蛋白質(zhì)支架以及制備、篩選和利用這種支架的方法。3.
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及可用于，例如產(chǎn)生具有新型結(jié)合特征的產(chǎn)物的蛋白質(zhì)支架。具有相對(duì)確定三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)通常稱為蛋白質(zhì)支架，其可用作設(shè)計(jì)工程改造產(chǎn) 物的試劑。這些支架通常含有適于特定或隨機(jī)序列改變的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，常進(jìn)行這種序 列隨機(jī)化來(lái)產(chǎn)生可從中選擇所需產(chǎn)物的蛋白質(zhì)文庫(kù)?？衫眠@種支架的一個(gè)具體領(lǐng)域是抗 體模擬設(shè)計(jì)領(lǐng)域。雖然市場(chǎng)上已有治療性抗體的一些成功例子(HERCEPTIN , AVASTIN ,
SYNAGIS )，但制備抗體片段作為治療性蛋白的興趣不斷高漲。其優(yōu)勢(shì)在于便于通過(guò)分子 生物學(xué)技術(shù)操作，從而能獲得所需結(jié)合特性，即在微生物系統(tǒng)中表達(dá)這種片段的能力，以及 預(yù)計(jì)抗體片段的組織穿透力優(yōu)于全長(zhǎng)抗體。一個(gè)例子是REOPRO 。此外，已有人致力于開發(fā)小的、非抗體治療劑，即抗體模擬物，從而能利用抗體和 抗體片段的優(yōu)勢(shì)，例如結(jié)合靶標(biāo)的親和力高和免疫原性及毒性低，同時(shí)能避免一些缺點(diǎn)，例 如需要結(jié)構(gòu)域內(nèi)的二硫鍵，這要求正確折疊和抗體片段易于凝聚及穩(wěn)定性不如全長(zhǎng)IgG。一 個(gè)例子是通過(guò)缺失單克隆抗體重鏈可變區(qū)的三個(gè)β鏈設(shè)計(jì)的“小抗體(minibody)”支架， 其涉及免疫球蛋白折疊(Tramontane)等，J. Mol. Recognit. 7 :9，1994)。該蛋白質(zhì)包含61個(gè) 殘基，可用于提供兩個(gè)超變環(huán)，很像抗體中的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。這兩個(gè)環(huán)任意排列，并選擇 了能結(jié)合抗原的產(chǎn)物，但迄今為止該框架因溶解性問(wèn)題而看來(lái)應(yīng)用有限。用于展示環(huán)的另 一框架是淀粉酶抑肽，它是α -淀粉酶的小蛋白抑制劑，含有74個(gè)殘基，通過(guò)兩個(gè)二硫鍵組 合在一起的6-鏈β片層夾心并形成3個(gè)CDR-樣環(huán)(McConnell和Hoess，J. Mol. Biol. 250 460，1995)。測(cè)試了其它蛋白質(zhì)是否能作為框架，并用于展示α螺旋表面上的隨機(jī)殘基(Nord 等，Nat. Biotechnol. 15 :772，1997 ；Nord 等，Protein Eng. 8 :601，1995)，α 螺旋束中 α 螺 旋之間的環(huán)(Ku 和 Schultz，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 92 :6552，1995)，和由二硫鍵約束的 環(huán)，例如小蛋白酶抑制劑的那些(Markland等，Biochemistry 35 :8045，1996 ；Markland等， Biochemistry 35 :8058，1996 ；Rottgen 禾口 Collins，Gene 164 -.243,1995 ；Wang 等，J. Biol. Chem. 270 12250，1995)。因此，需要開發(fā)小的、穩(wěn)定的、人工抗體-樣分子以供各種治療和診斷應(yīng)用。本文對(duì)參考文獻(xiàn)的引用或討論不應(yīng)理解為承認(rèn)這種參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技 術(shù)。
4.發(fā)明概述本發(fā)明提供能結(jié)合任何感興趣化合物的重組非天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)支架家族。具體 地說(shuō)，本文所述蛋白質(zhì)可用于展示與抗體可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)類似的確定環(huán)。這些 環(huán)可經(jīng)隨機(jī)化或限制性進(jìn)化而產(chǎn)生結(jié)合多種靶化合物所需的多樣性。這些蛋白質(zhì)可裝配成 能結(jié)合不同靶標(biāo)的多特異性支架。本發(fā)明提供重組非天然產(chǎn)生的多肽支架(下文稱為“本發(fā)明支架”)，其包含與衍 生自天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列的多個(gè)環(huán)區(qū)域序列相連的多個(gè)β鏈結(jié)構(gòu)域，其中通過(guò)天然產(chǎn) 生的蛋白質(zhì)序列中相應(yīng)環(huán)序列的至少一個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加而改變一個(gè)或多個(gè)所 述環(huán)區(qū)域序列，其中該多肽支架的β鏈結(jié)構(gòu)域與天然產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域序列 有至少50%同源性。在一些實(shí)施方式中，天然產(chǎn)生的序列是對(duì)應(yīng)于人結(jié)合腕蛋白C的蛋白 質(zhì)序列。具體地說(shuō)，這些支架包括結(jié)合腕蛋白C的第三FnIII結(jié)構(gòu)域(也稱為“Τη3”結(jié)構(gòu) 域)。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID N0:l、5-32、 64-67和210。在其它具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架可由包含選自下組的序列的核酸編碼 SEQ ID NO 33-59。在其它實(shí)施方式中，天然產(chǎn)生的序列對(duì)應(yīng)于預(yù)測(cè)的Tn3結(jié)構(gòu)基序，例如衍生自嗜 熱生物的那些，例如但不限于閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、海葡萄嗜熱菌 (Staphylothermus marinus)、嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobusacidocaldarius)、硫磺礦硫化 Bflif (Sulfolobus solfataricus)、禾口硫化卩十菌(Sulfolobustokodaii)。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含選自下組的氨基酸序列SEQ IDNO :2_4、 68-88和210。在其它特定實(shí)施方式中，本發(fā)明支架可由包含選自下組的序列的核酸編碼 SEQ ID NO :89-98。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明支架還包括二硫鍵穩(wěn)定的支架。通過(guò)耐熱、耐受離液 變性作用和蛋白酶處理檢測(cè)到二硫鍵穩(wěn)定的支架顯示穩(wěn)定性增加。本發(fā)明的支架經(jīng)工程改造結(jié)合感興趣靶標(biāo)，如本文所述。這種結(jié)合可以，例如顯示 至少100 μ M的親和力。本發(fā)明還提供包含至少兩個(gè)本發(fā)明支架的多聚支架(下文稱為“本發(fā)明的多聚支 架”)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多聚支架包含至少兩個(gè)相連的支架，例如但不限于二聚 結(jié)構(gòu)域、氨基酸接頭、二硫鍵、化學(xué)交聯(lián)和IgG分子或其片段或Fc區(qū)域。本發(fā)明還提供包含多個(gè)本發(fā)明支架的多肽展示文庫(kù)(下文稱為“本發(fā)明文庫(kù)”)。 本發(fā)明文庫(kù)可用于捕捉和堅(jiān)定靶標(biāo)結(jié)合支架來(lái)構(gòu)建多聚支架。在另一方面，本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明支架和文庫(kù)的分離核酸分子。本發(fā)明還提供制備、利用、篩選、優(yōu)化和工程改造本發(fā)明支架和文庫(kù)的方法。在還有另一方面，本發(fā)明還提供包含本發(fā)明支架的藥物組合物。本發(fā)明還提供通過(guò)給予治療有效量的本發(fā)明支架和/或包含本發(fā)明支架的藥物 組合物來(lái)治療、預(yù)防、緩解、檢測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)患者中疾病或其癥狀的方法，如本文所述。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供可用于預(yù)防、緩解、檢測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)疾病，例如 但不限于癌癥的TRAIL-R2特異性結(jié)合物。在其它具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的TRAIL-R2 特異性結(jié)合支架可用于治療其中的癌細(xì)胞表達(dá)TRAIL-R2的癌癥。在一些實(shí)施方式中，癌癥 可包括但不限于肺癌、非霍奇金淋巴瘤、胃腸道癌癥、腎癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌和黑色素瘤。5.附圖簡(jiǎn)述出于說(shuō)明本發(fā)明的目的，附圖描述了本發(fā)明的某些實(shí)施方式。然而，本發(fā)明不限于 附圖所述實(shí)施方式的確切配置和手段。

圖1.支架的重組體總細(xì)胞表達(dá).此處顯示了表達(dá)蛋白質(zhì)支架的大腸桿菌培養(yǎng)物 的各種重組體裂解液的考馬斯染色PAGE凝膠。高度表達(dá)的支架以星號(hào)(*)表示。圖2.基于Tn3的支架的表達(dá)和純化.此處顯示了重組體表達(dá)和純化后描述基于 Τη3的支架的考馬斯染色PAGE凝膠。不難將Tn3支架純化至均一。圖3Α.基于Τη3的支架的解鏈溫度和測(cè)定.該圖顯示了通過(guò)示差掃描量熱法檢測(cè) 基于Τη3支架的熱解鏈曲線。ρΗ 7.0時(shí)，測(cè)定的Tm是約45°C。圖3B.基于Tn3的支架的脲變性特征.該圖顯示了 ρΗ 7. 5時(shí)，基于Τη3的支架在各 種濃度的脲中的變性特征。利用分子的固有熒光的改變檢測(cè)分子的解折疊情況。對(duì)于Τη3支 架，解折疊導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加并向較高波長(zhǎng)遷移。如該圖所顯示的，該分子在低濃度脲(小于 或等于1Μ)中折疊，在較高濃度脲中變性。計(jì)算的50%分子解折疊的摩爾濃度約為2Μ。圖3C. Τη3支架存在單體狀態(tài).該圖顯示純化的Τη3支架的尺寸排阻層析分析結(jié) 果，從而測(cè)定了污染性片段和/或高級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)比例。圖上的百分比表示97%以上的支 架以單體形式洗出(通過(guò)在線光掃描檢測(cè)器測(cè)定約為IlkDa)，而只有少部分(約3% )在 峰值為21kDa處洗出，可能是二聚體。圖4.顯示環(huán)長(zhǎng)度多樣性的支架的BC環(huán).該圖表示各種Tn3相關(guān)蛋白質(zhì)支架的BC 環(huán)的長(zhǎng)度多樣性。(A)表示衍生自PDB數(shù)據(jù)庫(kù)的Τη3相關(guān)支架亞組的序列(51條序列)顯 示的環(huán)長(zhǎng)度多樣性。(B)表示衍生自瑞士-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Swiss-prot database)的序列 (397條序列)顯示的環(huán)長(zhǎng)度多樣性。如圖所示，各種Tn3相關(guān)支架顯示長(zhǎng)度為7-26個(gè)氨基 酸殘基。按照本文所用的方案，Τη3中BC環(huán)的長(zhǎng)度是9個(gè)殘基。圖5.支架的TO環(huán)顯示環(huán)長(zhǎng)度多樣性.該圖表示各種Tn3相關(guān)支架的TO環(huán)的長(zhǎng) 度多樣性。該圖描述了衍生自PDB數(shù)據(jù)庫(kù)的Τη3相關(guān)支架亞組的序列所顯示的TO環(huán)長(zhǎng)度 多樣性。如圖所示，Tn3支架的TO環(huán)顯示長(zhǎng)度為6-18個(gè)氨基酸殘基。按照本文所用的方 案，Tn3中TO環(huán)的長(zhǎng)度是10個(gè)殘基。圖6.支架的DE環(huán)顯示環(huán)長(zhǎng)度多樣性.該圖表示各種Tn3相關(guān)支架的DE環(huán)的長(zhǎng) 度多樣性。該圖描述了衍生自PDB數(shù)據(jù)庫(kù)的Τη3相關(guān)支架亞組的序列所顯示的DE環(huán)長(zhǎng)度 多樣性。如圖所示，Τη3支架的DE環(huán)顯示長(zhǎng)度為約4-約17個(gè)氨基酸殘基。按照本文所用 的方案，Τη3中DE環(huán)的長(zhǎng)度是6個(gè)殘基。圖7Α.支架的9氨基酸殘基BC環(huán)顯示序列多樣性.該圖表示瑞士 -蛋白質(zhì)數(shù)據(jù) 庫(kù)的9氨基酸殘基BC環(huán)(73條序列)顯示的序列多樣性。利用比對(duì)工具，Webl0g0，9氨基 酸殘基BC環(huán)中特定位置氨基酸的相對(duì)發(fā)生率由特定位置上單字母密碼的大小表示。例如， 所分析的9氨基酸殘基BC環(huán)3位最常見的氨基酸是脯氨酸(P)，然后是丙氨酸(A)，再然后 是纈氨酸(V)。圖7B.支架的12氨基酸殘基BC環(huán)顯示序列多樣性.該圖表示瑞士-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù) 庫(kù)的12氨基酸殘基BC(99條序列)環(huán)顯示的序列多樣性。利用比對(duì)工具，Webl0g0，12氨 基酸殘基BC環(huán)中特定位置氨基酸的相對(duì)發(fā)生率由特定位置上單字母密碼的大小表示。例如，所分析的12氨基酸殘基BC環(huán)3位最常見的氨基酸是脯氨酸(P)，然后是甘氨酸(G)，再 然后是谷氨酰胺(Q)。圖8.支架的re環(huán)顯示序列多樣性.該圖表示瑞士-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)所有長(zhǎng)度的re 環(huán)(393條序列)顯示的序列多樣性。利用比對(duì)工具，ffeblogo, TO環(huán)中特定位置氨基酸的 相對(duì)發(fā)生率由特定位置上單字母密碼的大小表示。例如，所分析的re環(huán)2位最常見的氨基 酸是天冬酰胺(N)，然后是蘇氨酸(T)，再然后是賴氨酸(K)。圖9. SYNAGIS 特異性Tn3支架的表達(dá)和純化.此處顯示了重組體表達(dá)和純化 后描述SYNAGIS 特異性Τη3支架(SynBPOl)的考馬斯染色PAGE凝膠。不難將SynBPOl 支架純化至均一。圖9B.測(cè)定SYNAGIS 特異性結(jié)合支架的Kd.曲線表示通過(guò)BIACORE 試驗(yàn) 表征SynBPOl支架與SYNAGIS 的特異性結(jié)合親和力的實(shí)驗(yàn)。利用各種濃度的固定化 SYNAGIS 和流動(dòng)相SynBPOl測(cè)定到結(jié)合親和力(Kd)為約16 μ M。圖9C. SYNAGIS 特異性結(jié)合支架顯示與基礎(chǔ)支架類似的穩(wěn)定性.從實(shí)施例 3制備的支架文庫(kù)鑒定SYNAGIS 特異性結(jié)合支架。此處顯示了通過(guò)固有熒光強(qiáng)度檢測(cè) 蛋白質(zhì)解折疊情況的脲變性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在該實(shí)驗(yàn)中，隨著脲濃度升高，Tn3支架(WT)和 SYNAGIS 特異性結(jié)合支架SynBPOl (Al)顯示非常相似的變性特征。圖9D.結(jié)合支架二價(jià)結(jié)合靶抗體SYNAGIS .曲線表示采用BIAcore試驗(yàn)方式 表征兩個(gè)支架結(jié)合到固定分子上的實(shí)驗(yàn)。在該實(shí)驗(yàn)中，固定的SYNAGIS 覆蓋有ΙμΜ的 SYNAGIS 4寺異性蛋白支架溶液(藍(lán)色曲線)或ΙμΜ的SYNAGIS 特異性蛋白支架 +0. 19 μ M交聯(lián)mAb溶液(紅色曲線)。圖10Α.含有天然產(chǎn)生的二硫鍵的Τη3結(jié)構(gòu)基序的序列比對(duì).該序列比對(duì)在線顯 示了 21個(gè)含有天然產(chǎn)生二硫鍵的Τη3相關(guān)結(jié)構(gòu)基序中半胱氨酸殘基的位置，從而測(cè)定穩(wěn)定 性工程改造的候選位置。各Τη3序列內(nèi)類似著色的Cys殘基由二硫鍵相連。比對(duì)包括Τη3 的序列(Iten.pro)以促進(jìn)鑒定Tn3中對(duì)應(yīng)于含二硫鍵的支架中半胱氨酸殘基的殘基和位置。圖10Β.靶向二硫鍵工程改造以增加支架穩(wěn)定性.該圖描述了支架序列中待工程 改造的潛在二硫鍵位置。為增加穩(wěn)定性，分別工程改造支架中描述的4個(gè)二硫鍵位置。得 到的重組支架分別稱為Tn3SS1、Tn3SS2、Tn3SS3和Tn3ss4。圖10C.所選的純化二硫鍵工程改造支架的RP-HPLC曲線.圖中描述了純化、還原 和重折疊形成二硫鍵后(i)Tn3SS3和(ii)Tn3ss4的反相HPLC色譜圖。色譜圖顯示了支架內(nèi) 所含的半胱氨酸在蛋白質(zhì)純化后僅部分氧化(上曲線)，通過(guò)DTT處理完全還原(中間曲 線)和重折疊后完全氧化成二硫鍵(下曲線)。圖10D. 二硫鍵工程改造支架的表達(dá)和表征.該圖描述了圖IOB所示4個(gè)二硫鍵 工程改造支架的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果。在還原和非還原條件下分析純化和重折疊 構(gòu)建物Tn3 (野生型)、Tn3ssl (1)、Tn3SS2 (2)、Tn3SS3 (3)、Tn3ss4 (4)樣品來(lái)評(píng)估預(yù)計(jì)的二硫鍵 形成。所述Tn3SS2形成二硫鍵連接的二聚體。其它構(gòu)建物(Tn3、Tn3ssl、Tn3SS3和Tn3ss4)不 對(duì)摻入的半胱氨酸殘基起反應(yīng)而形成二聚體，因?yàn)榧兓椭卣郫B的含二硫鍵支架在還原和 非還原條件下作類似遷移。圖10E.單二硫鍵工程改造支架的脲變性特征.該圖描述了圖A中概述的所選的含二硫鍵支架，Tn3ssl (SSl)、Tn3SS3(SS3)和Tn3ss4(SS4)以及Tn3(WT)支架的脲變性研究結(jié) 果。在該實(shí)驗(yàn)中，各種純化和重折疊支架接觸水平升高的脲。監(jiān)測(cè)相對(duì)熒光作為解折疊的檢 測(cè)手段。隨著蛋白質(zhì)解折疊或變得不穩(wěn)定，相對(duì)熒光增加。如圖中所示，與Tn3支架相比， 含有Tn3ssl的支架顯示對(duì)脲的敏感性較高，因此較不穩(wěn)定。與Tn3相比，支架Tn3SS3和Tn3ss4 也顯示對(duì)脲介導(dǎo)變性的耐受性更強(qiáng)，因此更穩(wěn)定。在該實(shí)驗(yàn)所檢驗(yàn)的支架中，支架Tn3ss4顯 示對(duì)脲介導(dǎo)變性的耐受性最強(qiáng)。圖10F.與Tn3支架相比，Tn3ss4 二硫鍵工程改造支架顯示穩(wěn)定性增加.該圖顯示 了比較Tn3支架(圓圈)和含二硫鍵支架Tn3ss4(正方形)穩(wěn)定性的鹽酸胍變性試驗(yàn)結(jié)果。 如該圖所示，Tn3ss4支架顯示對(duì)胍介導(dǎo)變性的耐受性更強(qiáng)，因此與Tn3支架相比更穩(wěn)定。圖10G.與Τη3支架相比，Tn3ss4支架顯示高水平的蛋白酶耐受.該圖描述了比較 Tn3支架與含Tn3ss4的支架穩(wěn)定性的蛋白酶敏感性試驗(yàn)結(jié)果。在該實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)蛋白酶耐受 性與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)。對(duì)于Tn3支架，與嗜熱菌蛋白酶溫育最低10分鐘導(dǎo)致降解。與嗜 熱菌蛋白酶溫育1小時(shí)后，Τη3支架完全降解。含Tn3ss4的支架在完整的16小時(shí)過(guò)程中顯 示嗜熱菌蛋白酶耐受性，提示穩(wěn)定性高于Tn3支架。圖10Η. Tn3ss4 二硫鍵工程改造支架顯示高解鏈溫度(Tm).該圖描述了比較Tn3支 架(虛線)與含二硫鍵Tn3ss4支架(實(shí)線)的熱穩(wěn)定性研究結(jié)果。如解鏈曲線所示，Tn3ss4 支架顯示解鏈溫度(約71°C)高于Tn3支架(約45°C，也參見圖3Α)。圖101. Tn3ss4 二硫鍵工程改造的支架存在單體狀態(tài).該圖描述了 Tn3ss4支架的尺 寸排阻層析/多角度光散射(SEC-MALS)分析曲線。該數(shù)據(jù)顯示純化的Tn3ss4支架存在單 體狀態(tài)，在線光散射檢測(cè)器測(cè)定到約llkDa。圖10J.純化的Tn3SS3+4 二硫鍵工程改造支架的RP-HPLC色譜.該圖描述了純化后、 還原后和重折疊形成二硫鍵后Tn3SS3+4的反相HPLC色譜圖。曲線顯示了支架內(nèi)所含半胱氨 酸在蛋白質(zhì)純化后僅部分氧化(上曲線)，通過(guò)DTT處理完全還原(中間曲線)和重折疊后 完全氧化成兩個(gè)二硫鍵(下曲線)。圖10K.含雙二硫鍵的支架Tn3SS3+4顯示高穩(wěn)定性水平.該圖顯示比較Tn3 (野生 型)支架(圓圈)與含單二硫鍵的支架，Tn3ss4(正方形)與含雙二硫鍵的支架Tn3SS3+4(三 角形)的穩(wěn)定性的鹽酸胍變性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖中所示，與含有單重折疊二硫鍵的支架Tn3ss4 以及Tn3支架相比，重折疊的雙二硫鍵支架Tn3SS3+4顯示對(duì)胍介導(dǎo)變性的耐受性更強(qiáng)，因此， 更穩(wěn)定。圖11A.超嗜熱生物的支架的表達(dá)和純化.此處顯示了表達(dá)和純化各種超嗜熱細(xì) 菌的預(yù)計(jì)支架(Tn3結(jié)構(gòu)基序)的考馬斯染色PAGE凝膠。將所有預(yù)計(jì)的支架表達(dá)和純化至 均一。在該圖中，T表示總細(xì)胞裂解液，S表示可溶性裂解液部分，P表示純化的蛋白質(zhì)。圖11B.海葡萄嗜熱菌的支架顯示高水平的熱穩(wěn)定性.該圖描述了海葡萄嗜熱菌 的支架的熱穩(wěn)定性。重組表達(dá)、純化推定的支架，并對(duì)其進(jìn)行熱穩(wěn)定性測(cè)試。如圖中所示， 海葡萄嗜熱菌的支架顯示高解鏈溫度(PH 7. 0時(shí)約83°C )。圖11C.硫化葉菌的支架顯示高水平的穩(wěn)定性.該圖描述了硫化葉菌的支架的熱 穩(wěn)定性。重組表達(dá)、純化推定的支架，并利用示差掃描量熱器對(duì)其進(jìn)行熱穩(wěn)定性測(cè)試。如圖 中所示，硫化葉菌的支架顯示高解鏈溫度(pH 3. 0時(shí)約98°C )。該支架還在pH 7. 0時(shí)顯示 高水平的穩(wěn)定性，然而其在高于75°C的溫度下凝聚并從溶液中沉淀。
圖11D.海葡萄嗜熱菌的支架顯示高水平的穩(wěn)定性.該圖描述了鹽酸胍變性試驗(yàn) 的結(jié)果，證明海葡萄嗜熱菌的支架的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性高。如圖中所示，支架解折疊需要高濃度 鹽酸胍(胍濃度是5. OM時(shí)50%的分子解折疊)，從而證明高穩(wěn)定性。圖11E.硫化葉菌的支架顯示高水平的穩(wěn)定性.該圖描述了鹽酸胍變性試驗(yàn)的結(jié) 果，證明硫化葉菌的支架的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性高。蛋白質(zhì)解折疊與分子的相對(duì)熒光增加相關(guān)。如 圖中所示，PH 7.0(圓圈)或Ph 3.0(正方形)時(shí)解折疊需要高濃度的胍-HC1，從而證明高 穩(wěn)定性。圖11F.海葡萄嗜熱菌的支架顯示高水平的蛋白酶耐受性.該圖描述了檢測(cè)海葡 萄嗜熱菌的支架的穩(wěn)定性的蛋白酶敏感性試驗(yàn)結(jié)果。在該實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)蛋白酶耐受性與蛋 白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)。對(duì)于該支架，與嗜熱菌蛋白酶溫育10分鐘導(dǎo)致低水平的降解，其在該時(shí) 期維持穩(wěn)定。海葡萄嗜熱菌支架在整個(gè)16小時(shí)過(guò)程中顯示嗜熱菌蛋白酶耐受。圖11G.硫化葉菌的支架顯示高水平的蛋白酶耐受性.該圖描述了檢測(cè)硫化葉菌 的支架的穩(wěn)定性的蛋白酶敏感性試驗(yàn)結(jié)果。在該實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)蛋白酶耐受性與蛋白質(zhì)穩(wěn)定 性相關(guān)。硫化葉菌支架在整個(gè)16小時(shí)過(guò)程中顯示嗜熱菌蛋白酶耐受。圖11H.從宿主細(xì)胞純化海葡萄嗜熱菌的支架.該圖描述海葡萄嗜熱菌支架純化 中的一步。由于該支架顯示高水平的穩(wěn)定性，可能加熱含有重組支架的粗制大腸桿菌裂解 液以除去主要的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，而保留該支架。泳道1表示熱處理前的粗制裂解液。含 有粗制裂解液的PAGE凝膠的考馬斯染色顯示存在候選支架。70°C，熱處理粗制裂解液15 分鐘導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)大量喪失，而該支架完好保存(泳道2)。圖111.從宿主細(xì)胞純化海葡萄嗜熱菌的支架.該圖描述海葡萄嗜熱菌支架純化 中的一步。由于該支架顯示高水平的穩(wěn)定性，可能加熱含有重組支架的粗制大腸桿菌裂解 液以降解主要的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，而保留該支架。泳道1表示蛋白酶處理前的粗制裂解液。 含有粗制裂解液的PAGE凝膠的考馬斯染色顯示存在該支架。55°C，蛋白酶處理粗制裂解液 45分鐘導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)大量喪失，而該支架完好保存(泳道2)。圖11J.從宿主細(xì)胞純化硫化葉菌的支架.該圖描述了硫化葉菌支架的純化。由 于該支架顯示高水平的穩(wěn)定性，可能在PH 3. 0溫育含有重組支架的粗制裂解液并將溫度 升高至70°C，持續(xù)15分鐘以除去主要的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，而保留可溶性支架。泳道1表示 酸或熱處理前的粗制大腸桿菌裂解液。泳道2表示將粗制裂解液的pH降低至3. 0后保留 的可溶性蛋白質(zhì)。泳道3表示將pH降低至3. 0和在70°C溫育15分鐘后的可溶性蛋白質(zhì)。 在這些處理中支架耐受并維持在溶液中。圖12. SynBPOl與SYNAGIS 結(jié)合所需的兩個(gè)環(huán).該圖描述了 SynBPOl及其變體 與結(jié)合于平板的SYNAGIS 的結(jié)合情況。在該實(shí)驗(yàn)中，將SynBPOl的BC和TO環(huán)轉(zhuǎn)移至野 生型支架，從而產(chǎn)生SynBPOl的單環(huán)變體。對(duì)這些變體(僅稱為BC和TO)進(jìn)行基于ELISA 的試驗(yàn)，在該試驗(yàn)中它們顯示不結(jié)合與平板結(jié)合的SYNAGIS 。作為對(duì)照，ELISA試驗(yàn)方式 中存在SynBPOl結(jié)合。此外，SynBPOl上存在SS4 二硫鍵突變。稱為SynBP01SS4的該變體 在ELISA中不顯示與結(jié)合于平板的SYNAGIS 有任何結(jié)合。圖13.通過(guò)BIAcore測(cè)定TRAIL-R2特異性克隆5E5的結(jié)合親和力.該圖描述了 克隆5E5對(duì)結(jié)合于芯片的TRAIL-R2的親和力測(cè)定。測(cè)定的Kd約為700nM。圖14.多個(gè)TRAIL-R2特異性克隆顯示的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合.該圖中描述了各種TRAIL-R2特異性支架的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。測(cè)試了兩個(gè)TRAIL-R2特異性克隆，5E5和 7G11與展示在噬菌體上的其它TRAIL-R2特異性克隆的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。5E5與本身和除2H6 和7G11以外的所有其它克隆競(jìng)爭(zhēng)。7G11只與本身和2H6競(jìng)爭(zhēng)。該數(shù)據(jù)表明有兩組克隆識(shí) 別TRAIL-R2上的兩個(gè)不同表位。圖15.各種TRAIL-2特異性克隆的競(jìng)爭(zhēng).該圖中描述了各種TRAIL-R2特異性支架 的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。測(cè)試了 5種TRAIL-R2特異性克隆，1E3、1G11、2B4、1C12和2D3 與展示在噬菌體上的其它TRAIL-R2特異性克隆的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。1E3、1C12和2D3與除8B3 和7G11以外的大多數(shù)噬菌體展示克隆競(jìng)爭(zhēng)。可溶性IGll不與噬菌體展示的任何克隆競(jìng)爭(zhēng)， 2B4在大多數(shù)情況下顯示低到中等的抑制作用。該數(shù)據(jù)提示1E3、1C12和2D3識(shí)別TRAIL-R2 上的相同表位。圖16. TRAIL-R2結(jié)合劑抑制細(xì)胞活力.該圖描述了當(dāng)與抗-HIS標(biāo)簽抗體和抗小 鼠IgG以2 1 0.5的摩爾比形成復(fù)合物時(shí)，Colo-205細(xì)胞系對(duì)5E5、7Gll、lC12、2D3和 1E3處理的敏感性。通過(guò)將用TRAIL-R2結(jié)合克隆處理的試驗(yàn)信號(hào)表示為用不結(jié)合TRAIL-R2 的對(duì)照Tn3處理細(xì)胞獲得信號(hào)的百分比而獲得活細(xì)胞百分比。圖17Α.表示多價(jià)Τη3-融合蛋白例子的圖.二價(jià)構(gòu)建物表示融合于抗體Fc區(qū)的 Τη3，而四價(jià)構(gòu)建物將Τη3與重鏈恒定區(qū)合伙輕鏈C κ區(qū)融合。圖17Β.顯示多價(jià)Τη3-融合蛋白中蛋白質(zhì)模塊連接鍵的圖.i)在Fc融合構(gòu)建物 中，N-末端Tn3模塊通過(guò)肽接頭和IgGl的絞鏈區(qū)連接于IgGl的Fc區(qū)。接頭序列的長(zhǎng)度 和組成可以不同，但在實(shí)施例16中是-GA-基序。ii)在Ck融合構(gòu)建物中，N-末端Tn3模 塊通過(guò)肽接頭連接于抗體κ輕鏈的恒定區(qū)。接頭序列的長(zhǎng)度和組成可以不同，但在實(shí)施例 16中是-GGGTPT-基序。iii)在IGHGl融合構(gòu)建物中，N-末端Tn3模塊通過(guò)肽接頭連接于 IgGl重鏈的恒定區(qū)。接頭序列的長(zhǎng)度和組成可以不同，但在實(shí)施例16中是-GGGTPT-基序。圖18.表達(dá)多價(jià)Τη3構(gòu)建物.該圖代表還原性SDS-PAGE，其顯示A蛋白純化后二 價(jià)Τη3構(gòu)建物(實(shí)施例1-3)，和四價(jià)Τη3構(gòu)建物(實(shí)施例4_7)的相對(duì)大小。樣品編號(hào)對(duì)應(yīng) 于表10所示那些。表達(dá)的所有構(gòu)建物通過(guò)該分析顯示預(yù)計(jì)的大小。圖19. Τη3單體和多聚體的結(jié)合親和力.該圖描述了利用單價(jià)、二價(jià)和四價(jià)1C12 和DlTn3構(gòu)建物獲得的生物傳感器結(jié)合實(shí)驗(yàn)的傳感器圖。將TRAIL-R2-FC融合蛋白固定在 傳感器芯片上，將樣品蛋白質(zhì)注射在該芯片上。“四”指四價(jià)Ck/IGHGl融合構(gòu)建物。1C12 構(gòu)建物顯示與TRAIL-R2結(jié)合改善與化合價(jià)呈函數(shù)關(guān)系，而對(duì)照Dl構(gòu)建物不顯示結(jié)合。圖20.靶向TRAIL-R2的二價(jià)Tn3構(gòu)建物的作用.該圖描述了用㈧二價(jià)形式的 TRAIL-R2特異性Τη3結(jié)合物1C12或⑶加入或未加入交聯(lián)抗體(抗-人Fe)的二價(jià)形式 非特異性Τη3結(jié)合物處理的Η2122細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線。與對(duì)照非結(jié)合物相比，TRAIL-R2 特異性結(jié)合物在試驗(yàn)中顯示溫和活性，該活性在第二抗體存在下降低。圖21.靶向TRAIL-R2的四價(jià)Τη3構(gòu)建物的作用.該圖描述了用㈧單特異性四 價(jià)形式的TRAIL-R2特異性Τη3結(jié)合物1C12或⑶加入或未加入交聯(lián)抗體(抗-人Fe)的 單特異性四價(jià)形式的非特異性Τη3結(jié)合物處理的Η2122細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線。與對(duì)照非結(jié) 合物相比，TRAIL-R2特異性結(jié)合物在試驗(yàn)中顯示有活性，該活性在第二抗體存在下略微降 低。圖22.靶向TRAIL-R2的多特異性四價(jià)Τη3構(gòu)建物的作用.該圖描述了用㈧雙特異性四價(jià)形式的TRAIL-R2特異性Tn3結(jié)合物1C12和2D3 (1C12融合于IgGl重鏈的恒定 區(qū)，2D3融合于Ck結(jié)構(gòu)域)或(B)加入或未加入交聯(lián)抗體(抗-人Fe)的雙特異性四價(jià) 形式的TRAIL-R2特異性結(jié)合物2D3和1C12(2D3融合于IgGl重鏈的恒定區(qū)，1C12融合于 Ck結(jié)構(gòu)域)處理的H2122細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線。與對(duì)照非結(jié)合物相比(如圖21所示)， TRAIL-R2特異性結(jié)合物在試驗(yàn)中顯示有活性，該活性在第二抗體存在下增加。圖23. pSec構(gòu)建物的設(shè)計(jì).(A)表示pSeC-0ppA-Tn3的開放讀框的氨基酸序列。 分泌入周質(zhì)空間后，oppA信號(hào)肽(下劃線所示)SEQ ID N0:227被切割。oppA信號(hào)肽內(nèi)的 倒數(shù)第二個(gè)殘基(斜體字顯示)突變成pSeC-0ppA(L25M)-Tn3衍生物中的甲硫氨酸以引入 NcoI克隆位點(diǎn)。(B)描述了 pSec-0ppA(L25M)-Tn3構(gòu)建物，顯示了該構(gòu)建物內(nèi)啟動(dòng)子、信號(hào) 肽、Tn3和His標(biāo)簽?zāi)K的配置。圖24.制備分泌的Tn3構(gòu)建物.(A)表示分泌Τη3的大腸桿菌粗制培養(yǎng)液和周質(zhì) 組分的SDS-PAGE分析。(B)表示從大腸桿菌培養(yǎng)液純化的Τη3支架的SDS-PAGE分析。(C) 表示從大腸桿菌培養(yǎng)液純化的Τη3的HPLC分析。DTT處理后保留時(shí)間的漂移與二硫鍵的存
在一致。圖25. SYNAGIS -Fc 二價(jià)結(jié)合物的SDS-PAGE.該圖顯示了與Fc區(qū)融合的 SynBPOl支架的還原性(泳道1)和非還原性(泳道2) SDS-PAGE分析。這些結(jié)果證明融合 的大小正確，還可能表示二聚化。圖26. SYNAGIS "Fe 二價(jià)結(jié)合物與SynBPOl的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析.SynBPOl與 SynBPOl-Fc的競(jìng)爭(zhēng)性BIAcore分析。簡(jiǎn)言之，通過(guò)胺偶連將SYNAGIS 固定在CM5傳 感器芯片表面。以75微升/分鐘的流速注射IyM濃度的SynBPOl或SynBPOl-Fc。二價(jià) SynBPOI-Fc構(gòu)建物顯示親和力高于單結(jié)構(gòu)域結(jié)合物。圖27.可將Tn3支架偶聯(lián)于PEG. (A)固定化金屬親和柱純化STn3 (CTC)(泳道 1-4)和馬來(lái)酰亞胺衍生PEG處理后(陽(yáng)離子交換層析之前)的純化STn3(CTC)(泳道5) 的SDS-PAGE分析。泳道1 表達(dá)STn3 (CTC)的細(xì)胞的總細(xì)胞裂解液；泳道2 =IMAC柱的流出 物；泳道3 IMAC柱的洗滌部分；泳道4 :STn3 (CTC)，未PEG化；泳道5 =PEG化的STn3 (CTC)。 (B)從SP XL陽(yáng)離子交換柱純化的PEG化STn3 (CTC)的SDS-PAGE分析。柱梯度組分示于泳 道 1-5。圖28. AB、⑶和EF環(huán)顯示環(huán)長(zhǎng)度多樣性.獲得103Fn3序列各自的ABjD和EF環(huán) 的長(zhǎng)度，利用該數(shù)據(jù)產(chǎn)生所示的環(huán)長(zhǎng)度頻率分布。對(duì)于任何給定的環(huán)，所有長(zhǎng)度的頻率總和 等于103，所分析序列的數(shù)量。圖29.測(cè)定不同pH和離子強(qiáng)度下Tn3的解鏈溫度.這些圖顯示通過(guò)示差掃描量 熱器測(cè)定PH 7. 0 (20mM磷酸鈉緩沖液)(A)、pH 5. 0 (20mM乙酸鈉緩沖液)(B)和pH 7. 0的 高鹽緩沖液中(含1.0M鹽的20mM磷酸鈉緩沖液)(C)Tn3支架的熱解鏈溫度。有高離子強(qiáng) 度存在下，測(cè)定的Tn3的Tm是pH 7. 0時(shí)約45°C，pH 5. 0時(shí)52°C，pH 7. 0時(shí)55°C。反復(fù)掃 描(黃色的)PH 7.0樣品顯示在這些條件下熱解鏈可逆。pH 5. 0時(shí)Tn3的熱解鏈?zhǔn)强赡?的。圖30Α.設(shè)計(jì)Τη3的荷電突變體.顯示了 Τη3三維結(jié)構(gòu)的代表性草圖(pdb代碼 lten)。顯示了 SEQ ID 1的殘基8_90，其中所有Asp和Glu殘基的側(cè)鏈以黃色和白色顯示。 設(shè)計(jì)了一組8個(gè)突變體，其中用Asn或Gln替代以黃色顯示的Asp和Glu殘基。如SEQ ID1編號(hào)殘基。圖30B.純化的Tn3重組荷電突變體的SDS-PAGE分析.各純化蛋白質(zhì)的等份試樣 進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。為進(jìn)行比較，在同一凝膠的不同泳道中對(duì)野生型蛋白質(zhì)進(jìn)行電 泳，顯示遷移率與各種荷電突變體相似。圖31Α.穩(wěn)定Τη3突變的加和性.產(chǎn)生一系列Τη3點(diǎn)突變，其中各Asp或Glu殘基替代為Asn或Gin。此處顯示了利 用固有熒光檢測(cè)蛋白質(zhì)解折疊的脲變性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在該實(shí)驗(yàn)中，與野生型Tn3支架相比，8 種Τη3支架荷電突變體中的5種(E33Q、D49N、E52Q、D53N、E86Q)需要較高濃度的脲來(lái)實(shí)現(xiàn)
解折疊。圖31B.荷電突變的組合導(dǎo)致Tn3穩(wěn)定性的加和改進(jìn).將提高野生型Τη3穩(wěn)定性的Asp或Glu殘基的點(diǎn)突變組合成Τη3的雙或三突變。 組合Τη3突變體(E33Q/D49N、D49N/E86Q和E33Q/D49N/E86Q)各自顯示穩(wěn)定性高于任何相 應(yīng)的點(diǎn)突變體或野生型Τη3。圖32.野生型和荷電工程改造Τη3支架的解鏈溫度測(cè)定.該圖顯示通過(guò)示差掃描 量熱法檢測(cè)Τη3支架變體在ρΗ 7.0時(shí)的熱解鏈曲線。對(duì)于野生型Tn3 (A)，測(cè)定的Tm是約 45°C，對(duì)于 E33Q/D49N Tn3 (B)是 50°C，對(duì)于 D49N/E86Q Tn3 (C)是 52°C，對(duì)于 E33Q/D49N/ E86Q Tn3 (D)是 52°C。6.詳述本文所述的蛋白質(zhì)支架設(shè)計(jì)成優(yōu)于抗體衍生的片段和非抗體框架。本發(fā)明支架勝 過(guò)抗體片段的主要優(yōu)點(diǎn)是結(jié)構(gòu)。這些支架衍生自人體液蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的完整、穩(wěn)定和可溶 性結(jié)構(gòu)模塊以及衍生自自然界的其它來(lái)源(量熱，但不限于嗜熱細(xì)菌)。因此，它們顯示優(yōu) 于抗體片段的折疊和熱穩(wěn)定特性，而抗體片段的產(chǎn)生包括除去抗體天然折疊的部分，從而 通常暴露完整抗體中包埋在疏水環(huán)境中的氨基酸殘基，例如可變區(qū)和恒定區(qū)之間的界面。 這種疏水性殘基暴露于溶劑增加了凝聚的可能性。此外，本發(fā)明支架提供抗體分子的功能優(yōu)點(diǎn)。具體地說(shuō)，雖然支架不是免疫球蛋 白，但它的總體折疊接近IgG重鏈可變區(qū)的折疊，從而其可能在相對(duì)取向上以抗體CDR的類 似方式展示其三個(gè)環(huán)。由于該結(jié)構(gòu)，本發(fā)明支架具有類似于天然的抗原結(jié)合特性和類似于 抗體的親和力。因此，可在體外采用類似于體內(nèi)抗體親和力成熟方法的環(huán)隨機(jī)化和改組方案。6. IFnIII 結(jié)構(gòu)基序本發(fā)明支架依據(jù)III型纖連蛋白模塊(FnIII)，一種在哺乳動(dòng)物血液和結(jié)構(gòu)蛋 白中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)域常見于迄今為止測(cè)序的蛋白質(zhì)，包括纖連蛋白、結(jié) 合腕蛋白、胞內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞因子受體和原核生物酶(Bork和Doolittle，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :8990，1992 ；Bork 等，Nature Biotech. 15 :553，1997 ；Meinke 等， J. Bacteriol. 175 :1910，1993 ；Watanabe 等，J. Biol. Chem. 265 15659，1990)。雖然該結(jié)構(gòu) 域在自然界中多次出現(xiàn)，其氨基酸序列差異很大。具體地說(shuō)，這些支架包括結(jié)合腕蛋白C的 第三FnIII結(jié)構(gòu)域(也稱為“Tn3”結(jié)構(gòu)域)。該結(jié)構(gòu)域的總體折疊極其接近最小功能性抗 體片段(即，重鏈的可變區(qū))的，其包含駱駝和羊駝IgG的完整抗原識(shí)別單位。此外，Τη3結(jié)構(gòu)域具有耐受隨機(jī)化的暴露環(huán)序列，從而有助于產(chǎn)生能以高親和力結(jié)合特異性靶標(biāo)的各種蛋白支架庫(kù)。這些蛋白質(zhì)支架可用于設(shè)計(jì)能實(shí)質(zhì)性結(jié)合任何感興趣化合物的蛋白質(zhì)(例如，任 何蛋白質(zhì))。具體地說(shuō)，基于本文所述Tn3結(jié)構(gòu)基序的分子可用作支架，其經(jīng)設(shè)計(jì)的定向進(jìn) 化(directed evolution)使得類似于抗體可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)的一個(gè)或多個(gè)環(huán)隨 機(jī)化。這種定向進(jìn)化方法產(chǎn)生對(duì)感興趣抗原具有高親和力的抗體-樣分子。此外，本文所 述支架可用于展示指定的暴露環(huán)(例如，以前依據(jù)抗原結(jié)合隨機(jī)化和選擇的環(huán))來(lái)指導(dǎo)結(jié) 合這種引入的環(huán)的分子的進(jìn)化?？蛇M(jìn)行該類選擇以鑒定各CDR-樣環(huán)或識(shí)別組合在非線形 表位結(jié)合部分中的兩個(gè)或所有三個(gè)CDR-樣環(huán)的識(shí)別分子。對(duì)應(yīng)于IgG重鏈抗原結(jié)合環(huán)的一組Tn3的三個(gè)環(huán)從氨基酸殘基23到31 (BC)、50 到56 (DE)和75到84 (FG)。BC、DE和FG環(huán)的長(zhǎng)度分別是9、6和10個(gè)殘基，落在抗體重鏈 中發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)抗原識(shí)別環(huán)的狹窄范圍內(nèi)，即分別是7-10、4-8和4-28殘基長(zhǎng)度?；蛘?，在另 一實(shí)施方式中，BC、DE和TO環(huán)可以分別從氨基酸殘基23到31、51到56和75到84。因此， 一旦為高抗原親和力作了隨機(jī)化和選擇，這些環(huán)可與抗原接觸，等于抗體中相應(yīng)環(huán)的接觸。 Tn3結(jié)構(gòu)域的AB、CD和EF環(huán)還可共享該特性，因此，也可用于為高抗原親和力作隨機(jī)化和 選擇。該方法可與BC、DE和re環(huán)的隨機(jī)化平行或串聯(lián)進(jìn)行。在具體的實(shí)施方式中，依據(jù)人結(jié)合腕蛋白C的Tn3結(jié)構(gòu)域的支架的一個(gè)或多個(gè)環(huán) 區(qū)域包含以下氨基酸殘基I. AB 環(huán)內(nèi)所含的 12-17 ；II. BC 環(huán)內(nèi)所含的 23-31 ；III. CD 環(huán)內(nèi)所含的 39-45 ；IV. DE 環(huán)內(nèi)所含的 50-56 ；V. EF環(huán)內(nèi)所含的60-66 ；和VI. FG 環(huán)所含的 75-84。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、 至少5個(gè)或至少6個(gè)環(huán)，其中環(huán)包含SEQ ID NO :201、202、203、204、205或206所示氨基酸 序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含具有SEQ ID NO: 201所示氨基酸序列的AB環(huán)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含具有SEQ ID NO :202所示氨基酸序列的BC環(huán)。在另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含具有SEQ ID NO :203所示氨基酸序列的⑶環(huán)。在另一實(shí)施方 式中，本發(fā)明支架包含具有SEQ ID NO: 204所示氨基酸序列的DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明支架包含具有SEQ ID NO :205所示氨基酸序列的EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 支架包含具有SEQ ID NO :206所示氨基酸序列的TO環(huán)。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架 包含具有SEQ ID NO :201所示氨基酸序列的AB環(huán)，具有SEQ ID NO :202所示氨基酸序列的 BC環(huán)，具有SEQ IDNO :203所示氨基酸序列的⑶環(huán)，具有SEQ ID NO 204所示氨基酸序列 的DE環(huán)，具有SEQ ID NO 205所示氨基酸序列的EF環(huán)，和具有SEQ ID NO: 206所示氨基酸 序列的re環(huán)。在另一具體實(shí)施方式
中，依據(jù)人結(jié)合腕蛋白C的Tn3結(jié)構(gòu)域的支架的一個(gè)或多個(gè) 環(huán)區(qū)域包含以下氨基酸殘基I. AB 環(huán)內(nèi)所含的 11-17 ；II. BC 環(huán)內(nèi)所含的 23-31 ；
III. CD 環(huán)內(nèi)所含的 39-45 ；IV. DE 環(huán)內(nèi)所含的 51-56 ；V. EF環(huán)內(nèi)所含的60-67 ；和VI. FG 環(huán)所含的 75-84。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、 至少5個(gè)或至少6個(gè)環(huán)，其中環(huán)包含SEQ ID NO :207、202、203、208、209或206所示氨基酸 序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含具有SEQ ID NO: 207所示氨基酸序列的AB環(huán)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含具有SEQ ID NO :202所示氨基酸序列的BC環(huán)。在另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含具有SEQ ID NO :203所示氨基酸序列的⑶環(huán)。在另一實(shí)施方 式中，本發(fā)明支架包含具有SEQ ID NO: 208所示氨基酸序列的DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明支架包含具有SEQ ID NO :209所示氨基酸序列的EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 支架包含具有SEQ ID NO :206所示氨基酸序列的TO環(huán)。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架 包含具有SEQ ID NO :207所示氨基酸序列的AB環(huán)，具有SEQ ID NO :202所示氨基酸序列的 BC環(huán)，具有SEQ IDNO 203所示氨基酸序列的⑶環(huán)，具有SEQ ID NO 208所示氨基酸序列 的DE環(huán)，具有SEQ ID NO 209所示氨基酸序列的EF環(huán)，和具有SEQ ID NO: 206所示氨基酸 序列的re環(huán)。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含的環(huán)區(qū)域是SEQ ID NO: 1-32或68-88中任一 所示同源環(huán)區(qū)域的變體。本發(fā)明提供重組的、非天然產(chǎn)生的多肽支架，其包含連接于多個(gè)衍生自天然產(chǎn)生 蛋白質(zhì)序列的環(huán)區(qū)域序列的多個(gè)β鏈結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)或多個(gè)所述環(huán)區(qū)域序列因天然產(chǎn) 生蛋白質(zhì)序列中相應(yīng)環(huán)序列的至少一個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加而有所不同，其中所述 多肽支架的β鏈結(jié)構(gòu)域與天然產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域序列有至少50%同源性。例 如，這種氨基酸序列可以是但不限于SEQID N0:l-32、60-88和210中的任一種。在另一具 體實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含人結(jié)合腕蛋白C的Τη3結(jié)構(gòu)域的序列。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明支架包含與人結(jié)合腕蛋白C的Τη3結(jié)構(gòu)域有至少50%同源性的序列。在進(jìn)一步的實(shí) 施方式中，與Τη3結(jié)構(gòu)域的所述同源性是至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少99 %或更高。在其它實(shí)施方式中，所 述天然產(chǎn)生的序列是對(duì)應(yīng)于人結(jié)合腕蛋白C的額外Τη3結(jié)構(gòu)基序的蛋白質(zhì)序列。在其它實(shí) 施方式中，所述天然產(chǎn)生的序列是對(duì)應(yīng)于另一結(jié)合腕蛋白，或者另一生物(例如但不限于， 鼠、豬、?；蝰R結(jié)合腕蛋白)的結(jié)合腕蛋白的Τη3結(jié)構(gòu)基序的蛋白質(zhì)序列。雖然Τη3代表用于產(chǎn)生抗體模擬物的支架，但其它分子可取代本文所述分子中的 Τη3。這些包括但不限于動(dòng)物和原核生物的相關(guān)Τη3結(jié)構(gòu)基序。此外，還可利用其它蛋白質(zhì) 的Τη3結(jié)構(gòu)基序。不同生物和母體蛋白質(zhì)的模塊可能最適合于不同應(yīng)用；例如在設(shè)計(jì)低ρΗ 下穩(wěn)定的支架中，從優(yōu)選在低PH下生長(zhǎng)的生物(例如但不限于硫化葉菌)產(chǎn)生蛋白質(zhì)是最 理想的。在另一實(shí)施方式中，可從超嗜熱細(xì)菌，例如但不限于閃爍古生球菌和海葡萄嗜熱菌 鑒定并利用相關(guān)Τη3結(jié)構(gòu)基序，二者各自顯示在大于70°C時(shí)生長(zhǎng)最佳。在其它實(shí)施方式中， 天然產(chǎn)生的序列對(duì)應(yīng)于嗜熱生物的預(yù)測(cè)Tn3結(jié)構(gòu)基序，例如但不限于閃爍古生球菌、海葡 萄嗜熱菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌和硫化葉菌。在還有另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 支架具有的蛋白質(zhì)序列與對(duì)應(yīng)于上述嗜熱生物的Τη3結(jié)構(gòu)基序或預(yù)測(cè)的Τη3結(jié)構(gòu)基序的任一序列具有至少30 %、至少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至 少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少99 %的同 源性。在一些實(shí)施方式中，可從SEQ ID NO :2-4和68-88所示氨基酸序列選擇嗜熱生物的 Tn3結(jié)構(gòu)基序。本發(fā)明還提供含7個(gè)以上的多個(gè)β鏈的本發(fā)明支架。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明 支架包含多個(gè)，至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)或更多個(gè)β鏈。本發(fā)明還提供含6個(gè)以上的多個(gè)環(huán)區(qū)域的本發(fā)明支架。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā) 明支架包含多個(gè)，至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)或更多個(gè)環(huán)區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈，其中所述β鏈從N-末端向 C-末端稱為Α、B、C、D、E、F和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈， 各鏈由環(huán)區(qū)域隔開，其中所述環(huán)區(qū)域從N-末端向C-末端稱為AB、BC、CD、DE、EF和TO環(huán)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含少于7個(gè)β鏈，各鏈由環(huán)區(qū)域隔開。在另一實(shí)施方式 中，本發(fā)明支架包含少于7個(gè)β鏈，各鏈由環(huán)區(qū)域隔開。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、 至少5個(gè)、至少6個(gè)或至少7個(gè)β鏈，其中所述β鏈包含選自SEQ ID NO 228-234的氨基 酸序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱 為A-G，其中所述A鏈包含SEQ ID Ν0:228所示序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架 包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述B鏈包含SEQ ID NO 229所 示序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱 為A-G，其中所述C鏈包含SEQ ID Ν0:230所示序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架 包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述D鏈包含SEQ ID NO 231所 示序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱 為A-G，其中所述E鏈包含SEQ ID Ν0:232所示序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架 包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述F鏈包含SEQ ID NO 233所 示序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱 為A-G，其中所述G鏈包含SEQ ID Ν0:234所示序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架 包含具有SEQ ID NO 228所示序列的A鏈、具有SEQ ID NO 229所示序列的B鏈、具有SEQ ID NO :230所示序列的C鏈、具有SEQ ID NO :231所示序列的D鏈、具有SEQ ID Ν0:232所 示序列的E鏈、具有SEQ ID NO 233所示序列的F鏈和具有SEQ ID NO 234所示序列的G 鏈。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、 至少5個(gè)、至少6個(gè)或至少7個(gè)β鏈，其中所述β鏈包含選自SEQ ID NO :235、229、230、 236、232、237和234的氨基酸序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β 鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述A鏈包含SEQ ID Ν0:235所示序列。在另一具 體實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述B 鏈包含SEQ ID NO :229所示序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈， 從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述C鏈包含SEQ ID Ν0:230所示序列。在另一具體 實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述D鏈 包含SEQ ID Ν0:236所示序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述E鏈包含SEQ ID N0:232所示序列。在另一具體 實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述F鏈 包含SEQID Ν0:237所示序列。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含至少7個(gè)β鏈，從 N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述G鏈包含SEQ ID Ν0:234所示序列。在另一具體實(shí)施 方式中，本發(fā)明支架包含具有SEQ ID NO :235所示序列的A鏈、具有SEQ ID NO :229所示 序列的B鏈、具有SEQ ID NO 230所示序列的C鏈、具有SEQ ID NO 236所示序列的D鏈、 具有SEQ ID NO :232所示序列的E鏈、具有SEQ ID NO :237所示序列的F鏈和具有SEQ ID NO 234所示序列的G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含與SEQ ID NO :1_32或68_99中任一所示同源 β鏈具有至少50%同源性的β鏈序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述同源性是至少55%、 至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至 少99%或更高。連接蛋白質(zhì)支架各鏈的環(huán)可作長(zhǎng)度和/或序列多樣性隨機(jī)化。在一個(gè)實(shí)施方式 中，本發(fā)明支架的至少一個(gè)環(huán)作長(zhǎng)度和/或序列多樣性隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 支架的至少一個(gè)環(huán)維持恒定，而至少一個(gè)額外的環(huán)作長(zhǎng)度和/或序列多樣性隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架文庫(kù)中環(huán)AB、CD和EF中至少一個(gè)維持恒定，而環(huán)BC、DE和TO中 至少一個(gè)作長(zhǎng)度和/或序列多樣性隨機(jī)化。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含具有以下共有序列的隨機(jī)化BC環(huán) S-X-a-X-b-X-X-X-G，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示脯氨酸或丙氨酸，其中(b)表示 丙氨酸或甘氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含具有以下共有序列的隨機(jī)化BC環(huán) Α-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G，其中X表示任何氨基酸，其中(d)表示脯氨酸、谷氨酸或賴氨 酸，其中(e)表示天冬酰胺或甘氨酸，和其中(f)表示絲氨酸或甘氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含BC環(huán)，其包含具有以下共有序列的11個(gè)氨 基酸S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G，其中X表示任何氨基酸，其中(c)表示脯氨酸、絲氨酸或甘 氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含具有以下共有序列的隨機(jī)化re環(huán) X-a-X-X-G-X-X-X-S，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、蘇氨酸或賴氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含具有以下共有序列的隨機(jī)化re環(huán) X-a-X-X-X-X-b-N-P-A，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、蘇氨酸或賴氨酸， 和其中(b)表示絲氨酸或甘氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含具有以下共有序列的隨機(jī)化re環(huán) X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、蘇氨酸或賴氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明文庫(kù)包含具有DE環(huán)的支架，該環(huán)包含6個(gè)殘基，并經(jīng) 隨機(jī)化而含有以下共有序列x-x-x-x-x-x，其中X表示任何氨基酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含含有7個(gè)殘基的AB環(huán)，該環(huán)經(jīng)隨機(jī)化而含 有以下共有序列K-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸、異亮氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中(a)表示絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含含有9個(gè)殘基的AB環(huán)，該環(huán)經(jīng)隨機(jī)化而含 有以下共有序列K-X-X-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸、 異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中(a)表示絲氨 酸、蘇氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含含有7、8或9個(gè)殘基的⑶環(huán)，其中⑶環(huán)中 各殘基經(jīng)隨機(jī)化，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含含有8個(gè)殘基的EF環(huán)，該環(huán)經(jīng)隨機(jī)化而含 有以下共有序列X-b-L-X-P-X-c-X，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸、異 亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中(b)表示天冬酰 胺、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸，和其中(c)表示異亮氨酸、蘇氨酸、絲氨 酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明支架可包含約75-約500、約75-約200、約75-約100、 約75-約250或約75-約150個(gè)氨基酸。6. 2基于二硫鍵工程改造的支架的蛋白質(zhì)為增加本發(fā)明支架的穩(wěn)定性，采用生物信息學(xué)方法鑒定適于二硫鍵工程改造的候 選位置。然而，通過(guò)手工檢查蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)鑒定毗鄰的候選殘基對(duì)進(jìn)行二硫鍵設(shè)計(jì)常因該 類鍵所要求的嚴(yán)格幾何約束性而沒(méi)有效果(參見Dombkowski，Bioinformatics (生物信息 學(xué))第19卷第14號(hào)，2003 1852-1853)。因此，本發(fā)明提供在通過(guò)熱耐受性，對(duì)離液變性作 用和蛋白酶處理檢測(cè)到穩(wěn)定性增加的位置具有工程改造的二硫鍵的支架。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)或 至少五個(gè)非天然產(chǎn)生的二硫鍵。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含至少一個(gè)非天然產(chǎn)生 的二硫鍵，其中所述至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的二硫鍵穩(wěn)定該支架。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 支架在兩個(gè)β鏈之間包含至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的二硫鍵。例如，所述至少一個(gè)非天然產(chǎn)生 的二硫鍵可在A鏈和B鏈之間，或在D鏈和E鏈之間，或在F鏈和G鏈之間，或在C鏈和F鏈 之間形成連接。在另一實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的二硫鍵在F鏈和G鏈之間 形成第一鍵，在C鏈和F鏈之間形成第二連接。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架在兩個(gè)環(huán)區(qū) 域之間包含至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的二硫鍵。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架在環(huán)區(qū)域和β 鏈之間包含至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的二硫鍵。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架在同一 β鏈內(nèi) 包含至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的二硫鍵。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架在同一環(huán)區(qū)域內(nèi)包含 至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的二硫鍵。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含至少一個(gè)非天然產(chǎn)生 的二硫鍵，其中該鍵位于兩個(gè)不同支架間。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含形成至少二個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)或更多個(gè) 支架的多聚支架(術(shù)語(yǔ)“多聚”定義為有至少二個(gè)或更多個(gè)支架結(jié)合)的二硫鍵。不難通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)檢測(cè)工程改造二硫鍵所致的穩(wěn)定性增加，例如熱(Tm) 和離液變性作用(例如，脲或胍)、蛋白酶處理(例如，嗜熱菌蛋白酶)或本領(lǐng)域接受的另 一穩(wěn)定性參數(shù)。用于檢測(cè)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的技術(shù)的綜述可見，例如"Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物學(xué)方法)〃和"CurrentProtocols in ProteinScience (最新蛋白質(zhì)科學(xué)方法)"，約翰威利父子公司(JohnWiley and Sons)出版，2007。在一個(gè)實(shí)施方式中，與二硫鍵工程改造前的同一支架相比，通過(guò)熱耐受性、對(duì)離液 變性作用、蛋白酶處理的耐受性或本領(lǐng)域熟知的另一穩(wěn)定性參數(shù)檢測(cè)到本發(fā)明的含二硫鍵 支架顯示穩(wěn)定性增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至 少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更多?？赏ㄟ^(guò)不同條件下蛋白質(zhì)所顯示的熒光水平檢測(cè)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。應(yīng)激下蛋白質(zhì) 的相對(duì)解折疊程度和蛋白質(zhì)顯示的固有熒光之間正相關(guān)。檢測(cè)熱特征的合適蛋白質(zhì)穩(wěn)定性 試驗(yàn)包括示差掃描量熱法(DSC)和圓二色性(⑶)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)顯示通過(guò)DSC或⑶檢測(cè)的參 數(shù)有相當(dāng)大漂移時(shí)，其與解折疊結(jié)構(gòu)相關(guān)，產(chǎn)生該漂移的溫度稱為解鏈溫度(Tm)。在一個(gè)實(shí) 施方式中，與相同實(shí)驗(yàn)條件下工程改造前的同一支架所顯示的相比，本發(fā)明的二硫鍵工程 改造支架顯示解鏈溫度(Tm)升高，至少高于45°C、至少高于50°C、至少高于55°C、至少高于 60°C、至少高于65°C、至少高于70°C、至少高于71°C、至少高于72°C、至少高于73°C、至少 高于74°C、至少高于75°C、至少高于76°C、至少高于77°C、至少高于78°C、至少高于79°C、 至少高于80°C、至少高于81°C、至少高于82°C、至少高于83°C、至少高于84°C、至少高于 851、至少高于851、至少高于861、至少高于871、至少高于881、至少高于891、至少高 于90°C、至少高于91°C、至少高于92°C、至少高于93°C、至少高于94°C、至少高于94°C、至 少高于95°C、至少高于96°C、至少高于97°C或至少高于98°C、或至少高于100°C、或至少高 于105°或至少高于110°、或至少高于120°。在另一實(shí)施方式中，與相同實(shí)驗(yàn)條件下二硫鍵工程改造前的同一支架相比，本發(fā) 明的二硫鍵工程改造支架顯示解鏈溫度(Tm)升高至少5%、至少10%、至少15%、至少 20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少 60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%或更聞。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的另一試驗(yàn)包括將蛋白質(zhì)接觸用于使蛋白質(zhì)內(nèi)相互作用失穩(wěn)定的 離液劑，量熱脲或胍(例如，胍-HCl或異硫氰酸胍)。蛋白質(zhì)接觸水平升高的脲或胍后，檢 測(cè)相對(duì)固有熒光來(lái)評(píng)估50%蛋白質(zhì)分子解折疊時(shí)的數(shù)值。該值稱為Cm值，表示蛋白質(zhì)穩(wěn)定 性的基準(zhǔn)值。Cm值越高，蛋白質(zhì)越穩(wěn)定。在一個(gè)實(shí)施方式中，與相似實(shí)驗(yàn)條件下在脲變性實(shí) 驗(yàn)中檢測(cè)的二硫鍵工程改造前的同一支架相比，本發(fā)明的二硫鍵工程改造支架顯示Cm升高 至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至 少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、或至少95%或更高。在另一實(shí)施方式中，與相似實(shí)驗(yàn)條件下在胍變性實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的二硫鍵工程改造 前的同一支架相比，本發(fā)明的二硫鍵工程改造支架顯示Cm升高至少5%、至少10%、至少 15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少 55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少
95%或更高。用于測(cè)試蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的另一試驗(yàn)是蛋白酶耐受性試驗(yàn)。在該試驗(yàn)中，蛋白質(zhì)穩(wěn) 定性的相對(duì)水平與一定時(shí)期內(nèi)對(duì)蛋白酶降解作用的耐受性相關(guān)。越耐受蛋白酶處理，蛋白質(zhì)越穩(wěn)定。在一個(gè)實(shí)施方式中，與相似實(shí)驗(yàn)條件下在蛋白酶耐受性實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的二硫鍵工 程改造前的同一支架相比，本發(fā)明的二硫鍵工程改造支架顯示穩(wěn)定性升高至少5%、至少 10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少 50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、或至少95%或更高。在一些例子中，優(yōu)選利用穩(wěn)定性降低的本發(fā)明支架，例如但不限于偶聯(lián)于細(xì)胞毒 素或放射性核素的支架。這種支架可能要求非特異性毒性相關(guān)的更快清楚速度。在一個(gè) 實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含二硫鍵，與工程改造前的支架相比，該二硫鍵使得該支架去穩(wěn) 定。在一個(gè)實(shí)施方式中，與相似實(shí)驗(yàn)條件下通過(guò)熱耐受、對(duì)離液變性作用、蛋白酶處理的耐 受性或本領(lǐng)域熟知的另一穩(wěn)定性參數(shù)檢測(cè)的二硫鍵工程改造前的同一支架相比，含有二硫 鍵的本發(fā)明支架顯示穩(wěn)定性降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至 少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%或更多。6. 3支架動(dòng)力學(xué)本發(fā)明提供特異性結(jié)合靶標(biāo)(例如，蛋白質(zhì))的支架。在一些實(shí)施方式中，所述靶 標(biāo)可以是，例如但不限于細(xì)胞表面抗原、可溶性抗原、固定抗原、免疫靜止抗原、胞內(nèi)抗原、 核內(nèi)抗原、自體抗原、非自體抗原、癌癥抗原、細(xì)菌抗原或病毒抗原。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明支架以特定的動(dòng)力學(xué)特異性結(jié)合靶標(biāo)。在一些實(shí)施 方式中，通過(guò)BIAcore 試驗(yàn)或本領(lǐng)域已知的其它試驗(yàn)檢測(cè)到本發(fā)明支架的結(jié)合率常數(shù) 或 k。n 比率(支架(Sc)+ 抗原(Ag) (k。n — Sc-Ag)為至少 IO5M-1 S-1、至少 1. 5X IO5MW至 少 2 X IO5M-1 S—1、至少 2. 5 X IO5IT1S人至少 5 X IO5IT1 s \ 至少 IO6M 1S \ 至少 5 X IO6M 1S \ 至 少IO7MW至少5X ΙΟΙ、—1、或至少IO8M-1 s-1、或者k。n比率為約IOV約IO8MW k。n比 率為約1. 5X IO5MY1-約IX IO7IT1 s入k。n比率為約2X IO5-約IX IO6MW k。n比率為約 4. 5 X IO5-約 5 X IO7M-1S^10在一些實(shí)施方式中，通過(guò)BIAcore 試驗(yàn)或本領(lǐng)域已知的其它試驗(yàn)檢測(cè)到本發(fā) 明支架的k。ff比率(支架(Sc) +抗原(AgkoffBSc-Ag)為小于ΙΟ、—1、小于δΧΙΟ、—1、 小于ICT4S入小于2X ICT4S人小于5X ICT4S人小于l(T5s人小于5Χ l(T5s人小于1 (T6S人小 于δΧΙΟ、—1、小于川 人小于日父川 人小于ΙΟ、—1、小于5X ΙΟ、—1、小于ΙΟ、—1、小于 sxio、-1、或小于 ο—1、—1、或 lo-s-io-^Vuotio、-1、或 lOH1。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明支架的親和力常數(shù)或Ka (k。n/k。ff)為至少IO2M4、 至少 5 X IO2IT1、至少 IO3IT1、至少 5 X IO3IT1、至少 IO4IT1、至少 5 X IO4IT1、至少 IO5IT1、 至少 5 X IO5IT1、至少 IO6IT1、至少 5 X IO6IT1、至少 IO7IT1、至少 5 X IO7IT1、至少 IO8IT1、至 少 5 X IO8IT1、至少 IO9IT1、至少 5 X IO9IT1、至少 IO10ITi、至少 5 X IO10ITi、至少 IO11ITi、至 少 5 X IO11ITi、至少 IO12IT1、至少 5 X IO12IT1、至少 IO13IT1、至少 5 X IO13IT1、至少 IO14IT1、 至少 5 X IO14IT1、至少 IO15IT1、或至少 5 X IO15IT1、或 102_5 X IO5IT1、IO4-I X IOiciIT1、或 IO5-IX IO8M-1.通過(guò)BIAcore 試驗(yàn)或本領(lǐng)域已知的其它試驗(yàn)檢測(cè)到本發(fā)明支架的Ka可以 是最多 ΙΟ、—1、最多 δΧΙ ΑΓ1、最多 ΙΟΙ—1、最多 5 X ΙΟΙ—1、最多 IO13M.1、最多 5 X IO13M.1、最 多 IO14M-1、或最多 5 X IO14MA在一些實(shí)施方式中，通過(guò)BIAcore 試驗(yàn)或本領(lǐng)域已知的其它試驗(yàn)檢測(cè)到本發(fā)明支架的解離常數(shù)或Kd(koff/kon)為小于10_5M、小于5 X 10_5M、小于10_6M、小于5 X 10_6M、 小于 1(Γ7Μ、小于 5X10〃、小于 1(Γ8Μ、小于 5Χ1(Γ8Μ、小于 1(Γ9Μ、小于 5Χ1(Γ9Μ、小于 1(Γ10Μ、 小于 5 X 1(Γ10Μ、小于 1(Γ"Μ、小于 5 X 1(Γ"Μ、小于 1(Γ12Μ、小于 5 X 1(Γ12Μ、小于 1(Γ13Μ、小于 5Χ1(Γ13Μ、小于 1(Γ14Μ、小于 5Χ1(Γ14Μ、小于 1(Γ15Μ、或小于 5 X 1(Γ15Μ。6. 4基于支架的結(jié)合蛋白的定向進(jìn)化本文所述的支架可用于開發(fā)新型或改善的靶標(biāo)結(jié)合蛋白的任何技術(shù)。在一個(gè)具體 實(shí)施例中，所述靶標(biāo)固定在固體支持物，例如柱樹脂或微量滴定板孔中，并且靶標(biāo)與基于支 架的候選結(jié)合蛋白文庫(kù)接觸。這種文庫(kù)可通過(guò)CDR-樣環(huán)的序列和/或長(zhǎng)度隨機(jī)化，由基 于Τη3基序的支架構(gòu)建的克隆構(gòu)成。在一個(gè)實(shí)施方式中，該文庫(kù)可以是噬菌體、噬菌粒、病 毒、細(xì)菌或酵母展示或核糖體展示文庫(kù)。如果需要，該文庫(kù)可以是通過(guò)，例如Szostak等， 美國(guó)專利號(hào)6，258，558Β1，美國(guó)專利號(hào)6，261，804Β1 ；美國(guó)專利號(hào)5，643，768和美國(guó)專利號(hào) 5，658，754所述的技術(shù)產(chǎn)生的RNA-蛋白質(zhì)融合文庫(kù)?；蛘?，其可以是DNA-蛋白質(zhì)文庫(kù)(例 如，Lohse 于 1998 年 12 月 2 日提交的 DNA-Protein Fusions and Uses Thereof (DNA-蛋 白質(zhì)融合及其應(yīng)用)，美國(guó)系列號(hào)60/110，549，目前放棄；和1999年12月2日提交的美國(guó) 系列號(hào)09/453，190所述)。在這點(diǎn)上，細(xì)菌噬菌體(噬菌體)展示是能篩選大寡肽文庫(kù)來(lái)鑒定那些文庫(kù)中能 特異性結(jié)合靶標(biāo)的成員的熟知技術(shù)。噬菌體展示是將變體多肽作為外殼蛋白的融合蛋白展 示在噬菌體顆粒表面上的技術(shù)(Scott, J. K.和Smith, G. P. (1990) Science 249 :386)。應(yīng) 用噬菌體展示是基于以下事實(shí)，可快速而有效地保存選擇性隨機(jī)化蛋白質(zhì)變體(或隨機(jī)克 隆的cDNA)的大文庫(kù)中以高親和力結(jié)合靶分子的那些序列?，F(xiàn)已采用在噬菌體上展示肽 (Cwirla, S. Ε.等，(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87 6378)或蛋白質(zhì)(Lowman，H.B.等， (1991)Biochemistry，3010832 ；Clackson, T.等(1991)Nature, 352624 ；Marks, J. D.等 (1991)，J. Mol. Biol.，222 581 ；Kang, A. S.等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 8363)文庫(kù)來(lái)篩選數(shù)百萬(wàn)的多肽或寡肽中具有特異性結(jié)合特性的那些(Smith，G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol.，2 :668)。分選隨機(jī)突變體的噬菌體文庫(kù)需要構(gòu)建和擴(kuò)增大量 變體的方案，這是利用靶標(biāo)受體的親和力純化方法和評(píng)估結(jié)合富集結(jié)果的手段(參見，例 如美國(guó)專利號(hào) 5，223，409，5，403，484，5，571，689 和 5，663，143)。雖然大多數(shù)噬菌體展示方法利用絲狀噬菌體，但λ形噬菌體展示系統(tǒng)(W0 95/34683 ；美國(guó)專利號(hào) 5，627，024)、Τ4 噬菌體展示系統(tǒng)(Ren 等，Gene, 215 439(1998)； Zhu 等，Cancer Research, 58 (15) :3209_3214 (1998) Jiang 等，Infection& Immunity, 65(11) 4770-4777(1997) ；Ren 等，Gene, 195(2) :303_311 (1997) ；Ren, Protein Sci. ,5 1833(1996) ；Efimov 等，Virus Genes，10 173 (1995))和 T7 噬菌體展示系統(tǒng)(Smith 和 Scott, Methods in Enzymology, 217 228-257 (1993)；美國(guó)專利號(hào) 5，766，905)也是已知 的?，F(xiàn)已開發(fā)可基礎(chǔ)噬菌體展示概念的許多其它改進(jìn)和改變形式。這些改進(jìn)形式增 強(qiáng)了展示系統(tǒng)篩選肽文庫(kù)以便結(jié)合所選靶分子和展示功能性蛋白質(zhì)的能力，所述功能性蛋 白質(zhì)可能篩選具有所需特性的這些蛋白質(zhì)。現(xiàn)已開發(fā)了噬菌體展示反應(yīng)的組合反應(yīng)裝置 (TO 98/14277)，噬菌體展示文庫(kù)已用于分析和控制生物分子相互作用(W0 98/20169 ；WO 98/20159)和受約束螺旋肽的特性(W098/20036)。WO 97/35196描述了分離親和配體的方法，其中將噬菌體展示文庫(kù)與其中的配體會(huì)結(jié)合靶分子的一種溶液和其中的親和配體不會(huì) 結(jié)合該靶分子的第二種溶液接觸來(lái)選擇性分離結(jié)合配體。WO 97/46251描述的方法用親和 純化的抗體生物淘選隨機(jī)噬菌體展示文庫(kù)，然后分離結(jié)合噬菌體，然后利用微量滴定板孔 通過(guò)微量淘選方法分離高親和力結(jié)合噬菌體。利用金黃色葡萄球菌A蛋白作為親和力標(biāo)簽 也已有報(bào)道(Li等· (1998)Mol Biotech.，9 :187)。W097/47314描述了利用底物扣除文庫(kù) 區(qū)分酶特異性，該方法利用組合文庫(kù)，所述文庫(kù)可以是噬菌體展示文庫(kù)。WO 97/09446描述 了采用噬菌體展示選擇適用于洗滌劑中酶的方法。選擇特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的其它方法描述 于美國(guó)專利號(hào) 5，498，538，5，432，018 和 WO 98/15833。美國(guó)專利號(hào)5，723，286，5，432，018，5，580，717，5，427，908，5，498，530， 5，770，434，5，734，018，5，698，426，5，763，192 和 5，723，323 也描述了產(chǎn)生肽文庫(kù)和篩選這
些文庫(kù)的方法。對(duì)于本發(fā)明的文庫(kù)，采用生物信息學(xué)方法測(cè)定天然產(chǎn)生的Tn3結(jié)構(gòu)基序的環(huán)長(zhǎng)度 和多樣性偏好(參見實(shí)施例2)。在該分析中，利用環(huán)長(zhǎng)度和序列多樣性的偏好開發(fā)“限制 性隨機(jī)化(restricted randomization) ”方法。在該限制性隨機(jī)化方法中，將相對(duì)環(huán)長(zhǎng)度 和序列偏好引入文庫(kù)開發(fā)方案。例如，測(cè)定到BC環(huán)的一種環(huán)長(zhǎng)度偏好是9個(gè)殘基。對(duì)含有 9個(gè)殘基的BC環(huán)作進(jìn)一步分析后，測(cè)定在該位置是否有特定氨基酸，或氨基酸組的偏好，或 者該位置是否完全隨機(jī)。將環(huán)長(zhǎng)度和序列多樣性分析整合入文庫(kù)開發(fā)產(chǎn)生了限制性隨機(jī)化 (即，隨機(jī)環(huán)內(nèi)氨基酸可處于的某些位置是有限的)。實(shí)施例中描述了限制性隨機(jī)化方法的 例子(參見實(shí)施例2)。本發(fā)明還提供包含本文所述本發(fā)明支架的文庫(kù)(下文稱為“本發(fā)明文庫(kù)”)。在一 個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明文庫(kù)包含非天然產(chǎn)生的多肽支架，其包含與衍生自天然產(chǎn)生的蛋白 質(zhì)序列的多個(gè)環(huán)區(qū)域序列相連的多個(gè)β鏈結(jié)構(gòu)域，其中通過(guò)天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列中相 應(yīng)環(huán)序列的至少一個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加而改變一個(gè)或多個(gè)所述環(huán)區(qū)域序列，其中 該多肽支架的β鏈結(jié)構(gòu)域與天然產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域序列有至少50%同源性。 在一些實(shí)施方式中，天然產(chǎn)生的序列是對(duì)應(yīng)于人結(jié)合腕蛋白C的蛋白質(zhì)序列。在其它實(shí)施 方式中，天然產(chǎn)生的序列是對(duì)應(yīng)于人結(jié)合腕蛋白C的額外Τη3結(jié)構(gòu)基序的蛋白質(zhì)序列。在其 它實(shí)施方式中，所述天然產(chǎn)生的序列是對(duì)應(yīng)于另一結(jié)合腕蛋白，或者另一生物(例如但不 限于，鼠、豬、牛或馬結(jié)合腕蛋白)的結(jié)合腕蛋白的Τη3結(jié)構(gòu)基序的蛋白質(zhì)序列。在還有另一 實(shí)施方式中，所述天然產(chǎn)生的序列是對(duì)應(yīng)于任何生物的Τη3結(jié)構(gòu)基序的蛋白質(zhì)序列。在其 它實(shí)施方式中，所述天然產(chǎn)生的序列對(duì)應(yīng)于嗜熱生物的預(yù)測(cè)Τη3結(jié)構(gòu)基序，例如但不限于 閃爍古生球菌、海葡萄嗜熱菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌和硫化葉菌。在還有另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明支架具有的蛋白質(zhì)序列與對(duì)應(yīng)于上述Τη3結(jié)構(gòu)基序或預(yù)測(cè)的Τη3結(jié)構(gòu) 基序的任一序列具有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至 少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至 少99%的同源性。將文庫(kù)與固定的靶標(biāo)溫育，洗滌支持物以除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)，在非常嚴(yán)格 的條件下洗脫最緊密的結(jié)合物并進(jìn)行PCR以回收序列信息或產(chǎn)生新的結(jié)合物文庫(kù)，從而可 用于重復(fù)該選擇過(guò)程，可進(jìn)一步誘變或不誘變?cè)撔蛄小？蛇M(jìn)行多輪選擇直至獲得對(duì)抗原具 有足夠親和力的結(jié)合物。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明文庫(kù)包含本文所述支架。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明文 庫(kù)包含的支架還包含至少7個(gè)β鏈，其中所述β鏈從N-末端向C-末端稱為A、B、C、D、E、 F和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明空位包含的支架還包含至少7個(gè)β鏈，各鏈由環(huán)區(qū) 域隔開，其中所述環(huán)區(qū)域從N-末端向C-末端稱為AB、BC、⑶、DE、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施 方式中，本發(fā)明文庫(kù)包含的支架還包含至少7個(gè)β鏈，從N-末端向C-末端稱為A、B、C、D、 Ε、F和G鏈，各鏈由環(huán)區(qū)域相連，其中所述環(huán)區(qū)域從N-末端向C-末端稱為AB、BC、⑶、DE、 EF禾口 FG環(huán)。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明文庫(kù)包含的支架還包含依據(jù)人結(jié)合腕蛋白C的Τη3 結(jié)構(gòu)域的支架的一個(gè)或多個(gè)環(huán)區(qū)域，其包含以下氨基酸殘基I. AB 環(huán)內(nèi)所含的 12-17 ；II. BC 環(huán)內(nèi)所含的 23-31 ；III. CD 環(huán)內(nèi)所含的 39-45 ；IV. DE 環(huán)內(nèi)所含的 50-56 ；V. EF環(huán)內(nèi)所含的60-66 ；和VI. FG 環(huán)內(nèi)所含的 75-84。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明文庫(kù)包含的支架還包含依據(jù)人結(jié)合腕蛋白C的 Τη3結(jié)構(gòu)域的支架的一個(gè)或多個(gè)環(huán)區(qū)域，其包含以下氨基酸殘基I. AB 環(huán)內(nèi)所含的 11-17 ；II. BC 環(huán)內(nèi)所含的 23-31 ；III. CD 環(huán)內(nèi)所含的 39-45 ；IV. DE 環(huán)內(nèi)所含的 51-56 ；V. EF環(huán)內(nèi)所含的60-67 ；和VI. FG 環(huán)內(nèi)所含的 75-84。本發(fā)明還提供包含支架的文庫(kù)，所述支架包含環(huán)序列多樣性。在一個(gè)實(shí)施方式中， 本發(fā)明文庫(kù)包含具有至少一個(gè)環(huán)的支架，該環(huán)含有至少一個(gè)隨機(jī)化的位置。在另一實(shí)施方 式中，本發(fā)明文庫(kù)包含具有至少一個(gè)環(huán)的支架，該環(huán)含有至少一個(gè)隨機(jī)化的位置，還含有至 少一個(gè)維持恒定的位置。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明文庫(kù)包含具有環(huán)的支架，該環(huán)含有至少 一個(gè)經(jīng)限制性隨機(jī)化的位置。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明文庫(kù)包含具有至少一個(gè)環(huán)的支架， 該環(huán)含有至少一個(gè)經(jīng)限制性隨機(jī)化的位置，還含有至少一個(gè)維持恒定的位置。在另一實(shí)施 方式中，本發(fā)明文庫(kù)包含具有至少一個(gè)環(huán)的支架，該環(huán)含有至少一個(gè)經(jīng)限制性隨機(jī)化的位 置，還含有至少一個(gè)維持恒定的位置。連接蛋白質(zhì)支架各鏈的環(huán)可作長(zhǎng)度和/或序列多樣性隨機(jī)化。在一個(gè)實(shí)施方式 中，本發(fā)明文庫(kù)具有含至少一個(gè)環(huán)的支架，該環(huán)作長(zhǎng)度和/或序列多樣性隨機(jī)化。在另一實(shí) 施方式中，本發(fā)明文庫(kù)具有的支架中至少一個(gè)環(huán)維持恒定，而至少一個(gè)額外的環(huán)作長(zhǎng)度和/ 或序列多樣性隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明文庫(kù)具有的支架中環(huán)AB、CD和EF中至少 一個(gè)、至少兩個(gè)或所有三個(gè)維持恒定，而環(huán)BC、DE和re中至少一個(gè)、至少兩個(gè)或所有三個(gè)作 長(zhǎng)度和/或序列多樣性隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明文庫(kù)具有的支架中環(huán)AB、CD和 EF中至少一個(gè)、至少兩個(gè)或所有三個(gè)作隨機(jī)化，而環(huán)BC、DE和TO中至少一個(gè)、至少兩個(gè)或 所有三個(gè)作長(zhǎng)度和/或序列多樣性隨機(jī)化。
在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明文庫(kù)所包含的支架包含具有以下共有序列的隨機(jī)化 BC環(huán)S-X-a-X-b-X-X-X-G，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示脯氨酸或丙氨酸，其中 (b)表示丙氨酸或甘氨酸。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明支架包含具有以下共有序列的隨機(jī)化BC環(huán) Α-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G，其中X表示任何氨基酸，其中(d)表示脯氨酸、谷氨酸或賴氨 酸，其中(e)表示天冬酰胺或甘氨酸，和其中(f)表示絲氨酸或甘氨酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明文庫(kù)具有BC環(huán)，其包含具有以下共有序列的11個(gè)氨基 酸S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G，其中X表示任何氨基酸，其中(c)表示脯氨酸、絲氨酸或甘氨 酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明文庫(kù)所包含的支架包含具有以下共有序列的隨機(jī)化 re環(huán)X-a-X-X-G-X-X-X-S，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、蘇氨酸或賴氨酸。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明文庫(kù)所包含的支架包含具有以下共有序列的隨機(jī) 化TO環(huán)X-a-X-X-X-X-b-N-P-A，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、蘇氨酸或 賴氨酸，和其中(b)表示絲氨酸或甘氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明文庫(kù)包含的支架包含具有以下共有序列的隨機(jī)化re 環(huán)X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、蘇氨酸或賴氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明文庫(kù)所包含的支架包含含有7個(gè)殘基的AB環(huán)，該環(huán) 經(jīng)隨機(jī)化而含有以下共有序列K-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、 酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中(a) 表示絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明文庫(kù)所包含的支架包含含有9個(gè)殘基的AB環(huán)，該環(huán) 經(jīng)隨機(jī)化而含有以下共有序列K-X-X-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、組 氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中
(a)表示絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明文庫(kù)所包含的支架包含含有7、8或9個(gè)殘基的CD 環(huán)，其中CD環(huán)中各殘基經(jīng)隨機(jī)化，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸、異亮氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明文庫(kù)所包含的支架包含含有8個(gè)殘基的EF環(huán)，該環(huán) 經(jīng)隨機(jī)化而含有以下共有序列X-b-L-X-P-X-c-X，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、組氨 酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中
(b)表示天冬酰胺、賴氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸，和其中(c)表示異 亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式是編碼文庫(kù)的分離核酸分子的集合，所述文庫(kù)包含本發(fā) 明和上述的支架。設(shè)計(jì)這些Tn3文庫(kù)的另一實(shí)際考慮是鑒定通常用于簡(jiǎn)并寡核苷酸中以編碼任何 氨基酸的“NNK”(N = A，G，T，C;K = G，T)混合密碼子方案的替代方案。雖然“ΝΝΚ”混合產(chǎn)生 能編碼所有20種氨基酸的32種不同密碼子，但它們不是等同編碼的(表11)。例如，“ΝΝΚ”方案中3/32密碼子編碼Leu (CTG，CTT, TTG)，但只有1/32編碼Asp (GAT)。此外，“NNK”混合 編碼一個(gè)終止密碼子(TAG)和Cys密碼子(TGT)，當(dāng)產(chǎn)生天然文庫(kù)時(shí)，二者均不需要?？紤]替 代方案時(shí)，我們注意到以下事實(shí)，即有人描述合成的抗體文庫(kù)編碼由小亞組的氨基酸構(gòu)成 的CDR序列。其中CDR僅由4種氨基酸(Tyr，Ala，ASp，Ser)，或者甚至二元配對(duì)(Tyr，Ser) 構(gòu)成的抗體文庫(kù)顯示能產(chǎn)生針對(duì)蛋白質(zhì)抗原的特定高親和力mAMFellouse等，Proc Natl Acad Sci，2004，101 12467-72，F(xiàn)ellouse 等· J. Mol. Biol.，2005，348 1153-62) 類似地， 僅包含Tyr和Ser的含隨機(jī)化環(huán)序列的10Fn3支架蛋白的文庫(kù)也產(chǎn)生針對(duì)靶蛋白的特異性 結(jié)合物(Koide等· ProcNatl Acad, Sci, 2007,104 :66_32_7)。雖然含有高度局限性氨基酸 組的文庫(kù)能產(chǎn)生特異性結(jié)合蛋白，但從文庫(kù)獲得的結(jié)合物的多樣性可能有限。因此，我們?cè)O(shè) 計(jì)了替代的“NHT”混合密碼子方案以便在Tn3文庫(kù)中引入多樣性(H = A，T，C)?！癗HT”混 合物編碼20種氨基酸的合理亞組，但規(guī)避了 “NNK”混合密碼子所述的不足(表12)。該方 案產(chǎn)生編碼12/20氨基酸的12種密碼子，S卩，各密碼子編碼獨(dú)特的氨基酸。此外，其中沒(méi)有 終止或Cys密碼子。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含NHT密碼子方案編碼的密碼 子。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含NNK混合密碼子方案所編碼的密碼子。在其它實(shí)施方式中，可對(duì)本發(fā)明支架進(jìn)行親和力成熟。在該本領(lǐng)域接受的方法中， 對(duì)特異性結(jié)合蛋白進(jìn)行選擇對(duì)特定靶標(biāo)的親和力是否增加的方案(參見Wu等.Proc Natl Aca Sci USA. 1998年5月26日；95(11) :6037_42)。得到的本發(fā)明支架可顯示至少與親和 力成熟前的支架一樣高的結(jié)合特征。在其它實(shí)施方式中，可對(duì)本發(fā)明支架進(jìn)行類似于抗體CDR嫁接的“環(huán)嫁接”。在該 本領(lǐng)域接受方法中，抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR被“嫁接”到受者抗體上，或者，在此例中是本發(fā) 明支架(參見Ewert等.Methods :2004年10月；34(2) :184_99)。在另一實(shí)施方式中，可 將另一支架的至少一個(gè)環(huán)嫁接到本發(fā)明支架上。本發(fā)明還提供鑒定能結(jié)合靶標(biāo)從而形成支架靶標(biāo)復(fù)合物的蛋白質(zhì)支架的氨基 酸序列的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括以下步驟a)提供本發(fā)明的多肽展示文庫(kù)； b)將(a)的多肽展示文庫(kù)與固定或可分離的靶標(biāo)接觸；c)將支架靶標(biāo)復(fù)合物與游離支架 相分離；d)復(fù)制(c)的分離支架從而產(chǎn)生因多樣性降低和富集了能結(jié)合靶標(biāo)的所展示支架 而不同于(a)中的新多肽展示文庫(kù)；e)任選用(d)的新文庫(kù)重復(fù)步驟(b)、(c)和(d)；和 f)測(cè)定編碼(d)物質(zhì)的所展示支架的區(qū)域的核酸序列，從而推測(cè)能結(jié)合靶標(biāo)的肽序列。在另一實(shí)施方式中，文庫(kù)篩選鑒定后，本發(fā)明支架可進(jìn)一步隨機(jī)化。在一個(gè)實(shí)施方 式中，本發(fā)明方法包括采用本文所述方法使得從文庫(kù)鑒定的支架的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至 少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或至少六個(gè)環(huán)進(jìn)一步隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，對(duì)進(jìn)一步隨 機(jī)化的支架進(jìn)行后續(xù)方法以鑒定能結(jié)合靶標(biāo)的支架，所述方法包括a)將所述進(jìn)一步隨機(jī) 化的支架與固定或可分離的靶標(biāo)接觸；b)將進(jìn)一步隨機(jī)化的支架靶標(biāo)復(fù)合物與游離支架 相分離；c)復(fù)制(b)的分離支架，任選重復(fù)步驟(a)-(c)；和d)測(cè)定編碼所述進(jìn)一步隨機(jī)化 的支架的區(qū)域的核酸序列，從而推測(cè)能結(jié)合靶標(biāo)的肽序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，進(jìn)一步 隨機(jī)化的支架包含以前在第一文庫(kù)中進(jìn)行隨機(jī)化的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四 個(gè)、至少五個(gè)或至少六個(gè)隨機(jī)化的環(huán)。在其它進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述進(jìn)一步隨機(jī)化的支 架包含以前未在第一文庫(kù)中進(jìn)行隨機(jī)化的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少 五個(gè)或至少六個(gè)隨機(jī)化的環(huán)。
在另一實(shí)施方式中，文庫(kù)篩選鑒定后，本發(fā)明支架可進(jìn)一步隨機(jī)化。在一個(gè)實(shí)施 方式中，本發(fā)明方法包括采用本文所述方法使得從文庫(kù)鑒定的支架的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、 至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)或至少七個(gè)鏈環(huán)進(jìn)一步隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式 中，對(duì)進(jìn)一步隨機(jī)化的支架進(jìn)行后續(xù)方法以鑒定能結(jié)合靶標(biāo)的支架，所述方法包括a)將所 述進(jìn)一步隨機(jī)化的支架與固定或可分離的靶標(biāo)接觸；b)將進(jìn)一步隨機(jī)化的支架靶標(biāo)復(fù)合 物與游離支架相分離；c)復(fù)制(b)的分離支架，任選重復(fù)步驟(a)-(c)；和d)測(cè)定編碼所述 進(jìn)一步隨機(jī)化的支架的區(qū)域的核酸序列，從而推測(cè)能結(jié)合靶標(biāo)的肽序列。在進(jìn)一步的實(shí)施 方式中，進(jìn)一步隨機(jī)化的支架包含以前在第一文庫(kù)中進(jìn)行隨機(jī)化的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至 少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)或至少七個(gè)隨機(jī)化的鏈。在其它進(jìn)一步的實(shí)施方式 中，所述進(jìn)一步隨機(jī)化的支架包含以前未在第一文庫(kù)中進(jìn)行隨機(jī)化的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、 至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)或至少七個(gè)隨機(jī)化的鏈。在另一實(shí)施方式中，文庫(kù)篩選鑒定后，本發(fā)明支架可進(jìn)一步隨機(jī)化。在一個(gè)實(shí)施方 式中，本發(fā)明方法包括采用本文所述方法使得從文庫(kù)鑒定的支架的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至 少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或至少六個(gè)和至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少 五個(gè)、至少六個(gè)或至少七個(gè)鏈環(huán)進(jìn)一步隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，對(duì)進(jìn)一步隨機(jī)化的支架 進(jìn)行后續(xù)方法以鑒定能結(jié)合靶標(biāo)的支架，所述方法包括a)將所述進(jìn)一步隨機(jī)化的支架與 固定或可分離的靶標(biāo)接觸；b)將進(jìn)一步隨機(jī)化的支架靶標(biāo)復(fù)合物與游離支架相分離；C) 復(fù)制(b)的分離支架，任選重復(fù)步驟(a)-(c)；和d)測(cè)定編碼所述進(jìn)一步隨機(jī)化的支架的 區(qū)域的核酸序列，從而推測(cè)能結(jié)合靶標(biāo)的肽序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，進(jìn)一步隨機(jī)化的 支架包含以前在第一文庫(kù)中進(jìn)行隨機(jī)化的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少 五個(gè)或至少六個(gè)隨機(jī)化的環(huán)和至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六 個(gè)或至少七個(gè)鏈。在其它進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述進(jìn)一步隨機(jī)化的支架包含以前未在第 一文庫(kù)中進(jìn)行隨機(jī)化的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或至少六個(gè)隨 機(jī)化的環(huán)和至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)或至少七個(gè)鏈。在另一實(shí)施方式中，獲得本發(fā)明支架的一種方法包括選自BC、DE或TO環(huán)的第一隨 機(jī)化環(huán)和未在所述文庫(kù)中作隨機(jī)化的選自AB、CD或EF環(huán)的第二環(huán)。在還有另一實(shí)施方式 中，獲得本發(fā)明支架的另一方法包括選自AB、CD或EF環(huán)的第一隨機(jī)化環(huán)和未在所述文庫(kù)中 作隨機(jī)化的選自BC、DE或re環(huán)的第二環(huán)。本發(fā)明還提供獲得結(jié)合至少一種或更多種靶標(biāo)的至少兩種支架的方法。該方法 能篩選共同起作用而引發(fā)特定反應(yīng)的試劑。當(dāng)需要激動(dòng)活性，而激動(dòng)活性需要多種支架協(xié) 作時(shí)(例如但不限于，受體酪氨酸激酶的激動(dòng)作用)，優(yōu)選采用這種篩選。該方法能篩選 協(xié)作性試劑而無(wú)需重新設(shè)計(jì)文庫(kù)來(lái)形成多聚復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括 在允許支架靶配體復(fù)合物形成的條件下將靶配體與本發(fā)明文庫(kù)接觸，將所述支架與交聯(lián) 劑(定義為將至少兩個(gè)相同或不同的支架緊密結(jié)合在一起的試劑)結(jié)合，其中所述支架的 交聯(lián)引發(fā)可檢測(cè)的反應(yīng)，以及從該復(fù)合物獲得結(jié)合靶標(biāo)的所述支架。在進(jìn)一步的實(shí)施方式 中，所述交聯(lián)劑是支架特異性抗體，或其片段，表位標(biāo)簽特異性抗體或其片段，二聚體化功 能域，例如Fc區(qū)，亮氨酸拉鏈基序，化學(xué)交聯(lián)劑或本領(lǐng)域已知的另一二聚體化功能域。本發(fā)明還提供利用本發(fā)明支架檢測(cè)化合物的方法。依據(jù)通過(guò)文庫(kù)篩選所得支架的 結(jié)合特異性，可能在試驗(yàn)中利用這種支架檢測(cè)樣品中的特異性靶標(biāo)，例如用于診斷方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)化合物的方法包括在允許化合物支架復(fù)合物形成的條件下將樣品 中的所述化合物與本發(fā)明支架接觸并檢測(cè)所述支架，從而檢測(cè)樣品中的所述化合物。在進(jìn) 一步的實(shí)施方式中，對(duì)支架作標(biāo)記(即，放射性標(biāo)記、熒光、酶聯(lián)或比色標(biāo)記)以促進(jìn)檢測(cè)所 述化合物。本發(fā)明還提供利用本發(fā)明支架捕捉化合物的方法。依據(jù)通過(guò)文庫(kù)篩選所得支架的 結(jié)合特異性，可能在試驗(yàn)中利用這種支架捕捉樣品中的特異性靶標(biāo)，例如用于純化方法。在 一個(gè)實(shí)施方式中，捕捉樣品中化合物的方法包括在允許化合物支架復(fù)合物形成的條件下 將樣品中的所述化合物與本發(fā)明支架接觸并從樣品中除去所述復(fù)合物，從而捕捉所述樣品 中的所述化合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述支架固定以促進(jìn)除去化合物支架復(fù)合物。在一些實(shí)施方式中，從本發(fā)明文庫(kù)分離的支架包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少四 個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)或更多個(gè)隨機(jī)化的環(huán)區(qū)域。在一些實(shí)施方式中，分離的支架環(huán)序列 可從供者支架交換至受者支架的任何環(huán)(例如，供者支架的AB環(huán)序列可轉(zhuǎn)移至受者支架中 的任何環(huán)區(qū)域)。在具體的實(shí)施方式中，可將分離的環(huán)序列轉(zhuǎn)移至受者支架中的同源環(huán)(例 如，供者支架的AB環(huán)序列可轉(zhuǎn)移至受者支架中的AB環(huán)位置)。在一些實(shí)施方式中，分離的 環(huán)序列可以與各種受者支架隨機(jī)“混合和匹配”。在其它實(shí)施方式中，可通過(guò)環(huán)序列鑒定分離的支架序列。例如，利用文庫(kù)對(duì)特定靶 標(biāo)進(jìn)行淘選，分離特異性結(jié)合物的集合。隨機(jī)化環(huán)序列的特征在于不依賴支架背景的特定 序列(即，結(jié)合靶標(biāo)X的支架，其中所述支架包含SEQ IDNO :x所示的AB環(huán)序列)。在支架 顯示結(jié)合靶標(biāo)X的兩個(gè)環(huán)序列的其它實(shí)施方式中，所述環(huán)序列的特征在于沒(méi)有支架序列存 在下結(jié)合靶標(biāo)X。換言之，考慮到可將從結(jié)合特定靶標(biāo)的文庫(kù)分離的支架表達(dá)為不依賴支架 主鏈而結(jié)合該靶標(biāo)的可變環(huán)序列。該方法類似于抗體可變區(qū)中CDR的概念。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含特異性結(jié)合SYNAGIS 的序列的支架。在這 種實(shí)施方式中，特異性結(jié)合SYNAGIS 的本發(fā)明支架可包含選自SEQID NO 100、102、105、 107或109的BC環(huán)序列。在其它實(shí)施方式中，特異性結(jié)合SYNAGIS 的本發(fā)明支架可包含 選自SEQ ID NO :101、103、104、106、108、或110的TO環(huán)序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，特 異性結(jié)合SYNAGIS 的本發(fā)明支架可包含選自SEQ ID NO :100、102、105、107、或109的至 少一個(gè)BC環(huán)序列；還可包含選自SEQ ID NO :101、103、104、106、108、或110的至少一個(gè)FG 環(huán)序列。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明還可包含與特異性結(jié)合SYNAGIS 的支架競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的 支架，所述SYNAGIS 結(jié)合物包含選自SEQ IDNO :100、102、105、107、或 109 的一個(gè)BC環(huán)序列；還包含選自 SEQ ID N0:101、103、 104、106、108、或110的TO環(huán)序列。可如本文在實(shí)施例11和/或14中所示，或通過(guò)本領(lǐng)域 已知的其它試驗(yàn)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含特異性結(jié)合溶菌酶的序列的支架。在這種實(shí) 施方式中，特異性結(jié)合溶菌酶的本發(fā)明支架可包含選自SEQ ID N0:lll、114、102、120或 124的至少一個(gè)BC環(huán)序列。在其它實(shí)施方式中，特異性結(jié)合溶菌酶的本發(fā)明支架可包含選 自 SEQ ID NO :112、113、115、116、117、118、119、121、122、或 125 的至少一個(gè) FG 環(huán)序列。在 進(jìn)一步的實(shí)施方式中，特異性結(jié)合溶菌酶的本發(fā)明支架可包含選自SED ID N0:lll、114、 102、120、或 124 的至少一個(gè) BC 環(huán)序列；還可包含選自 SEQ ID NO :112、113、115、116、117、 118、119、121、122、或125的至少一個(gè)TO環(huán)序列。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明還可包含與特異性結(jié)合溶菌酶的支架競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的支架，所述溶菌酶結(jié)合物包含選自SED ID N0:lll、114、 102、120、或 124 的至少一個(gè) BC 環(huán)序列；還包含選自 SEQ ID NO :112、113、115、116、117、118、 119、121、122、或125的至少一個(gè)!7G環(huán)序列?？扇绫疚脑趯?shí)施例11和/或14中所示，或通 過(guò)本領(lǐng)域已知的其它試驗(yàn)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)。6. 5多聚支架除了支架單體，可將本文所述的任何支架構(gòu)建物制備成支架二聚體或多聚體，作 為增加化合價(jià)和由此導(dǎo)致的抗原結(jié)合親合力的手段。還可本文所述的任何支架構(gòu)建物制備 成支架的二聚體或多聚體，從而作為增加抗原結(jié)合特異性的手段(例如，可制備結(jié)合不同 抗原的支架)?？赏ㄟ^(guò)各支架模塊之間的共價(jià)結(jié)合，例如通過(guò)包含入氨基酸接頭來(lái)產(chǎn)生這種 多聚體(多聚支架或者本文也稱為多價(jià)支架)。在其它方法中，可利用本領(lǐng)域已知的二聚體 化功能域裝配多聚支架。在具體實(shí)例中，可通過(guò)構(gòu)建編碼單體支架的融合基因，或者通過(guò)工 程改造密碼子將半胱氨酸殘基摻入單體序列并在表達(dá)產(chǎn)物之間形成二硫鍵來(lái)產(chǎn)生共價(jià)結(jié) 合的支架。還可通過(guò)各種技術(shù)產(chǎn)生非共價(jià)結(jié)合的多聚支架。這些技術(shù)包括在單體序列中引入 對(duì)應(yīng)于荷正電和/或負(fù)電殘基的密碼子并使得表達(dá)產(chǎn)物中這些殘基之間(和由此的單體之 間)相互作用。利用單體亞單位中天然存在的荷電殘基可簡(jiǎn)化該方法。產(chǎn)生非共價(jià)結(jié)合支 架的另一方法是在單體支架基因中(例如，在氨基或羧基末端)引入已知相互作用的蛋白 質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的編碼序列。這種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域包括卷曲螺旋基序、亮氨酸拉 鏈基序和已知指導(dǎo)二聚體或高級(jí)多聚體形成的許多蛋白質(zhì)亞單位(或其片段)中的任一 種。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多聚支架包含融合于抗體的任何結(jié)構(gòu)域(或片段) 的至少一個(gè)支架。在一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)支架融合于抗體可變區(qū)、CHl結(jié)構(gòu)域、Ck結(jié) 構(gòu)域、C λ結(jié)構(gòu)域、CH2或CH3結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方式中，至少一個(gè)支架融合于抗體Fc的 CH2結(jié)構(gòu)域。在這種實(shí)施方式中，表達(dá)時(shí)，通過(guò)抗體Fc片段的CH2和CH3區(qū)二聚化而得到的 蛋白質(zhì)對(duì)于特定靶標(biāo)是二價(jià)的。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，本發(fā)明支架替代與Fc片段相連的抗 體可變區(qū)。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明支架不替代與CHl-Fc片段、Ck結(jié)構(gòu)域或CX結(jié)構(gòu) 域相連的抗體可變區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，通過(guò)將支架融合于抗體的CHl和CK或CX區(qū)來(lái)構(gòu)建多 聚支架。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明支架替代融合于抗體的CHl和Ck或CX區(qū)的抗體可 變區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明支架可融合于抗體輕鏈或重鏈的C-末端。在其它實(shí) 施方式中，本發(fā)明支架可融合于抗體輕鏈或重鏈的N-末端。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多聚支架包含對(duì)同一表位具有特異性的多個(gè)支 架。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的多聚支架包含對(duì)不同表位具有特異性的多個(gè)支架，或稱 為表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？扇绯鲇谒心康耐ㄟ^(guò)引用全文納入本文的2008年7月30日提交 的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào) 12/182，975〃 Multispecific epitopebinding proteins and uses thereof (多特異性表位結(jié)合蛋白及其應(yīng)用)"所示裝配和使用本發(fā)明的多聚支架?？蓮目?體、抗體片段、雙抗體、scFv.Fab.Fv或結(jié)合肽選擇這種表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方式中，與本發(fā)明支架的一樣，表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)ο嗤袠?biāo)具有特異 性。
在另一實(shí)施方式中，與本發(fā)明支架的一樣，表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Σ煌袠?biāo)具有特異 性。為連接兩個(gè)或更多個(gè)支架的具體情況選擇合適的接頭取決于各種參數(shù)，包括，例 如單體結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)和/或肽接頭對(duì)蛋白水解和氧化的穩(wěn)定性。接頭多肽可主要包含選自Gly、Ser、Ala或Thr的氨基酸殘基。例如，肽接頭含有的 至少75% (根據(jù)肽接頭中存在的殘基總數(shù)計(jì)算)，例如至少80%，如至少85%或至少90% 的氨基酸殘基可選自Gly、Ser、Ala或Thr。肽接頭還可僅由Gly、Ser、Ala和/或Thr殘基 構(gòu)成。接頭多肽應(yīng)具有足以連接兩個(gè)或更多個(gè)本發(fā)明單體結(jié)構(gòu)域或兩個(gè)或更多個(gè)本發(fā)明多 聚支架的長(zhǎng)度，如此它們彼此能采取正確的構(gòu)象，從而保留所需活性。為該目的，合適的長(zhǎng)度是至少一個(gè)，通常少于約50個(gè)氨基酸殘基，例如2-25氨基 酸殘基、5-20氨基酸殘基、5-15氨基酸殘基、8-12氨基酸殘基或11個(gè)殘基。類似地，多肽編 碼接頭大小可以是，例如約2-約15氨基酸、約3-約15、約4-約12、約10、約8或約6氨基 酸。在涉及核酸，例如DNA、RNA或二者的組合的方法和組合物中，含有接頭序列的多核苷酸 可以是，例如約6個(gè)核苷酸-約45個(gè)核苷酸、約9個(gè)核苷酸-約45個(gè)核苷酸、約12個(gè)核苷 酸-約36個(gè)核苷酸、約30個(gè)核苷酸、約24個(gè)核苷酸或約18個(gè)核苷酸。類似地，選擇包含 入接頭多肽的氨基酸殘基應(yīng)顯示不明顯干擾多肽多聚體的活性或功能的特性。因此，肽接 頭整體上應(yīng)不顯示電荷，電荷與多肽多聚體的活性或功能不一致，會(huì)干擾內(nèi)部折疊，或與一 個(gè)或多個(gè)單體結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基形成鍵或其它相互作用從而嚴(yán)重阻礙多肽多聚體結(jié) 合特異性靶標(biāo)。還可從文庫(kù)選擇肽接頭，其中該肽接頭中的氨基酸殘基為特定多肽多聚體中特定 組的單體結(jié)構(gòu)域作隨機(jī)化?？衫萌嵝越宇^發(fā)現(xiàn)單體結(jié)構(gòu)域的合適組合，然后利用可變接 頭的這種隨機(jī)文庫(kù)優(yōu)化以獲得具有最佳長(zhǎng)度和幾何特征的接頭。最佳接頭可含有參與結(jié)合 靶標(biāo)并在不結(jié)合特定靶標(biāo)時(shí)約束單體結(jié)構(gòu)域在多肽多聚體中相對(duì)彼此運(yùn)動(dòng)的類型正確的
最低數(shù)量氨基酸殘基。利用天然產(chǎn)生以及人工肽接頭將多肽連接入新型連接的融合多肽是參考文獻(xiàn)中 熟知的(Hallewell 等· (1989)，J. Biol. Chem. 264,5260-5268 ；Alfthan等.(1995),Protein Eng.8,725-731 ；Robinson 禾口 Sauer(1996) , Biochemistry 35,109-116 ；Khandekar 等· (1997)，J.Biol.Chem. 272,32190-32197 ；Fares 等· (1998)，Endocrinology 139， 2459-2464 ；SmalIshaw 等· (1999)，Protein Eng. 12，623-630 ；美國(guó)專利號(hào) 5，856，456)。如上所述，通常優(yōu)選肽接頭具有至少一定的柔韌性。因此，在一些實(shí)施方式中，肽 接頭含有1-25個(gè)甘氨酸殘基、5-20個(gè)甘氨酸殘基、5-15個(gè)甘氨酸殘基或8_12個(gè)甘氨酸殘 基。肽接頭通常含有至少50%甘氨酸殘基，例如至少75%甘氨酸殘基。在本發(fā)明的一些實(shí) 施方式中，肽接頭只包含甘氨酸殘基。在具體的實(shí)施方式中，接頭序列可包含(G-G-G-G-S)x 所示序列，其中χ是正整數(shù)。在另一具體實(shí)施方式
中，接頭序列可包含(G-A)x所示序列，其 中χ是正整數(shù)。在另一具體實(shí)施方式
中，接頭序列可包含(G-G-G-T-P-T),所示序列，其中χ 是正整數(shù)。在一些情況中，優(yōu)選或需要在肽接頭中提供一定的剛性。這可通過(guò)在肽接頭的氨 基酸序列中包含脯氨酸殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，肽接頭在其氨基 酸序列中可包含至少一個(gè)脯氨酸殘基。例如，肽接頭的氨基酸序列中至少25%，例如至少本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方式中，肽接頭只 包含脯氨酸殘基。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，修飾肽接頭從而引入包含用于非多肽部分的連接基 團(tuán)的氨基酸殘基。這種氨基酸殘基的例子可以是半胱氨酸殘基(隨后連接非多肽部分)或 者該氨基酸序列可在體內(nèi)包含N-糖基化位點(diǎn)(從而將糖部分連接(體內(nèi))于肽接頭)。其 它選擇是利用設(shè)計(jì)的tRNA和tRNA合成酶將非天然氨基酸遺傳學(xué)摻入(參見，例如美國(guó)申 請(qǐng)公布系列號(hào)2003/0082575)多肽結(jié)構(gòu)域或接頭。例如，插入酮基-酪氨酸能位點(diǎn)特異性 地偶連于表達(dá)的單體結(jié)構(gòu)域或多聚體。多肽多聚體中存在的所有肽接頭的氨基酸序列有時(shí)相同?；蛘?，多肽多聚體中存 在的所有肽接頭的氨基酸序列可以不同。6. 6 融合本文所述支架可融合于其它蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。例如，可經(jīng)N或C-末端融合IgG的恒 定區(qū)(Fc)與支架而整合這些支架與人免疫反應(yīng)。Fc融合分子活化免疫反應(yīng)的補(bǔ)體組分并 提高蛋白質(zhì)支架的治療價(jià)值。類似地，支架和補(bǔ)體蛋白，例如Clq之間融合可用于靶向細(xì) 胞，支架和毒素之間的融合可用于特異性破壞攜帶特定抗原的細(xì)胞。此外，各種出版物描述了獲得生理活性分子的方法，其半衰期通過(guò)在該分子中 引入FcRn-結(jié)合多肽(W0 97/43316 ；美國(guó)專利號(hào)5，869，046 ；美國(guó)專利號(hào)5，747，035 ；W0 96/32478 ；W0 91/14438)或通過(guò)融合分子與保留FcRn-結(jié)合親和力但對(duì)其它Fc受體的親 和力極大降低的抗體(W0 99/43713)或與抗體的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合(W0 00/09560 ；美 國(guó)專利號(hào)4，703，039)而得到修飾。增加生理活性分子半衰期的具體技術(shù)和方法還可見 于2006年8月1日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)7，083，784，名為〃 Antibodies with Increased Half-lives (半衰期增加的抗體)"，該篇專利出于所有目的通過(guò)引用納入本文。具體地 說(shuō)，考慮到本發(fā)明支架可融合于IgG的Fc區(qū)，其中所述Fc區(qū)包含氨基酸殘基突變(如Kabat 的 EU 指數(shù)編號(hào)):M252Y/S254T/T256E 或 H433K/N434F/Y436H。此外，本發(fā)明支架可與增加或延長(zhǎng)體內(nèi)或血清半衰期的分子融合。在一些實(shí)施方 式中，本發(fā)明支架與白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、聚乙二醇(PEG)、多糖、免疫球蛋白 分子(IgG)、補(bǔ)體、血紅蛋白、結(jié)合肽、脂蛋白和其它因子締合以增加其在血流中的半衰期或 其組織穿透性?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如從利用公眾可得的基因序列構(gòu)建的重組融合基因表 達(dá)融合蛋白來(lái)制備這些融合體。本發(fā)明支架還可與增加或延長(zhǎng)體內(nèi)或血清半衰期的分子結(jié)合或締合。在一些實(shí)施 方式中，本發(fā)明支架與白蛋白、聚乙二醇(PEG)、多糖、免疫球蛋白分子或具有增加血清半衰 期的Fc突變的免疫球蛋白分子、補(bǔ)體、血紅蛋白、脂蛋白和其它因子締合以增加血清半衰 期。可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如從利用公眾可得的基因序列構(gòu)建的重組融合基因表達(dá)融合蛋白 來(lái)制備這些融合體。術(shù)語(yǔ)“聚乙二醇”或“PEG”表示含或不含偶聯(lián)劑、偶連或活化部分(例如，含巰 基、三氟甲磺酸根、三氟乙基磺酸根(tresylate)、氮丙啶、環(huán)氧乙烷、N-羥基琥珀酰亞 胺或馬來(lái)酰亞胺部分)的聚乙二醇化合物或其衍生物。術(shù)語(yǔ)“PEG”應(yīng)表示分子量介于 500-150, OOODa之間的聚乙二醇，包括其類似物，其中例如末端0H-基團(tuán)被甲氧基取代(稱 為 mPEG)。
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在一個(gè)實(shí)施方式中，用聚乙二醇(PEG)衍生支架。PEG是含有兩個(gè)末端羥基的環(huán) 氧乙烷重復(fù)單位的線形、水溶性聚合物。PEG根據(jù)其分子量分類，其分子量通常為約500 道爾頓到約40，000道爾頓。在目前優(yōu)選的實(shí)施方式中，所用的PEG的分子量是5，000道 爾頓到約20，000道爾頓。偶連于本發(fā)明支架的PEG可以是支化或非支化的(參見，例 如 Monfardini，C.等.1995Bioconjugate Chem6 62-69)。PEG 可從耐卡塔公司(Nektar Inc.)、西格瑪化學(xué)品公司(Sigma ChemicalCo.)和其它公司商品化購(gòu)得。這種PEG包括但 不限于單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG_S)、單甲氧 基聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG_NH2)、 單甲氧基聚乙二酉享-三氟乙基磺酸酉旨(monomethoxypolyethyleneglycol-tresylate) (MePEG-TRES)和單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。簡(jiǎn)言之，在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)無(wú)反應(yīng)活性的基團(tuán)，例如甲氧基或乙氧基對(duì) 所用親水性聚合物，例如PEG的一端封端。隨后，通過(guò)與合適的活化劑反應(yīng)而活化該 聚合物的另一端，所述活化劑是例如三聚氰酰鹵(例如，三聚氰酰氯、溴或氟)、二咪唑 (diimadozle)、酐試劑(例如，二鹵代琥珀酸酐，如二溴代琥珀酸酐)、酰疊氮、對(duì)二唑鐺芐 基SI (p-diazoiumbenzyl ether)、3_ (對(duì)坐金翁苯氧基(p_diazoniumphenoxy)) p圣基丙 基醚)等。然后活化的聚合物與本文所述多肽反應(yīng)產(chǎn)生用聚合物衍生的多肽?；蛘?，可活 化本發(fā)明支架中的官能團(tuán)以便與聚合物反應(yīng)，或者可采用已知的偶連方法在協(xié)調(diào)偶連反應(yīng) 中連接兩個(gè)基團(tuán)。不難知道可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和使用的多種其它反應(yīng)方案以PEG 衍生本發(fā)明多肽。在一些實(shí)施方式中，工程改造本發(fā)明支架以提供用于偶連的反應(yīng)活性基團(tuán)。在這 種支架中，N-末端和/或C-末端還可用于提供用于偶連的反應(yīng)活性基團(tuán)。在其它實(shí)施方 式中，N-末端可偶連于一個(gè)部分(例如但不限于PEG)，而C-末端偶連于另一部分(例如但 不限于生物素)，反之亦然。術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)半衰期”以其常規(guī)意義使用，即，身體/靶器官中存在多肽的50%生物 學(xué)活性的時(shí)間，或者多肽活性是其初始值的50%的時(shí)間。作為測(cè)定功能性體內(nèi)半衰期的替 代方案，可測(cè)定“血清半衰期”，即，清除前50%多肽分子在血漿或血流中循環(huán)的時(shí)間。測(cè)定 血清半衰期常比測(cè)定功能半衰期簡(jiǎn)單，血清半衰期的幅度常是功能性體內(nèi)半衰期幅度的良 好指示。血清半衰期的其它術(shù)語(yǔ)包括血漿半衰期、循環(huán)半衰期、循環(huán)性半衰期、血清清除率、 血漿清除率和清除半衰期。待保留的功能通常選自促凝血、蛋白水解、輔因子結(jié)合、受體結(jié) 合活性或特定蛋白質(zhì)相關(guān)的其它類型生物學(xué)活性。與功能性體內(nèi)半衰期或血漿半衰期有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“增加”用于表示與參比分子(例 如，未修飾的多肽)相比，在可比條件下測(cè)得多肽的相關(guān)半衰期統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地增加。例如， 與未修飾的參比分子相比，相關(guān)半衰期可增加至少約25%，例如至少約50%，如至少約 100%、至少約150%、至少約200%、至少約250%或至少約500%。在其它實(shí)施方式中，與 未修飾的參比分子相比，半衰期可增加約至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5 倍、至少10倍、至少20倍、或至少50倍。6. 7隨機(jī)化實(shí)施方式在一方面，本發(fā)明提供隨機(jī)化支架。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供多聚隨機(jī)化 支架。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供二硫鍵工程改造的隨機(jī)化支架。在還有另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含隨機(jī)化支架的文庫(kù)。下文提供了本發(fā)明支架和包含所述支架的展 示文庫(kù)的隨機(jī)化方案，在本節(jié)中統(tǒng)稱為“本發(fā)明”。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6 個(gè)隨機(jī)化環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化環(huán)，其中至少AB、或至少BC、 或至少⑶、或至少DE、或至少EF、或至少TO環(huán)隨機(jī)化。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)。例如，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB 環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī) 化的CD環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包 含隨機(jī)化的EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的re環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含兩個(gè)隨機(jī)化的環(huán)。例如，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB 和BC環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB和CD環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā) 明包含隨機(jī)化的AB和DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB和EF環(huán)。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的 BC和CD環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC和DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本 發(fā)明包含隨機(jī)化的BC和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC和TO環(huán)。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的CD和DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的 CD和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的CD和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本 發(fā)明包含隨機(jī)化的DE和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的DE和TO環(huán)。在 另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的EF和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含三個(gè)隨機(jī)化的環(huán)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā) 明包含隨機(jī)化的AB、BC和⑶環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、BC和DE環(huán)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、BC和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含 隨機(jī)化的AB、BC和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、CD和DE環(huán)。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、⑶和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī) 化的AB、⑶和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、DE和EF環(huán)。在另一實(shí) 施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、DE和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的 AB、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC、⑶和DE環(huán)。在另一實(shí)施方式 中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC、⑶和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC、⑶ 和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC、DE和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本 發(fā)明包含隨機(jī)化的BC、DE和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC、EF和TO 環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的CD、DE和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 包含隨機(jī)化的⑶、DE和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的⑶、EF和re環(huán)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的DE、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含四個(gè)隨機(jī)化的環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含 隨機(jī)化的AB、BC、⑶和DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、BC、⑶和EF環(huán)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、BC、CD和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 包含隨機(jī)化的AB、⑶、DE和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、⑶、DE和 re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、CD、EF和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、DE、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC、⑶、DE和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC、⑶、DE和TO環(huán)。在另一實(shí)施方 式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC、DE、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的 CD、DE、EF 禾口 FG 環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含五個(gè)隨機(jī)化的環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含 隨機(jī)化的AB、BC、CD、DE，和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、BC、CD、DE， 和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、⑶、DE、EF和re環(huán)。在另一實(shí)施方 式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的AB、BC、DE、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化 的AB、BC、⑶、EF，和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的BC、⑶、DE、EF和TO 環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含六個(gè)隨機(jī)化的環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含 隨機(jī)化 AB、BC、CD、DE、EF 禾口 FG 環(huán)。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明包含三個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中BC、DE、和TO環(huán)均隨機(jī) 化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、至少⑶、至少EF環(huán) 隨機(jī)化。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明包含三個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中AB、CD、和EF環(huán)均隨機(jī)化。 在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的環(huán)，其中AB、BC、CD、DE、EF、和TO環(huán)均隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的環(huán)，其中至少一個(gè)、或至少兩個(gè)、或至少 三個(gè)、或至少四個(gè)、或至少五個(gè)、或至少六個(gè)環(huán)未隨機(jī)化。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中一個(gè)環(huán)未隨機(jī)化。在一 個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中AB環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中BC環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至 少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中CD環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化 的環(huán)，其中DE環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中EF 環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中re環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中兩個(gè)環(huán)未隨機(jī)化。在一 個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB和BC環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí) 施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB和CD環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方 式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB和DE環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB和EF環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā) 明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB和re環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包 含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC和⑶環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至 少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC和DE環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一 個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC和EF環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨 機(jī)化的環(huán)，其中至少BC和re環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化 的環(huán)，其中至少⑶和DE環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)， 其中至少⑶和EF環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中 至少⑶和re環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少 DE和EF環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少DE和 re環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少EF和re環(huán) 未隨機(jī)化。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中三個(gè)環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、BC和⑶環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、BC和DE環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、BC和EF環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、BC和re環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、⑶和DE環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、⑶和EF環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、⑶和re環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、DE和EF環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、EF和TO環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC、⑶和DE環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC、⑶和EF環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC、⑶和re環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC、DE和EF環(huán)未隨機(jī)化。另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC、EF和re環(huán)未隨機(jī)化。在另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少⑶、DE和EF環(huán)未隨機(jī)化。在另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少⑶、DE和re環(huán)未隨機(jī)化。在另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少⑶、EF和re環(huán)未隨機(jī)化。在另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少DE、EF和TO環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中四個(gè)環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、BC、⑶和DE環(huán)未隨機(jī)化。在 另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、BC、⑶和EF環(huán)未隨機(jī)化。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、BC、⑶和re環(huán)未隨機(jī) 化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、⑶、DE和EF環(huán)未隨 機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、⑶、DE和TO環(huán)未 隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、⑶、EF和TO環(huán) 未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、DE、EF和TO 環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC、⑶、DE和 EF環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC、⑶、DE 和re環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC、DE、 EF和re環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少⑶、 DE、EF和TO環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中五個(gè)環(huán)環(huán)未隨機(jī)化。在 另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、BC、⑶、DE和EF環(huán)未隨機(jī) 化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、BC、⑶、DE和TO環(huán) 未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、⑶、DE、EF 和re環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、BC、 DE、EF和TO環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少 AB、BC、⑶、EF和TO環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少BC、CD、DE、EF和FG環(huán)未隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中六個(gè)環(huán)未隨機(jī)化。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)，其中至少AB、BC、⑶、DE、EF和TO環(huán)未隨 機(jī)化。本發(fā)明還提供其中β鏈區(qū)域隨機(jī)化的支架，其中在相似條件下檢測(cè)到所述β鏈 隨機(jī)化支架顯示至少與β鏈隨機(jī)化之前的同一支架一樣高的穩(wěn)定性和特異性靶標(biāo)親和 力。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或 至少六個(gè)β鏈隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少A鏈、或至少B鏈、或至少C鏈、 或至少D鏈、或至少E鏈、或至少F鏈隨機(jī)化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含兩個(gè)隨機(jī)化的β鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 包含隨機(jī)化的A鏈和B鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A鏈和C鏈。在另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A鏈和D鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A 鏈和E鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A鏈和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā) 明包含隨機(jī)化的A鏈和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B鏈和C鏈。在另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B鏈和D鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B 鏈和E鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B鏈和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā) 明包含隨機(jī)化的B鏈和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的C鏈和D鏈。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的C鏈和E鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的 C鏈和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的C鏈和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本 發(fā)明包含隨機(jī)化的D鏈和E鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的D鏈和F鏈。在 另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的D鏈和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化 的E鏈和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的E鏈和G鏈。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明包含隨機(jī)化的F鏈和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含三個(gè)隨機(jī)化的β鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明 包含隨機(jī)化的Α、Β、和C鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、Β、和D鏈。在另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、B、和E鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的 Α、Β、和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、B、和G鏈。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、C、和D鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、C、和E鏈。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、C、和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨 機(jī)化的A、C、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、D、和E鏈。在另一實(shí)施方 式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、D、和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、D、和 G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、C、和D鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包 含隨機(jī)化的B、C、和E鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、C、和F鏈。在另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、C、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的 B、D、和E鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、D、和F鏈。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、D、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的C、D、和E鏈。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的C、D、和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨 機(jī)化的C、D、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的C、E、和F鏈。在另一實(shí)施方 式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的C、E、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的C、F、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的D、E、和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包 含隨機(jī)化的D、F、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的E、F、和G鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含四個(gè)隨機(jī)化的β鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 包含隨機(jī)化的Α、B、C、和D鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、B、C、和E鏈。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、B、C、和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含 隨機(jī)化的Α、B、C、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、C、D、和E鏈。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、C、D、和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī) 化的Α、C、D、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、D、E、和F鏈。在另一實(shí) 施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、D、E、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的 A、E、F、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、C、D、和E鏈。在另一實(shí)施方 式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、C、D、和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、C、 D、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、D、E、和F鏈。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、D、EjP G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、E、F、和 G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的C、D、E和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 包含隨機(jī)化的C、D、EjP G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的D、E、F、和G鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含五個(gè)隨機(jī)化的β鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 包含隨機(jī)化的Α、B、C、D、和E鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、B、C、D、和F 鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、B、C、D、和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā) 明包含隨機(jī)化的A、C、D、E和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、C、D、E和G 鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、C、D、E和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā) 明包含隨機(jī)化的A、C、D、EjP G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、B、C、E和 F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、B、C、E和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā) 明包含隨機(jī)化的A、B、C、D和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、B、C、D和G 鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、C、D、E、和F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā) 明包含隨機(jī)化的B、C、D、EjP G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、D、E、F和 G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的B、C、E、F和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā) 明包含隨機(jī)化的B、C、D、F和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的C、D、E、F、和 G鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含六個(gè)隨機(jī)化的β鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明 包含隨機(jī)化的Α、B、C、D、EJP F鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的Α、B、C、D、Ε、 和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、C、D、E、F和G鏈。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、B、D、E、F和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、B、 C、E、F和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、B、C、D、F和G鏈。在另一實(shí)施 方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化的A、B、C、D、E和G鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含隨機(jī)化 的 B、C、D、E、F 和 G 鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含六個(gè)隨機(jī)化的β鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明 包含隨機(jī)化的Α、B、C、D、Ε、F和G鏈。本發(fā)明還提供聚環(huán)長(zhǎng)度多樣性的蛋白質(zhì)支架。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至 少一個(gè)環(huán)，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、 至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30個(gè) 氨基酸殘基。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明可包含至少一個(gè)環(huán)，其包含1、2、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30 個(gè)氨基酸殘基。在 另一實(shí)施方式中，本發(fā)明可包含至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或至少六個(gè)相同 長(zhǎng)度的環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明可包含至少兩個(gè)環(huán)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或 至少六個(gè)不同長(zhǎng)度的環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明因天然產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列中相應(yīng)環(huán)序列的至少一個(gè)氨基 酸的缺失、取代或添加而不同于天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明在相應(yīng) 天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列的至少一個(gè)、或至少兩個(gè)、或至少四個(gè)、或至少四個(gè)、或至少五個(gè)、或 至少六個(gè)環(huán)序列中包含至少一個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明在 相應(yīng)天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列的至少一個(gè)、或至少兩個(gè)、或至少三個(gè)、或至少四個(gè)、或至少五 個(gè)、或至少六個(gè)環(huán)序列中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、或至少6、或至 少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至少15、 或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少23、或 至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個(gè)氨基酸的缺失、 取代或添加。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在相應(yīng)天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列的至少一個(gè)、或至少 兩個(gè)、或至少三個(gè)、或至少四個(gè)、或至少五個(gè)、或至少六個(gè)環(huán)序列中包含至少1、至少2、至少 3、至少4到約至少8、、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至 少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少 23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個(gè)氨基酸 的缺失、取代或添加。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)AB中包含至少一個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)AB中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)AB中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到約至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或 至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個(gè)氨基 酸的缺失、取代或添加。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)BC中包含至少一個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)BC中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)BC中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到約至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或
41至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個(gè)氨基 酸的缺失、取代或添加。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)CD中包含至少一個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)CD中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少 14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、 或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個(gè) 氨基酸的缺失、取代或添加。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)⑶中包含至少1、至少2、至少 3、至少4到約至少8、、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至 少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少 23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個(gè)氨基酸 的缺失、取代或添加。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)DE中包含至少一個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)DE中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)DE中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到約至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或 至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個(gè)氨基 酸的缺失、取代或添加。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)EF中包含至少一個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)EF中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)EF中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到約至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或 至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個(gè)氨基 酸的缺失、取代或添加。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)re中包含至少一個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)re中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少 14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、 或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個(gè) 氨基酸的缺失、取代或添加。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明在環(huán)re中包含至少1、至少2、至少3、至少4到約至少8、、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至 少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少 23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個(gè)氨基酸 的缺失、取代或添加。 本發(fā)明還提供包含環(huán)序列多樣性的支架。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少1、 至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個(gè)環(huán)，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至 少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至 少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少 27、至少28、至少29或至少30個(gè)隨機(jī)化的位置。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少1、至 少2、至少3、至少4、至少5或至少6個(gè)環(huán)，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至 少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至 少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少 27、至少28、至少29或至少30個(gè)隨機(jī)化的位置，還包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少 5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少 16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、 至少27、至少28、至少29或至少30個(gè)維持恒定的位置。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至 少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個(gè)環(huán)，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至 少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至 少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少 26、至少27、至少28、至少29或至少30個(gè)經(jīng)歷限制性隨機(jī)化的位置。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個(gè)環(huán)，其包含至少1、至少2、至 少3、至少4、至少5或至少6個(gè)環(huán)，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至 少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、 至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至 少28、至少29或至少30個(gè)經(jīng)歷限制性隨機(jī)化的位置，還包含至少1、至少2、至少3、至少4、 至少5或至少6個(gè)環(huán)，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、 至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少 19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29 或至少30個(gè)維持恒定的位置。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少1、至少2、至少3、至少
4、至少5或至少6個(gè)環(huán)，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個(gè)環(huán)，其包含 至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少 12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、 至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30個(gè)經(jīng)歷限制性隨機(jī) 化的位置，還包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個(gè)環(huán)，其包含至少1、至少 2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、 至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至 少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30個(gè)隨機(jī)化的位置，和至少1、至 少2、至少3、至少4、至少5或至少6個(gè)環(huán)，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至 少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少 27、至少28、至少29或至少30個(gè)維持恒定的位置。本發(fā)明還提供包含環(huán)序列多樣性的支架。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一 個(gè)環(huán)，其含有至少一個(gè)隨機(jī)化的位置。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)環(huán)，其含有 至少一個(gè)隨機(jī)化的位置，還包含至少一個(gè)維持恒定的位置。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含 環(huán)，其包含至少一個(gè)經(jīng)歷限制性隨機(jī)化的位置。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè) 環(huán)，其包含至少一個(gè)經(jīng)歷限制性隨機(jī)化的位置，還包含至少一個(gè)維持恒定的位置。在另一實(shí) 施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)環(huán)，其包含至少一個(gè)經(jīng)歷限制性隨機(jī)化的位置，還包含至少 一個(gè)隨機(jī)化的位置和至少一個(gè)維持恒定的位置。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五 個(gè)或至少六個(gè)序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和 多樣性隨機(jī)化的AB環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC環(huán)。 本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的CD環(huán)。本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的DE 環(huán)。本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的EF環(huán)。本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化 的re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB和BC環(huán)。在另一實(shí) 施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB和CD環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB和DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和 多樣性隨機(jī)化的AB和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的 AB和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC和CD環(huán)。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC和DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本 發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng) 度和多樣性隨機(jī)化的BC和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī) 化的CD和DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的CD和EF環(huán)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的CD和re環(huán)。在另一實(shí)施方式 中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的DE和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序 列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的DE和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性 隨機(jī)化的EF和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC和CD環(huán)。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC和DE環(huán)。在另一實(shí)施方式 中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包 含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和 多樣性隨機(jī)化的AB、CD和DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化 的AB、CD和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、CD和TO 環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、DE和EF環(huán)。在另一實(shí) 施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、DE和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本 發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列 長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC、CD和DE環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性 隨機(jī)化的BC、CD和EF環(huán)在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC、CD
44和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC、DE和EF環(huán)。在 另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC、DE和re環(huán)。在另一實(shí)施方式 中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC、EF和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包 含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的CD、DE和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和 多樣性隨機(jī)化的CD、DE和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化 的CD、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的DE、EF和 FG環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC、CD和DE環(huán)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC、CD和EF環(huán)。在另一實(shí) 施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC、CD和re環(huán)。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、⑶、DE和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包 含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、CD、DE和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng) 度和多樣性隨機(jī)化的AB、CD、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣 性隨機(jī)化的AB、DE、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化 的BC、CD、DE和EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC、CD、 DE和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC、CD、EF和TO 環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC、DE、EF和TO環(huán)。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的CD、DE、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的含AB、BC、⑶、DEjP EF 環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC、CD、DE、和TO環(huán)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、CD、DE、EF和TO環(huán)。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC、DE、EF和TO環(huán)。在另一實(shí) 施方式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC、CD、EF和TO環(huán)。在另一實(shí)施方 式中，本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC、CD、EF、和TO環(huán)。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的AB、BC、CD、DEJP EF環(huán)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā) 明包含序列長(zhǎng)度和多樣性隨機(jī)化的BC、⑶、DE、EF和TO環(huán)。6. 8支架偶聯(lián)物本發(fā)明包括利用偶連或融合于一個(gè)或多個(gè)部分支架，所述部分包括但不限于肽、 多肽、蛋白質(zhì)、融合蛋白、核酸分子、小分子、模擬試劑、合成藥物、無(wú)機(jī)分子和有機(jī)分子。本 發(fā)明包括利用重組融合或化學(xué)偶連(包括共價(jià)和非共價(jià)偶連)于異源蛋白質(zhì)或多肽(或其 片段，至少10個(gè)、至少20個(gè)、至少30個(gè)、至少40個(gè)、至少50個(gè)、至少60個(gè)、至少70個(gè)、至 少80個(gè)、至少90或至少100個(gè)氨基酸的多肽)的支架，從而產(chǎn)生融合蛋白。這種融合無(wú)需 直接進(jìn)行，而可以通過(guò)本文所述的接頭序列發(fā)生。例如，可通過(guò)將支架融合或偶連于特定細(xì) 胞表面受體的特異性抗體，在體外或體內(nèi)利用支架將異源靶多肽靶向特定細(xì)胞類型。還可 將融合或偶連于異源多肽的支架用于采用本領(lǐng)域已知方法的體外免疫測(cè)定和純化方法中， 參見,例如國(guó)際公布號(hào)WO 93/21232 ；歐洲專利號(hào)EP439, 095 ；Naramura等，1994，Immunol. Lett. 39 91-99 ；美國(guó)專利號(hào) 5，474，981 ；Gillies 等，1992，PNAS 89 1428-1432 ；和 Fell 等，1991，J. Immunol. 146 :2446_2452，它們通過(guò)引用全文納入本文?？赏ㄟ^(guò)基因改組、基序改組、外顯子改組和/或密碼子改組(統(tǒng)稱為“DNA改組”)的技術(shù)產(chǎn)生包含本發(fā)明支架的其它融合蛋白?？刹捎肈NA改組來(lái)改變本發(fā)明支 架的活性(例如，具有較高親和力和較低解離速率的支架)。一般可參見，美國(guó)專利號(hào) 5，605，793 ；5，811，238 ；5，830，721 ；5，834，252 和 5，837，458 ；Patten 等，1997，Curr. Opinion Biotechnol. 8 724-33 ；Harayama,1998, Trends Biotechnol. 16(2) :76_82 ； Hansson 等，1999， J. Mol. Biol. 287 265-76 ；Lorenzo 禾口 Blasco，1998，BioTechniques 24(2) :308-313(各份專利和出版物通過(guò)引用全文納入本文)。先通過(guò)易錯(cuò)PCR、隨機(jī)核苷 酸插入或其它方法進(jìn)行隨機(jī)誘變，再重組來(lái)改變支架，或者其編碼的支架。可將編碼特異性 結(jié)合靶標(biāo)的支架的多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)部分與一種或多種異源分子的一個(gè)或多個(gè)組分、 基序、區(qū)段、部分、結(jié)構(gòu)域、片段等重組(recombine)。此外，可將本發(fā)明支架與標(biāo)記序列，例如肽融合以促進(jìn)純化。在某些實(shí)施方式中， 標(biāo)記氨基酸序列是六_組氨酸肽(his-標(biāo)簽)，例如，加利福尼亞州查塔沃斯市恰根公司 (QIAGEN, Inc.，9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif.，91311)的 pQE 載體中提供的標(biāo)簽 等，其中許多標(biāo)記可商品化購(gòu)得。如Gentz等(1989，PNAS，86 :821-824)中所述，六-組氨 酸為純化融合蛋白提供了便利。可用于純化的其它肽標(biāo)簽包括但不限于對(duì)應(yīng)于衍生自流 感血凝素蛋白某表位的血凝素“HA”標(biāo)簽(Wilson等，Cell, 37 767)和“flag”標(biāo)簽。在其它實(shí)施方式中，可將本發(fā)明支架、其類似物或衍生物與診斷或可檢測(cè)試劑偶 連?？衫眠@種支架作為臨床檢驗(yàn)方法的一部分來(lái)監(jiān)測(cè)或預(yù)后疾病的發(fā)生或進(jìn)展，例如測(cè) 定具體療法的效力。可將支架與可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)這種診斷和檢測(cè)，所述可檢測(cè)物質(zhì) 包括但不限于各種酶，例如但不限于辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙 酰膽堿酯酶；輔基，例如但不限于鏈霉親和素/生物素及親和素/生物素；熒光材料，例如 但不限于傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素(dichlorotriaz inylaminefluorescein)、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料，例如但不限于魯米諾；生物發(fā) 光物質(zhì)，例如但不限于螢光素酶、螢光素和水母蛋白；放射性物質(zhì)，例如但不限于碘(1311、 1251、1231、1211)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115ln、113ln、112ln、mln)、锝(99Tc)、鉈(2tllTi)、鎵 (6W7Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y、47Sc、186Re J88ReJ42PiNic15RtK97Riu68Gh57CcK65ZrK85SiN32Pj53GcU169YlK51CiN54MrK75SeJ13SrK 和117Tn ；用于各種正電子發(fā)射斷層顯像的正電子發(fā)射金屬和非放射性順磁金屬離子，以及 作放射性標(biāo)記或偶連于特定放射性同位素的分子。本發(fā)明還包括利用與治療性部分偶連的支架?？蓪⒅Ъ芘c治療性部分，例如 細(xì)胞毒素，如抑制細(xì)胞或殺細(xì)胞藥物，治療性藥物或放射性金屬離子，如α-(射線)發(fā) 射體偶連。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性藥物可以是對(duì)細(xì)胞有害的任何藥物。治療性部分包括 但不限于抗代謝劑(如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、 達(dá)卡巴嗪)、烷化劑(如雙氯乙基甲胺、塞替派(thio印a)、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司 汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和 順二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環(huán)霉素類(如道諾比星(以前稱為道諾霉素)和多 柔比星)、抗生素(如放線菌素d(以前稱為放線菌素)、博來(lái)霉素、光神霉素和氨茴霉 素(AMC))、耳他汀分子(如耳他汀PHE、苔蘚抑素1和索拉他汀liKsolastatin 10)；參 B Woyke 等，Antimicrob. Agents Chemother. 46 3802-8 (2002), Woyke 等，Antimicrob. AgentsChemother. 45 3580-4 (2001)，Mohammad 等，Anticancer Drugs 12 735-40 (2001)，Wall 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 266 76-80 (1999)，Mohammad 等，Int. J. Oncol. 15 367-72 (1999)，所有通過(guò)引用納入本文)、激素(如糖皮質(zhì)激素類、孕激素、雄激素和雌激 素)、DNA修復(fù)酶抑制劑(如依托泊甙或拓?fù)涮婵?、激酶抑制劑(如化合物T1571、甲磺 酸伊馬替尼(Kantaijian 等，Clin Cancer Res. 8(7) :2167_76 (2002))、細(xì)胞毒劑(如紫 杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊甙、替尼泊甙、長(zhǎng)春新堿、 長(zhǎng)春堿、秋水仙素、多柔比星、道諾霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線 菌素D、l-去氫睪酮、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似物 或同源物)以及美國(guó)專利號(hào) 6，245，759,6, 399，633,6, 383，790,6, 335，156,6, 271，242、 6，242，196,6，218，410,6，218，372,6，057，300,6，034，053,5，985，877,5，958，769, 5，925，376,5，922，844,5，911，995,5，872，223,5，863，904,5，840，745,5，728，868, 5，648，239,5, 587，459中公開的化合物)、法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(如R115777、BMS-214662 和美國(guó)專利號(hào) 6，458，935、6，451，812、6，440，974、6，436，960、6，432，959、6，420，387、
6，414，145,6,410，541、6，410，539、6，403，581,6，399，615、6，387，905、6，372，747、6，369，034,6，362，188、6，342，765、6，342，487,6，300，501、6，268，363、6，265，422、6，248，756,6,239，140、6，232，338、6，228，865,6，228，856、6，225，322、6，218，406、6，211，193,6,187，786、6，169，096、6，159，984,6，143，766、6，133，303、6，127，366、6，124，465,6，124，295、6，103，723、6，093，737,6，090，948、6，080，870、6，077，853、
6，071，935,6, 066，738,6, 063，930,6, 054，466,6, 051，582,6, 051，574 和 6，040，305 中公
開的化合物)、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(如喜樹堿；伊立替康；SN-38 ；拓?fù)涮婵担?-氨基喜樹 堿；GG-211(GI 147211) ；DX_8951f ；IST-622 ；盧比替康；卩比唑啉吖啶；XR-5000 ；賽托品 (saintopin) ；UCE6 ；UCE1022 ；TAN-1518A ；TAN-1518B ；KT6006 ；KT6528 ；ED-110 ；NB-506 ； ED-110 ；NB-506 ；和羅貝霉素(rebeccamycin))；布各雷(bulgarein) ；DNA 小溝結(jié)合劑如 Hoescht染料33342和Hoechst染料33258 ；兩面針堿；花椒寧堿；表小檗堿；甲氧檗因； β-拉帕醌；BC-4-1 ；二膦酸鹽(如阿侖膦酸鹽、西馬膦酸鹽(cimadronte)、氯屈膦酸鹽、 替魯膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、奈立膦酸鹽、奧帕膦酸鹽(olpandronate)、利塞膦 酸鹽、吡膦酸鹽、帕米膦酸鹽、坐萊膦酸鹽(zolendronate))、HMG-CoA還原酶抑制劑(如 洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、他汀、西立伐他汀、來(lái)適可、魯匹妥 (Iupitor)、羅蘇伐他汀和阿托伐他汀)和其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、包合物和前藥 (參見例如 Rothenberg，Μ. L.，Annals of Oncology 8 :837_855 (1997)；禾口 Moreau，P.等， J. Med. Chem. 41 :1631-1640 (1998))，反義寡核苷酸(如美國(guó)專利號(hào) 6，277，832,5, 998，596、 5，885，834,5, 734，033和5，618，709公開的物質(zhì))，免疫調(diào)節(jié)劑(如抗體和細(xì)胞因子)、抗 體和腺苷脫氨酶抑制劑(如磷酸氟達(dá)拉濱和2-氯脫氧腺苷)。例子包括紫杉醇、松胞菌 素B、短桿菌肽D、溴乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊甙、替尼泊甙、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水 仙素、多柔比星、道諾霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、l-去氫 睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似物或同 源物。治療劑包括但不限于抗代謝劑(如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、 5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪)、烷化劑(如雙氯乙基甲胺、塞替派(thio印a)、苯丁酸氮芥、美法 侖、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉 素C和順二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環(huán)霉素類(如道諾比星(以前稱為道諾霉素)和多柔比星)、抗生素(如放線菌素d(以前稱為放線菌素)、博來(lái)霉素、光神霉素和氨茴霉素 (AMC))、耳他汀分子(如耳他汀PHE、苔蘚抑素1和索拉他汀10 ；參見Woyke等，Antimicrob. Agents Chemother. 46 3802-8 (2002)， Woyke 等，Antimicrob. Agents Chemother. 45 3580-4(2001)，Mohammad 等，Anticancer Drugs 12 :735_40 (2001)，Wall 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 266 :76_80(1999)，Mohammad 等，Int. J. Oncol. 15 :367_72 (1999)，所 有通過(guò)引用納入本文)、抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)、激素(如糖皮質(zhì)激素類、 孕激素、雄激素和雌激素)、DNA修復(fù)酶抑制劑(如依托泊甙或拓?fù)涮婵?、激酶抑制劑(如 化合物 T1571、甲磺酸伊馬替尼(Kantaijian 等，Clin Cancer Res. 8(7) :2167_76 (2002)) 以及美國(guó)專利號(hào) 6，245，759,6, 399，633,6, 383，790,6, 335，156,6, 271，242,6, 242，196、 6，218，410,6，218，372,6，057，300,6，034，053,5，985，877,5，958，769,5，925，376, 5，922，844,5，911，995,5，872，223,5，863，904,5，840，745,5，728，868,5，648，239, 5，587，459中公開的化合物)、法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(如R115777、BMS-214662和美國(guó)專
利號(hào)6，458，935,6, 451，812、6:,440,974,6,436，960,6,432，959,6, 420, 387,6，414:,145、6，410，541,6,410，539、6:,403，581、6，399:’ 615、6，387，905,6，372，747,6，369，034、6，362，188,6,342，765,6;,342，487、6，300:’ 501、6，268，363,6，265，422,6，248，756、6，239，140,6,232，338,6;,228，865、6，228;,856、6，225，322,6，218，406,6，211，193、6，187，786,6,169，096,6,,159，984、6，143;,766、6，133，303,6，127，366,6,124，465、6，124，295,6，103，723,6,,093，737、6，090;,948、6，080，870,6，077，853,6，071，935、
6，066，738,6, 063，930,6, 054，466,6, 051，582,6, 051，574和 6，040，305 中公開的化合物)、
拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(如喜樹堿；伊立替康；SN-38 ；拓?fù)涮婵担?-氨基喜樹堿；GG-21KGI 147211) ；DX-8951f ；IST-622 ；盧比替康；吡唑啉吖啶；XR-5000 ；賽托品(saintopin)； UCE6 ；UCE1022 ；TAN-1518A；TAN-1518B；KT6006 ；KT6528 ；ED-110 ；NB-506 ；ED-110 ；NB-506 ； 和羅貝霉素(rebeccamycin))；布各雷(bulgarein) ；DNA小溝結(jié)合劑如Hoescht染料33342 和Hoechst染料33258 ；兩面針堿；花椒寧堿；表小檗堿；甲氧檗因；β _拉帕醌；BC-4-1 ；和 它們藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、包合物和前藥(參見例如Rothenberg，M. L.，Annals of Oncology 8:837-855(1997)；和 Moreau，P.等，J. Med. Chem. 41 1631-1640 (1998))，反義寡 核苷酸(如美國(guó)專利號(hào) 6，277，832,5, 998，596,5, 885，834,5, 734，033 和 5，618，709 公開的 物質(zhì))，免疫調(diào)節(jié)劑(如抗體和細(xì)胞因子)、抗體(例如，利妥昔單抗(Rituxan )、刺孢霉素 (Mylotarg 、伊利圖莫單抗(ibritumomab)圖西坦(tiuxetan) (Zevalin )和托西莫單抗 (Bexxar ))和腺苷脫氨酶抑制劑(如磷酸氟達(dá)拉濱和2-氯脫氧腺苷)。
此外，可將支架與能改進(jìn)給定的生物學(xué)反應(yīng)的治療性部分或藥物部分偶聯(lián)。治療 性部分或藥物部分不應(yīng)理解為僅限于典型的化療藥物。例如，藥物部分可以是具有所需 生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。這種蛋白質(zhì)可包括，例如毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋 白A、假單胞菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干 擾素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、組織纖溶酶原激活物、凋亡物質(zhì)(如TNF-α、 TNF-β ), AIM I (參見國(guó)際公布號(hào)WO 97/33899)、AIM II (參見國(guó)際公布號(hào)WO 97/34911)、 Fas 配體(Takahashi 等，1994，J. Immunol.，6 1567-1574)和 VEGI (參見國(guó)際公布號(hào) W099/23105)；血栓形成劑或抗血管新生藥物，例如血管抑制素、內(nèi)皮抑制素或凝血途徑 (coagulation pathway)的組分(如組織因子)；或生物反應(yīng)修飾劑，如淋巴因子(如白介素-1( “IL-1”)、白介素-2( “IL-2”)、白介素_6( “IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (“GM-CSF”)和粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”))、生長(zhǎng)因子(如生長(zhǎng)激素(“GH”))、或 凝血藥物(如鈣、維生素K、組織因子，例如但不限于Hageman因子(因子XII)、高分子量激 肽原(HMWK)、前激肽釋放酶(PK)、凝血蛋白因子II (凝血酶原)、因子V、XIIa、VIII、XIIIa、 XI、XIa、IX、IXa、X、血纖蛋白原的α和β鏈的磷脂血纖肽A和B、血纖蛋白單體)。還可將支架偶聯(lián)于治療性部分如放射性金屬離子，如α _發(fā)射體(如213Bi)或用于 將放射性金屬離子，包括但不限于131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm與多肽偶聯(lián)的大環(huán)螯合劑。在 某些實(shí)施方式中，所述大環(huán)螯合劑是可經(jīng)接頭分子與支架相連的1，4，7，10_四氮雜環(huán)十二 烷-N，N'，N"，N"‘-四乙酸(DOTA)。本領(lǐng)域公知這種接頭分子，參見Denardo等，1998， Clin Cancer Res. 4(10) 2483-90 ；Peterson φ, 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4) 553-7 ； Zimmerman等，1999，Nucl. Med. Biol. 26(8) :943_50，各篇文獻(xiàn)通過(guò)引用全文納入本文。將治療性部分偶聯(lián)于抗體的技術(shù)是熟知的，參見例如Arnon等，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy，，(癌癥治療中用于藥 物的免疫靶向的單克隆抗體)，刊于Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy (《單 克隆抗體和癌癥治療》)，Reisfeld等編，第243-56頁(yè)，(奧蘭李斯公司(Alan R. Liss, Inc.) 1985) ；Hellstrom 等，“Antibodies For DrugDelivery，，(用于藥物遞送的抗體)， 刊于Controlled Drug Delivery(《受控藥物遞送》)，(第二版)，Robinson等編，第 623-53 頁(yè)，(馬賽爾戴克公司(Marcel Dekker, Inc.) 1987) ；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review”(癌癥治療中的細(xì)胞毒性藥物 的抗體運(yùn)載體綜述)，刊于 MonoclonalAntibodies ‘84 biological And Clinical Applications (《單克隆抗體‘84 生物學(xué)和臨床應(yīng)用》)，Pinchera等編，第475-506頁(yè)， (1985) ；"Analysis, Results, AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”(癌癥治療中放射性標(biāo)記抗體的治療性應(yīng) 用)，干1J于MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy (《用于癌癥檢測(cè)禾口 治療的單克隆抗體》)，Baldwin等編，第303-16頁(yè)，(學(xué)術(shù)出版社(Academic Press) 1985) 禾口 Thorpe 等，1982，Immunol. Rev. 62 :119-58。應(yīng)選擇偶聯(lián)于支架的治療性部分或藥物，從而在對(duì)象中實(shí)現(xiàn)對(duì)具體疾病的所需預(yù) 防或治療作用。決定將哪種治療性部分或藥物偶聯(lián)于支架時(shí)，醫(yī)生或其他醫(yī)務(wù)人員應(yīng)考慮 以下情況疾病的性質(zhì)、疾病的嚴(yán)重程度和對(duì)象的情況。本發(fā)明支架也可連接于固體支持物，該固體支持物尤其可用于靶抗原的免疫測(cè)得 或純化。這種固體支持物包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙 烯或聚丙烯。6. 9 制備重組表達(dá)本發(fā)明支架需要構(gòu)建含有編碼該支架的多核苷酸的表達(dá)載體。一旦獲得 編碼支架的多核苷酸，可采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)通過(guò)重組DNA技術(shù)制備用于產(chǎn)生支架的載 體。因此，本文描述了通過(guò)表達(dá)含有支架編碼核苷酸序列的多核苷酸來(lái)制備蛋白的方法?？?采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含有支架多肽編碼序列及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信 號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括，例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組。因此， 本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明支架的操作性連接于啟動(dòng)子的核苷酸序列的可復(fù)制載體。
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通過(guò)常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，并通過(guò)常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生本 發(fā)明支架。因此，本發(fā)明包括含有編碼本發(fā)明支架的操作性連接于異源啟動(dòng)子的多核苷酸 的宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括但不限于微生物，例如細(xì)菌(如大腸桿菌(E. coli)和枯 草芽胞桿菌(B. subtilis))?？衫酶鞣N宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)本發(fā)明支架。這種宿主表達(dá)系統(tǒng)提供產(chǎn)生 感興趣編碼序列，隨后將其純化的運(yùn)載體，但也提供了用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn) 染時(shí)能原位表達(dá)本發(fā)明支架的細(xì)胞。這些系統(tǒng)包括但不限于微生物，例如用含有支架編 碼序列的重組細(xì)菌噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(如大腸桿菌 和枯草芽胞桿菌)；用含有支架編碼序列的重組酵母菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母菌(如酵母 (Saccharomyces)，畢赤酵母(Pichia))；用含有支架編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如， 桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用含支架編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花 葉病毒，CaMV ；煙草花葉病毒，TMV)感染或用含支架編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如， Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或包含含有源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(如金屬硫 蛋白啟動(dòng)子)或源自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(如腺病毒晚期啟動(dòng)子；牛痘病毒7. 5K啟動(dòng) 子)的重組表達(dá)構(gòu)建物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(如COS、CHO、BHK,293, NSO和3T3細(xì)胞)?？赏ㄟ^(guò)三種通用方法鑒定含有編碼本發(fā)明支架的基因插入物的表達(dá)載體(a)核 酸雜交，(b) “標(biāo)記”基因功能的存在或不存在，和(c)所插入序列的表達(dá)。在第一方法中， 可分別利用包含的序列與編碼肽、多肽、蛋白質(zhì)或融合蛋白的插入基因同源的探針，通過(guò)核 酸雜交檢測(cè)表達(dá)載體中是否存在編碼肽、多肽、蛋白質(zhì)或融合蛋白的基因。在第二方法中， 可根據(jù)載體中編碼抗體或融合蛋白的核苷酸序列插入所致某些“標(biāo)記”基因功能(例如，胸 苷激酶活性、對(duì)抗生素的耐受性、轉(zhuǎn)化表型、桿狀病毒中形成包含體等)是否存在來(lái)鑒定和 選擇重組載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果編碼支架的核苷酸序列插入載體的標(biāo)記基因序列內(nèi)， 可通過(guò)標(biāo)記基因功能不存在來(lái)鑒定含有編碼支架的插入基因的重組體。在第三方法中，可 通過(guò)檢驗(yàn)該重組體表達(dá)的基因產(chǎn)物(例如，支架或其多聚體)鑒定重組表達(dá)載體。這種使 用可以基于，例如蛋白質(zhì)在體外試驗(yàn)系統(tǒng)中的物理和功能特性，如該支架的結(jié)合、激動(dòng)或拮 抗特性。在一些實(shí)施方式中，至少可部分化學(xué)合成本發(fā)明支架。在其它實(shí)施方式中，可半合 成制備本發(fā)明支架。6. 10支架純化一旦通過(guò)重組表達(dá)產(chǎn)生了本發(fā)明支架，可通過(guò)蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域已知的任何方法來(lái) 純化，例如層析(如，金屬螯合層析、離子交換、親和力和分子大小柱層析)、離心、差別溶解 性或蛋白質(zhì)純化的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。本發(fā)明支架的高度穩(wěn)定性質(zhì)能允許改變純化方案。例如，本發(fā)明支架所顯示的熱 穩(wěn)定性允許加熱包含支架的粗制裂解液，從而通過(guò)變性除去主要的宿主細(xì)胞蛋白。在另一 實(shí)施方式中，本發(fā)明支架顯示的高度蛋白酶耐受性允許在任何純化步驟之前快速降解粗制 裂解液中的宿主細(xì)胞蛋白。本發(fā)明支架顯示的PH耐受性還允許在任何純化步驟之前通過(guò) 降低或升高PH來(lái)選擇性沉淀粗制裂解液中的宿主細(xì)胞蛋白。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)高溫 轉(zhuǎn)變、蛋白酶處理、PH上調(diào)或下調(diào)或以上任意的組合以圖除去粗制裂解液中主要的宿主細(xì) 胞蛋白來(lái)促進(jìn)純化本發(fā)明支架。在一些實(shí)施方式中，熱變性、蛋白酶處理或PH改變后剩余的蛋白質(zhì)是至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至 少85 %、至少90 %、或至少95 %的特異性支架蛋白。在一些實(shí)施方式中，純化支架的方法包括將含有所述支架的粗制裂解液的pH降 低至約6. 5、或約6. 0、或約5. 5、或約5. 0、或約4. 5、或約4. 0、或約3. 5、或約3. 0、、或約2. 5、 或約2.0以圖沉淀宿主細(xì)胞蛋白。在其它實(shí)施方式中，純化方法包括將含有所述支架的粗 制裂解液的PH升高至約8. 0、或約8. 5、或約9. 0、或約9. 5、或約10. 0、或約10. 5、或約11. 0、 或約11. 5、或約12.0、或約12.5以圖沉淀宿主細(xì)胞蛋白。6. 11支架的放大生產(chǎn)為大量獲得，可通過(guò)放大工藝(下文稱為“本發(fā)明的放大工藝”)制備本發(fā)明支架。 在一些實(shí)施方式中，可通過(guò)本發(fā)明的放大工藝在研究實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生支架，該工藝可放大從 而在分析級(jí)生物反應(yīng)器中(例如但不限于51^、1(^、151^、3(^或5(^生物反應(yīng)器)產(chǎn)生本發(fā) 明支架。在其它實(shí)施方式中，可通過(guò)本發(fā)明的放大工藝在研究實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生支架，該工藝可 放大從而在生產(chǎn)規(guī)模的生物反應(yīng)器中(例如但不限于75L、100L、150L、300L或500L生物 反應(yīng)器)產(chǎn)生本發(fā)明支架。在一些實(shí)施方式中，與在研究實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的生產(chǎn)工藝相比，本 發(fā)明的放大工藝不導(dǎo)致或幾乎不導(dǎo)致生產(chǎn)率降低。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的放大工藝以約lg/L、約2g/L、約3g/L、約5g/L、約 7. 5g/L、約 10g/L、約 12. 5g/L、約 15. Og/L、約 17. 5g/L、約 20g/L、約 25g/L、約 30g/L 或更高 的生產(chǎn)率產(chǎn)生支架。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的放大工藝以約10g/L-約300g/L、約10g/L_約250g/ L、約 10g/L-約 200g/L、約 10g/L-約 175g/L、約 10g/L-約 150g/L、約 10g/L-約 100g/L、約 20g/L-約 300g/L、約 20g/L-約 250g/L、約 20g/L_ 約 200g/L, from 20g/L_ 約 175g/L、約 20g/L-約 150g/L、約 20g/L-約 125g/L、約 20g/L_ 約 100g/L、約 30g/L_ 約 300g/L、約 30g/ L-約 250g/L、約 30g/L-約 200g/L、約 30g/L_ 約 175g/L、約 30g/L_ 約 150g/L、約 30g/L_ 約 125g/L、約 30g/L-約 100g/L、約 50g/L_ 約 300g/L、約 50g/L_ 約 250g/L、約 50g/L_ 約 200g/ L、50g/L-約 175g/L、約 50g/L_ 約 150g/L、約 50g/L_ 約 125g/L 或約 50g/L_ 約 lOOg/L 的生 產(chǎn)率產(chǎn)生支架。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的放大工藝以約10mg/L、約20m/L、約30mg/L、約50mg/ L、約 75mg/L、約 100mg/L、約 125mg/L、約 150mg/L、約 175mg/L、約 200mg/L、約 250mg/L、約 300mg/L或更高的生產(chǎn)率產(chǎn)生多聚支架。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的放大工藝以至少約10mg/L、至少約20m/L、至少約 30mg/L、至少約50mg/L、至少約75mg/L、至少約100mg/L、至少約125mg/L、至少約150mg/L、 至少約175mg/L、至少約200mg/L、至少約250mg/L、至少約300mg/L或更高的生產(chǎn)率產(chǎn)生多 聚支架。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的放大工藝以約10mg/L-約300mg/L、約10mg/L_約 250mg/L、約 10mg/L-約 200mg/L、約 10mg/L-約 175mg/L、約 10mg/L-約 150mg/L、約 IOmg/ L-約 100mg/L、約 20mg/L-約 300mg/L、約 20mg/L_ 約 250mg/L、約 20mg/L_ 約 200mg/L、20mg/ L-約 175mg/L、約 20mg/L_ 約 150mg/L、約 20mg/L_ 約 125mg/L、約 20mg/L_ 約 100mg/L、約 30mg/L-約 300mg/L、約 30mg/L_ 約 250mg/L、約 30mg/L_ 約 200mg/L、約 30mg/L_ 約 175mg/ L、約 30mg/L-約 150mg/L、約 30mg/L_ 約 125mg/L、約 30mg/L_ 約 100mg/L、約 50mg/L_ 約300mg/L、約 50mg/L-約 250mg/L、約 50mg/L-約 200mg/L、50mg/L-約 175mg/L、約 50mg/L_ 約 150mg/L、約50mg/L-約125mg/L或約50mg/L_約100mg/L的生產(chǎn)率產(chǎn)生多聚支架。6. 12產(chǎn)生分泌型支架本發(fā)明還提供胞內(nèi)產(chǎn)生支架或以分泌形式產(chǎn)生支架的方法。在一些實(shí)施方式中， 分泌型支架的產(chǎn)生水平如本文所述。在其它實(shí)施方式中，分泌型支架適當(dāng)折疊并完全功能 化。在其它實(shí)施方式中，分泌型支架的產(chǎn)生包括利用Ptac啟動(dòng)子。在其它實(shí)施方式中，分 泌型支架的產(chǎn)生包括利用oppA信號(hào)。在還有其它實(shí)施方式中，分泌型支架在原核宿主細(xì)胞 中表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，支架分泌入原核宿主細(xì)胞的周質(zhì)空間。在還有其它實(shí)施 方式中，支架直接分泌入培養(yǎng)基。在還有進(jìn)一步的實(shí)施方式中，可從粗制細(xì)胞培養(yǎng)液或周質(zhì) 提取物篩選支架。本發(fā)明還提供利用蛋白質(zhì)支架分泌串聯(lián)蛋白質(zhì)或融合物的方法。在一些實(shí)施方式 中，本發(fā)明支架可用作將肽和/或蛋白質(zhì)分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基或原核細(xì)胞周質(zhì)空間中的運(yùn)載 體分子。在另一實(shí)施方式中，純化本發(fā)明支架的方法包括將包含所述支架的粗制裂解液加 熱至70°C，15分鐘，隨后通過(guò)離心除去凝聚的化合物。在其它實(shí)施方式中，純化本發(fā)明支 架的方法包括將包含所述支架的粗制裂解液加熱至約50°C、約55°C、約60°C、約65°C、約 70°C、約75°C、約80°C、約85°C或約90°C，隨后通過(guò)離心除去凝聚的化合物。在其它實(shí)施方 式中，純化本發(fā)明支架的方法包括將粗制裂解液加熱至少約1分鐘、約2分鐘、約3分鐘、約 4分鐘、約5分鐘、約6分鐘、約7分鐘、約8分鐘、約9分鐘、約10分鐘、約11分鐘、約12分 鐘、約13分鐘、約14分鐘、約15分鐘、約20分鐘或約30分鐘，隨后通過(guò)離心除去凝聚的化 合物。在另一具體實(shí)施方式
中，純化本發(fā)明支架的方法包括將粗制裂解液的pH改變至 3. 0，將包含所述支架的粗制裂解液在70°C加熱15分鐘，然后通過(guò)離心除去凝聚的化合物。6. 13檢驗(yàn)支架可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法檢驗(yàn)本發(fā)明支架與靶標(biāo)的特異性結(jié)合?？刹捎玫拇?表性試驗(yàn)包括但不限于采用例如以下技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)系統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡、放 射性免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、“夾心"免疫測(cè)定、免疫沉淀試驗(yàn)、沉淀反應(yīng)、 凝膠擴(kuò)散沉淀毒反應(yīng)、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫放射測(cè)得、熒光免疫測(cè) 定，等等。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域已知的常規(guī)試驗(yàn)(參見，例如Ausubel等編，1994，最新分子生 物學(xué)方法，第1卷，約翰威利父子公司，紐約)。ELISA包括制備抗原(例如，支架)、用抗原包被96孔微量滴定板的孔、將偶連于 可檢測(cè)化合物，例如酶底物(如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)的感興趣表位結(jié)合蛋白 (例如，支架特異性抗體)加入孔中、溫育一定時(shí)期并檢測(cè)抗原是否存在。在ELISA中，感興 趣的表位結(jié)合蛋白不偶連于可檢測(cè)化合物，而可向孔中加入偶連于可檢測(cè)化合物的第二抗 體(識(shí)別感興趣的蛋白質(zhì))。此外，可將感興趣的蛋白質(zhì)包被孔，而不是用抗原包被孔。在 該情況中，可加入偶聯(lián)于可檢測(cè)化合物的第二抗體，然后向包被的孔中加入感興趣抗原。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道可作出改變以增加所檢測(cè)信號(hào)的參數(shù)以及本領(lǐng)域已知的ELISA的其 它改進(jìn)形式。ELISA的其它討論參見，例如Ausubel等編，1994，最新分子生物學(xué)方法，第1 卷，約翰威利父子公司，紐約，11. 2. 1。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種體外試驗(yàn)方法測(cè)得支架對(duì)抗原的結(jié)合親和力和其它結(jié) 合特性，包括例如平衡方法(如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA;或放射性免疫測(cè)定(RIA))、或 動(dòng)力學(xué)方法(如BIACORE 分析)和其它方法，例如間接結(jié)合試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)、熒 光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、凝膠電泳和色譜(如凝膠過(guò)濾)。這些和其它方法可采用檢測(cè)一 個(gè)或多個(gè)組分上的標(biāo)記和/或采用各種檢測(cè)方法，例如但不限于生色、熒光、發(fā)光或同位素 標(biāo)記。結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)的詳述見Paul，W. E.編，F(xiàn)undamental Immunology (基礎(chǔ)免疫 學(xué))，第 4 版，L&R 公司(Lippincott-Raven)，費(fèi)城(1999)?？赏ㄟ^(guò)許多不同方法增加本發(fā)明支架的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明支架 包含非天然產(chǎn)生的二硫鍵，如本文所述。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含N和/或C末 端區(qū)域的延伸段。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含至少一個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或 取代以便調(diào)節(jié)支架的表面電荷。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含改變以增加血清半衰 期，如本文所述。在還有另一實(shí)施方式中，本發(fā)明支架包含至少一個(gè)氨基酸殘基的添加、缺 失或取代以便穩(wěn)定支架的疏水核?？赏ㄟ^(guò)許多不同技術(shù)評(píng)估本發(fā)明支架的穩(wěn)定性。選擇本領(lǐng)域已知的技術(shù)包括解鏈 溫度、示差掃描量熱法(DSC)、圓二色性(⑶)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、蛋白酶耐受性、 等溫量熱法(ITC)、核磁共振(NMR)、固有熒光和生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，與工程改 造前的同一支架相比，本發(fā)明的工程改造支架顯示穩(wěn)定性增加。6. 14藥物組合物在另一方面，本發(fā)明通過(guò)組合物，例如但不限于含有本發(fā)明支架或靶標(biāo)結(jié)合蛋白 中的一種或組合，用藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體配制在一起的藥物組合物。這種組合物可包含 本發(fā)明不同支架中的一種或組合，例如但不限于兩種或更多種。例如，本發(fā)明的藥物組合物 可包含結(jié)合靶抗原上不同表位或具有互補(bǔ)活性的支架組合。本發(fā)明的藥物組合物還可在組合治療中，例如與其它藥劑組合給予。例如，組合治 療可包括本發(fā)明支架與至少一種其它治療相組合，其中所述治療可以是免疫治療、化療、放 療或藥物治療。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽。此類鹽的例子包括酸 加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些源自無(wú)毒性無(wú)機(jī)酸，如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴 酸、氫碘酸和亞磷酸等的鹽，以及源自無(wú)毒性有機(jī)酸，如脂族單和二羧酸、苯基取代的鏈烷 酸、羥基鏈烷酸、芳香酸、脂族和芳族磺酸等的鹽。堿加成鹽包括衍生自堿土金屬，例如鈉、 鉀、鎂、鈣等的鹽，以及衍生自無(wú)毒有機(jī)胺，如N，N' -二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯 卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺和普魯卡因等的鹽。本發(fā)明的藥物組合物也可包含藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化 劑包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫 酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基 甲苯(BHT)、卵磷脂、沒(méi)食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四 乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。用于本發(fā)明藥物組合物中的水性和非水性運(yùn)載體的例子包括水、乙醇、多元醇 (如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它們的合適混合物，植物油如橄欖油，以及可注射的有機(jī) 酯，如油酸乙酯。可利用涂覆材料如卵磷脂，在分散體的情況中通過(guò)保持所需粒度，和使用
53表面活性劑來(lái)維持合適的流動(dòng)性。這些組合物還可包含輔料，如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分散劑?？赏ㄟ^(guò)滅菌方法 和加入各種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇和苯酚山梨酸等確保防止 存在微生物。組合物中包含等滲劑，如糖、氯化鈉等也是理想的。此外，可通過(guò)加入能延緩 吸收的物質(zhì)，例如單硬脂酸鋁和明膠實(shí)現(xiàn)可注射藥物形式的長(zhǎng)期吸收。在制備和儲(chǔ)存條件下，藥物組合物通常必須無(wú)菌和穩(wěn)定?？蓪⒔M合物制成適合高 藥物濃度的溶液、微乳劑、脂質(zhì)體或其它有序結(jié)構(gòu)。運(yùn)載體可以是含有，例如水、乙醇、多元 醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及它們的合適混合物的溶劑或分散介質(zhì)。可利用 涂覆材料如卵磷脂，在分散體的情況中通過(guò)保持所需粒度和使用表面活性劑來(lái)維持合適的 流動(dòng)性。在許多情況中，組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉的 合適的。組合物中包含延遲吸收的試劑如單硬脂酸鹽和明膠可延長(zhǎng)可注射組合物的吸收?？梢曅枰獙⑺枇康幕钚曰衔锖蜕鲜鼋M分中的一種或組合摻入合適溶劑，隨后 滅菌和微過(guò)濾來(lái)制備無(wú)菌注射液。通常將活性活化物摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和上述其它所 需成分的無(wú)菌載體中來(lái)制備分散劑。在用于無(wú)菌注射液制備的無(wú)菌粉末情況中，優(yōu)選的制 備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，從之前無(wú)菌過(guò)濾的溶液得到活性組分和任何其它 所需組分的粉末。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物(例如，液體制劑)是基本不含內(nèi)毒素和/或相 關(guān)熱原物質(zhì)的無(wú)熱原制劑。內(nèi)毒素包括局限在微生物內(nèi)并且在微生物破壞或死亡時(shí)釋放 的毒素。熱原也包括來(lái)自細(xì)菌和其它微生物外膜的誘導(dǎo)發(fā)熱的熱穩(wěn)定性物質(zhì)(糖蛋白)。 如果給予人，這些物質(zhì)均可引起發(fā)熱、低血壓和休克。因?yàn)橛袧撛诘挠泻ψ饔?，?yōu)選的做法 是從靜脈內(nèi)給予的藥物溶液中去除即使含量很低的內(nèi)毒素。食品藥品管理局(“FDA") 規(guī)定在靜脈內(nèi)藥物應(yīng)用的一小時(shí)期間，上限是5內(nèi)毒素單位(EU)/劑量/千克體重(The United States PharmacopeialConvention, Pharmacopeial Forum(美國(guó)藥典大會(huì)，藥典論 壇)26(1) =223(2000)) 0當(dāng)以數(shù)百或數(shù)千毫克每千克體重的劑量給予治療性蛋白時(shí)，最好 去除即使痕量的內(nèi)毒素。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物中內(nèi)毒素和熱原水平低于10EU/mg、或 低于5EU/mg、或低于lEU/mg、或低于0. lEU/mg、或低于0. 01EU/mg、或低于0. 001EU/mg。在 另一實(shí)施方式中，組合物中內(nèi)毒素和熱原水平低于約10EU/mg、或低于約5EU/mg、或低于約 lEU/mg、或低于約 0. lEU/mg、或低于約 0. 01EU/mg、或低于約 0. 001EU/mg。6. 15劑量/給藥為了制備包含本發(fā)明支架的藥物或無(wú)菌組合物，將支架與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體 或賦形劑混合?？赏ㄟ^(guò)與凍干粉末、漿液、水性溶液、洗劑或懸浮液形式的生理上可接受的 運(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合制備治療和診斷物質(zhì)的制劑(參見例如Hardman等(2001) Goodman and Gilman' s The Pharmacological Basisof Therapeutics (古德曼禾口吉爾曼 治療藥理學(xué)基礎(chǔ))，紐約州紐約的MGH公司(McGraw-Hill，New York,N. Y.) ；Gennaro (2000) Remington :The Science andPractice of Pharmacy (雷明頓藥物科學(xué)禾口 實(shí)踐)； Lippincott, Williams 和 ffilkins,紐約州紐約；Avis 等(編)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms :ParenteralMedications (藥物劑型胃腸夕卜藥物)；紐約州 MD 公司(Marcel Dekker, NY) ；Lieberman 等(編)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms :Tablets(藥物 劑型片劑)，紐約州 MD 公司；Lieberman 等(編)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms Disperse Systems (藥物劑型分散體系)，紐約州 MD 公司；Weiner 和 Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety (賦形劑毒性和安全性)，紐約州紐約的MD公司)。治療劑給藥方案的選擇依據(jù)多種因素，包括實(shí)體的血清或組織周轉(zhuǎn)速率、癥狀的 水平、實(shí)體的免疫原性和生物基質(zhì)中靶細(xì)胞的可接近性。在某些實(shí)施方式中，在與可接受的 副作用水平相一致的情況下，給藥方案盡可能增大遞送給患者的治療劑用量。因此，生物遞 送量部分取決于特定實(shí)體和所治療癥狀的嚴(yán)重程度。選擇抗體、細(xì)胞因子和小分子的合適 劑量有指南可用(參見例如Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy (抗體治療)，英國(guó)牛津 郡生物科學(xué)出版公司(Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK) ；Kresina (編)(1991) MonoclonalAntibodies, Cytokines and Arthritis (單克隆抗體，細(xì)胞因子和關(guān)節(jié)炎)，紐 約MD公司(Marcel Dekker,New York,N. Y.) ；Bach(H) (1993)Monoclonal Antibodiesand Peptide Therapy in Autoimmune Diseases (自身免疫病中的單克隆抗體和多肽治療)， 紐約 MD 公司(Marcel Dekker, New York, N. Y.) ；Baert 等(2003) NewEngl. J. Med. 348 601-608 ；Milgrom 等(1999)New Engl. J. Med. 341 :1966_1973 ；Slamon 等(2001)New Engl. J. Med. 344 :783_792 ；Beniaminovitz,等(2000)NewEngl. J. Med. 342 :613_619 ；Ghosh 等 (2003) New Engl. J. Med. 348 :24_32 ；Lipsky 等(2000) New Engl. J. Med. 343 1594-1602)。臨床醫(yī)生使用本領(lǐng)域已知或懷疑會(huì)影響治療或估計(jì)會(huì)影響治療的參數(shù)或因素來(lái) 確定合適的劑量。通常，以稍低于最佳劑量的用量開始，然后少量遞增直至相對(duì)任何不良副 作用達(dá)到所需或最優(yōu)效果。重要的診斷手段包括檢測(cè)如炎癥癥狀或炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生水 平?？筛淖儽景l(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平，從而獲得有效實(shí)現(xiàn)特定患 者、組成與給藥方式的所需治療應(yīng)答而對(duì)患者無(wú)毒的活性成分用量。所選劑量水平取決于 各種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括所用的本發(fā)明特定組合物或其脂、鹽、酰胺的活性，給藥途徑，給 藥時(shí)間，所用特定化合物的排出率，治療持續(xù)時(shí)間，與所用特定組合物聯(lián)用的其他藥物、化 合物和/或材料，年齡、性別、體重、病癥、整體健康狀況、所治療病人的既往醫(yī)療史以及醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域熟知的類似因素。本發(fā)明支架可通過(guò)連續(xù)輸注提供，或以如1天、1周或每周1-7次的間隔提供?？赏?過(guò)靜脈內(nèi)、皮下、局部、口服、鼻部、直腸、肌肉內(nèi)、腦內(nèi)或吸入的方式提供劑量。具體的給藥 方案涉及避免顯著不良副作用的最大劑量或給藥頻率。每周總劑量可以是至少0. 05μ g/kg 體重、至少 0. 2μ g/kg、至少 0. 5μ g/kg、至少 1 μ g/kg、至少 10 μ g/kg、至少 100 μ g/kg、至少 0. 2mg/kg、至少 1. 0mg/kg、至少 2. 0mg/kg、至少 10mg/kg、至少 25mg/kg 或至少 50mg/kg (參 見如 Yang等(2003) New Engl. J. Med. 349 427-434 ；Herold等(2002) New Engl. J. Med. 346 1692-1698 ；Liu 等(1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67 :451_456 ；Portielji 等(20003) Cancer Immunol. Immunother. 52 133-144)。以摩爾/千克體重計(jì),小分子治療劑,例如肽 模擬物、蛋白質(zhì)支架、天然產(chǎn)物或有機(jī)化學(xué)物質(zhì)的所需劑量大致與抗體或多肽的相同。以 摩爾/千克體重計(jì)，小分子或支架治療劑的所需血漿濃度大致與抗體相同。該劑量可以是 至少15 μ g、至少20 μ g、至少25 μ g、至少30 μ g、至少35 μ g、至少40 μ g、至少45μ g、至 少50 μ g、至少55 μ g、至少60 μ g、至少65 μ g、至少70 μ g、至少75 μ g、至少80 μ g、至少 85μ g、至少90μ g、至少95 μ g或至少100 μ g。給予對(duì)象的劑量可以是至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12 或更多次。
對(duì)于本發(fā)明支架，給予患者的劑量可以是0. 000 lmg/kg-100mg/kg患者體 重。該齊U 量可以是 0. 0001mg/kg-20mg/kg、0. 0001mg/kg-10mg/kg、0. 0001mg/kg_5mg/ kg、0.0001-2mg/kg、0. 0001-lmg/kg、0. 0001mg/kg-0. 75mg/kg、0. 0001mg/kg-0. 5mg/ kg、0. 0001mg/kg-0. 25mg/kg、0. 0001-0. 15mg/kg、0. 0001-0. 10mg/kg、0. 001-0. 5mg/kg、 0. 01-0. 25mg/kg 或 0. 01-0. lOmg/kg 患者體重?？梢杂靡郧Э?kg)計(jì)的患者體重乘以以mg/kg計(jì)的待給予劑量來(lái)計(jì)算本發(fā)明 支架的劑量。本發(fā)明支架的劑量可以是150μg/kg患者體重或更少、125μg/kg或更少、 100 μ g/kg或更少、95 μ g/kg或更少、90 μ g/kg或更少、85 μ g/kg或更少、80 μ g/kg或更少、 75 μ g/kg或更少、70 μ g/kg或更少、65 μ g/kg或更少、60 μ g/kg或更少、55 μ g/kg或更少、 50 μ g/kg或更少、45 μ g/kg或更少、40 μ g/kg或更少、35 μ g/kg或更少、30 μ g/kg或更少、 25 μ g/kg或更少、20 μ g/kg或更少、15 μ g/kg或更少、10 μ g/kg或更少、5 μ g/kg或更少、 2. 5 μ g/kg或更少、2 μ g/kg或更少、1. 5 μ g/kg或更少、1 μ g/kg或更少、0. 5 μ g/kg或更少 或0. 5 μ g/kg或更少。本發(fā)明支架的單位劑量可以是0. lmg-20mg、0. lmg-15mg、0. lmg_12mg、 0. lmg-10mg、0. lmg-8mg、0. lmg-7mg、0. lmg-5mg、0. 1-2. 5mg、0. 25mg-20mg、0. 25_15mg、 0. 25_12mg、0. 25_10mg、0. 25_8mg、0. 25mg_7mg、0· 25mg_5mg、0· 5mg-2. 5mg、lmg_20mg、 Img-15mg、lmg-12mg、Img-IOmg、lmg_8mg、lmg_7mg、lmg_5mg 或 lmg-2. 5mg。本發(fā)明支架的劑量在對(duì)象中可達(dá)到的血清滴度為至少0. 1 μ g/ml、至少0. 5 μ g/ ml、至少 1 μ g/ml、至少 2 μ g/ml、至少 5 μ g/ml、至少 6 μ g/ml、至少 10 μ g/ml、至少 15 μ g/ ml、至少 20 μ g/ml、至少 25 μ g/ml、至少 50 μ g/ml、至少 100 μ g/ml、至少 125 μ g/ml、至 少 150 μ g/ml、至少 175 μ g/ml、至少 200 μ g/ml、至少 225 μ g/ml、至少 250 μ g/ml、至少 275 μ g/ml、至少 300 μ g/ml、至少 325 μ g/ml、至少 350 μ g/ml、至少 375 μ g/ml 或至少 400 μ g/ml0或者，本發(fā)明支架的劑量在對(duì)象中可達(dá)到的血清滴度為至少0. 1 μ g/ml、至少 0. 5 μ g/ml、至少 1 μ g/ml、至少 2 μ g/ml、至少 5 μ g/ml、至少 6 μ g/ml、至少 10 μ g/ml、至少 15 μ g/ml、至少 20 μ g/ml、至少 25 μ g/ml、至少 50 μ g/ml、至少 100 μ g/ml、至少 125 μ g/ ml、至少 150 μ g/ml、至少 175 μ g/ml、至少 200 μ g/ml、至少 225 μ g/ml、至少 250 μ g/ml、至 少 275 μ g/ml、至少 300 μ g/ml、至少 325 μ g/ml、至少 350 μ g/ml、至少 375 μ g/ml 或至少 400 μ g/ml。可重復(fù)給予本發(fā)明支架的劑量，給藥間隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30 天、45天、2個(gè)月、75天、3個(gè)月或至少6個(gè)月。特定病人有效量可以根據(jù)諸如所治療的病癥、病人總體健康、給藥方法途徑和劑 量以及副作用嚴(yán)重性等因素而有所不同(參見如Maynard等(1996)AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice (藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范SOP手冊(cè))，佛羅里達(dá)州伯克萊屯英 特法姆出版社(Interpharm Press, Boca Raton, Fla. ) ；Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice (藥物實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范)，英國(guó)倫敦UP公司(Urch Publ. , London, UK)。給藥途徑可以通過(guò)，例如局部或皮膚應(yīng)用、靜脈內(nèi)注射或輸液、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、 肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、病損內(nèi)或緩釋系統(tǒng)或植入物(參見例如Sidman等 (1983)Biopolymers 22 547-556 ；Langer 等(1981)J. Biomed. Mater. Res. 15 167-277 ；Langer(1982)Chem. Tech. 12 98-105 ；Epstein 等(1985)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82 3688-3692 ；Hwang ^ (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034;美國(guó)專利號(hào) 6，350466和6，316，024)。如果需要，組合物也可含有增溶劑和局部麻醉劑，例如利多卡因 來(lái)減輕注射部位的疼痛。此外，也可采用肺部給藥，例如利用吸入器或噴霧器，和用霧化 劑配制。參見例如美國(guó)專利號(hào) 6，019，968,5, 985，320,5, 985，309,5, 934，272,5, 874，064、 5，855，913、5，290，540 和 4，880，078 ；以及 PCT
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