專利名稱：Hcv基因型分型和表型分型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HCV基因型分型(genotyping)和表型分型(phenotyping)分析。例 如，本發(fā)明包括用于擴(kuò)增HCV的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的組合物和引物。
背景技術(shù)：
丙型肝炎(HCV)是黃病毒科的帶包膜的正鏈RNA病毒。單鏈的HCVRNA基因組是 正極性的且包含一個(gè)長度為大約9600個(gè)核苷酸的開放讀碼框，其編碼大約3010個(gè)氨基酸 的多聚蛋白。在受感染的細(xì)胞中，多聚蛋白在多個(gè)位點(diǎn)被宿主和病毒蛋白酶切割，從而產(chǎn)生 病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白(C、El、E2/NS1)組成核衣殼蛋白和一個(gè)或兩個(gè)與膜結(jié)合的糖蛋白。非 結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)是催化并調(diào)節(jié)HCV RNA基因組復(fù)制的酶或 輔助因子。NS3既是蛋白水解切割酶又是解旋酶(為了復(fù)制而促進(jìn)病毒基因組的解螺旋)。 NS5b是病毒復(fù)制所需的RNA依賴性的RNA聚合酶。HCV影響世界上大約3%的人口(170，000，000人)并且已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織宣布 為全球性健康傳染病。約50%至80%的感染了 HCV的人發(fā)展為具有病毒抗性的慢性肝炎。 具有慢性肝炎的個(gè)體發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)日益增加。HCV引起的末期肝病大約 占到肝移植的30%至40%。目前全球的HCV治療標(biāo)準(zhǔn)是聚乙二醇化的a-干擾素與利巴韋林(一種廣譜抗病 毒試劑)聯(lián)用。但是，該方案持續(xù)很久且不良好耐受。而且，只有大約一半的感染基因型 1HCV的個(gè)體對治療具有持久反應(yīng)。業(yè)界對于有效且安全替代干擾素或者可以用于含有干擾素的方案的治療劑有很 大的需要。幾種HCV抗病毒治療處于臨床試驗(yàn)中。例如，這些治療劑包括病毒蛋白酶抑制 劑和聚合酶抑制劑。已經(jīng)開發(fā)了 HCV蛋白酶NS3的抑制劑，其同時(shí)為高活性和選擇性的。 為此原因，這些化合物具有成為下一代抗HCV治療的前景(參見，例如，W0 00/09543、TO 00/09558和W000/59929，每篇皆通過引用全文并入本文)。盡管在用于感染HCV的患者的新的治療選擇的開發(fā)上取得了進(jìn)步，但是藥物抗性 仍是主要問題。由于缺少RNA依賴性的RNA聚合酶的修復(fù)活性，HCV表現(xiàn)出高度遺傳多樣 性。由于HCV聚合酶的保真率差，所以在接受特異性HCV抗病毒治療劑(例如，蛋白酶抑制 劑和聚合酶抑制劑)治療的患者中可能產(chǎn)生藥物抗性HCV突變，這與已經(jīng)在接受HIV抗病 毒治療劑治療的患者中觀察到的情況相似。除了對特異性靶向HCV的抗病毒治療產(chǎn)生抗性 之外，病毒能夠?qū)Ψ翘禺愋钥共《局委焺?例如干擾素)產(chǎn)生抗性。對蛋白酶抑制劑的藥物抗性受到特別關(guān)注。體外研究已經(jīng)表明HCV蛋白酶中的突 變能夠產(chǎn)生對蛋白酶抑制劑的抗性。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與HIV蛋白酶中的發(fā)現(xiàn)是類似的。例如，在
5HIV中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIV蛋白酶中的特異性突變導(dǎo)致對HIV蛋白酶抑制劑的表型敏感性降低。本發(fā)明提供了可用于確定HCV基因型和HCV表型的引物、試劑盒和方法。例如，本 發(fā)明的方法可用于預(yù)測患者對HCV治療劑的反應(yīng)和用于確定HCV藥物抗性(例如蛋白酶藥 物抗性)。本發(fā)明的方法還可用于臨床前的藥物開發(fā)以按活性篩選有前景的蛋白酶抑制劑。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于對鑒定丙型肝炎病毒(HCV)亞型有用的引物的發(fā)現(xiàn)和用于HCV基 因型分型和表型分型的方法的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明提供了引物、包含引物的試劑盒、用于擴(kuò) 增HCV(例如基因型1的HCV)的特定區(qū)域的方法、用于確定HCV的基因型和表型(例如基 因型la或lb等)的方法。本發(fā)明還包括用于確定存在藥物抗性HCV的方法。本發(fā)明提供了引物的群體。引物的群體可以包含第一或第二輪引物。在一 個(gè)實(shí)施方式中，每個(gè)引物包含編碼 Met/Lys-Glu/Gly-Thr/I le-Lys-I le/Val/Leu-I le/ Ala-Thr/Gln-Trp/Lys的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，每個(gè)引物的互補(bǔ)物包含編碼 Ser-Thr-Tyr-Gly/Cys-Lys-Phe-Leu-Ala-Asp-Gly 的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，每個(gè)引物包含編碼Ala-Pro/Hi s_11 e-Thr-Ala-Tyr-Ser/ Ala-Gln/Arg-Gln-Thr的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，每個(gè)引物的互補(bǔ)物包含編碼 Gly-Ser-Gly/Arg-Lys-Ser/Thr-Thr/Asn-Lys/Arg-Val-Pro-Ala/Val-Ala/Asp 的核酸序 列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含本發(fā)明引物的試劑盒。本發(fā)明提供了擴(kuò)增編碼HCV NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸的方法。本發(fā)明的方法包括， 例如，擴(kuò)增編碼NS3/4A結(jié)構(gòu)域或其部分、NS3結(jié)構(gòu)域或其部分(例如，NS3蛋白酶和NS3解 旋酶兩者，或NS3蛋白酶和一部分的NS3解旋酶)、NS2/NS3結(jié)構(gòu)域或其部分或NS2/NS3/4A 結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸。本發(fā)明包括使用第一和/或第二輪引物擴(kuò)增HCV蛋白酶結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方式中，第二輪引物(即第二組)嵌套于使用第一組引物所擴(kuò)增的核酸區(qū)域 內(nèi)。例如，本發(fā)明包括使用第一輪引物擴(kuò)增編碼蛋白酶結(jié)構(gòu)域的HCV核酸，所述第一輪 引物包含編碼 Met/Lys-Glu/Gly-Thr/Ile-Lys-Ile/Val/Leu-Ile/Ala-Thr/Gln-Trp/ Lys 和 Ser-Thr-Tyr-Gly/Cys-Lys-Phe-Leu-Ala-Asp-Gly 的核酸序列。第二輪引物可以 包含編碼 Ala-Pro/His-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser/Ala-Gln/Arg-Gln-Thr 和 Gly-Ser-Gly/ Arg-Lys-Ser/Thr-Thr/Asn-Lys/Arg-Val-Pro-Ala/Val-Ala/Asp 的核酸序列。本發(fā)明包括使用本發(fā)明的引物擴(kuò)增核酸樣品的方法，所述核酸樣品來自于被HCV 感染或懷疑被HCV感染的患者的樣品。在本發(fā)明的一個(gè)方面，使用基因型非特異性簡并引 物擴(kuò)增HCV蛋白酶結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，使用基因型特異性非簡并引物擴(kuò)增HCV 蛋白酶結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，使用鎖(locked)核酸(LNA)引物擴(kuò)增HCV蛋白酶 結(jié)構(gòu)域。使用本發(fā)明的引物僅僅基于編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸序列中的變異而對HCV 進(jìn)行基因型分型是可能的。本發(fā)明包括使用本發(fā)明的引物通過本領(lǐng)域已知的基于核酸的方 法(例如，PCR擴(kuò)增、測序和雜交方法)對HCV進(jìn)行基因型分型。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過擴(kuò)增NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域和/或?qū)S3蛋白酶結(jié) 構(gòu)域進(jìn)行測序而確定HCV基因型。例如，本發(fā)明包括擴(kuò)增HCV的蛋白酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的核酸片段
6并基于片段序列確定HCV的基因型的方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過使用基因型非特異 性簡并引物擴(kuò)增HCV蛋白酶結(jié)構(gòu)域并對所擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物進(jìn)行測序而確定HCV的基因型。 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過使用基因型特異性非簡并引物擴(kuò)增HCV蛋白酶結(jié)構(gòu)域并對所 擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物進(jìn)行測序而確定HCV的基因型。例如，使用本發(fā)明的方法，可以通過將靶序 列與已知基因型(例如Ia和/或lb HCV)的序列相比較而確定HCV的基因型。本發(fā)明還提供了確定例如在攜帶基因型1的HCV的患者中存在藥物抗性HCV的方 法。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過擴(kuò)增編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸片段并確定該片段內(nèi)存在 與藥物抗性相關(guān)的突變而確定藥物抗性HCV的存在。突變的存在是藥物抗性HCV的指征。 在一個(gè)實(shí)施方式中，擴(kuò)增的核酸編碼位置D168的突變，例如D168A和D168V。核酸可以編 碼另外的產(chǎn)生藥物抗性的突變，包括但不限于，NS3的位置A156(例如A156T和A156S)和 F43(例如F43S)的突變。在一個(gè)實(shí)例中，實(shí)施例2中描述的引物U3420和D4038可用于鑒 別這些與藥物抗性相關(guān)的突變。
本發(fā)明還提供了確定HCV表型(例如蛋白酶活性)的方法。該方法包括將HCV的 NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域克隆進(jìn)入篩選載體，所述篩選載體包含編碼一個(gè)或多個(gè)與HCV膜結(jié)合的 蛋白和可分泌性報(bào)道分子(例如可分泌性熒光素酶報(bào)道分子)的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方 式中，篩選載體包括載體中所允許的最大數(shù)目的與HCV膜結(jié)合的蛋白(例如4A、4B和5A， 例如，使非特異性背景噪聲信號最小化或減少非特異性背景噪聲信號)和可分泌性熒光素 酶報(bào)道分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，篩選載體包含HCV賂3解旋酶、44、48、5々、58(例如，58 的前6個(gè)氨基酸)和可分泌性熒光素酶報(bào)道分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，篩選載體包括HCV NS3解旋酶、4A、4B(例如，4B的前6個(gè)氨基酸)和可分泌性熒光素酶報(bào)道分子。在另一個(gè)實(shí) 施方式中，篩選載體包括HCV NS3解旋酶、4A、4B、5A(例如，5A的前6個(gè)氨基酸)和可分泌 性熒光素酶報(bào)道分子。篩選載體表達(dá)編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)另外的HVC NS結(jié)構(gòu)域(例如NS3 解旋酶、4A、4B、5A)和可分泌性報(bào)道分子的多核苷酸，其中NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)HCV NS結(jié)構(gòu)域和可分泌性報(bào)道分子可操作地連接。如果NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域是功能性的(即，能夠 切割多聚蛋白)，則報(bào)道分子(例如熒光素酶)被切割并被分泌。在存在合適的底物(例如 熒光素酶底物)時(shí)，可以在細(xì)胞外檢測到來自分泌的報(bào)道分子的信號。如果NS3蛋白酶結(jié)構(gòu) 域不是功能性的，則分泌性報(bào)道分子不被切割從而不被分泌(即，不能在細(xì)胞外產(chǎn)生信號)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，分離HCV并按照對HCV抗病毒治療劑(例如蛋白酶 抑制劑)的敏感性來篩選HCV。這個(gè)方法包括將分離的HCV的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域克隆進(jìn)入 本文描述的篩選載體(例如包含編碼HCV NS3解旋酶、4々、48、5々、58(例如，58的前6個(gè)氨 基酸)和分泌性熒光素酶報(bào)道分子的多核苷酸的篩選載體)。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與候選治療劑 (例如蛋白酶抑制劑)接觸。如果HCV對治療劑敏感，則NS3蛋白酶不切割分泌性熒光素報(bào) 道分子并且分泌性熒光素報(bào)道分子不被分泌。例如，這樣的方法可用于按照抗病毒活性進(jìn) 行化合物的臨床前篩選，確定患者是否對特定的抗病毒治療有反應(yīng)，以及確定患者是否對 特定的抗病毒治療有抗性。


圖1顯示了一個(gè)流程圖，其描繪了確定從患者中獲得的HCV的抗性的方法的示例性步驟。
圖2顯示了示例性報(bào)道系統(tǒng)。圖3顯示了以來自96孔Mini-Pr印的DNA進(jìn)行的表型分型分析的結(jié)果。圖4顯示了 96孔板上的表型分型分析的信號差異。圖5顯示了使用表型分型系統(tǒng)獲得的同一個(gè)NS3序列的EC50差異。圖6顯示了一個(gè)流程圖，其描繪了基于細(xì)胞的報(bào)道分子分析的自動(dòng)化程序的示例 性步驟。圖7顯示了使用本發(fā)明的示例性引物進(jìn)行的HCV NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的基因型分型 和表型分型。圖8顯示了基因型1分離體中上游引物U3276的氨基酸保守性。圖9顯示了基因型1分離體中下游引物D4221的氨基酸保守性。圖10顯示了基因型1分離體中上游引物U3420的氨基酸保守性。圖11顯示了基因型1分離體中下游引物D4038的氨基酸保守性。圖12顯示了使用基因型la/b非特異性簡并引物進(jìn)行的基因型分型分析的結(jié)果。圖13顯示了患者NS3克隆的表型分型結(jié)果。圖14顯示了 la/b特異性非簡并引物的序列。圖15顯示了以la/b特異性非簡并引物獲得的結(jié)果。圖16顯示了本發(fā)明的表型分型分析的可重復(fù)性。圖17顯示了以臨床樣品進(jìn)行的準(zhǔn)種(quasi-species)分析。圖18顯示了群體表型分型和克隆表型分型之間的比較。圖19顯示，表型分型分析報(bào)告了針對體外抗性研究中鑒別的變體的效力。圖20顯示了在混合群體分析中使用表型分型分析來鑒定體外鑒別的替代。發(fā)明詳述一般描述本發(fā)明包括HCV引物，所述引物能夠退火至編碼一個(gè)或多個(gè)NS3結(jié)構(gòu)域的HCV核 酸。本發(fā)明還包括擴(kuò)增編碼一個(gè)或多個(gè)NS3結(jié)構(gòu)域的核酸的方法，基因型分型的方法(例 如HCV的基因亞型分型)，檢測藥物抗性突變的方法和HCV表型分型的方法。本發(fā)明的組合 物和方法部分基于以下發(fā)現(xiàn)可以僅僅通過利用編碼一個(gè)或多個(gè)NS3結(jié)構(gòu)域的病毒核酸內(nèi) 的遺傳變異(即，無需知道NS3蛋白酶部分之外的變異)來確定HCV的基因型、HCV對于抗 病毒治療的敏感性和HCV對于抗病毒治療劑(即藥物)的抗性。除非另有指明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員通常理解的相同的意思。雖然與本文描述的相類似或等同的任何方法和材料均可用 于實(shí)踐或測試本發(fā)明，但是描述了優(yōu)選的方法和材料。定義如本文所用的術(shù)語"EC5tl”或半數(shù)最大效應(yīng)濃度是指誘導(dǎo)介于基線和最大值中點(diǎn) 處的反應(yīng)的藥物濃度。EC5tl代表在體內(nèi)獲得最大效應(yīng)的50%所需的藥物血漿濃度。術(shù)語 "IC5tl”或半數(shù)最大抑制濃度代表在體外抑制50%所需的藥物或抑制劑的濃度。如本文所用的術(shù)語“基因”是指任何與生物功能相關(guān)的DNA片段。因此，基因包括 但不限于，編碼序列和/或它們的表達(dá)所需的調(diào)節(jié)性序列?；蜻€可以包括非表達(dá)DNA片段，例如，所述DNA片段形成針對其它蛋白的識別序列。可以從多種來源獲得基因，包括從 目標(biāo)來源克隆或從已知的或預(yù)測的序列信息合成，基因可以包括這樣的序列，其被設(shè)計(jì)用 于具有想要的參數(shù)。如本文所用的術(shù)語“基因型分型”或“基因型分析”是指確定生物、生物的一部分、 基因或基因的一部分的遺傳序列。這樣的分析可以在病毒(例如HCV)中進(jìn)行，以確定個(gè)體 對特定的治療順利反應(yīng)的可能性。還可以進(jìn)行這樣的分析以確定是否存在與藥物抗性相關(guān) 的突變。如本文所用的術(shù)語“HCV盒”是指來自患者的HCV NS3核酸序列(即臨床HCV分離 體)。HCV盒可以任選地包含編碼另外的NS結(jié)構(gòu)域的核酸。例如，HCV盒可以包含NS3蛋 白酶結(jié)構(gòu)域、全部或部分的NS3解旋酶結(jié)構(gòu)域和/或全部或部分的NS4A。 如本文所用的術(shù)語“分離的”是指從臨床樣品(例如血液、血清)中分離的病毒核 酸或目標(biāo)蛋白和/或其它病毒成分(例如其它蛋白或核酸)。如本文所用的“分離的”核酸 序列是指基本上不含其它核酸序列的核酸序列，例如，至少約20%純、優(yōu)選至少約40%純、 更優(yōu)選約60%純、甚至更優(yōu)選約80%純、最優(yōu)選約90%純、甚至最優(yōu)選約95%純?？梢酝?過例如瓊脂糖凝膠電泳確定分離的核酸的純度?？梢酝ㄟ^遺傳工程中使用的標(biāo)準(zhǔn)克隆程序 來獲得分離的核酸序列，以將核酸序列從其天然位置轉(zhuǎn)移至不同的位點(diǎn)(在那里其將被復(fù) 制)?？寺〕绦蚩梢园ㄇ谐⒎蛛x想要的核酸片段(其包含編碼多肽的核酸序列)，將片 段插入載體分子，并將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中核酸序列的多個(gè)拷貝或克隆 將被復(fù)制。如本文所用的術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“引物”是指單鏈或雙鏈形 式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。因此，當(dāng)包含在多核苷酸中時(shí)，最常見的天 然產(chǎn)生的編碼核苷酸縮寫如下腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧 啶⑶。另外，字母R和Y分別代表嘌呤(A或G)和嘧啶(C或T)。字母K代表G或T ；字母 S代表G或C ；字母V代表A、G或C。此外，核苷酸后的上標(biāo)“M”指示該核苷酸被修飾，例如 AM,GMXM和TM分別指示修飾的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。修飾的核苷酸的例子 包括但不限于鎖核酸(LNA)。除非另有指明，否則單鏈核酸序列以一系列的5’至3’方向的 單字母縮寫表示。除非另有指明，否則特定的核酸序列暗含也包括其保守型修飾的變體(例如簡并 密碼子替代)和互補(bǔ)序列，以及明確指明的序列。特別地，可以通過產(chǎn)生這樣的序列而獲得 簡并密碼子替代所述序列中一個(gè)或多個(gè)選定的(或所有的)密碼子的第三個(gè)位置被混合 堿基和 / 或脫氧肌苷殘基替代(Batzer 等人(1991)Nucleic Acid Res. 19 5081 ；Ohtsuka 等人(1985) J. Biol. Chem. 260 :2605_2608 ；Cassol 等人(1992) ；Rossolini 等人(1994) Mol. Cell. Probes 8 :91_98)。術(shù)語核酸與基因、cDNA和基因編碼的mRNA可以互換使用。與待擴(kuò)增的核酸上的區(qū)域相比，上游引物一般與距離核酸分子5’末端較近的區(qū)域 結(jié)合。另一方面，與待擴(kuò)增的核酸上的區(qū)域相比，下游引物一般與距離核酸分子3’末端較 近的區(qū)域結(jié)合。如本文所使用，當(dāng)DNA片段被置于與另一個(gè)DNA片段有功能上的關(guān)聯(lián)時(shí)，該DNA片 段被稱作“可操作地連接”。例如，如果信號序列DNA作為前蛋白(pr印rotein)來表達(dá)(前 蛋白參與融合蛋白的分泌)，則信號序列DNA與編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA可操作地連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子刺激序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列可操作地連接。 一般地，可操作地連接的DNA序列是連續(xù)的并且處在讀碼相內(nèi)。類似地，當(dāng)多肽序列被置于 與另一個(gè)多肽序列有功能上的關(guān)聯(lián)時(shí)，該多肽序列為“可操作地連接”。因此，在一些實(shí)施方 式中，與另一個(gè)肽序列可操作地連接的蛋白酶序列這樣連接如果該蛋白酶序列是有功能 的，則其能夠使連接的肽序列中所結(jié)合的至少一個(gè)肽鍵發(fā)生蛋白水解。如本文所用的“表型分型”或“表型分析”是指確定HCV病毒的表型特征(例如， 對于抗病毒試劑的敏感性和/或抗病毒治療劑的抗性)的方法?？梢赃M(jìn)行這樣的分析以確 定HCV樣品中是否存在與藥物抗性相關(guān)的某些突變。如本文所用的術(shù)語“多肽”是指由肽鍵連接的氨基酸殘基的單鏈組成的化合物。本 文使用常規(guī)的氨基酸殘基的三字符或單字符代碼，其中，丙氨酸是ala或A ；精氨酸是arg 或R ；天冬酰胺是asn或N ；天冬氨酸是asp或D ；半胱氨酸是cys或C ；谷氨酸是glu或E ； 谷氨酰胺是gin或Q ；甘氨酸是gly或G ；組氨酸是his或H ；異亮氨酸是ile或I ；亮氨酸 是Ieu或L ；賴氨酸是Iys或K ；蛋氨酸是met或M ；苯丙氨酸是phe或F ；脯氨酸是pro或 P ；絲氨酸是ser或S ；蘇氨酸是thr或T ；色氨酸是trp或W ；酪氨酸是tyr或Y ；以及纈氨 酸是val或V。除非另有指明，否則當(dāng)多肽序列以一系列單字符和/或三字符縮寫表示時(shí)，與通 常的做法相一致，以N至C的方向表示序列?？s寫后的數(shù)字表明該氨基酸距離N末端的位 置(例如Met-I代表位置1的蛋氨酸)。
如本文所用的術(shù)語“重組”是指以基因或DNA的新的組合進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織 或生物。如本文所用的術(shù)語“個(gè)體”可以是人、哺乳動(dòng)物或動(dòng)物。接受治療的個(gè)體是需要治 療或潛在地需要治療的患者?！皞€(gè)體”和“患者”可以互換使用。在本文中提及引物時(shí)，術(shù)語“基本上互補(bǔ)”是指引物的互補(bǔ)性足夠與核苷酸序列在 指定的退火條件下選擇性地雜交，從而退火的引物能夠被聚合酶延伸以形成該核苷酸序列 的互補(bǔ)性拷貝。如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指將核酸(即核苷酸聚合物)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞。如本 文所用的術(shù)語“遺傳轉(zhuǎn)化”是指將DNA(特別是重組DNA)轉(zhuǎn)移并導(dǎo)入細(xì)胞。本文所用的“轉(zhuǎn) 化”包括轉(zhuǎn)染。如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化子”是指進(jìn)行了轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織或生物。如本文所用的術(shù)語“載體”廣泛地指任何編碼外源核酸的質(zhì)粒、噬?；虿《尽Ｔ撔g(shù) 語也被理解為包括促進(jìn)核酸轉(zhuǎn)移進(jìn)入病毒粒子或細(xì)胞的非質(zhì)粒、非噬粒和非病毒化合物， 例如，如，多聚賴氨酸化合物等。載體可以是適合作為輸送媒介用于將核酸或其突變體輸送 至細(xì)胞的的病毒載體，或者載體可以是適合用于同樣目的的非病毒載體。用于將DNA輸送 至細(xì)胞和組織的病毒和非病毒載體的例子在本領(lǐng)域是熟知的，在例如Ma等人(1997，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 94 12744-12746)中有描述。病毒載體的例子包括但不限于，重組 細(xì)胞巨化病毒、重組牛痘病毒、重組腺病毒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組腺相關(guān)病毒、重組禽痘病 毒等(Cranage等人，1986，EMBO J. 5 =3057-3063 ； 1994年8月18曰公布的國際專利申請WO 94/17810 ； 1994年10月27日公布的國際專利申請WO 94/23744)。非病毒載體的例子包括 但不限于脂質(zhì)體、DNA的多胺衍生物等。
如本文所用的術(shù)語“野生型”是指天然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽序列。HCV 引物本發(fā)明提供了包含至少1、2、3、4或5個(gè)引物的引物群體。在一個(gè)實(shí)施方式中，一 個(gè)或多個(gè)引物能夠退火(即雜交)至HCV基因組的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè) 引物能夠退火至編碼HCV蛋白酶的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)引物能夠退火 至編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)引物能夠退火至編碼 NS3/4A結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸。 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，本文公開的一個(gè)或多個(gè)引物能夠在核酸擴(kuò)增所需 的條件下擴(kuò)增HCV基因組的區(qū)域。在一個(gè)例子中，一個(gè)或多個(gè)引物能夠擴(kuò)增編碼HCV蛋白 酶的核酸。在一個(gè)例子中，一個(gè)或多個(gè)引物能夠擴(kuò)增編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域或其部分的核 酸。在另一個(gè)例子中，一個(gè)或多個(gè)引物能夠擴(kuò)增編碼NS3/4A結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸。引物可以是基因型特異性或簡并引物。此外，引物可以是上游引物或下游引物并 且可以在擴(kuò)增的第一輪、第二輪或任何后續(xù)輪次中使用。引物可以與任何已知的擴(kuò)增方法 一起使用，包括但不限于，聚合酶鏈反應(yīng)(“？0 ”)、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(“肌寸0 ”)、連接酶 鏈反應(yīng)(“LCR”)、自身連續(xù)(self-sustained)序列復(fù)制(“3SR”)(也稱為基于核酸序列 的擴(kuò)增(“NASBA”))、Q-B-復(fù)制酶擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增(“RCA”)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(“TMA”)、連 接子輔助的DNA擴(kuò)增(“LADA”)、多位點(diǎn)置換擴(kuò)增(“MDA”)、侵染及鏈置換擴(kuò)增(“SDA”)。在一個(gè)實(shí)施方式中，群體中的每個(gè)引物包含編碼具有氨基酸序列Met/Lys-Glu/ Gly-Thr/IIe-Lys-Ile/Val/Leu-Ile/Ala-Thr/Gln-Trp/Lys (SEQ ID NO 1)的多肽的核酸 序列。SEQ ID NO :1的引物可以是上游或下游引物且可以用于擴(kuò)增的第一輪或后續(xù)輪 次。在一些實(shí)施方式中，SEQ ID NO :1的引物是上游引物。在其它實(shí)施方式中，引物用于擴(kuò) 增的第一輪。SEQ ID NO 1 的氨基酸序列中 Met-l、Glu-2、Thr-3、Ile-6、Thr_7 和 Trp_8 的百分 率介于約 95%至約 99. 9%，相應(yīng)地 Lys-1、Gly_2、Ile_3、Ala_6、Gln-7 和 Lys-8 的百分率 介于約 5%至約 0. 1%。在一些實(shí)施方式中，Met-l、Glu-2、Thr-3、Ile-6、Thr-7 或 Trp-8 的 百分率是約 95%,96%,97%,98%,99%,99. 1%,99. 2%,99. 3%,99. 4%,99. 5%,99. 6%, 99. 7%,99. 8%或 99. 9%。Lys_l、Gly_2、Ile-3、Ala-6、Gln_7 和 Lys_8 的百分率相應(yīng)地改 變，從而每個(gè)氨基酸位置上的兩個(gè)百分率之和是100%。SEQ ID NO 1的氨基酸序列中Ile_5、Val_5和Leu_5的百分率分別介于約67% 至約72%、約14%至約18%和約12%至約17%。在一些實(shí)施方式中，Ile_5的百分率是約 67%,68%,69%,69. 1%,69. 2%,69. 3%,69. 4%,69. 5%、70%、71 %或 72%;Val_5 的百分 率是約 14%、15%、15· 9%、16%、16· 1%、16· 2%、16· 3%、17%或 18% ；Leu-5 的百分率是 約 12%、13%、14%、14. 4%、14. 5%、14. 6%、14. 7%、14. 8%、15%、16%或 17%，其中每個(gè) 氨基酸的百分率之和是100%。在示例性的實(shí)施方式中，引物的群體包含編碼氨基酸序列群的核酸序列，所述氨 基酸序列群具有以下的每種氨基酸分布Met (99. 5 % )/Lys(0. 5 % )-Glu(99. 5 % )/Gly(0. 5 % )-Thr (96. 5 % )/ Ile(3. 5 % )-Lys (100 % )-lie (69. 3 % )/Val(16. 1 % )/Leu(14. 6 % )-lie (99. 5 % )/Ala(0. 5% ) -Thr (99. 5% ) /Gln (0. 5% ) -Trp (99. 5% ) /Lys (0. 5% ) 在另一個(gè)示例性的實(shí)施方式中，每個(gè)引物包含與核酸序列 ATGGAGACYAAGVTYATYACSTGGG(SEQ ID NO 2)具有 80 %,85 %,90 %,95 %,96 %,97 98%、99%或100%同源性的核酸序列，其中任意核苷酸可以被修飾。修飾的核苷酸的 例子包括但不限于鎖核酸(LNA)。雖然本發(fā)明的引物可以包含任意數(shù)目的修飾的堿基， 例如具有LNA的引物，但是在一些實(shí)施方式中，引物包含約4個(gè)或約8個(gè)LNA。一般 地，A和T的修飾比G和C的修飾更常見。在一些實(shí)施方式中，每個(gè)引物包含核酸序列 ATGGAGACYAMAMGVTYAMTYAMCSTGGG 或 AMTGMGMAGACYAMAMGVTYAMTYAMCMSTGGG。在另一個(gè)實(shí)施方式中，群體中每個(gè)引物的互補(bǔ)物包含編碼具有氨基酸序列 Ser-Thr-Tyr-Gly/ Cys-Lys-Phe-Leu-Ala-Asp-Gly(SEQ ID NO 3)的多肽的核酸序列。SEQ ID NO :3的引物可以是上游或下游引物且可以用于擴(kuò)增的第一輪或后續(xù)輪 次。在一些實(shí)施方式中，SEQ ID NO :3的引物是下游引物。在其它實(shí)施方式中，引物用于擴(kuò) 增的第一輪。SEQ ID NO :3的氨基酸序列中Gly-4的百分率介于約95%至約99%，相應(yīng)地 Cys-4的百分率介于約5%至約1%。在一些實(shí)施方式中，Gly-4的百分率是約95%、96%、 97%、98%或99%。相應(yīng)地，Cys-4的百分率是約5%、4%、3%、2%或1%。在示例性的實(shí)施方式中，群體中引物的互補(bǔ)物包含編碼氨基酸序列群的核酸序 列，所述氨基酸序列群具有以下的每種氨基酸分布Ser (100%) -Thr (100%) -Tyr (100%) -Gly (97. 0 % ) /Cys (3. 0%) -Lys (100%) -P he(100% )-Leu (100% )-Ala(100% )-Asp (100% )-Gly(100% )。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方式中，每個(gè)引物包含與核酸序列CCGTCGGCAAGRAACTTGCC RTAGGTGGA(SEQ ID NO 4)具有 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源 性的核酸序列，其中任意核苷酸可以被修飾。修飾的核苷酸的例子包括但不限于LNA。在一 些實(shí)施方式中，每個(gè)引物包含核酸序列CCGTCGGCAAGRAMACTTMGCCRTMAGGTMGGA 或CCGTMCGGCAAMGRAMACTMTMGCCRTMAMGGTMGGA。在另一個(gè)實(shí)施方式中，群體中的每個(gè)引物包含編碼具有氨基酸序列Ala-Pro/ His-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser/Ala-Gln/Arg-Gln-Thr(SEQ ID NO 5)的多肽的核酸序列。SEQ ID NO :5的引物可以是上游或下游引物且可以用于擴(kuò)增的第一輪或后續(xù)輪 次。在一些實(shí)施方式中，SEQ ID NO :5的引物是上游引物。在其它實(shí)施方式中，引物用于擴(kuò) 增的第二輪。SEQ ID NO 5的氨基酸序列中Pro_2和Gln_8的百分率介于約95%至約99. 9%, 相應(yīng)地His-2和Arg-8的百分率介于約5%至約0. 1%。在一些實(shí)施方式中，Pro_2或Gln_8 的百分率是約 95 %、96 %、97 %、98 %、99 %、99. 1 %、99. 2 %、99. 3 %、99. 4 %、99. 5 %、 99. 6%、99. 7%、99. 8%或99. 9%。His_2和Arg_8的百分率相應(yīng)地改變，從而每個(gè)氨基酸 位置的兩個(gè)百分率之和是100%。SEQ ID NO 5的氨基酸序列中Ser_7和Ala_7的百分率分別介于約64%至約68% 和約32%至約36%。在一些實(shí)施方式中，Ser-7的百分率是約64%、65%、66%、67%或 68 % ；Ala-7的百分率是約32 %、33 %、34 %、35 %、或36 %，其中每個(gè)氨基酸的百分率之和 是 100%。
在示例性的實(shí)施方式中，引物的群體包含編碼氨基酸序列群的核酸序列，所述氨 基酸序列群具有以下的每種氨基酸分布Ala (100 % ) -Pro (99. 5%)/His(0. 5% )-lie (100% ) -Thr (100%) -Ala (100 % ) -T yr(100% )-Ser(66% )/Ala(34% )-Gln(99% )/Arg(l% )-Gln(100% )-Thr(100% )。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方式中，每個(gè)引物包含與核酸序列GCGCCYATYACGGCCTAYKC CCARCARAC(SEQ ID NO 6)具有 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源 性的核酸序列，其中任意核苷酸可以被修飾。修飾的核苷酸的例子包括但不限于LNA。在一 些實(shí)施方式中，每個(gè)引物包含核酸序列GCGCCYAMTMYACGGCMCTMAMYKCCCMARCMAMRAC 或GCGCCYAMTMYACGGCCTAMYKCCCARCAMRAC。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方式中，每個(gè)引物包含與核酸序列AGGGCATTTAAATAGCCACC ATGGCGCCYATYACGGCCTAYKCCCARCARAC(SEQ ID NO 7)或AAAAAGGCGCGCCACCATGGCGCCYATYACGGCCTAYKCCCARCARAC(SEQ ID NO 8)具有 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性的核酸序列，其中核酸序列 SEQ ID NO :7或8的任意核苷酸可以被修飾。示例性的弓I物還包括那些包含核酸序列AGGGCATTTAAATAGCCACCATGGCGCCYAMTMYACGGCCTAMYKCCCARCAMRAC 或AGGGCATTTAAATAGCCACCATGGCGCCYAMTMYACGGCMCTMAMYKCCCMA RCMAMRAC 的引物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，群體中每個(gè)引物的互補(bǔ)物包含編碼具有氨基酸序列 Gly-Ser-Gly/Arg-Lys-Ser/Thr-Thr/Asn-Lys/Arg-Val-Pro-Ala/Val-Ala/Asp(SEQ ID NO 9)的多肽的核酸序列。SEQ ID NO :9的引物可以是上游或下游引物且可以用于擴(kuò)增的 第一輪或后續(xù)輪次。在一些實(shí)施方式中，SEQ ID NO :9的引物是下游引物。在其它實(shí)施方 式中，引物用于擴(kuò)增的第二輪。SEQ ID NO 9 的氨基酸序列中 Gly_3、Ser_5、Thr_6、Ala-IO 和 Ala-Il 的百分率 介于約95%至約99. 9%，相應(yīng)地Arg-3、Thr_5、Asn_6、Val-IO和Asp-Il的百分率介于約 5%至約0. 1%ο在一些實(shí)施方式中，Gly-3、Ser_5、Thr_6、Ala-10或Ala-11的百分率是 約 95%,96%,97%,98%,99%,99. 1 %,99. 2%,99. 3%,99. 4%,99. 5%,99. 6%,99. 7%, 99. 8%或99. 9%。Arg-3、Thr-5、Asn-6、Val-IO和Asp-Il的百分率相應(yīng)地改變，從而每個(gè) 氨基酸位置上的兩個(gè)百分率之和是100%。SEQ ID NO 9的氨基酸序列中Lys_7和Arg_7的百分率分別介于約90%至約95% 和約10%至約5%。在一些實(shí)施方式中，Lys-7的百分率是約90%、91 %、92%、93%、94% 或95% ；相應(yīng)地，Arg-7的百分率是約10%、9%、8%、7%、6%或5%。在示例性的實(shí)施方式中，群體中引物的互補(bǔ)物包含編碼氨基酸序列群的核酸序 列，所述氨基酸序列群具有以下的每種氨基酸分布Gly (100 % ) -Ser (100 % ) -Gly (99. 5%)/Arg(0. 5% )-Lys (100% )-Ser (99. 5%)/ Thr (0. 5%) -Thr (99 % ) /Asn (1%) -Lys (93 % ) /Arg (7 % ) -Val (100%) -Pro (100%) -Ala (9 9% )/Val(l% )-Ala(99% )/Asp(l% )。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方式中，每個(gè)引物包含與核酸序列GCAGCCGGCACYTTRGTGCTYTTRCCGCTRCC(SEQ ID NO 10)具有 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源性的核酸序列，其中任意核苷酸可以被修飾。修飾的核苷酸的例子包括但不限于LNA。 在一些實(shí)施方式中，每個(gè)引物包含核酸序列GCAGCCGGCAMCYTTMRGTMGCTMYTMTMRCMCGCTMRCC 或GCAGCCGGCACYTTMRGTGCTMYTTMRCCGCTMRCC。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方式中，每個(gè) 引物包含與核酸序列AAAAAGCGGCCGCAGCCGGCACYTTRGTGCTYTTRCCGCTRCC(SEQID NO 11)或 CTTGGTTAATTAATGCAGCCGGCACYTTRGTGCTYTTRCCGCTRCC (SEQ ID NO 12)具有 80 %、 85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%同源性的核酸序列，其中核酸序列SEQ ID NO 11或12的任意核苷酸可以被修飾。示例性的引物還包括那些包含核酸序列AAAAAGCGGCCGCAGCCGGCACYTTMRGTGCTMYTTMRCCGCTMRCC 或AAAAAGCGGCCGCAGCCGGCAMCYTTMRGTMGCTMYTMTMRCMCGCTMRCC 的引物。在另一個(gè)示例性實(shí)施方式中提供了非簡并引物或?qū)δ承┗蛐突蚧騺喰吞禺?性的引物。示例性的HCV基因型Ia的引物包括ATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGG (例如上游引物)，ACCCGCCGTCGGCAAGGAACTTGCCGTA (例如，下游引物)，AGGGCATTTAAATAGCCACCATGGCGCCCATCACGGCGTACGCCCAGCAGAC (例如，上游引物)，AAAAAGCGGCCGCAGCCGGGACCTTGGTGCTCTTACCGCTGCC (例如，下游引物)。示例性的 HCV基因型Ib的引物包括ATGGAGACCAAGATCATCACCTGGG (例如，上游引物)，CCGTCGGCAAGGAACTTGCCATAGGTGGA (例如，下游引物)，AGGGCATTTAAATAGCCACCATGGCGCCCATCACGGCCTACTCCCAACAGAC (例如，上游引物)，AAAAAGCGGCCGCAGCCGGCACCTTAGTGCTCTTGCCGCTGCC (例如，下游引物)。試劑盒本發(fā)明包括包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的引物或其互補(bǔ)物的試劑盒。試劑盒可以包含 本發(fā)明引物的任意組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)編碼SEQ ID N0:1和 /或SEQ ID NO :3的多肽序列的引物或其互補(bǔ)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含一個(gè) 或多個(gè)編碼SEQ ID NO :5和/或SEQ IDNO 9的多肽序列的引物或其互補(bǔ)物。在另一個(gè)實(shí) 施方式中，試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :4的引物或其互補(bǔ)物。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)SEQ ID N0:6、7和/或8的引物或其互補(bǔ)物。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)SEQ ID NO :10、11和/或12的引物或其互補(bǔ) 物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)SEQID N0:6、7和/或8的引物或其互補(bǔ) 物以及一個(gè)或多個(gè)SEQ ID N0:10、ll和/或12的引物或其互補(bǔ)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒還包含說明書，用于擴(kuò)增HCV的區(qū)域、確定HCV的基 因型或表型、或確定藥物抗性HCV的存在。例如，試劑盒可以包含確定HCV對治療劑敏感性 的說明書。這樣的試劑盒可用于按照抗病毒效應(yīng)篩選候選治療劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒還包含一個(gè)或多個(gè)用于擴(kuò)增HCV核酸的酶或試劑。 例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)引物和聚合酶(例如，嗜熱聚合酶如Taq聚合酶或嗜溫聚合酶)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含dNTP。試劑盒可以任選地包含 擴(kuò)增緩沖劑。本發(fā)明的試劑盒可以包含置于帶標(biāo)簽的容器或帶多個(gè)標(biāo)簽的容器中的一個(gè)或多 個(gè)引物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含用于克隆HCV核酸的載體。例如，本發(fā) 明包括包含具有CMV啟動(dòng)子的載體的試劑盒。本發(fā)明還包括包含編碼報(bào)道分子部分(例如 熒光素酶部分)的載體的試劑盒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包括熒光素酶的底 物例如熒光素。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含用于克隆HCV核酸的載體和一 個(gè)或多個(gè)引物。HCV的擴(kuò)增本發(fā)明包括擴(kuò)增HCV核酸的方法。本發(fā)明的方法可用于擴(kuò)增DNA或RNA。分子可以 是雙鏈的或 單鏈的形式，優(yōu)選為雙鏈。當(dāng)用作起始材料的核酸是雙鏈時(shí)，優(yōu)選為使兩條鏈形 成單鏈或部分單鏈的形式。已知的將鏈分開的方法包括但不限于，加熱、堿、甲酰胺、尿素和 乙二醛(glycoxal)處理，酶法(例如解旋酶作用)和結(jié)合蛋白。例如，可以通過在80°C至 105°C范圍內(nèi)的溫度加熱而將鏈分開。用于實(shí)現(xiàn)這種處理的一般性方法由Jos印hSambrook， 等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)提供。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法包括使用本發(fā)明的引物擴(kuò)增來自HCV樣品的核酸。HCV樣 品可以是，例如，來自于被HCV感染或懷疑被HCV感染的患者的臨床樣本。例如，可以通過 靜脈穿刺或活組織檢查(例如血液和肝臟樣品)獲得含有HCV的臨床樣本?？梢灾苯訌臉?本擴(kuò)增病毒核酸(即，在擴(kuò)增前沒有分離和/或純化步驟)或者可以分離病毒核酸并在擴(kuò) 增前通過本領(lǐng)域已知的方法將其純化。本發(fā)明的方法可以用于擴(kuò)增HCV的蛋白酶區(qū)域。例如，本發(fā)明包括擴(kuò)增HCV的NS3 蛋白酶結(jié)構(gòu)域的方法。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)引物，例如SEQID N0:l-12的那些，可用于擴(kuò)增 HCV的區(qū)域。引物可以含有一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸。在示例性的實(shí)施方式中，使用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3的引物，或SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :9的引物，或其組合。在另一 個(gè)示例性實(shí)施方式中，SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4的引物或SEQ ID NO :6、7或8和SEQ ID NO =IOUl或12的引物或其組合用于擴(kuò)增病毒核酸。本發(fā)明包括使用全長的NS3/4A引物擴(kuò)增編碼NS3的核酸的方法。在一個(gè)實(shí)施方 式中，引物是對被HCV感染或懷疑被HCV感染的患者特異性的全長NS3/4A引物。在另一個(gè) 實(shí)施方式中，引物退火至編碼NS3/4A或其部分、NS3 (NS3蛋白酶和NS3解旋酶)或其部分、 NS2/NS3或其部分或NS2/NS3/NS4A或其部分的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，引物編碼HCV 蛋白酶結(jié)構(gòu)域。一個(gè)或多個(gè)引物可以是對特定HCV序列特異性的，例如基因型特異性的。在本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)引物是簡并引物。不同的引物可以同時(shí)或依次用于擴(kuò)增想要的HCV區(qū)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式 中使用兩組或多組引物。在此實(shí)施方式中，第二組引物可用于擴(kuò)增第一組引物的擴(kuò)增產(chǎn)物 內(nèi)的區(qū)域(SP，至少一組引物為巢式的)?？梢允褂帽景l(fā)明的引物通過本領(lǐng)域已知的方法(例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR))擴(kuò)增核酸。在PCR中，在存在聚合酶和dNTP時(shí)，在允許引物的后續(xù)延伸和變性的條件下，本發(fā)明 的引物組退火至單鏈HCV核酸模板。參見例如美國專利4，683，202和5，766，889，每篇通過 引用全文并入本文。如技術(shù)人員所能認(rèn)識到的，可以使用本發(fā)明的引物根據(jù)本領(lǐng)域已知的 方法使用各種擴(kuò)增方法來擴(kuò)增編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸，包括非聚合酶鏈反應(yīng)方法和 不依賴于使用嗜熱聚合酶的方法(例如嗜溫聚合酶例如phi29)?？梢允褂萌魏文壳耙阎?以后發(fā)現(xiàn)的擴(kuò)增方法(包括但不限于本文描述的那些)來進(jìn)行擴(kuò)增。HCV基因型分型的方法本發(fā)明還提供了確定HCV的基因型的方法。特別地，本發(fā)明允許不對完整的HCV基 因組進(jìn)行測序而確定HCV的基因型。相反地，本發(fā)明允許僅僅基于HCV蛋白酶(例如NS3、 NS3/4A或NS3和一部分的NS4A)的序列而確定HCV的基因型。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法包括如上所述擴(kuò)增編碼蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸(例如，使 用基因型特異性引物或簡并引物)并基于所述編碼蛋白酶的核酸片段的序列而確定HCV的 基因型。在一個(gè)實(shí)施方式中，片段位于HCV的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域之內(nèi)。 本發(fā)明還提供了通過非擴(kuò)增方式(例如，通過測序或雜交技術(shù))確定HCV基因型 的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過確定NS3基因型特異性引物或引物組是否能夠與HCV核 酸雜交而確定HCV的基因型。本發(fā)明的基因型分型方法可用于確定HCV分離體是否對HCV抗病毒治療劑敏感。 例如，本發(fā)明的基因型分型方法可用于確定HCV分離體NS3序列是否與對于抗病毒治療劑 的抗性相關(guān)。不希望被特別的理論所束縛，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域中的單 個(gè)氨基酸替代能夠賦予對抗病毒治療劑的抗性，而解旋酶結(jié)構(gòu)域和NS4A中的氨基酸替代 似乎不影響抗性，例如對蛋白酶抑制劑的抗性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，可以確定HCV分離體的臨床基因型和亞型。HCV有 11種主要的臨床基因型，其進(jìn)一步被特征性地分為亞型(稱為a、b、c等)。已經(jīng)表明一些 臨床基因型相對于其它基因型來說更容易被目前的治療方法所治療。例如，與基因型2和 3相比，基因型1對單獨(dú)的干擾素的反應(yīng)較弱。因此，通過確定HCV的基因型或亞型(例如 HCV基因型1，包括HCV基因型Ia和lb)，本發(fā)明的方法可用于幫助醫(yī)生為感染HCV的患者 選擇最合適的治療劑(即最有效并安全的)。為了對來自患者的HCV進(jìn)行基因型分型，必須從該患者獲得含有病毒的臨床樣 本。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過活組織檢查(例如肝活組織檢查)獲得樣本。在另一個(gè)實(shí)施 方式中，樣本是血液。從臨床樣本中分離病毒RNA并用作擴(kuò)增的模板。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用能夠退 火至編碼蛋白酶(例如NS3或NS3/4A)的病毒核酸的基因型特異性引物來擴(kuò)增核酸模板。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用能夠擴(kuò)增編碼蛋白酶(例如NS3或NS3/4A)的病毒核酸的簡并 引物來擴(kuò)增核酸模板。本發(fā)明包括使用編碼SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3的氨基酸的引物 (或其互補(bǔ)物)和/或編碼SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 9的氨基酸的引物(或其互補(bǔ)物) 進(jìn)行基因型分型的方法。本發(fā)明還包括使用一個(gè)或多個(gè)對應(yīng)于SEQ ID N0:2、4、6、7、8、10、 11或12的引物或其互補(bǔ)物進(jìn)行基因型分型的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，使用多個(gè) 引物組擴(kuò)增NS3核酸以產(chǎn)生用于基因型分析的多個(gè)擴(kuò)增子。然后使用本領(lǐng)域已知的方法(例如Sanger測序)對擴(kuò)增的蛋白酶核酸進(jìn)行測序。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增的蛋白酶核酸作為群體進(jìn)行測序(例如，以確定從個(gè)體分離的HCV 群體的NS3蛋白酶的序列)。在其它實(shí)施方式中，擴(kuò)增的蛋白酶核酸單個(gè)地進(jìn)行測序(例 如，確定從個(gè)體分離的單個(gè)HCV的NS3蛋白酶的序列)。在一個(gè)實(shí)施方式中，在測序前通過 本領(lǐng)域已知的方法(包括但不限于，鳥槍法測序)將擴(kuò)增的蛋白酶核酸進(jìn)行克隆。在其它 實(shí)施方式中，擴(kuò)增的蛋白酶核酸不首先進(jìn)行克隆而直接測序。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過將經(jīng)測序的蛋白酶核酸的序列與一個(gè)或多個(gè)已知基 因型的蛋白酶序列進(jìn)行比對、并鑒別與經(jīng)測序的蛋白酶核酸同源的已知基因型的蛋白酶序 列，而確定經(jīng)測序的蛋白酶核酸的基因型。可以使用計(jì)算機(jī)軟件(例如Blast)和本領(lǐng)域已 知的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過將經(jīng)測序的蛋白酶核酸的主要核苷酸(或由經(jīng)測 序的核苷酸編碼的氨基酸)與已知基因型的對照進(jìn)行比較而確定經(jīng)測序的蛋白酶核酸的 基因型。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，從血清樣品中分離病毒RNA。使用簡并引物(其被設(shè)計(jì)為擴(kuò) 增不論何種基因型的NS3蛋白酶)擴(kuò)增樣品。然后對經(jīng)擴(kuò)增的核酸進(jìn)行測序。如技術(shù)人員能夠認(rèn)識到的，本發(fā)明的范圍包括以上所描述的基因型分型方法的變 體。例如，可以不首先從病毒樣品中分離RNA而直接擴(kuò)增HCV。同樣，引物可以變化，只要引 物能夠退火至編碼蛋白酶區(qū)域的病毒核酸。例如，擴(kuò)增的區(qū)域可以另外包含編碼 除了 NS3 之外的周圍的蛋白結(jié)構(gòu)域(例如p7、NS2、NS4A和/或NS4B)的核酸。此外，可以在測序前 將擴(kuò)增的核酸進(jìn)行克隆。HCV表型分型的方法本發(fā)明還提供了確定HCV表型的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)表型是蛋白酶功 能(例如，NS3蛋白酶活性的水平)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)表型是HCV對于抗病毒治 療劑的敏感性。例如，本發(fā)明包括確定HCV對蛋白酶抑制劑的敏感性的方法。在本發(fā)明的 另一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)表型是對于抗病毒治療劑的抗性。為了對來自患者的HCV進(jìn)行表型分型，按照上文所述從個(gè)體獲得HCV的臨床樣 品。例如，可以從患者的血清獲得HCV。將HCV的蛋白酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行擴(kuò)增，從而擴(kuò)增子(即 HCV盒)可以被克隆進(jìn)入篩選載體。在轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞前可以通過本領(lǐng)域已知的方法(例如 maxi-prep)將含有患者HCV盒的篩選載體進(jìn)行純化。本發(fā)明的表型分型方法需要患者的HCV盒。如上文所討論，從患者獲得HCV核酸 并將其擴(kuò)增?？梢酝ㄟ^本申請中公開的方法擴(kuò)增編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸。例如，可 以使用基因型特異性引物擴(kuò)增HCV核酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用簡并引物擴(kuò)增HCV核 酸。本發(fā)明包括使用編碼SEQID NO :1和SEQ ID NO 3的氨基酸的引物(或其互補(bǔ)物)和 /或編碼SEQ IDNO 5和SEQ ID NO 9的氨基酸的引物(或其互補(bǔ)物)進(jìn)行表型分型的方 法。本發(fā)明還包括使用一個(gè)或多個(gè)對應(yīng)于SEQ ID NO :2、4、6、7、8、10、11或12的引物或其 互補(bǔ)物進(jìn)行表型分型的方法。本發(fā)明的表型分型報(bào)告系統(tǒng)依賴于包含編碼報(bào)道分子部分(例如可分泌性報(bào)道 分子部分)的核酸的篩選載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選載體包含編碼一個(gè)或多個(gè)與HCV 膜結(jié)合的蛋白和可分泌性報(bào)道分子的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，篩選載體包括載體 中所允許的最大數(shù)目的與HCV膜結(jié)合的蛋白(例如4A、4B和5A，例如，使非特異性背景噪聲信號最小化或減少非特異性背景噪聲信號)和可分泌性報(bào)道分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中， 篩選載體包括HCV NS3解旋酶、4A、4B、5A、5B (例如，5B的前6個(gè)氨基酸)和可分泌性報(bào)道 分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，篩選載體包括HCV NS3解旋酶、4A、4B(例如，4B的前6個(gè)氨基 酸)和可分泌性報(bào)道分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，篩選載體包括HCV NS3解旋酶、4A、4B、 5A(例如，5A的前6個(gè)氨基酸)和可分泌性報(bào)道分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選載體包括編碼HCV賂3解旋酶、44、48、5々、58(例如，58的 前6個(gè)氨基酸)和分泌性報(bào)道分子的多核苷酸。在該實(shí)施方式中，將NS3結(jié)構(gòu)域盒克隆進(jìn) 入篩選載體。例如，NS3結(jié)構(gòu)域盒可以包含編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域或NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域和 一部分的解旋酶結(jié)構(gòu)域的核酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述盒包含編碼NS3蛋白酶 結(jié)構(gòu)域和一部分的解旋酶結(jié)構(gòu)域(例如，解旋酶結(jié)構(gòu)域的約4個(gè)氨基酸、約5個(gè)氨基酸、約 6個(gè)氨基酸、約7個(gè)氨基酸、約8個(gè)氨基酸、約9個(gè)氨基酸或約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸)的核 酸。
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選載體包含編碼HCV NS4B、5A、5B(例如，5B的前6個(gè)氨基 酸)和分泌性報(bào)道分子的多核苷酸。在該實(shí)施方式中，將NS3/4A結(jié)構(gòu)域盒克隆進(jìn)入篩選載 體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述盒包含編碼NS3結(jié)構(gòu)域(即NS3蛋白酶和解旋酶 結(jié)構(gòu)域)和一部分的NS4A結(jié)構(gòu)域(例如，NS4A結(jié)構(gòu)域的約4個(gè)氨基酸、約5個(gè)氨基酸、約 6個(gè)氨基酸、約7個(gè)氨基酸、約8個(gè)氨基酸、約9個(gè)氨基酸或約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸)的核 酸。如上文所討論，將HCV盒克隆進(jìn)入包含編碼報(bào)道分子(例如可分泌性報(bào)道分子) 的多核苷酸的篩選載體。編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域或全長蛋白酶(例如NS3Pro或NS3/4A)的 HCV盒、編碼NS部分(例如NS4B和5B)的載體核酸，和編碼分泌性報(bào)道分子的載體核酸可 操作地連接，從而對來自分泌的報(bào)道分子的信號的檢測指示想要的功能結(jié)構(gòu)域的存在。在 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，載體受CMV啟動(dòng)子的控制。本發(fā)明的篩選載體可以在多種細(xì)胞系中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選載體 在294細(xì)胞系(例如293-FS細(xì)胞)中轉(zhuǎn)染。重要的是要注意系統(tǒng)不限于Huh_7細(xì)胞或“治 愈的(cured)”復(fù)制子細(xì)胞。在圖2中顯示了可用于表型分型分析的示例性HCV報(bào)告系統(tǒng)。 如圖2所示，NS3活性與報(bào)道分子活性(例如分泌的熒光素酶活性)相關(guān)聯(lián)。圖2的系統(tǒng) 提供了簡單且一致的DNA轉(zhuǎn)染并避免了與轉(zhuǎn)染RNA相關(guān)的問題。本發(fā)明的報(bào)告系統(tǒng)通過分泌能夠檢測NS3盒是否編碼功能性蛋白酶的報(bào)道分子 部分而工作。特別地，多肽內(nèi)的功能性蛋白酶結(jié)構(gòu)域從翻譯的多肽中切割報(bào)道分子。如果 蛋白酶結(jié)構(gòu)域不是功能性的，則報(bào)道分子部分不被切割。因此，檢測分泌的信號指示功能性 蛋白酶結(jié)構(gòu)域的存在，而不存在分泌的信號則指示不存在功能性蛋白酶結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí) 施方式中，弱信號是低效率蛋白酶的指征。能夠分泌的報(bào)道分子可以是本領(lǐng)域已知的任何報(bào)道分子部分。在一個(gè)實(shí)施方式 中，能夠分泌的報(bào)道分子是自己能夠分泌或者與分泌信號肽可操作地連接之后能夠分泌的 可檢測的部分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，能夠分泌的報(bào)道分子是可分泌性熒光素酶。為了讓熒 光素酶提供可檢測的信號，必須存在熒光素酶的底物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，將含有 本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞與熒光素酶的底物接觸。在一個(gè)實(shí)施方式中，向細(xì)胞中加入報(bào)道分 子底物(例如熒光素)并讀取產(chǎn)生的信號。在一個(gè)實(shí)施方式中，信號是熒光信號。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過本領(lǐng)域已知的方法(例如使用光度計(jì))讀取信號。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理 解，系統(tǒng)中還可以使用另外的可分泌性報(bào)道分子部分，只要報(bào)道分子部分原來(otherwise) 不存在于用于進(jìn)行分析的細(xì)胞中。其它的合適的報(bào)道分子部分包括但不限于SEAP。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的表型分析可用于確定HCV分離體是否對于抗病毒治 療(例如蛋白酶抑制劑治療劑)敏感。在該實(shí)施方式中，將包含篩選載體的宿主細(xì)胞與藥 物接觸。藥物可以進(jìn)行系列稀釋。如果藥物阻止或減少報(bào)道分子的分泌，則藥物對于抑制 病毒蛋白酶是有效的。為了確定藥物是否阻止或減少報(bào)道分子的分泌，可以加入報(bào)道分子 底物(例如，如果報(bào)道分子是熒光素酶的話，可以加入熒光素酶底物)。然后可以測定信號 強(qiáng)度。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的表型分型分析可用于確定HCV群體(例如從個(gè)體 中分離的HCV群體)是否對于抗病毒治療(例如蛋白酶抑制劑治療劑)敏感。在該實(shí)施方 式中，將包含篩選載體的宿主細(xì)胞(其中單個(gè)篩選載體可以包含編碼來自HCV群體的不同 NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸)與藥物接觸。藥物可以進(jìn)行系列稀釋，可以加入報(bào)道分子底物， 可以測定報(bào)道分子活性，如上文和本文其它地方所述。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過將以篩選載體(其含有患者的HCV盒)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的宿 主細(xì)胞與目標(biāo)藥 物接觸而確定對目標(biāo)藥物的藥物抗性。在一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)藥物是蛋 白酶抑制劑。例如，目標(biāo)藥物可以是ITMN-191。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)藥物進(jìn) 行系列稀釋(例如系列稀釋的ITMN-191)。報(bào)道分子的分泌指征藥物的抗性。在一個(gè)實(shí)施 方式中，可分泌性熒光素酶是報(bào)道分子，加入熒光素酶底物。加入可分泌性熒光素酶底物之 后，讀取信號(例如熒光)?；谑欠翊嬖谛盘栆约靶盘柕膹?qiáng)度，可以進(jìn)行分析以確定藥物 抗性。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過將報(bào)道分子信號針對藥物濃度作圖而確定EC50值。表 型分型分析中EC50值的任何升高都是患者HCV中藥物抗性的指征。本發(fā)明的表型分型方法可以以高通量形式進(jìn)行。分泌的報(bào)道分子容易被測定并且 表型分型系統(tǒng)可針對機(jī)器進(jìn)行修正。在一個(gè)實(shí)施方式中，自動(dòng)操作允許每天進(jìn)行大約96、 144、192、240或288個(gè)樣品的12點(diǎn)EC50測定。核酸本發(fā)明還提供了編碼HCV NS多聚蛋白的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的分離的核酸分子。例 如，本發(fā)明包括編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域和任選的NS2結(jié)構(gòu)域、NS3解旋酶結(jié)構(gòu)域、NS4A結(jié)構(gòu) 域、NS4B結(jié)構(gòu)域和/或NS5A結(jié)構(gòu)域或任何這樣的結(jié)構(gòu)域的一部分的分離的核酸分子。在 一個(gè)實(shí)施方式中，分離的核酸分子編碼NS2的一部分，從約170位氨基酸開始。在另一個(gè)實(shí) 施方式中，核酸分子編碼NS多聚蛋白的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域和至少一部分的NS3解旋酶結(jié)構(gòu) 域。例如，本發(fā)明包括編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域和NS3解旋酶結(jié)構(gòu)域的至少約4個(gè)氨基酸、約 5個(gè)氨基酸、約6個(gè)氨基酸、約7個(gè)氨基酸、約8個(gè)氨基酸、約9個(gè)氨基酸或約10個(gè)或更多個(gè) 氨基酸的分離的核酸分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，分離的核酸分子編碼NS3蛋白酶 結(jié)構(gòu)域、NS3解旋酶結(jié)構(gòu)域和NS4A結(jié)構(gòu)域。例如，本發(fā)明包括編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域、NS3 解旋酶結(jié)構(gòu)域和NS4A結(jié)構(gòu)域的至少約4個(gè)氨基酸、約5個(gè)氨基酸、約6個(gè)氨基酸、約7個(gè)氨 基酸、約8個(gè)氨基酸、約9個(gè)氨基酸或約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸的分離的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過使用本發(fā)明的引物獲得編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的分離的 核酸分子。例如，可以通過使用NS3基因型特異性引物獲得分離的核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用簡并引物獲得分離的核酸分子，所述簡并引物被設(shè)計(jì)為擴(kuò)增不論何種基因 型的NS3區(qū)域。本發(fā)明包括使用編碼SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3的氨基酸序列的引物 (或其互補(bǔ)物)和/或編碼SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 9的氨基酸序列的引物(或其互補(bǔ) 物)獲得的分離的核酸分子。本發(fā)明還包括使用一個(gè)或多個(gè)對應(yīng)于SEQ ID N0:2、4、6、7、 8、10、11或12引物或其互補(bǔ)物獲得的分離的核酸分子。本發(fā)明的分離的核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，例如雙鏈的DNA。本發(fā)明包括含有 修飾的核苷酸的核酸分子。例如，可以通過將一個(gè)或多個(gè)核苷酸替代、添加或刪除引入相應(yīng) 的HCV NS3核苷酸序列中而產(chǎn)生本發(fā)明的核酸分子，從而一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代、添加或刪 除被引入所編碼的蛋白中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的核酸分子長度為至少約10個(gè)氨基酸、約12 個(gè)氨基酸、約15個(gè)氨基酸、約18個(gè)氨基酸、約20個(gè)氨基酸或約25個(gè)氨基酸并且在嚴(yán)謹(jǐn)條 件下與包含至少一個(gè)NS3核苷酸序列的核酸分子雜交。還提供了用于復(fù)制核酸分子以及用于表達(dá)多肽的宿主細(xì)胞和載體?？梢允褂萌魏?載體或宿主細(xì)胞(例如，原核的或真核的)。本領(lǐng)域中已知有很多載體和宿主細(xì)胞可用于此 目的。為了想要的應(yīng)用而選擇合適的配套是本領(lǐng)域的常規(guī)技能。在一個(gè)實(shí)施方式中 ，載體 是pcDNA3，宿主細(xì)胞是293-FS細(xì)胞。使用基于探針的方法分離編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸序列的技術(shù)是常規(guī)技術(shù) 并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。例如，可以使用由Mullis等人(美國專利4. 683，195) 和Mullis (美國專利4. 683，202)公開的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法(通過引用并入本文)。 用于分離這樣的核酸序列的探針可以基于已公開的核酸或蛋白序列?？梢詫⒎蛛x的NS3核酸(或多肽)的序列與對照的NS3序列比較以確定核酸分 離自何種HCV基因型。如本領(lǐng)域所知，兩個(gè)多核苷酸或多肽之間的相似性是通過將一個(gè) 多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列及其保守性核苷酸或氨基酸替代與第二個(gè)多核 苷酸或多肽的序列相比較而確定的。本領(lǐng)域還已知“同一性”是指兩個(gè)多肽或兩個(gè)多核 苷酸序列之間的序列相關(guān)性程度(由這樣的兩串序列之間匹配同一性確定)。同一性和 相 1以性均可容易地計(jì)算(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.，ed.，Oxford UniversityPress, New York,1988 ；Biocomputing :Informatics and Genome Projects, Smith,D.W. ,ed. ,Academic Press,New York, 1993 ；Computer Analysis of SequenceData, Part I,Griffin,A. M.,禾口Griffin,H. G. ,eds. ,Humana Press,New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press,1987 ；禾口 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds. , MStockton Press, New York, 1991)。存在一些測定兩個(gè)多核苷酸或多肽序列之間同一性和相似性的方法，術(shù)語“同一 性”和“相似性”對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的(Sequence Analysis inMolecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press,1987 ；Sequence AnalysisPrimer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds. , M Stockton Press, New York, 1991 ；以及 Carillo, H.,禾口 Lipman, D., SIAM J. Applied Math.，48 :1073 (1988))。通常使用的確定兩個(gè)序列之間同一性或相似性 W^fe^SiM^KTJP^i Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed. , Academic Press, San Diego,1994 禾口 Carillo, H. , and Lipman, D. , SIAM J. Applied Math. 48 1073(1988)中公開的那些。優(yōu)選的確定同一性的方法設(shè)計(jì)為給出所測的兩個(gè)序列之間的最大匹配。用于確定 同一性和相似性的方法由計(jì)算機(jī)程序編碼。確定兩個(gè)序列之間同一性和相似性的計(jì)算機(jī) 程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等人，Nucl. Acid Res. 12(1) :387(1984))、 BLASTP, BLASTN、FASTA (Atschul 等人，J. Mol. Biol. 215 403 (1990)) 以上所稱的相似性 或同一性程度按照兩個(gè)序列之間的同一性程度確定，通常指示第一個(gè)序列從第二個(gè)序列的 衍生?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序方法(例如GCG程序包(Needleman andffunsch, J. Mol. Biol. 48 =443-453(1970))中提供的GAP)確定兩個(gè)核酸序列之間的同一性程度。為 了本發(fā)明確定兩個(gè)核酸序列之間同一性程度的目的，可以按照如下設(shè)置使用GAP =GAP創(chuàng)建 罰分(creation penalty)為 5· O ；GAP 延伸罰分(extension penalty)為 0. 3。本發(fā)明還包括使用表型篩選載體中克隆的HCV盒產(chǎn)生本發(fā)明的經(jīng)翻譯的多肽的 方法。一般來講，產(chǎn)生重組形式的蛋白通常包括以下步驟。首先獲得編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域和任選的NS3解旋酶和/或NS4A結(jié)構(gòu)域的核酸分 子。然后將核酸分子置于與合適的控制序列以及編碼部分或全部NS多聚蛋白(例如NS4B、 NS5A)和報(bào)道分子的核酸可操作地連接，從而形成含有蛋白開放讀碼框的表達(dá)單元。 表達(dá)單 元用于轉(zhuǎn)化(即轉(zhuǎn)染)合適的宿主，在允許產(chǎn)生重組多肽的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主。產(chǎn) 生多肽以后，如果多肽的蛋白酶部分是功能性的，則報(bào)道分子從多肽上被切割下來并從細(xì) 胞中分泌。上述每個(gè)步驟均可以以不同的方式實(shí)現(xiàn)。例如，使用合適的復(fù)制子和控制序列 (如上所述)實(shí)現(xiàn)可在多種宿主中操作的表達(dá)載體的構(gòu)建?？刂菩蛄小⒈磉_(dá)載體和轉(zhuǎn)化方法 取決于用于表達(dá)基因的宿主細(xì)胞的類型，這在上文中已詳細(xì)討論或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的。合適的限制性位點(diǎn)可以(如果正常情況下不存在的話)添加到編碼序列的末端，從 而提供可切割的基因以插入這些載體中。技術(shù)人員能夠容易地調(diào)整本領(lǐng)域已知的任何宿主 /表達(dá)系統(tǒng)以與本發(fā)明的核酸分子一起使用，從而產(chǎn)生想要的重組多肽。可以使用多種表達(dá)系統(tǒng)，包括酵母、細(xì)菌、動(dòng)物、植物、真核和原核系統(tǒng)。在一些實(shí) 施方式中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是優(yōu)選的。載體用于本發(fā)明的表達(dá)單元通常包含以下由5’至3’方向可操作地連接的元件哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中可操作的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(例如CMV啟動(dòng)子)、來自患者的HCV盒(即編碼NS3/4A 的核酸或編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸)、編碼至少一個(gè)其它NS結(jié)構(gòu)域(例如NS3解旋酶 /4A/4B/5A(當(dāng)使用包含NS3蛋白酶的盒時(shí))或NS4B/5A(當(dāng)使用包含NS3/4A的盒時(shí))，任 選地與編碼5B (例如5B的前6個(gè)氨基酸)的DNA序列連接)的DNA序列、以及編碼報(bào)道分 子(例如熒光素酶)的DNA序列。如上文所討論，HCV盒與報(bào)道分子(與編碼HCV NS多聚 蛋白部分的核酸融合或位于其內(nèi))的任何其它排列均可用于本發(fā)明的載體。合適的啟動(dòng)子 的選擇由所選的宿主細(xì)胞確定，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，將在下文更具體地討論。用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括能夠指導(dǎo)融合蛋白轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。優(yōu)選 的啟動(dòng)子包括病毒啟動(dòng)子和細(xì)胞啟動(dòng)子。病毒啟動(dòng)子包括CMV啟動(dòng)子、來自腺病毒2的主 要晚期啟動(dòng)子(Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol. 2 :1304_13199，1982)和 SV40 啟動(dòng)子 (Subramani等人，Mol. Cell. Biol. 1 :854_864，1981)。細(xì)胞啟動(dòng)子包括小鼠金屬硫蛋白1啟動(dòng)子(Palmiter 等人，Science 222 :809_814，1983)和小鼠 Vk (參見美國專利 6，291，212) 啟動(dòng)子(Grant等人，Nuc. Acids Res. 15 :5496，1987)。特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是小鼠Vh (參見 美國專利6，291，212)啟動(dòng)子(Loh等人，同上)。轉(zhuǎn)化例如，可以通過磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等人，Cell 14 =725,1978 ；Corsaro and Pearson,Somatic Cell Genetics 7 603,1981 ；Graham and Van derEb,Virology 52 456，1973)將本發(fā)明的表型篩選載體和HCV盒引入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。還可以使用其它 用于將克隆的DNA序列引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的技術(shù)，例如電穿孔(Neumann等人，EMBO J. 1 841-845,1982)或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。為了鑒別整合了克隆的DNA的細(xì)胞，可以將選擇性標(biāo)記與目標(biāo)基因或cDNA—起 引入細(xì)胞中。用于培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括賦予藥物抗性的基因，例如新 霉素、潮霉素和甲氨蝶呤。選擇性標(biāo)記可以是可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記?？蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記 包括DHFR基因(參見美國專利6，291，212)。選擇性標(biāo)記參見Thilly (Mammalian Cell Technology, ButterworthPub 1 ishers, Stoneham, Mass)的綜述,選擇性標(biāo)記的選擇是本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還包括經(jīng)轉(zhuǎn)化(即轉(zhuǎn)染)的細(xì)胞，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以表達(dá)本發(fā)明的重 組多肽(即NS3/4A/4B/5A/報(bào)道分子)。除了經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞本身以外，本發(fā)明還包括處 于營養(yǎng)培養(yǎng)基中的那些細(xì)胞的培養(yǎng)物，優(yōu)選為單克隆(即均質(zhì)克隆)培養(yǎng)物，或源自單克隆 培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。如果報(bào)道分子肽被分泌，則培養(yǎng)基包含報(bào)道分子肽，含有細(xì)胞或不含細(xì)胞 (如果細(xì)胞被過濾或離心掉)。用于實(shí)施本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括能夠被外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染并在培養(yǎng)物中生長的 真核細(xì)胞(在一些情況下為原核細(xì)胞)，例如培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物、昆蟲、真菌、植物和細(xì)菌細(xì)胞。含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞生長于合適的生長培養(yǎng)基。如本文所用的術(shù) 語“合適的生長培養(yǎng)基”是指含有細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物的培養(yǎng)基。細(xì)胞生長所需的營養(yǎng) 物可以包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和生長因子。通常，生長培養(yǎng)基將通過 例如藥物選擇或必需營養(yǎng)物的缺陷(由DNA構(gòu)建體上的選擇性標(biāo)記或與DNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染 的選擇性標(biāo)記所補(bǔ)充)來選擇含有DNA構(gòu)建體的細(xì)胞。培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常生長于商售的含血清的或無血清的培養(yǎng)基。選擇適合于 所用的特定細(xì)胞系的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)操作。使轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生 長一段時(shí)間(通常1-2天)以開始表達(dá)目標(biāo)DNA序列。然后應(yīng)用藥物選擇以選擇穩(wěn)定表達(dá) 選擇性標(biāo)記的細(xì)胞生長。對于以可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可以逐步增加藥物濃度 以選擇拷貝數(shù)增加的克隆序列(從而增加了表達(dá)水平)。雖然本發(fā)明已經(jīng)通過提及以上例子進(jìn)行了詳細(xì)描述，但是應(yīng)該理解，可以不脫離 本發(fā)明的精神而做出各種改變。因此，本發(fā)明僅由以下權(quán)利要求限定。本申請中提到的所 有引證專利、專利申請和出版物均通過引用全文并入本文。
實(shí)施例以下實(shí)施例是為了解釋本發(fā)明，而非以任何方式、形態(tài)或形式限制本發(fā)明，不論明示或暗示。雖然它們是通?？梢允褂玫哪切且部梢蕴娲缘厥褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已 知的其它程序、方法或技術(shù)。實(shí)施例1 :HCV NS3結(jié)構(gòu)域簡并引物的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)優(yōu)選地能夠退火至HCV基因型Ia和Ib兩者的引物以擴(kuò)增HCVNS3區(qū)域。為 了設(shè)計(jì)引物，收集發(fā)表的HCV基因型1(主要是Ia和lb)的序列并進(jìn)行比對以鑒別具有高 度同源性的區(qū)域。計(jì)算同源區(qū)域內(nèi)每個(gè)核酸的出現(xiàn)頻率?？梢苑峙湟粋€(gè)截止頻率百分?jǐn)?shù)以 保持所設(shè)計(jì)的引物的簡并性在可接受的范圍內(nèi)。設(shè)計(jì)簡并引物時(shí)的另一個(gè)考慮因素是嘗試 保持3’最末端的5個(gè)核酸無簡并性。實(shí)施例2 擴(kuò)增HCV NS3結(jié)構(gòu)域從臨床樣品分離病毒RNA并使用第一輪和第二輪簡并引物擴(kuò)增HCVNS3結(jié)構(gòu)域。擴(kuò) 增的HCV區(qū)域顯示于圖7。圖7顯示了其中鑒別出了合理的同源性的區(qū)域。如圖中所示， “U”代表上游引物，“D”代表下游引物，數(shù)字對應(yīng)于同源區(qū)域的5’末端的Con-I位置。第 二輪引物，U3420和D4038，攜帶將盒克隆進(jìn)入表型分型載體的限制性位點(diǎn)。U3420還具有 蛋白翻譯的起始密碼子和kozac序列。圖8-11分別顯示了基 因型1分離體中引物U3276、 D422UU3420和D4038中的氨基酸保守性。實(shí)施例3 =以臨床樣品講行的HCV基因型測試從多個(gè)來源(包括醫(yī)院、臨床實(shí)驗(yàn)室和商業(yè)實(shí)體)獲得臨床分離體?；颊逳S3克隆的表型分型結(jié)果顯示于圖13。將顯示于圖12的三個(gè)擴(kuò)增的臨床樣 品克隆進(jìn)入表型分型載體并通過表型分型分析進(jìn)行鑒定。圖14顯示了基因型la/b特異性非簡并引物的序列。圖15顯示了使用基因型Ia/ b特異性非簡并引物通過PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并對群體進(jìn)行測序。 測序結(jié)果顯示它們是HCV Ia或Ib序列。實(shí)施例4 :HCV表型分型分析圖3顯示了以來自96孔Mini-Pr印的DNA進(jìn)行的表型分型分析。圖4顯示了高通量自動(dòng)化系統(tǒng)中96孔板上的信號差異。圖5顯示了使用同一個(gè)表型分型載體的一天之內(nèi)和各天之間的EC5tl差異。圖19顯示了已經(jīng)在體外HCV復(fù)制子抗性研究中鑒別的NS3變體的表型分型EC5(1。 每個(gè)變體的單個(gè)EC5tl值和不同變體的EC50等級排列與復(fù)制子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)有良好的相關(guān) 性。實(shí)施例5 自動(dòng)化的HCV表型分型分析基于細(xì)胞的表型分型分析可調(diào)整為高通量系統(tǒng)(HTS)。例如，使用該分析，可以在 40個(gè)患者中在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)篩選至少96個(gè)序列，即在10個(gè)月的時(shí)間內(nèi)可以鑒定19，200個(gè)靶 標(biāo)。圖6顯示了一個(gè)流程圖，其描繪了基于細(xì)胞的報(bào)道分子分析的自動(dòng)化程序的示例 性步驟。實(shí)施例1中描述的從96孔mini-pr印獲得的DNA可用于本檢驗(yàn)?？梢詫NA轉(zhuǎn) 染進(jìn)入細(xì)胞，然后以NS3/4A蛋白酶活性抑制劑(例如系列稀釋的ITMN-191)處理該細(xì)胞。 加入報(bào)道分子分泌的熒光素酶的底物并測定分泌的熒光素酶的活性。分泌的熒光素酶的活 性是蛋白酶活性的指征，蛋白酶活性進(jìn)而又是HCV表型的指征。雖然已經(jīng)通過提及上述優(yōu)選實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但是應(yīng)該理解，可以不脫離本發(fā)明的精神而作出各種改變和修飾， 這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，本發(fā)明僅 由以下權(quán)利要求限定。
權(quán)利要求
第一輪上游引物的群體，其中每個(gè)引物包含編碼Met/Lys-Glu/Gly-Thr/Ile-Lys-Ile/Val/Leu-Ile/Ala-Thr/Gln-Trp/Lys的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物的群體，其中每個(gè)引物編碼氨基酸序列并且其中所述的 氨基酸序列的群體具有以下的每種氨基酸的分布Met (99. 5 % )/Lys (0.5 % )-Glu (99. 5 % )/Gly(0. 5 % )-Thr (96. 5 % )/ Ile(3. 5 % )-Lys (100 % )-lie (69. 3 % )/Val(16. 1 % )/Leu(14. 6 % )-lie (99. 5 % )/ Ala(0. 5% ) -Thr (99. 5% ) /Gln (0. 5% ) -Trp (99. 5% ) /Lys (0. 5% )
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列 ATGGAGACYAAGVTYATYACSTGGG，其中 Y 是 C 或 T，V 是 A 或 G 或 C，S 是 G 或 C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列 ATGGAGACYAMAMGVTYAMTYAMCSTGGG，其中 Y 是 C 或 T，V 是 A 或 G 或 C，S 是 G 或 C，并且其中 AM是修飾的腺苷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列AMTGMGMAGACYAMAM GVTYAMTYAMCMSTGGG,其中Y是C或T，V是A或G或C，S是G或C，并且其中AM是修飾的腺 苷，GM是修飾的鳥苷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物的群體，其中該群體包含至少1個(gè)引物。
7.第一輪下游引物的群體，其中每個(gè)引物的互補(bǔ)物包含編碼Ser-Thr-Tyr-Gly/ Cys-Lys-Phe-Leu-Ala-Asp-Gly 的核酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物的群體，其中每個(gè)引物的互補(bǔ)物編碼氨基酸序列并且其 中所述的氨基酸序列的群體具有以下的每種氨基酸的分布Ser (100 % ) -Thr (100 % ) -Tyr ( 100% )-Gly (97. 0% )/Cys (3. 0%) -Lys (100%)-Phe (100%)-Leu(100%) -Ala(100% )-Asp ( 100% )-Gly(100% )。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列 CCGTCGGCAAGRAACTTGCCRTAGGTGGA，其中 R 是 A 或 G。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列CCGTCGGCAAGRAMA CTTMGCCRTMAGGTMGGA，其中R是A或G，并且其中AM是修飾的腺苷，TM是修飾的胸苷。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列CCGTMCGGCAAMGRA MACTMTMGCCRTMAMGGTMGGA，其中R是A或G，并且其中AM是修飾的腺苷，TM是修飾的胸苷。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物的群體，其中群體包含至少1個(gè)引物。
13.第二輪上游引物的群體，其中每個(gè)引物包含編碼Ala-Pro/ His-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser/Ala-Gln/Arg-Gln-Thr 的核酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的引物的群體，其中每個(gè)引物編碼氨基酸序列并且其中所述 的氨基酸序列的群體具有以下的每種氨基酸的分布Ala (100 % ) -Pro (99. 5%)/His(0. 5% )-lie (100% ) -Thr (100%) -Ala (100 % ) -Tyr (1 00% )-Ser (66% )/Ala(34% )-Gln(99% )/Arg(l% )-Gln(100% )-Thr (100% )。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列 GCGCCYATYACGGCCTAYKCCCARCARAC，其中 Y 是 C 或 T，K 是 G 或 T，R 是 A 或 G。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列GCGCCYAMTMYACG GCMCTMAMYKCCCMARCMAMRAC，其中Y是C或T，K是G或T，R是A或G，并且其中AM是修飾的腺苷，CM是修飾的胞苷，TM是修飾的胸苷。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列GCGCCYAMTMYAC GGCCTAMYKCCCARCAMRAC，其中Y是C或T，K是G或T，R是A或G，并且其中AM是修飾的腺 苷，TM是修飾的胸苷。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列AGGGCATTTAAATA GCCACCATGGCGCCYATYACGGCCTAYKCCCARCARAC，其中 Y 是或 1\1(是6或11，1 是4或6。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列AAAAAGGCGCGCCA CCATGGCGCCYATYACGGCCTAYKCCCARCARAC，其中 Y 是 C 或 T，K 是 G 或 T，R 是 A 或 G。
20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的引物的群體，其中該群體包含至少1個(gè)引物。
21.第二輪下游引物的群體，其中每個(gè)引物的互補(bǔ)物包含編碼Gly-Ser-Gly/ Arg-Lys-Ser/Thr-Thr/Asn-Lys/Arg-Val-Pro-Ala/Val-Ala/Asp 的核酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的引物的群體，其中每個(gè)引物的互補(bǔ)物編碼氨 基酸序列并且其中所述的氨基酸序列的群體具有以下的每種氨基酸的分布 GlydOO % )-Ser (100 % )-Gly (99. 5 % ) /Arg (0. 5 % )-Lys (100 % )-Ser (99. 5 % )/ Thr (0. 5%) -Thr (99 % ) /Asn (1%) -Lys (93 % ) /Arg (7 % ) -Val (100%) -Pro (100%) -Ala (9 9% )/Val(l% )-Ala(99% )/Asp(l% )。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列GCAGCCGGCACYTT RGTGCTYTTRCCGCTRCC，其中 Y 是 C 或 T，R 是 A 或 G。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列GCAGCCGGCAMCYT TMRGTMGCTMYTMTMRCMCGCTMRCC，其中Y是C或T，R是A或G，并且其中AM是修飾的腺苷，TM 是修飾的胸苷，CM是修飾的胞苷。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列GCAGCCGGCACYTT MRGTGCTMYTTMRCCGCTMRCC，其中Y是C或T，R是A或G，并且其中TM是修飾的胸苷。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列AAAAAGCGGCCGCA GCCGGCACYTTRGTGCTYTTRCCGCTRCC，其中 Y 是 C 或 T，R 是 A 或 G。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的引物的群體，其中每個(gè)引物包含核酸序列CTTGGTTAATTAAT GCAGCCGGCACYTTRGTGCTYTTRCCGCTRCC，其中 Y 是 C 或 T，R 是 A 或 G。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的引物的群體，其中該群體包含至少1個(gè)引物。
29.一種包含如權(quán)利要求1和權(quán)利要求7所述的引物的試劑盒。
30.一種包含如權(quán)利要求13和權(quán)利要求21所述的引物的試劑盒。
31.一種擴(kuò)增來自HCV感染或懷疑被HCV感染的患者的樣品的HCVNS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的方法，包括使用如權(quán)利要求1和權(quán)利要求7或權(quán)利要求13和權(quán)利 要求21所述的引物或其組合從所述樣品中擴(kuò)增核酸樣品。
32.一種確定HCV病毒基因型的方法，包括擴(kuò)增HCV病毒蛋白酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的片段并基于 所述片段的基因型確定HCV病毒的基因型。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中通過使用如權(quán)利要求1和權(quán)利要求7或權(quán)利要 求13和權(quán)利要求21所述的引物或其組合來擴(kuò)增所述片段。
34.一種確定藥物抗性HCV病毒的存在的方法，包括擴(kuò)增來自HCV樣品的HCV蛋白酶結(jié) 構(gòu)域內(nèi)的片段，確定該片段內(nèi)與藥物抗性相關(guān)的突變的存在，其中所 述突變的存在是藥物抗性HCV的存在的指征。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中使用如權(quán)利要求1和權(quán)利要求7或權(quán)利要求13 和權(quán)利要求21所述的引物或其組合進(jìn)行擴(kuò)增。
36.一種確定HCV病毒表型的方法，包括將HCV病毒的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域克隆進(jìn)入篩選 載體，所述篩選載體包含編碼HCV NS3解旋酶、4A、4B、5A和分泌性熒光素酶報(bào)道分子的多 核苷酸，其中編碼NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸、NS3解旋酶、4A、4B、5A和分泌性熒光素酶 報(bào)道分子可操作地連接，從而分泌性熒光素酶報(bào)道分子的分泌指示功能性NS3蛋白酶結(jié)構(gòu) 域的存在。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中多核苷酸編碼HCVNS3解旋酶、4A、4B、5A、5B的 前6個(gè)氨基酸和分泌性熒光素酶報(bào)道分子。
38.一種篩選載體，其包含編碼可操作地連接的HCV NS3解旋酶、4A、4B、5A和分泌性熒 光素酶報(bào)道分子的多核苷酸，從而分泌性熒光素酶報(bào)道分子的分泌指示篩選載體中插入了 功能性的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的篩選載體，其中多核苷酸編碼HCVNS3解旋酶、4A、4B、5A、 5B的前6個(gè)氨基酸和分泌性熒光素酶報(bào)道分子。
40.包含上游引物和下游引物的引物組，其中所述上游引物包含選自 ATGGAGACCAAGATCATCACCTGGG 和 ATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGG 的序列，所述下游引物包含 選自 CCGTCGGCAAGGAACTTGCCATAGGTGGA 和 ACCCGCCGTCGGCAAGGAACTTGCCGTA 的序列。
41.包含上游引物和下游引物的引物組，其中所述上游引物包含選自AGGGCATTTAAATA GCCACCATGGCGCCCATCACGGCCTACTCCCAACAGAC 和 AGGGCATTTAAATAGCCACCATGGCGCCCATCACGG CGTACGCCCAGCAGAC 的序列，所述下游引物包含選自 AAAAAGCGGCCGCAGCCGGCACCTTAGTGCTCT TGCCGCTGCC 和 AAAAAGCGGCCGCAGCCGGGACCTTGGTGCTCTTACCGCTGCC 的序列。
42.—種包含選自以下的序列的引物ATGGAGACCAAGATCATCACCTGGG， ATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGG, CCGTCGGCAAGGAACTTGCCATAGGTGGA, ACCCGCCGTCGGCAAGGAACTTGCCGTA, AGGGCATTTAAATAGCCACCATGGCGCCCATCACGGCCTACTCCCAAC AGAC，AGGGCATTTAAATAGCCACCATGGCGCCCATCACGGCGTACGCCCAGCAGAC，AAAAAGCGGCCGCAGCCGG CACCTTAGTGCTCTTGCCGCTGCC 和 AAAAAGCGGCCGCAGCCGGGACCTTGGTGCTCTTACCGCTGCC。
全文摘要
本發(fā)明包括HCV基因型分型和表型分型的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可用于確定HCV分離體是否對于抗病毒藥物有抗性。本發(fā)明還包括用于擴(kuò)增HCV NS3區(qū)域的引物和試劑盒。
文檔編號C12Q1/70GK101842498SQ200880114609
公開日2010年9月22日 申請日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者S·塞維特, S·林, 洪勁, 秦曉麗 申請人:英特芒尼公司