專利名稱：一種檢測(cè)dna,rna和超微量蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用DNA條碼一納米金一T7RNA轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Bio-DNA TMA) 方法檢測(cè)DNA， RNA和超微量蛋白質(zhì)的技術(shù)。
背景技術(shù)：
臨床分子水平定量檢測(cè)DNA， RNA和蛋白質(zhì)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷，疾病 療效和預(yù)后的判斷。目前一般釆用熒光定量PCR和RT-PCR， IVRNA轉(zhuǎn)錄介導(dǎo) 的雜交保護(hù)發(fā)光(TMA—HPA)檢測(cè)DNA和RNA含量，發(fā)光ELISA檢測(cè)微量 蛋白質(zhì)。另外，還有一類不需靶分子擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法如分支DNA雜交技術(shù) (bDNA)，捕獲雜交技術(shù)(Hybrid Capture, HC)。近年以納米材料發(fā)展的檢測(cè) DNA， RNA，微量蛋白質(zhì)技術(shù)引人注目，如MirkinCA等發(fā)明的DNA條碼一納 米金技術(shù)(Bio-coded nanoparticles technology)檢測(cè)DNA， RNA和超微量蛋白 質(zhì)。各種技術(shù)都有其優(yōu)缺點(diǎn)，核酸擴(kuò)增技術(shù)靈敏度高，但易產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性， 并且實(shí)驗(yàn)條件要求高；雜交技術(shù)簡(jiǎn)便易自動(dòng)化，重復(fù)好，但靈敏度較低，試劑成 本昂貴；納米技術(shù)靈敏高，方便，成本較低，但定量需特需儀器，不易標(biāo)準(zhǔn)化和 大規(guī)模檢測(cè)。發(fā)明內(nèi)容為了吸取各方法的優(yōu)點(diǎn)，避免其缺陷，本發(fā)明提供一種既具有PCR法的高 敏感性，又要避免PCR的缺陷，且簡(jiǎn)便易行的DNA條碼一納米金一T7RNA轉(zhuǎn) 錄擴(kuò)增(Bio-DNATMA)方法檢測(cè)DNA， RNA和超微量蛋白質(zhì)，用于科研和 臨床分子診斷。DNA條碼一納米金一T7RNA轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Bio-DNATMA)方法主要綜合利用 納米技術(shù)和TMA擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，克服各自的缺陷，建立的一種新的分子水平 檢測(cè)DNA， RNA和超微量蛋白質(zhì)技術(shù)。此技術(shù)首先利用磁珠捕獲探針上的捕獲 探針l(可為核酸或抗體)與納米結(jié)合探針上捕獲探針2(可為核酸或抗體)在液相中夾心ELISA檢測(cè)耙分子，再利用磁鐵吸附磁珠，很容易去除未結(jié)合的探 針和其他雜質(zhì)。由于納米結(jié)合探針結(jié)合成千上萬(wàn)的生物素標(biāo)記的條碼DNA，可 把檢測(cè)靶分子成千上萬(wàn)倍放大；每分子條碼DNA利用鏈親和素一生物素系統(tǒng)可 結(jié)合3分子含T7RNA啟動(dòng)子的DNA序列，從而可用TMA技術(shù)定量檢測(cè)條碼 DNA，而條碼DNA與靶分子含量成正比。對(duì)特定的含T7RNA啟動(dòng)子的DNA序 列，TMA技術(shù)可在3小時(shí)內(nèi)按一分子DNA模板轉(zhuǎn)錄出約1萬(wàn)分子RNA，相應(yīng) 地把條碼DNA擴(kuò)增一萬(wàn)倍。轉(zhuǎn)錄的RNA用高靈敏度的熒光染料RiboGreen熒 光光度法檢測(cè)(可檢測(cè)0.2ng的RNA)，通過(guò)上述三步放大反應(yīng)，可把耙分子擴(kuò) 增約3X1()S倍，可與PCR相媲美。Bio-DNATMA吸收了納米金技術(shù)和TMA技術(shù)的擴(kuò)增優(yōu)點(diǎn)，靈敏度可達(dá)PCR 技術(shù)水平，理論上可檢測(cè)一個(gè)耙分子。由于Bio-DNATMA不是直接擴(kuò)增耙分子， 因而避免了PCR技術(shù)的假陽(yáng)性問(wèn)題，且操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，易于大規(guī)模檢測(cè)， 也不需要貴重儀器，成本相對(duì)較低。此技術(shù)可應(yīng)用于檢測(cè)DNA， RNA和超微量 蛋白質(zhì)，特別是現(xiàn)在還沒(méi)有成熟的分子水平檢測(cè)體液中超微量蛋白質(zhì)技術(shù)，因而 Bio-DNATMA具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為磁珠捕獲探針和納米結(jié)合探針的制備示意圖；圖2為磁珠捕獲探針和納米結(jié)合探針夾心ELISA檢測(cè)靶DNA的過(guò)程示意圖；圖3為生物素一鏈親和素橋連TMA的過(guò)程示意4為T(mén)MA擴(kuò)增反應(yīng)示意圖；圖5為RiboGreen熒光定量檢測(cè)RNA的示意圖；圖6為Bio-DNATMA檢測(cè)RNA原理示意圖；圖7為Bio-DNATMA檢測(cè)超微量蛋白質(zhì)的原理示意圖。
具體實(shí)施方式
原理1.磁珠捕獲探針的制備表面帶有游離-NH3的磁珠，與末端帶有-SH的捕獲探4針l (3末端帶有-SH，中間帶有PEG和10個(gè)連續(xù)的A，作為間隔橋梁序列， 5末端為與檢測(cè)靶DNA 3末端互補(bǔ)的18—25bp堿基序列)用戊二醛的方法 連接氨基和巰基，使捕獲探針1標(biāo)記到磁珠表面，制成磁珠捕獲探針(圖1)。2. 納米結(jié)合探針的制備納米金顆粒的金原子與5末端帶有-SH的捕獲探針2 和條碼DNA (條碼DNA/捕獲探針2為100: 1)在水溶液中形成共價(jià)鍵，牢 固結(jié)合在納米金的表面，逐步加NaCl到終濃度為0.3M，使捕獲探針2和條 碼DNA在納米金表面伸展(捕獲探針2其5末端帶有-SH，中間帶有PEG 和IO個(gè)連續(xù)的A，作為間隔橋梁序列，3末端為與檢測(cè)耙DNA5末端互補(bǔ)的 18—25bp堿基序列；條碼DNA其5末端帶有-SH，中間帶有10個(gè)連續(xù)的A， 作為間隔橋梁序列，3末端為 一段與檢測(cè)DNA不互補(bǔ)且無(wú)關(guān)的18-25bp DNA， 并用生物素標(biāo)記)，制備納米結(jié)合探針(圖l)。3. 生物素標(biāo)記的含TV啟動(dòng)子的DNA序列的制備設(shè)計(jì)引物F: 5-BI0TIN-GAG AGA GGA TCC AAG TAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3f5末端用生物素 標(biāo)記，下劃線部分為1V啟動(dòng)子序列)；R: 5-ATC TTG CAA GAA AAC AGA TGG CAAGCATGA CTC GAG GCG CCT TGT CCC AAG陽(yáng)3 (下戈機(jī)部分為 T7 RNA酶終止序列).以pcDNA-HCCR質(zhì)粒(HCCR基因cDNA克隆入 pET-30a表達(dá)質(zhì)粒)為模板，PCR擴(kuò)增HCCR基因的500bp序列，擴(kuò)增產(chǎn)物 純化后作為生物素標(biāo)記的含IV啟動(dòng)子的DNA序列。4. Bio-DNATMA法檢測(cè)靶DNA原理磁珠捕獲探針上的捕獲探針1與檢測(cè)靶 DNA3末端互補(bǔ)，納米結(jié)合探針捕獲探針2與檢測(cè)DNA5末端互補(bǔ)，在雜交 緩沖液中夾心法結(jié)合靶DNA，磁鐵吸附磁珠捕獲探針，去上清液，并洗滌， 去除未結(jié)合的納米結(jié)合探針和其他雜質(zhì)(圖2)。再加入雜交緩沖液重懸磁珠， 以及鏈親和素，生物素標(biāo)記的含T7啟動(dòng)子的DNA序列，37°C，溫育30分鐘， 磁鐵吸附磁珠捕獲探針，去上清液，并洗滌，去除未結(jié)合的鏈親和素，生物 素標(biāo)記的含T7啟動(dòng)子的DNA序列(圖3)。加入T7RNA聚合酶緩沖液，T7RNA 聚合酶和四種核苷酸(UTP， ATP， GTP,CTP)， 37°C，溫育3小時(shí)，轉(zhuǎn)錄RNA(圖4)， RNA的量與檢測(cè)耙DNA含量成正比。轉(zhuǎn)錄的RNA用RiboGreen 熒光染料熒光光度計(jì)定量檢測(cè)(圖5)。5. Bio-DNATMA法檢測(cè)DNA的擴(kuò)增原理第一次擴(kuò)增直徑200nm的納米結(jié)合探針可結(jié)合約10000條DNA條碼，可 把靶DNA放大104倍。第二次擴(kuò)增;每一條條碼DNA可通過(guò)鏈親和素結(jié)合3條 生物素標(biāo)記的含T7啟動(dòng)子的DNA序列，放大3倍。第三次擴(kuò)增每一條含T7 啟動(dòng)子的DNA序列在T7RNA聚合酶作用下，3小時(shí)可合成約10"個(gè)RNA分子， 此步放大104倍。RiboGreen熒光染料最低能夠檢測(cè)0.2ngRNA，約對(duì)應(yīng)于108個(gè) 500bp的RNA分子。 一分子檢測(cè)靶DNA通過(guò)三次放大反應(yīng)可放大到3 X 108倍， 恰夠RiboGreen熒光染料檢測(cè)最低極限，因而理論上Bio-DNA TMA法可檢測(cè)到 一分子耙DNA。6. Bio-DNA TMA法檢測(cè)RNA原理磁珠捕獲探針上的捕獲探針1與檢測(cè)靶 RNA3末端互補(bǔ)，納米結(jié)合探針上捕獲探針2與檢測(cè)靶RNA5末端互補(bǔ)，在 雜交緩沖液中夾心法結(jié)合靶RNA，磁鐵吸附磁珠捕獲探針，去上清液，并洗 漆，去除未結(jié)合的納米結(jié)合探針和其他雜質(zhì)。再加入雜交緩沖液重懸磁珠， 以及鏈親和素，生物素標(biāo)記的含T7啟動(dòng)子的DNA序列，37°C，溫育30分鐘， 磁鐵吸附磁珠捕獲探針，去上清液，并洗滌，去除未結(jié)合的鏈親和素，生物 素標(biāo)記的含1V啟動(dòng)子的DNA序列。加入T7RNA聚合酶緩沖液，T7RNA聚 合酶和四種核苷酸(UTP,ATP,GTP,CTP)， 37°C，溫育3小時(shí)，轉(zhuǎn)錄RNA， RNA的量與檢測(cè)耙DNA含量成正比。轉(zhuǎn)錄的RNA用RiboGreen熒光染料熒 光光度計(jì)定量檢測(cè)(圖6)。7. Bio-DNATMA法檢測(cè)超微量蛋白的原理與檢測(cè)DNA， RNA不同的是，用 針對(duì)檢測(cè)靶蛋白的兩株結(jié)合位點(diǎn)不同的單抗，分別替代捕獲探針1和捕獲探 針2，制備磁珠捕獲探針和納米結(jié)合探針。磁珠捕獲探針上的抗體1與納米 結(jié)合探針上抗體2夾心法結(jié)合靶蛋白，磁鐵吸附磁珠捕獲探針，去上清液， 并洗滌，去除未結(jié)合的納米結(jié)合探針和其他雜質(zhì)。再加入結(jié)合緩沖液重懸磁 珠，以及鏈親和素，生物素標(biāo)記的含T7啟動(dòng)子的DNA序列，37°C，溫育30 分鐘，磁鐵吸附磁珠捕獲探針，去上清液，并洗滌，去除未結(jié)合的鏈親和素， 生物素標(biāo)記的含T7啟動(dòng)子的DNA序列。加入T7RNA聚合酶緩沖液，T7RNA 聚合酶和四種核苷酸(UTP, ATP, GTP， CTP)， 37°C，溫育3小時(shí)，轉(zhuǎn)錄RNA， RNA的量與檢測(cè)靶DNA含量成正比。轉(zhuǎn)錄的RNA用RiboGreen熒光染料熒 光光度計(jì)定量檢測(cè)(圖7)。實(shí)施例l: DNA的檢測(cè)1. 引物設(shè)計(jì)以檢測(cè)EBV的Bamffl-W片段DNA為例(NCBI genbankaccession No: Ml5973)。檢測(cè)Bamffl-W片段DNA的序列2091 CCATCCCTGA AGACCCAGCG GCCATTCTCT CTGGTAACGA GCAGAGAAGA AGTAGAGGCC CGCGGCCATT GGGCCCAGAT TGAGAGACCA GTCCAGGGGC CCGAGGTTGG AGCCAGCGGG CACCCGAGGT CC 2222。(1)，捕獲探針1: 5—GGG CTT GGC CGG GTC TAA -PEG- AAA AAA AAA A- SH-(C6)-3.(下劃線部分與EBV BamHI-W片段DNA結(jié)合)。 (2),捕獲探針2: 5 — SH-(C6) -AAA AAA AAA A-PEG- GGA GGG ACC GGG TGC TGG-3(下劃線部分與EBV BamHI-W片段DNA結(jié)合)。(3 )條碼DNA: 5 — SH-(C6) -AAA AAA AAA A-PEG- GGA TTC TCA ACT CGTAGCT-Biotin-3.(4)陽(yáng)性檢測(cè)靶DNA:以EBV BamHI-W片段DNA為模板，合成一段陽(yáng)性對(duì) 照引物，5—CCA GCA CCC GGT CCC TCC AAA AAA AAA TTA GAC CCG GCC AAG CCC-3(下劃線為橋聯(lián)序列)。2. 磁珠捕獲探針的制備(1)取lml直徑lpm表面帶有游離-NH3的磁珠，加4ml PBS (O.OIM， pH 7.4) 充分搖勻，用磁鐵吸附磁珠，去上清；重復(fù)三次，去上清。(2) 用PBS配制新鮮的5X戊二醛溶液。(3) 在磁珠中加入新鮮配制的5ml5X戊二醛溶液，充分搖勻，放在旋轉(zhuǎn)搖床， 室溫?fù)u3小時(shí)。(4) 用磁鐵吸附磁珠，去上清；加5mlPBS充分搖勻，磁鐵吸附磁珠，去上清， 重復(fù)三洗次。(5) 加入50D的捕獲探針1 (過(guò)量)，充分搖勻，放在旋轉(zhuǎn)搖床，室溫?fù)u24 小時(shí)。(6) 用磁鐵吸附磁珠，去上清；加5mlPBS充分搖勻，磁鐵吸附磁珠，去上清， 重復(fù)三洗次。(7) 加入1M的甘氨酸5ml，充分搖勻，放在旋轉(zhuǎn)搖床，室溫?fù)u3小時(shí)，封 閉非結(jié)合位點(diǎn)。(8) 用磁鐵吸附磁珠，去上清；加5mlPBS充分搖勻，磁鐵吸附磁珠，去上清，重復(fù)三洗次。最后用lmlPBS重懸，4'C保存。(9) 260 nm測(cè)定OD值，驗(yàn)證捕獲探針1是否標(biāo)記上。2. 納米結(jié)合探針的制備(1) 捕獲探針2和條碼DNA引物用純水溶解，按條碼DNA/捕獲探針2為 100: 1的比例混勻。(2) 取5ml直徑100nm的納米金溶液，加入總量為50D的條碼DNA和捕 獲探針2混和液，充分搖勻。室溫旋轉(zhuǎn)搖床搖過(guò)夜。(3) 加熱至60度，加入5MNaC150ul， 10%SDS 50ul，混勻，室溫旋轉(zhuǎn)搖床 搖2h。加熱至60度，加5M NaCl 50ul混勻，室溫旋轉(zhuǎn)搖床搖2h;重復(fù)四次。 使NaCl終濃度為0.3M。觀察溶液顏色為紫紅色。(4) 10000rpm離心IO分鐘，去上清；加入PBS含0.3 M NaCl， 0.1%SDS， 重懸。同樣離心洗滌3次，最后加入用5mlPBS含5% BSA 0.3 MNaCl， 0.1% SDS重懸，37°C，搖2h， 封閉未結(jié)合位點(diǎn)。10000rpm離心IO分鐘，去封閉液， 力口lmlPBS (含0.3MNaCl， 0.1%SDS)重懸，4'C保存。(5) 260 nm測(cè)定OD值，驗(yàn)證條碼DNA和捕獲探針2是否標(biāo)記上。(6) 260nm-800nm光譜掃描，在560nm處有一高吸收峰(100nm金特征吸收 峰)，根據(jù)560nm OD值估算納米金的數(shù)量。(7) 取上面制備好的納米結(jié)合探針10ul，倍比稀釋，取lul點(diǎn)在醋酸纖維薄 膜上，37。C烤干，用5%的奶粉(含0.3 M NaCl， 0.1%SDS) 37。C封閉2h;加 HRP標(biāo)記的鏈親和素，37°C 30分鐘，用PBS含0.3MNaCl， 0.1^SDS洗膜四 次，加DAB顯色。驗(yàn)證條碼DNA標(biāo)記效率。3. Bio-DNA TMA法檢測(cè)EBV DNA:(1) ，取EDTA抗凝血槳500W，用QIAamp DNA Blood MiniKit (Qiagen)試劑 盒提取DNA，用50Pl純水洗脫。(2) ， 50W樣本DNA， 50W陽(yáng)性對(duì)照DNA， 50W PBS陰性對(duì)照，分別加入10W 5 X雜交液(含0.5XSDS， 5g聚蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白V, 1. 5M NaCl, 0. 5M Tris-Hcl， pH 8. 0) 95。C5min，取出馬上加入50W磁珠捕獲 探針和50W納米結(jié)合探針，6(TC10min，然后55'C旋轉(zhuǎn)雜交2小時(shí)。(3) 磁分離器吸附磁珠30秒，棄去上清液，加入500WPBS (0.3MNaCl， 0.1%SDS)洗3次。(4) 磁珠重懸于50liaPBS (0.3MNaCl， 0.1%SDS)，依次加入50W鏈親和 素(終濃度為5Pg/ml， 50W生物素標(biāo)記的含T7啟動(dòng)子的DNA序列(終濃度為 250ng/ml) 37°C，搖動(dòng)30min。 PBS (0.3MNaCl， 0.1%SDS)，同上洗4次。(5) 磁珠重懸于50WT7RNA轉(zhuǎn)錄液(1XT7RNA轉(zhuǎn)錄緩沖液，60UT7RNA聚 合酶，RNA酶抑制劑200U， 1.25MM NTP)， 37°C，搖動(dòng)3小時(shí)。(6) 加入20W RiboGreen工作液(Invitrogen試劑盒帶的TE緩沖液稀釋 200倍為工作液)，激發(fā)光為485mn，發(fā)射光535nm測(cè)定熒光。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(1) 把陽(yáng)性檢測(cè)靶DNA用PBS (0.3MNaCl， 0.1%SDS)倍比稀釋，使終濃度 依次為10。/ml ， 10Vml,l()2/ml， 103/ml, 104/ml, 105/ml, 106/ml， 107/ml，按 上面步驟操做，每一濃度做三個(gè)平行孔，測(cè)定熒光。(2) 取三個(gè)孔的熒光均值的對(duì)數(shù)與濃度對(duì)數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3) 樣品結(jié)果從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得去。實(shí)施例2: RNA的檢測(cè)1. 引物設(shè)計(jì)以檢測(cè)HCV的RNA為例(NCBI accession No: EU482888,檢測(cè)對(duì) 應(yīng)序列nt 1-216)。(1)， 捕獲探針l: 5—AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA AGC -PEG- AAA AAAAAA A- SH-(C6)-3.(下劃線部分與HCV 5-UTR nt 1-18 RNA結(jié)合)。 (2),捕獲探針2: 5—SH"C6) -AAA AAA AAAA隱PEG- CCC AAC ACT ACT CGG CTA G-3(下劃線部分與HCV 5-UTR nt 198-216 RNA結(jié)合)。(3 )條碼DNA: 5 — SH國(guó)(C6) -AAA AAA AAA A-PEG- GGA TTC TC A ACT CGT AGCT-Biotin-3.(4)陽(yáng)性檢測(cè)靶RNA: WHO HCV標(biāo)準(zhǔn)品。2. 磁珠捕獲探針的制備(1)取lml直徑l!im表面帶有游離-NH3的磁珠，力卩4ml PBS (O.OIM， pH 7.4，) 充分搖勻，用磁鐵吸附磁珠，去上清；重復(fù)三次，去上清。(2) 用PBS配制新鮮的5X戊二醛溶液。(3)在磁珠中加入新鮮配制的5ml5X戊二酸溶液，充分搖勻，放在旋轉(zhuǎn)搖床, 室溫?fù)u3小時(shí)。(4〉用磁鐵吸附磁珠，去上清；力卩5mlPBS充分搖勻，磁鐵吸附磁珠，去上清， 重復(fù)三洗次。(5) 加入50D的捕獲探針1 (過(guò)量)，充分搖勻，放在旋轉(zhuǎn)搖床，室溫?fù)u24 小時(shí)。(6) 用磁鐵吸附磁珠，去上清；力n5mlPBS充分搖勻，磁鐵吸附磁珠，去上清， 重復(fù)三次。(7) 加入1M的甘氨酸5ml，充分搖勻，放在旋轉(zhuǎn)搖床，室溫?fù)u3小時(shí)，封 閉非結(jié)合位點(diǎn)。(8) 用磁鐵吸附磁珠，去上清；力卩5mlPBS充分搖勻，磁鐵吸附磁珠，去上清， 重復(fù)三洗次。最后用lmlPBS (含RNA酶抑制劑100U)重懸，4°〇保存。(9) 260 nm測(cè)定OD值，驗(yàn)證捕獲探針1是否標(biāo)記上。 2.納米結(jié)合探針的制備(1) 捕獲探針2和條碼DNA引物用純水溶解，按條碼DNA/捕獲探針2為 100: 1的比例混勻。(2) 取5ml直徑100nm的納米金溶液，加入總量為50D的條碼DNA和捕 獲探針2混和液，充分搖勻。室溫旋轉(zhuǎn)搖床搖過(guò)夜。(3) 加熱至60度，加入5MNaC150ul， 10%SDS 50ul，混勻，室溫旋轉(zhuǎn)搖床 搖2h。加熱至60度，加5M NaCl 50ul混勻，室溫旋轉(zhuǎn)搖床搖2h;重復(fù)四次。 使NaCl終濃度為0.3M。觀察溶液顏色為紫紅色。(4) 10000卬m離心10分鐘，去上清；加入PBS含0.3MNaCl， 0.1%SDS， 重懸。同樣離心洗滌3次，最后加入用5mlPBS含5X BS夂0.3 MNaCl， 0.1% SDS重懸，37°C，搖2h，封閉未結(jié)合位點(diǎn)。10000rpm離心IO分鐘，去封閉液， 加l mlPBS (含0.3MNaCl， 0.1%SDS ， RNA酶抑制劑100U)重懸，4。C保 存。(5) 260 nm測(cè)定OD值，驗(yàn)證條碼DNA和捕獲探針2是否標(biāo)記上。(6) 260nm-800nm光譜掃描，在560nm處有一高吸收峰(100nm金特征吸收 峰)，根據(jù)560nm OD值估算納米金的數(shù)量。(7)取上面制備好的納米結(jié)合探針lOul，倍比稀釋，取lul點(diǎn)在醋酸纖維薄 膜上，37。C烤干，用5%的奶粉(含0.3 M NaCl， 0.1%SDS) 37。C封閉2h;加 HRP標(biāo)記的鏈親和素，37°C 30分鐘，用PBS含0.3 MNaCl， 0.1XSDS洗膜四 次，加DAB顯色。驗(yàn)證條碼DNA標(biāo)記效率。3. Bio-DNA TMA法檢測(cè)HCV RNA:(1) ，取EDTA抗凝血槳500W，用QIAamp RNA Blood MiniKit (Qiagen)試劑 盒提取RNA，用50W無(wú)RNA酶純水洗脫。(2) ， 50W樣本RNA， 50W陽(yáng)性對(duì)照HCV RNA， 50W PBS陰性對(duì)照，分別加入 10W 5X雜交液(含0.5XSDS， 5g聚蔗糖，5g聚乙烯吡咯垸酮，5g牛血清白 蛋白V， RNA酶抑制劑500U ，1.5M NaCl,O. 5M Tris-Hcl, pH 8.0) 65°C， 15min，取出馬上加入5tmi磁珠捕獲探針和50W納米結(jié)合探針，60。Cl0min， 然后55"C旋轉(zhuǎn)雜交2小時(shí)。(3) 磁分離器吸附磁珠30秒，棄去上清液，加入500f4PBS (0.3MNaCl， 0.1 XSDS,RNA酶抑制劑100U)洗3次。(4) 磁珠重懸于50WPBS (0.3MNaCl， 0.1 %SDS , RNA酶抑制劑100U)， 依次加入50W鏈親和素(終濃度為5Pg/ml， 50W生物素標(biāo)記的含T7啟動(dòng)子的 DNA序列(終濃度為250ng/ml) 37。C，搖動(dòng)30min。 PBS (0.3MNaCl， 0.1% SDS， RNA酶抑制劑IOOU)，同上洗4次。(5) 磁珠重懸于50WT7RNA轉(zhuǎn)錄液(1XT7RNA轉(zhuǎn)錄緩沖液，60UT7RNA聚 合酶，RNA酶抑制劑200U ， 1.25MM NTP)， 37'C，搖動(dòng)3小時(shí)。(6) 加入2(mi RiboGreen工作液(Invitrogen試劑盒帶的TE緩沖液稀釋 200倍為工作液)，激發(fā)光為485nm，發(fā)射光535nm測(cè)定熒光。4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(1)把WHOHCV標(biāo)準(zhǔn)品用PBS (0.3MNaCl， 0.1%SDS)倍比稀釋，使終濃 度依次為10Vml ， 10Vml ,102/ml, 103/ml, 104/ml ， 105/ml, 106/ml, 107/ml， 按上面步驟操做，每一濃度做三個(gè)平行孔，測(cè)定熒光。(2) 取三個(gè)孔的熒光均值的對(duì)數(shù)與濃度對(duì)數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3) 測(cè)定樣品結(jié)果從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得去。實(shí)施例3:微量蛋白的檢測(cè)1. 引物設(shè)計(jì)以檢測(cè)血清Her-2蛋白為例。(1) 條碼DNA: 5 — SH-(C6) -AAA AAA AAA A-PEG- GGA TTC TCA ACT CGTAGCT-Biotin-3.2. 抗Her-2單抗(克隆號(hào)6E2， Oncogene Sciences)包被ELISA板(1) Her-2單抗用pH9.0的碳酸鹽緩沖液稀釋成l^g/ml, 100W/孔，4。C過(guò)夜。(2) 去包被液，加5X奶粉200W/孔，4-C過(guò)夜，封板。(3) 去封閉液，用PBST緩沖液洗3次，放4r備用。 2.納米結(jié)合抗體的制備(1) 條碼DNA引物用純水溶解，混勻。(2) 取5ml直徑100nm的納米金溶液，加入50D的條碼DNA和500ng/ml Her-2單抗(克隆號(hào)A18， Oncogene Sciences)混和，充分搖勻。室溫旋轉(zhuǎn)搖床 搖過(guò)夜。(3) 加入5MNaCl 50ul, 10%SDS 50ul，混勻，室溫旋轉(zhuǎn)搖床搖2h。加5MNaCl 50ul混勻，室溫旋轉(zhuǎn)搖床搖2h;重復(fù)四次。使NaCl終濃度為0.3 M。觀察溶液 顏色為紫紅色。(4) 10000rpm離心10分鐘，去上清；加入PBS含0.3 MNaCl， 0.1%SDS， 重懸。同樣離心洗滌3次，最后加入用5mlPBS含5X BSA^ 0.3 MNaCl， 0.1% SDS重懸，37°C，搖2h，封閉未結(jié)合位點(diǎn)。10000rpm離心IO分鐘，去封閉液， 力口lmlPBS (含0.3MNaCl， 0.1%SDS)重懸，4。C保存。(5) 260 nm測(cè)定OD值，驗(yàn)證條碼DNA和捕獲探針2是否標(biāo)記上。280 nm 測(cè)定OD值，驗(yàn)證Her-2單抗是否標(biāo)記上。(6) 260nm-800nm光譜掃描，在560nm處有一高吸收峰(100nm金特征吸收 峰)，根據(jù)560mnOD值估算納米金的數(shù)量。(7) 取上面制備好的納米結(jié)合探針10ul，倍比稀釋，取lul點(diǎn)在醋酸纖維薄 膜上，37。C烤干，用5%的奶粉(含0.3 M NaCl， 0.1%SDS) 37。C封閉2h;加 HRP標(biāo)記的鏈親和素，37°C 30分鐘，用PBS含0.3 M NaCl， 0.1^SDS洗膜四 次，加DAB顯色。驗(yàn)證條碼DNA標(biāo)記效率。(8) 取上面制備好的納米結(jié)合探針10ul，倍比稀釋，取lul點(diǎn)在醋酸纖維薄膜上，37。C烤干，用5%的奶粉(含0.3 M NaCl, 0.1%SDS) 37。C封閉2h;加 HRP標(biāo)記的抗鼠IgG， 37°C 30分鐘，用PBS含0.3 M NaCl， 0.1 %SDS洗膜四 次，加DAB顯色。驗(yàn)證Her-2單抗標(biāo)記效率。3. Bio-DNA TMA法檢測(cè)血清Her-2蛋白(1)， 100W血清，100W陽(yáng)性對(duì)照Her-2蛋白，鮮l PBS陰性對(duì)照，分別力口 入包被好的ELISA板中，再加入100W納米結(jié)合抗體，37t:搖床搖120min。(3) 棄去孔中液體，加入200WPBST (0.3MNaCl， 0.1%SDS， 0.1%Tween 20)洗4次。(4) 依次加入50W鏈親和素(終濃度為5Pg/ni1， 50W生物素標(biāo)記的含T7啟 動(dòng)子的DNA序列(終濃度為250ng/ml) 37°C，搖動(dòng)30min。 PBST同上洗4次。(5) 加入50M1T7RNA轉(zhuǎn)錄液(1 X T7RNA轉(zhuǎn)錄緩沖液，60U T7RNA聚合酶， RNA酶抑制劑200U ， 1.25MM NTP), 37°C， 3小時(shí)。(6) 加入20W RiboGreen工作液(Invitrogen試劑盒帶的TE緩沖液稀釋 200倍為工作液)，激發(fā)光為485nm，發(fā)射光535nm測(cè)定熒光。4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(1)把Her-2蛋白(Oncogene Sciences)倍比稀釋，使終濃度依次為lpg/ml ， 10pg/ml,100pg/ml, lng/ml， 10ng/ml, 100ng/ml, 1000ng/ml。按上面步驟 操做，每一濃度做三個(gè)平行孔，測(cè)定熒光。(2) 取三個(gè)孔的熒光均值的對(duì)數(shù)與濃度對(duì)數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3) 測(cè)定樣品結(jié)果從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得去。
權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)DNA，RNA或超微量蛋白質(zhì)的方法，按照以下步驟進(jìn)行(1)制備磁珠捕獲探針1以及結(jié)合有生物素標(biāo)記的條碼DNA的納米結(jié)合探針2；(2)利用磁珠捕獲探針上的捕獲探針1，以及納米結(jié)合探針上捕獲探針2在液相中夾心ELISA檢測(cè)靶分子；(3)利用磁鐵吸附磁珠，洗滌去除雜質(zhì)；(4)加入鏈親和素以及生物素標(biāo)記的含RNA啟動(dòng)子的DNA序列，使條碼DNA與生物素標(biāo)記的含RNA啟動(dòng)子的DNA序列結(jié)合；(5)利用磁鐵吸附磁珠，洗滌去除雜質(zhì)；(6)對(duì)含RNA啟動(dòng)子的DNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后檢測(cè)轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。
2. 按權(quán)利要求1所述的檢測(cè)DNA， RNA或超微量蛋白質(zhì)的方法，其特征在于 所述的納米結(jié)合探針2為納米金探針。
3. 按權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)DNA，RNA或超微量蛋白質(zhì)的方法，其特征在于 用作檢測(cè)DNA時(shí)，磁珠捕獲探針上的捕獲探針1與檢測(cè)靶DNA 3末端或者5末 端互補(bǔ)，納米結(jié)合探針捕獲探針2則相應(yīng)地與檢測(cè)DNA的另外一個(gè)末端互 補(bǔ)。
4. 按權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)DNA，RNA或超微量蛋白質(zhì)的方法，其特征在于 用作檢測(cè)RNA時(shí)，磁珠捕獲探針上的捕獲探針1與檢測(cè)靶RNA 3末端或5末端 互補(bǔ)，納米結(jié)合探針上捕獲探針2則相應(yīng)地與檢測(cè)靶RNA的另外一個(gè)末端互 補(bǔ)。
5. 按權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)DNA， RNA或超微量蛋白質(zhì)的方法，其特征在于 用作檢測(cè)蛋白質(zhì)時(shí)，磁珠捕獲探針上的捕獲探針l以及納米結(jié)合探針上捕獲探 針2分別是針對(duì)檢測(cè)靶蛋白的兩株結(jié)合位點(diǎn)不同的單抗。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)DNA，RNA和超微量蛋白質(zhì)的方法，首先利用磁珠捕獲探針上的捕獲探針1(可為核酸或抗體)與納米結(jié)合探針上捕獲探針2(可為核酸或抗體)在液相中夾心ELISA檢測(cè)靶分子，再利用磁鐵吸附磁珠，很容易去除未結(jié)合的探針和其他雜質(zhì)。由于納米結(jié)合探針結(jié)合成千上萬(wàn)的生物素標(biāo)記的條碼DNA，可把檢測(cè)靶分子成千上萬(wàn)倍放大；每分子條碼DNA利用鏈親和素—生物素系統(tǒng)可結(jié)合3分子含T₇RNA啟動(dòng)子的DNA序列，從而可用TMA技術(shù)定量檢測(cè)條碼DNA，而條碼DNA與靶分子含量成正比。對(duì)特定的含T₇RNA啟動(dòng)子的DNA序列，TMA技術(shù)可在3小時(shí)內(nèi)按一分子DNA模板轉(zhuǎn)錄出約1萬(wàn)分子RNA，相應(yīng)地把條碼DNA擴(kuò)增一萬(wàn)倍。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101250585SQ200810027100
公開(kāi)日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者劉萬(wàn)里, 宋立兵, 曾木圣 申請(qǐng)人:廣州市搏克生物技術(shù)有限公司