專利名稱：賦予玉米斐濟(jì)病毒抗性的主要qtls的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及用于在植物中產(chǎn)生或增強(qiáng)斐濟(jì)病毒，尤其是Mal de RioCuarto病毒和 /或玉米粗縮病毒抗性的組合物和方法。此外，本發(fā)明涉及由本發(fā)明組合物遺傳轉(zhuǎn)化的植 物。
背景技術(shù)：
在阿根廷，由Mal de Rio Cuarto病毒(MRCV)造成的疾病是主要的玉米疾病，在 大爆發(fā)的年份中占到產(chǎn)量損失的70%以上(Rodriguez PE et al. (1998)Plant Dis. 82 149-52)。該疾病是斐濟(jì)病毒(Fijivirus)血清群2的成員，該血清群2包括其他病毒例 如玉米粗縮病毒(maize rough dwarfvirus)，/K稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus),禾口馬唐矮化病毒(pangola stunt virus) (Uyeda I&Milne RG (1 995) Semin. Virol. 6 :85-88)。MRCV 的主要載體是 Delphacodes kuscheli，但其他 Delphacodes 種類， 例如D. haywardi和D. tigrinus,以及Toyapropinqua，已證實(shí)可攜帶該病毒。該病毒未顯 示出經(jīng)種子傳播至子代。Distefano et al.，Arch. Virol. 147 1699-1709 (2002)，分析了 MRCV序列，并提出其是一種新的與MRDV(玉米粗縮病毒)相關(guān)的斐濟(jì)病毒種類。在多個(gè)歐 洲國(guó)家(例如，捷克、法國(guó)、意大利、挪威、西班牙、瑞典)和中國(guó)都發(fā)現(xiàn)了 MRDV，同時(shí)在烏拉 圭也檢 則至Ij MRCV (Ornaghi J. Α. ，Beviacqua J. Ε. ，Aguirrezabala D. Α. ，March G. J. and Lenardon S. L. 1999. Detection of Mal de Rio Cuarto virus inUruguay. Fitopatologia Brasileira 24 471)。MRCV感染引起玉米發(fā)育異常并明顯降低作物產(chǎn)量。易感表型包括生長(zhǎng)遲緩， 節(jié)間縮短，具有散落顆粒的多穗，無(wú)花藥的畸形雄花穗，葉片背面存在小的突起，退化 根，切斷和退化葉片。植物癥狀取決于植物的物候期、植物基因型和環(huán)境(Lenarckto et al. , "Virus del Mal de Rio Cuartoen maiz，，，in Proyecto de Investigaciones en Fitovirologi a (Lenardon ed.), 2 :10 (1999)。若在胚芽鞘即第一葉階段感染，會(huì)出現(xiàn)非常 嚴(yán)重的癥狀。在1996-1997年嚴(yán)重的MRCV爆發(fā)中，在阿根廷有超過(guò)300，000公頃玉米受到感 染，造成的損失總計(jì)約$120，000, 000美元。在2006年，Delphacodes kuscheli數(shù)量的增加 明顯，導(dǎo)致阿根廷玉米植物重新出現(xiàn)病毒疾病，這顯著地影響到2007年收成。在易感地區(qū) (科爾多瓦省)，易感基因型受到MRCV的強(qiáng)烈感染，而在其他玉米地區(qū)，則受到適度感染。分子遺傳標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，已促進(jìn)玉米中重要農(nóng)業(yè)性狀的定位和選擇。與抗病性基因 緊密連鎖的標(biāo)記，是通過(guò)使用標(biāo)記輔助選擇(marker assistedselection，MRS)、根據(jù)基因 型快速鑒定抗性玉米系的寶貴資源。也可通過(guò)使用適宜的DNA標(biāo)記，促進(jìn)抗病性基因向所 需培育植物的基因滲入。
分子標(biāo)記和標(biāo)記輔助詵擇遺傳圖譜(genetic map)是基因組(或基因組的一部分例如單個(gè)染色體)的圖解表示，其中通過(guò)界標(biāo)之間的重組頻率測(cè)量染色體界標(biāo)之間的距離。遺傳界標(biāo)可以是多種已 知多態(tài)性標(biāo)記的任何標(biāo)記，例如但不限于分子標(biāo)記例如SSR標(biāo)記，RFLP標(biāo)記，F(xiàn)LP標(biāo)記，或 SNP標(biāo)記。而且，SSR標(biāo)記可以是來(lái)自于基因組或表達(dá)的核酸(例如ESTs)的。這些物理界 標(biāo)的特性和用于檢測(cè)它們的方法不同，但基于多核苷酸長(zhǎng)度和/或序列，所有這些標(biāo)記在 物理上是相互可區(qū)別的(以及在任一具體標(biāo)記的多個(gè)等位基因之間)。盡管編碼蛋白的具體DNA序列在物種之間通常是非常保守的，但DNA的其他區(qū)域 (通常是非編碼區(qū))會(huì)累積多態(tài)性，因此在同一物種的個(gè)體之間是可變的。這些區(qū)域?yàn)榇?量分子遺傳標(biāo)記提供了基礎(chǔ)。通常，在子代之間分離的任何不同遺傳多態(tài)性狀(包括核酸 多態(tài)性)都是潛在的標(biāo)記?；蚪M可變性可以是任何起源的，例如插入、缺失、復(fù)制、重復(fù)元 件、點(diǎn)突變、重組事件，或轉(zhuǎn)座元件的存在和序列。在本領(lǐng)域中已知大量的玉米分子標(biāo)記，且 是公開(kāi)的或可從不同來(lái)源獲得的，例如MaizeGDB互聯(lián)網(wǎng)資源。同樣，許多檢測(cè)分子標(biāo)記的 方法也完全建立。從植物育種者角度來(lái)看，發(fā)展分子標(biāo)記技術(shù)的主要?jiǎng)訖C(jī)在于，通過(guò)標(biāo)記輔助選擇 (MAS)提高育種效能。與所需表型性狀(例如數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus), 或QTL，例如具體抗病性)表現(xiàn)出連鎖不平衡的分子標(biāo)記等位基因，為在植物種群中選擇 所需性狀提供了可用工具。實(shí)行這種方法的關(guān)鍵步驟是(i)形成分子標(biāo)記的密集遺傳圖 譜，(ii)根據(jù)標(biāo)記和表型可變性之間的統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)檢測(cè)QTL，(iii)根據(jù)QTL分析結(jié)果，確定 一組所需的標(biāo)記等位基因，和(iv)使用和/或外推這些信息至現(xiàn)有的育種種質(zhì)(breeding germplasm)中，以使基于標(biāo)記的選擇決定得以進(jìn)行。含有增加密度的公共玉米標(biāo)記的玉米基因組的完整的連鎖圖的有效性，有助于玉 米遺傳作圖(genetic mapping)和MAS。參見(jiàn)例如萬(wàn)維網(wǎng)上的Maize⑶B資源。兩類標(biāo)記被頻繁用于標(biāo)記輔助選擇方案，即簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simplesequence repeat, SSR，也稱為微衛(wèi)星)標(biāo)記和單核苷多態(tài)性(SNP)標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)SSR通常指任何類型 的導(dǎo)致長(zhǎng)度可變性的分子異質(zhì)性，且最常是含有兩個(gè)或三個(gè)堿基對(duì)序列的多倍串聯(lián)重復(fù)的 DNA短片段(高達(dá)幾百個(gè)堿基對(duì))。因?yàn)閺?fù)制保真度差，例如由聚合酶滑動(dòng)引起，這些重復(fù) 序列會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)度可變的高度多態(tài)DNA區(qū)域。SSRs看起來(lái)隨機(jī)分布在整個(gè)基因組中，且其側(cè) 翼通常為保守區(qū)。SSR標(biāo)記也可來(lái)源于RNA序列(采用cDNA、部分cDNA或EST形式)以及 基因組物質(zhì)。SSR異質(zhì)性的特征使它們非常適合用作分子遺傳標(biāo)記，即SSR基因組可變性是遺 傳的、多等位基因的、共顯性的并且是重現(xiàn)可檢測(cè)的。日益尖端的基于擴(kuò)增的檢測(cè)技術(shù)(例 如，基于PCR)的增加，為核苷酸序列異質(zhì)性檢測(cè)提供了多種靈敏方法。將設(shè)計(jì)引物(或其 他類型的探針)設(shè)計(jì)為與位于SSR區(qū)側(cè)翼的保守區(qū)雜交，從而使可變的SSR區(qū)擴(kuò)增。由SSR 區(qū)產(chǎn)生的不同大小的擴(kuò)增子具有特征性和可復(fù)制的大小。由同一個(gè)體或來(lái)自植物種群不同 個(gè)體的兩條同源染色體獲得的不同大小的SSR擴(kuò)增子，通常被稱為“標(biāo)記等位基因”。只要 存在至少兩個(gè)可產(chǎn)生帶有至少兩個(gè)不同大小的PCR產(chǎn)物的SSR等位基因，則該SSRs可以用 來(lái)作為標(biāo)記。依賴單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的玉米標(biāo)記也是本領(lǐng)域公知的。已發(fā)展多種技術(shù)用于檢測(cè)SNPs，包括等位基因特異性雜交(ASH;參見(jiàn)例如Shattuck-Eidens et al.，(1991)"Rapid detection of maize DNA sequencevariation",Genet. Anal. Tech. Appl. 8 240-245)。也廣泛使用其他類型的分子標(biāo)記，包括但不限于表達(dá)的序列標(biāo)簽(ESTs)和來(lái)源 于EST序列的SSR標(biāo)記，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)，隨機(jī) 擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)和同工酶標(biāo)記。廣泛地用于檢測(cè)這種多變性的方案也是本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的，且這些方案通常是特異性針對(duì)它們?cè)O(shè)計(jì)檢測(cè)的多態(tài)性類型。例如，PCR擴(kuò)增、 單鏈構(gòu)型多態(tài)性(SSCP)和自主序列復(fù)制(self-sustained sequence replication, 3SR ； 參見(jiàn) Chan and Fox,"NASBA and other transcription-based amplification methods for researchand diagnostic microbiology，，，Reviews in Medical Microbiology 10 185-196(1999))。也可產(chǎn)生多種類型的FLP標(biāo)記。最常見(jiàn)的是，使用擴(kuò)增引物產(chǎn)生片段長(zhǎng)度多態(tài) 性。這種FLP標(biāo)記在許多方面都類似于SSR標(biāo)記，除了引物所擴(kuò)增的區(qū)域通常不是高重 復(fù)區(qū)之外。擴(kuò)增的區(qū)域或擴(kuò)增子在種質(zhì)之間仍舊會(huì)具有足夠的可變性，通常是由于插入 或缺失引起的，使得由擴(kuò)增引物產(chǎn)生的片段可在多態(tài)個(gè)體中區(qū)別出來(lái)，已知在玉米中經(jīng)常 發(fā)生這種插入缺失(indels) (Bhattramakki et al. (2002) Plant Mol Biol 48，539-547; Rafalski (2002) Plant Sci 162:329-333)。術(shù)語(yǔ)“插入缺失”是指插入或缺失，其中一條鏈 相對(duì)于第二條鏈稱為具有插入，或第二條鏈相對(duì)于第一條鏈稱為具有缺失。本文公開(kāi)的MZA 標(biāo)記是已經(jīng)過(guò)選擇的擴(kuò)增的FLP標(biāo)記的實(shí)例，因?yàn)樗鼈兎浅＝咏饕旧w2的QTL。一個(gè)分子標(biāo)記與另一分子標(biāo)記的連鎖作為重組頻率來(lái)測(cè)量。通常，兩個(gè)位點(diǎn)(例 如兩個(gè)SSR標(biāo)記)在遺傳圖譜上越近，它們?cè)谖锢韴D譜上也相互越近。相對(duì)遺傳距離(由 交換頻率測(cè)定，以厘摩衡量；cM)與在染色體上兩個(gè)連鎖位點(diǎn)彼此相隔的物理距離(由堿基 對(duì)衡量，例如千堿基對(duì)(kb)或兆堿基對(duì)(Mbp))通常是成比例的。cM和物理距離之間的精 確比例的缺乏，可由在不同染色體區(qū)重組頻率的變化獲得，例如某些染色體區(qū)是重組“熱點(diǎn) (hot spot)”，而其他區(qū)域未表現(xiàn)出任何重組，或只發(fā)生了很少的重組事件。通常，一個(gè)標(biāo)記 與另一標(biāo)記越接近，無(wú)論是根據(jù)重組或物理距離測(cè)量，它們都連鎖得越堅(jiān)固。在某些方面， 一個(gè)分子標(biāo)記與編碼賦予具體表型(抗病性)的多肽的基因越接近，無(wú)論根據(jù)重組或物理 距離測(cè)量，該標(biāo)記都更好地標(biāo)記所需表型性狀。遺傳作圖可變性也可在同一作物物種包括玉米的不同種群之間觀察到。盡管這 種遺傳作圖的可變性會(huì)出現(xiàn)在種群之間，但是來(lái)源于一個(gè)種群的遺傳圖譜和標(biāo)記信息通常 仍然可用于在多個(gè)種群間鑒定具有所需性狀的植物，反選擇具有不需要性狀的植物和指導(dǎo) MAS。QTL 作圖植物育種者的目標(biāo)是為具有所需性狀例如病原體抗性的個(gè)體選擇植物和富集植 物種群，從而最終提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率。很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，可將與具體表型數(shù)量相關(guān)的 具體染色體位點(diǎn)(或區(qū)間)繪制在生物體基因組中。這種位點(diǎn)被稱為數(shù)量性狀位點(diǎn)或QTL。 植物育種者可有利地利用分子標(biāo)記通過(guò)鑒定標(biāo)記等位基因來(lái)鑒定所需個(gè)體，該等位基因顯 示出在統(tǒng)計(jì)上明顯可能與所需表型(例如病原體抗性)共分離，從而證明為連鎖不平衡。通 過(guò)鑒定與數(shù)量性狀共分離的分子標(biāo)記或分子標(biāo)記簇，育種者可鑒定一個(gè)QTL。通過(guò)鑒定和 選擇與所需表型相關(guān)的標(biāo)記等位基因(或所需的來(lái)自多個(gè)標(biāo)記的等位基因)，植物育種者能夠通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)姆肿訕?biāo)記等位基因來(lái)快速選擇所需表型(稱為標(biāo)記輔助選擇過(guò)程或 MAS)。位于遺傳圖譜上的分子標(biāo)記越多，圖譜適宜進(jìn)行MAS的潛在有效性就越大。
已發(fā)展多個(gè)實(shí)驗(yàn)范例來(lái)鑒定和分析QTL (參見(jiàn)例如Jansen (1996) Trends Plant Sci 1:89)。關(guān)于作物物種QTL作圖的大部分公開(kāi)報(bào)道是基于使用雙親代雜交 (bi-parental cross, Lynch and Walsh(1997)Genetics andAnalysis of Quantitative Traits, Sinauer Associates, Sunderland)。通常，這些范例包括使一個(gè)或多個(gè)親代對(duì)雜 交，它們可以是例如來(lái)自兩個(gè)近交品系的單配對(duì)，或不同近交品系或系的多個(gè)相關(guān)或無(wú)關(guān) 親代，它們都表現(xiàn)出與感興趣表型性狀相關(guān)的不同特征。通常，這些實(shí)驗(yàn)范例包括由兩個(gè)歧 化近交系的單交(例如經(jīng)選擇系之間使表型和分子標(biāo)記差異最大)獲得100-300個(gè)分離的 子代。在親代和分離子代中對(duì)多個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行基因分型并對(duì)一個(gè)至多個(gè)數(shù)量性狀(例如 抗病性)進(jìn)行評(píng)估。而QTL鑒定為在分離子代中基因型值和表型可變性之間的明顯統(tǒng)計(jì)關(guān) 聯(lián)。這些實(shí)驗(yàn)方案的強(qiáng)度來(lái)自于近交后代雜交(inbred cross)的利用，因?yàn)楂@得的Fl親 代都具有相同的連鎖相。因此，F(xiàn)l親代自交后，所有分離子代(F2)是有信息的且連鎖不平 衡達(dá)到最大，連鎖相是已知的，只有兩個(gè)QTL等位基因，而且除回交子代之外，每個(gè)QTL等位 基因的頻率是0.5。用于測(cè)定標(biāo)記是否與QTL(或與另一標(biāo)記)遺傳連鎖的許多統(tǒng)計(jì)方法是本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括例如標(biāo)準(zhǔn)線性模型，例如ANOVA或回歸作圖(Haley and Knott (1992)Heredity 69 :315)，最大可能性方法例如期望-最大化算法(如Lander and Botstein (1989) "Mapping Mendelian factorsunderlying quantitative traits using RFLP linkage maps", Geneticsl21185-199 ；Jansen(1992) "A general mixture model for mappingquantitative trait loci by using molecular markers，，，Theor. Appl. Genet. ,85 252-260 ； Jansen (1993) “Maximum likelihood in a generalized linear finitemixture model by using the EM algorithm，，，Biometrics 49 :227_231 ； Jansen(1994) "Mapping of quantitative trait loci by using genetic markers anoverview of biometrical models，，，In J. W. van Ooijen and J. Jansen (eds.), Biometrics in Plantbreeding !applications of molecular markers, pp.116—124, CPR0-DL0 Metherlands ；Jansen(1996) "A general Monte Carlo method formapping multiple quantitative trait loci，，，Genetics 142 305-311 ；and Jansenand Stam(1994)"High Resolution of quantitative trait into multiple loci viainterval mapping”，Genetics 136:1447-1455)。示例性統(tǒng)計(jì)方法包括單點(diǎn)標(biāo)記分析、區(qū)間作圖 (interval mapping, Lander and Botstein (1989)Geneticsl21 185) > Μ π* IK # HI (complex interval mapping)、懲罰回歸分(penalized regression analysis) > ^ie^vIiT (complex pedigree analysis) > MCMCMQM ^l/f (Jansen(1994)Genetics 138:871)、HAPLO-IM+ 分析、HAPL0-MQM 分析、HAPL0-MQM+ 分析、貝葉斯 MCMC、嶺回歸(ridge regression)、血統(tǒng)同一t生分析(identity-by-descent analysis) > Haseman-Elston 回歸， 以上任何都適用于本發(fā)明。此外，在美國(guó)專利No. 6，399，855和WOO149104中描述了有關(guān)可 用于鑒定和定位QTLs的適用于復(fù)合育種種群(complex breeding populations)的可選統(tǒng) 計(jì)方法的其他細(xì)節(jié)。這些方法中的任何方法都是高度運(yùn)算的，通常在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和專門軟 件的輔助下進(jìn)行。適宜的統(tǒng)計(jì)軟件包可從多個(gè)公共和商業(yè)來(lái)源獲得，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。Sala等在阿根廷專利申請(qǐng)ARP20030100125號(hào)中公開(kāi)了與玉米植物MRCV抗性相關(guān) 的三個(gè) QTL 等位基因的組合。該位點(diǎn)與 bnlgl017，bnlg2277，bnlgl25，bnlg38UPbnlgl80 的偏好抗性標(biāo)記等位基因相連，其中存在所有賦予抗性的等位基因時(shí)，出現(xiàn)抗性。在本領(lǐng)域中需要可抵抗斐濟(jì)病毒尤其是MRCV和MRDV和它們的致病劑例如 Delphacodes kuscheli感染的改良玉米品系。在本領(lǐng)域中需要鑒定表現(xiàn)出斐濟(jì)病毒抗性的 玉米植物或種群(種質(zhì))的方法。本領(lǐng)域需要鑒定與斐濟(jì)病毒抗性位點(diǎn)連鎖的分子遺傳標(biāo) 記，促進(jìn)MAS，并也需要賦予斐濟(jì)病毒抗性的基因等位基因的基因發(fā)現(xiàn)和克隆。這些標(biāo)記可 用于在玉米種群中選擇顯示出偏好標(biāo)記等位基因的個(gè)體植物和植物種群，然后用其選擇抗 性表型，或可選地用于反選擇顯示出斐濟(jì)病毒易感性表型的植物或植物種群。本發(fā)明提供 了這些和其他優(yōu)勢(shì)。 發(fā)明_既述提供了用于鑒定具有新賦予的或增強(qiáng)的斐濟(jì)病毒抗性的玉米植物或種質(zhì)的組合 物和方法。還提供了產(chǎn)生抵抗斐濟(jì)病毒的玉米植物或種質(zhì)的方法，例如通過(guò)所需抗性標(biāo)記 等位基因的基因滲入和/或通過(guò)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生方法，以及通過(guò)這些方法產(chǎn)生的植物和種植。 選擇抗性植物和種質(zhì)的系統(tǒng)和試劑盒，也是本發(fā)明的一部分。在一些方面，本發(fā)明提供了鑒定具有對(duì)MRCV的新賦予的抗性、抗性增強(qiáng)或易感性 的第一玉米植物或種質(zhì)(例如系或品種)。在這些方法中，在第一玉米植物或種質(zhì)中，檢測(cè) 至少一個(gè)或多個(gè)與新賦予的抗性、抗性增強(qiáng)或易感性相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)(例如，多個(gè)標(biāo)記位 點(diǎn))的至少一個(gè)等位基因。可從表1和2所提供的位點(diǎn)，包括MZA625、MZA16656、MZA15451、 MZA15490、MZA2038、MZA11826和MZA9105，以及任何與這些QTL標(biāo)記連鎖的其他標(biāo)記(例如 這些位點(diǎn)約IOcM之內(nèi)的)中選擇標(biāo)記位點(diǎn)。表1和2顯示了通過(guò)結(jié)合作圖分析和QTL區(qū) 間作圖(包括單標(biāo)記回歸分析)方法確定的證實(shí)與MRCV抗性表型連鎖不平衡的玉米標(biāo)記。 該表表明，基因組-SSR或EST-SSR標(biāo)記型(所有簡(jiǎn)單重復(fù)序列)，或SNP或MZA標(biāo)記，定位 有標(biāo)記的染色體及其相對(duì)于其他已知標(biāo)記的大概遺傳圖譜位置，以cM表示，在染色體上的 零位置是第一(最末端)標(biāo)記。還顯示了用于標(biāo)記隨機(jī)分離分析和統(tǒng)計(jì)概率的玉米種群， 和考慮了多檢驗(yàn)的可變性和假陽(yáng)性作為調(diào)整概率(adjusted probability)給出的抗性/ 易感性表型。還顯示了單標(biāo)記回歸的概率值。本發(fā)明也提供了與MRCV相關(guān)的染色體QTL區(qū)間。這些區(qū)間位于連鎖組2上。發(fā) 現(xiàn)位于這些區(qū)間之內(nèi)的任何標(biāo)記也可作為MRCV抗性標(biāo)記，這也是本發(fā)明的一部分。這些區(qū) 間包括(i)MZA8381 禾口 MZA18180 ；
(ii)MZA4305 和 MZA2803 ；(iii)MZA15490 和 MZA2038 ；(iv)bnlgl458b 和 umcl261a ；(v)bnlgl458b 禾口 umc 1262a ；(vi)bnlgl327 和 umcl261a ；以及(viii)bnlgl327 和 umcl262a。在同一植物中可選擇多個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)。組合選擇哪些QTL標(biāo)記是沒(méi)有特別限制的。組合使用的QTL標(biāo)記可以是表1和2所列的任何標(biāo)記，與表1和2中的標(biāo)記連鎖的任何其他標(biāo)價(jià)(例如由MaizeGDB資源確定的連鎖標(biāo)記)，或本文所述QTL區(qū)間內(nèi)的任何標(biāo)記。 與表1和2的QTL標(biāo)記連鎖的標(biāo)記可以緊密連鎖，例如距表1和2的QTL標(biāo)記約 10cM之內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，連鎖位點(diǎn)表現(xiàn)出距QTL標(biāo)記9、8、7、6、5、4、3、2、1、0. 75,0. 5
或0. 25或更小厘摩的遺傳重組距離。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選QTL 標(biāo)記選自 MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、 MZA2038、MZA11826 禾PMZA9105。最優(yōu)選的 QTL 標(biāo)記選自 MZA15490 禾PMZA2038。在一些實(shí)施方案中，種質(zhì)是玉米系或品種。在一些方面，玉米植物對(duì)MRCV的新賦 予的抗性、抗性增強(qiáng)或易感性，可采用任何適宜方式量化，例如1-9級(jí)(MRCV得分)，其中，1 表示高度易感基因型，而9為完全抗性基因型；4表示具有最小抗性水平的基因型，以便產(chǎn) 生商業(yè)雜種。評(píng)估MRCV抗性的第二種方式是通過(guò)評(píng)估高度易感植物占具體基因型的百分比。 例如，基因型排列在完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)中，每個(gè)試驗(yàn)單元由4米田列表示，且每列種植大約 20個(gè)植物的田間試驗(yàn)。通過(guò)觀察每個(gè)試驗(yàn)單元并進(jìn)行田間評(píng)分(1-9分)來(lái)評(píng)估MRCV抗 性增強(qiáng)。同時(shí)，檢測(cè)每個(gè)試驗(yàn)單元中高度易感植物的百分比。有關(guān)表現(xiàn)MRCV癥狀的玉米實(shí) 例，參見(jiàn)圖3A，而圖3B是表現(xiàn)MRCV易感性的玉米實(shí)例。可采用多種技術(shù)中的任何技術(shù)鑒定標(biāo)記等位基因。等位基因檢測(cè)方法不受任何限 制。等位基因檢測(cè)方法通常包括分子鑒定方法，例如標(biāo)記擴(kuò)增子的擴(kuò)增和檢測(cè)。例如，通過(guò) 例如基于擴(kuò)增的技術(shù)，可檢測(cè)多態(tài)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)或單核苷酸多態(tài)性(SNP)形式的等 位基因。在這些和其他基于擴(kuò)增的檢測(cè)方法中，標(biāo)記位點(diǎn)或一部分標(biāo)記位點(diǎn)被擴(kuò)增(例如 通過(guò)采用從感興趣玉米植物分離的核酸作為模板進(jìn)行的PCR、LCR或轉(zhuǎn)錄)，并檢測(cè)獲得的 擴(kuò)增標(biāo)記擴(kuò)增子。這種方法的一個(gè)實(shí)例中，將擴(kuò)增引物或擴(kuò)增引物對(duì)與從第一玉米植物或
13種質(zhì)分離的基因組核酸混合，其中引物或引物對(duì)與至少一部分標(biāo)記位點(diǎn)互補(bǔ)或部分互補(bǔ)， 并能夠使用玉米基因組核酸作為模板，通過(guò)DNA聚合酶，啟動(dòng)DNA聚合。在具有DNA聚合酶 和模板基因組核酸的DNA聚合反應(yīng)中引物或引物對(duì)(例如表3提供的引物對(duì))被延伸，產(chǎn) 生至少一個(gè)擴(kuò)增子。表3 表3列出了基因組標(biāo)記和SSR標(biāo)記，包括經(jīng)顯示與MRCV抗性表型連鎖不平衡(直 接或通過(guò)遺傳圖譜外推的)的標(biāo)記。表3提供了 SSR標(biāo)記位點(diǎn)基因分型分析所用的左、右 PCR引物序列。也顯示了右引物5’端所用的尾巴序列，和SSR中串聯(lián)重復(fù)元件的核苷酸數(shù)。
在任何情況中，表示檢測(cè)的等位基因的數(shù)據(jù)，可被傳遞(例如電子地或經(jīng)紅外、無(wú) 線或光傳播)至計(jì)算機(jī)或計(jì)算機(jī)可讀取介質(zhì)中，用于分析或存儲(chǔ)。在一些實(shí)施方案中，植物 RNA是擴(kuò)增反應(yīng)的模板。在其他實(shí)施方案中，植物基因組DNA是擴(kuò)增反應(yīng)的模板。在一些實(shí) 施方案中，QTL標(biāo)記是SNP型標(biāo)記，而檢測(cè)的等位基因是SNP等位基因(參見(jiàn)例如表4(顯 示在QTL位置的SNP標(biāo)記和具體PH7WT ( = 630 = PH14J)和PH9TJ單元型))，檢測(cè)方法是 等位基因特異性雜交(ASH)。
因，且該等位基因是反選擇的。例如，可被選擇(偏好等位基因，例如PH7WT和PH9TJ(參見(jiàn) 表5))或剔除(非偏好等位基因，例如PH3DT、PH890和PH6KW(參見(jiàn)表5))的等位基因。 若選擇多個(gè)標(biāo)記，則為每個(gè)標(biāo)記選擇等位基因；從而選擇兩個(gè)或多個(gè)等位基因。在 一些實(shí)施方案中，可以是標(biāo)記位點(diǎn)具有超過(guò)一個(gè)優(yōu)勢(shì)等位基因的情況，在這種情況下，可選 擇任一等位基因。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，鑒定與對(duì)MRCV的新賦予的抗性、抗性增強(qiáng)或易感性相關(guān)的QTL標(biāo)記 位點(diǎn)的能力，也提供了選擇具有偏好標(biāo)記位點(diǎn)的植物的方法。即，被鑒定包含所需標(biāo)記位點(diǎn) (例如與抗性正相關(guān)的標(biāo)記等位基因)的任何植物可被選擇，而缺乏該位點(diǎn)或具有與抗性 負(fù)相關(guān)的位點(diǎn)的植物可被剔除。從而，在一個(gè)方法中，鑒定標(biāo)記位點(diǎn)之后，該方法包括選擇 (例如分離)第一玉米植物或種質(zhì)，或選擇第一植物或種質(zhì)的子代。在一些實(shí)施方案中，獲 得的所選的第一玉米植物或種質(zhì)可與第二玉米植物或種質(zhì)雜交(例如原種或外來(lái)玉米，取 決于子代所需的特征)。同樣，在其他實(shí)施方案中，如果等位基因與對(duì)MRCV的新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)相 關(guān)，該方法可包括等位基因向第二玉米植物或種質(zhì)的基因滲入，以產(chǎn)生基因滲入的玉米植 物或種質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，第二玉米植物或種質(zhì)與第一玉米植物或種質(zhì)相比，通常會(huì)顯 示出MRCV抗性降低，而基因滲入的玉米植物或種質(zhì)與第二玉米植物或種質(zhì)相比，通常會(huì)顯 示出MRCV抗性增強(qiáng)。由這些方法產(chǎn)生的基因滲入的玉米植物或種質(zhì)也是本發(fā)明的一部分。 (在一些實(shí)施方案中，偏好基因滲入的等位基因是PH7WT/PH9TJ，參見(jiàn)表5)。在其他方面，不同作圖種群可用于測(cè)定本發(fā)明的連鎖標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案，所用 的作圖種群是來(lái)源于雜交PH7WTxPH3DT或PH9TJxPH890的種群。在其他實(shí)施方案中，可使用 其他種群。在其他方面，可使用多種軟件測(cè)定連鎖標(biāo)記位點(diǎn)。例如，TASSE、MapManager-QTX 和GeneFlow都可用于本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，例如，若在連鎖分析中使用軟件，檢測(cè)的 等位基因信息(例如數(shù)據(jù))被電子傳送或電子存儲(chǔ)在例如計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中。在其他方面，可用不同作圖種群測(cè)定用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的連鎖標(biāo)記。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所用的作圖種群是來(lái)源于雜交PH7WTxPH3DT或PH9TJxPH890的種群。在其他實(shí) 施方案中，可使用其他種群。在其他方面，在測(cè)定構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物所用的連鎖標(biāo)記位點(diǎn)中可 使用多種軟件。例如，TASSEL、MapManager-QTX和GeneFlow都可用于本發(fā)明。用于鑒定預(yù)期具有對(duì)MRCV的新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)的玉米植物的系統(tǒng)，也是 本發(fā)明的一方面。通常，該系統(tǒng)包括一組標(biāo)記引物和/或探針，其經(jīng)配置，檢測(cè)與對(duì)MRCV 的新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的至少一個(gè)等位基因，其中標(biāo)記 位點(diǎn)或位點(diǎn)選自 MZA7588、MZA8381、MZA3105、MZA482、MZA16531、MZA14553、MZA4305、 MZA625、MZA15451、MZA9105、MZA11826、MZA15490、MZA16656、MZA2038、MZA2803、MZA18224、 MZA2349、MZA564、MZA11066、MZA18180、MZA8442、MZA15563、MZA18036、MZA15264、MZA10384、 MZA12874、MZA12454、MZA8926和MZA5057，以及與這些QTL標(biāo)記連鎖(或在一些實(shí)施方案 中，是緊密連鎖的，例如被證實(shí)不大于10%的重組頻率)的任何其他標(biāo)記；以及，此外，位于 染色體QTL區(qū)間之內(nèi)的任何標(biāo)記位點(diǎn)，其包括(i)MZA8381 禾口 MZA18180 ；(ii)MZA4305 和 MZA2803 ；(iii)MZA15490 和 MZA2038 ；(iv)bnlgl458b 和 umcl261a ；(v)bnlgl458b 禾口 umc 1262a ；
(vi)bnlgl327 和 umcl261a ；以及(viii)bnlgl327 和 umcl262a。在一些實(shí)施方案中，所用的優(yōu)選的QTL標(biāo)記選自MZA625、MZA16656、MZA15451、 MZA15490、MZA2038、MZA11826 和 MZA9105。在所需的實(shí)施標(biāo)記檢測(cè)或關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)中，該系統(tǒng)也可包括經(jīng)配置檢測(cè)一個(gè)或多個(gè) 來(lái)自標(biāo)記探針或引物組或其擴(kuò)增子的信號(hào)輸出由此鑒定等位基因的存在或缺失的檢測(cè)器， 和/或使偏好等位基因的存在或缺失與預(yù)期抗性關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)指令。檢測(cè)器的精確配置取決 于用于檢測(cè)標(biāo)記等位基因的標(biāo)記類型。典型實(shí)施方案包括光檢測(cè)器、射線檢測(cè)器等。光發(fā) 射或其他探針標(biāo)記的檢測(cè)，可指示標(biāo)記等位基因的存在或缺失。同樣，精確形式的指令可依 據(jù)系統(tǒng)組成而變化，例如它們可作為系統(tǒng)軟件而存在于系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)集成單元中，或 存在于可與檢測(cè)器關(guān)聯(lián)操作的一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)或計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中。在一個(gè)典型實(shí)施方 案中，系統(tǒng)指令包括至少一個(gè)包括偏好等位基因的存在或缺失與預(yù)期的新賦予的抗性、抗 性增強(qiáng)或易感性之間的關(guān)聯(lián)的查詢表。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)可由分離元件組成或可以整合成便于檢測(cè)標(biāo)記等位基因 和用于進(jìn)行標(biāo)記抗性性狀關(guān)聯(lián)的單獨(dú)單元。在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)也可包括樣品，例如 來(lái)自玉米或所選玉米植物組織的基因組DNA，擴(kuò)增的基因組DNA、cDNA、擴(kuò)增的cDNA、RNA或 擴(kuò)增的RNA。試劑盒也是本發(fā)明的一部分。例如，試劑盒可包括用于檢測(cè)抗性相關(guān)標(biāo)記位點(diǎn)的 適宜引物或探針，以及使用引物或探針檢測(cè)標(biāo)記位點(diǎn)和使位點(diǎn)與預(yù)期MRCV抗性關(guān)聯(lián)的說(shuō) 明。試劑盒還可包括包裝探針、引物或說(shuō)明的包裝材料，對(duì)照物例如包括用于擴(kuò)增的探針、 引物或模板核酸的對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)，分子大小標(biāo)記等。定義在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明不限于具體實(shí)施方案，本發(fā)明當(dāng)然 可以變化。還應(yīng)理解的是，本文所用術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方案，而不對(duì)其構(gòu)成限定。如 在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(a)” “一個(gè)(an)”和“該 (the)”包括復(fù)數(shù)指示物，除非另有明確的相反指示。因而，例如“植物(plant)” “該植物 (theplant)”或“植物(a plant) ”的涵義，也包括多個(gè)植物；而且，根據(jù)內(nèi)容，使用術(shù)語(yǔ)“植 物”也可包括該植物的遺傳上類似或相同子代；使用術(shù)語(yǔ)“核苷酸”任選地包括，如實(shí)際情 況，該核酸分子的多個(gè)拷貝；同樣，術(shù)語(yǔ)“探針”任選地(和通常)包含多個(gè)類似或相同的探 針?lè)肿?。除非另有指出，否則核酸是以5’至3’的方向從左往右書寫。說(shuō)明書中所述的數(shù) 值范圍，包括定義范圍的數(shù)值，并包括所定義范圍之內(nèi)的每個(gè)整數(shù)或任何非整數(shù)的分?jǐn)?shù)。除 非另有指出，本文所用的所有技術(shù)和科技術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解 的具有相同的含義。盡管類似或等同于本文所述的方法和材料的方法和材料都可以用于檢 驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)踐中，但本文描述了優(yōu)選材料和方法。在本發(fā)明的描述和權(quán)利要求中，所用的 以下術(shù)語(yǔ)符合以下給出的定義?！爸参铩笨梢允钦曛参铮淙我獠糠?，或來(lái)源于植物的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物。因此， 術(shù)語(yǔ)“植物”是指任何整株植物、植物組分或器官(例如葉、莖、根等)、植物組織、種子、植 物細(xì)胞和/或其子代。植物細(xì)胞是取自植物或來(lái)源于其中植物的細(xì)胞的培養(yǎng)物的植物的細(xì)胞。因此，術(shù)語(yǔ)“玉米植物”包括整株玉米植物、玉米植物細(xì)胞、玉米植物原生質(zhì)體、可再生 玉米植物的玉米植物細(xì)胞或玉米植物組織培養(yǎng)物、玉米植物愈合組織，玉米植物或玉米植 物的部分例如玉米種子、玉米穗軸、玉米花、玉米子葉、玉米葉片、玉米莖、玉米芽、玉米根、 玉米根尖等中完好的玉米植物團(tuán)和玉米植物細(xì)胞?！胺N質(zhì)”是指?jìng)€(gè)體(例如植物)、一組個(gè)體(例如植物系、品種或族)的遺傳材料， 或來(lái)自系、品種、物種或培養(yǎng)物的克隆。種質(zhì)可以是生物體或細(xì)胞的一部分，或可從生物體 或細(xì)胞分離。通常，種質(zhì)提供了具有具體分子組成的遺傳材料，其為生物體或細(xì)胞培養(yǎng)物的 一些或所有遺傳性質(zhì)提供物理基礎(chǔ)。如本文所用的，種質(zhì)包括可生長(zhǎng)成新植物的細(xì)胞、種子 或組織，或可培養(yǎng)成整株植物的植物部分，例如葉、莖、花粉或細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“等位基因”是指存在于具體位點(diǎn)的兩個(gè)或多個(gè)不同核酸序列之一。例如，第 一等位基因可存在于一條染色體上，而第二等位基因可存在于第二同源染色體上，例如存 在于雜合個(gè)體的不同染色體，或種群中不同純合或雜合個(gè)體之間?！捌玫任换颉笔窃诰?體位點(diǎn)上的等位基因，該位點(diǎn)賦予或有助于農(nóng)藝所需表型例如MRCV抗性，或可選地是可以 鑒定可從育種程序或種植中剔除的易感植物的等位基因。標(biāo)記的偏好等位基因是與偏好 表型分離或可選地與易感植物表型分離從而提供鑒定疾病傾向植物的益處的標(biāo)記等位基 因。偏好等位基因形式的染色體片段是包括在物理上位于染色體片段的一個(gè)或多個(gè)基因位 點(diǎn)上有助于優(yōu)良農(nóng)藝性能的核酸序列的染色體片段。“等位基因頻率”是指等位基因出現(xiàn) 在個(gè)體、系或系種群之內(nèi)位點(diǎn)上的頻率(比例或百分比)。例如，對(duì)于等位基因“A”，基因型 “AA”、Aa”或“aa”的二倍體的等位基因頻率分別為1.0、0.5或0.0。通過(guò)對(duì)來(lái)自該系內(nèi)的 個(gè)體樣品的等位基因頻率進(jìn)行平均，可估算該系內(nèi)的等位基因頻率。同樣，通過(guò)對(duì)構(gòu)成種群 的品系的等位基因頻率進(jìn)行平均，可計(jì)算系種群的等位基因頻率。對(duì)于具有有限數(shù)量的個(gè) 體或品系的種群，等位基因頻率可表達(dá)為含有該等位基因的個(gè)體或品系(或任何其他指定 定集合)的計(jì)數(shù)。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀連鎖，且等位基因的存在是所需性狀或性狀形式會(huì)出現(xiàn)在含有 該等位基因的植物上的指示器時(shí)，等位基因與性狀“正”相關(guān)。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀連鎖，且 等位基因的存在是所需性狀或性狀形式不會(huì)出現(xiàn)在含有該等位基因的植物上的指示器時(shí)， 等位基因與性狀“負(fù)”相關(guān)。如果個(gè)體在給定位點(diǎn)上僅具有一種類型的等位基因(例如，二倍體個(gè)體在兩個(gè)同 源染色體上都在一個(gè)位點(diǎn)具有一拷貝的同一等位基因)，則該個(gè)體是“純合的”。如果在給 定位點(diǎn)存在超過(guò)一個(gè)的等位基因類型(例如兩個(gè)不同等位基因都具有的一個(gè)拷貝的二倍 體個(gè)體)，則個(gè)體是“雜合的”。術(shù)語(yǔ)“同源性”是指一組成員在一個(gè)或多個(gè)具體位點(diǎn)具有相 同基因型。相反，術(shù)語(yǔ)“異源性”用于指示組內(nèi)的個(gè)體在一個(gè)或多個(gè)具體位點(diǎn)基因型不同?！拔稽c(diǎn)”是多態(tài)核酸、性狀決定簇、基因或標(biāo)記所在的染色體區(qū)域。因此，例如，“基 因位點(diǎn)(gene locus) ”是在物種基因組上可發(fā)現(xiàn)具體基因的具體染色體位置。術(shù)語(yǔ)“數(shù)量性狀位點(diǎn)”或“QTL”是指在至少一個(gè)遺傳背景例如在至少一個(gè)育種種 群或子代中具有至少一個(gè)與表型性狀的差異表達(dá)相關(guān)的等位基因的多態(tài)基因位點(diǎn)。QTL可 通過(guò)單基因機(jī)制或通過(guò)多基因機(jī)制起作用。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”、“分子標(biāo)記”、“標(biāo)記核酸”和“標(biāo)記位點(diǎn)”，是指在鑒定連鎖位點(diǎn)時(shí)作 為參照點(diǎn)的核酸序列或其編碼產(chǎn)物(例如蛋白)。標(biāo)記可來(lái)源于基因組核酸序列或來(lái)源于表達(dá)的核酸序列(例如，來(lái)源于剪接的RNA或cDNA)，或來(lái)源于編碼的多肽。該術(shù)語(yǔ)也表示 與標(biāo)記序列互補(bǔ)或位于標(biāo)記序列側(cè)翼的核酸序列，例如作為能夠擴(kuò)增標(biāo)記序列的探針或引 物對(duì)的核酸?！皹?biāo)記探針”是可用于鑒定標(biāo)記位點(diǎn)的存在的核酸序列或分子，例如與標(biāo)記位 點(diǎn)序列互補(bǔ)的核酸探針?？蛇x地，在一些方面，標(biāo)記探針是指能夠區(qū)別(即基因分型)存在 于標(biāo)記位點(diǎn)上的具體等位基因的任何類型的探針。如果核酸能在溶液中根據(jù)如沃森-克里 克堿基配對(duì)規(guī)則特異性雜交，則它們是“互補(bǔ)的”?！皹?biāo)記位點(diǎn)”是可用于追蹤第二連鎖位點(diǎn) 存在的位點(diǎn)，例如編碼或有助于表型性狀的表達(dá)的連鎖位點(diǎn)。例如，標(biāo)記位點(diǎn)可用于監(jiān)測(cè)在 一個(gè)與標(biāo)記位點(diǎn)基因或物理連鎖的位點(diǎn)上的等位基因的分離，例如QTL。因此，“標(biāo)記等位 基因”，可選地“標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因”，是在具有標(biāo)記位點(diǎn)多態(tài)性的種群中在標(biāo)記位點(diǎn)上發(fā) 現(xiàn)的多個(gè)多態(tài)核酸序列之一。在某些方法，本發(fā)明提供了與玉米中MRCV抗性相關(guān)的標(biāo)記位 點(diǎn)。預(yù)期每個(gè)所鑒定的標(biāo)記與有助于抗性的基因元件例如QTL具有緊密的物理或基因親近 度(導(dǎo)致物理和/或遺傳連鎖)。“遺傳標(biāo)記”是在種群中多態(tài)的核酸，其中，可通過(guò)一種或多種分析方法，例如 RFLP、AFLP、同工酶、SNP、SSR等，檢測(cè)并區(qū)別出它的等位基因。該術(shù)語(yǔ)還表示與基因組序列 互補(bǔ)的核酸序列，例如用作探針的核酸?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域建立已久的方法檢測(cè)與種群成員之間遺傳多態(tài)性對(duì)應(yīng)的標(biāo)記。這些 包括例如基于PCR的序列特異性擴(kuò)增方法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的檢測(cè)、同工酶 標(biāo)記的檢測(cè)，通過(guò)等位基因特異性雜交(ASH)的多核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)、擴(kuò)增的植物基因 組可變序列的檢測(cè)、自主序列復(fù)制的檢測(cè)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSRs)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)的檢測(cè)，或擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLPs)的檢測(cè)。已知建立已久的方法用于檢測(cè)表 達(dá)的序列標(biāo)簽(ESTs)和來(lái)源于EST序列的SSR標(biāo)記和隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)。“遺傳圖譜”是在給定物種內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)染色體(或連鎖群)上的位點(diǎn)之間遺傳 連鎖關(guān)系的描繪，通常以圖標(biāo)或表格形式描繪?！斑z傳作圖”是通過(guò)使用遺傳標(biāo)記、標(biāo)記的種 群隔離和重組頻率的標(biāo)準(zhǔn)遺傳原理確定位點(diǎn)連鎖關(guān)系的過(guò)程。“遺傳圖譜位置”是遺傳圖譜 中相對(duì)于相同連鎖群中周圍遺傳標(biāo)記的位置，在該連鎖群中，在給定物種內(nèi)可發(fā)現(xiàn)具體標(biāo) 記。相反的，基因組的“物理圖譜”是指絕對(duì)距離(例如，以堿基對(duì)測(cè)量或分離和重疊鄰近 基因片段，例如重疊群)?；蚪M的物理圖譜不考慮進(jìn)物理圖譜不同點(diǎn)之間的遺傳行為(例 如重組頻率)?！斑z傳重組頻率”是兩個(gè)基因位點(diǎn)之間交換事件(重組)的頻率。通過(guò)追隨減數(shù)分 裂之后的標(biāo)記和/或性狀分離，可觀察到重組頻率。遺傳重組頻率可以厘摩(cM)表示，其 中一 cM是表現(xiàn)出重組頻率(S卩，每100次細(xì)胞分裂中出現(xiàn)一次這兩個(gè)標(biāo)記之間的交換 事件)的兩個(gè)遺傳標(biāo)記之間的距離。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“連鎖”用于描述一個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)與另一標(biāo)記位點(diǎn)或一些其他位 點(diǎn)(例如抗性位點(diǎn))相關(guān)的程度。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“連鎖平衡”描述兩個(gè)標(biāo)記獨(dú)立分離的情況，即在子代中隨機(jī) 分配。表現(xiàn)出連鎖平衡的標(biāo)記被認(rèn)為是不連鎖的(無(wú)論它們是否位于同一染色體上)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“連鎖不平衡”描述兩 個(gè)標(biāo)記以非隨機(jī)方式分離的情況，即具 有小于50%的重組頻率(經(jīng)定義，在相同連鎖群上以小于50cM分離)。表現(xiàn)出連鎖不平衡 的標(biāo)記被認(rèn)為是連鎖的。當(dāng)標(biāo)記位點(diǎn)和相連的位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)共同在子代植物中比不共同在子代植物更頻繁時(shí)則發(fā)生連鎖。如本文所用的，連鎖可在兩個(gè)標(biāo)記之間，或可選地在標(biāo)記和表 型之間。標(biāo)記位點(diǎn)可與性狀相關(guān)(連鎖)，例如當(dāng)標(biāo)記位點(diǎn)與抗性性狀連鎖不平衡時(shí)，標(biāo)記 位點(diǎn)可與對(duì)植物病原體的新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)相關(guān)?？蓽y(cè)量分子標(biāo)記與表型性狀的連 鎖程度，表示為例如分子標(biāo)記與表型共分離的統(tǒng)計(jì)概率。如本文所用的，以“概率”或“調(diào)整概率”給出分子標(biāo)記與表型之間的連鎖關(guān)系。概 率值是隨機(jī)的表型與具體標(biāo)記等位基因的存在或缺失的具體組合的統(tǒng)計(jì)學(xué)可能性。因而， 概率值越低，表型與具體標(biāo)記共分離的可能性越大。在一些方面，概率值被認(rèn)為“顯著的”或 “不顯著的”。在一些實(shí)施方案中，隨機(jī)分配的概率值0.05(p = 0.05，或5%概率)被認(rèn)為 共分離的顯著指示。但是，本發(fā)明不限于這個(gè)具體標(biāo)準(zhǔn)，可接受的概率可以是小于50% (ρ =0. 5)的任何概率。例如，顯著概率可小于0. 25、小于0. 20、小于0. 15或小于0. 1。術(shù)語(yǔ)“物理連鎖”有時(shí)用于表示，兩個(gè)位點(diǎn)例如兩個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)是物理存在于同一染 色體上。有利的是，兩個(gè)連鎖位點(diǎn)是緊密接近的，以便同源染色體對(duì)之間的重組不會(huì)在減 數(shù)分裂期間高頻率地發(fā)生在兩個(gè)位點(diǎn)之間，例如以便連鎖位點(diǎn)至少約90%的時(shí)間，例如 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%,99. 75%或更多時(shí)間共分離。在本申請(qǐng)中短語(yǔ)“緊密連鎖”表示兩個(gè)連鎖位點(diǎn)之間的重組以等于或小于約10% 的概率發(fā)生(即在遺傳圖譜上以不大于IOcM分離)。換句話說(shuō)，緊密連鎖位點(diǎn)至少90%的 時(shí)間共分離。當(dāng)被證實(shí)具有與所需性狀(例如病原體抗性)共分離 (連鎖)的顯著概率時(shí)， 該標(biāo)記位點(diǎn)尤其可用于本發(fā)明中。例如，在一些方面，這些標(biāo)記可稱為連鎖QTL標(biāo)記。在其 他方面，特別有用的分子標(biāo)記是那些連鎖或緊密連鎖的標(biāo)記。在一些方面，連鎖可表示為任何所需限度或范圍。例如，在一些實(shí)施方案中，兩個(gè) 連鎖位點(diǎn)是以小于50cM圖譜單位分離的。在其他實(shí)施方案中，連鎖位點(diǎn)是以小于40cM分 離的兩個(gè)位點(diǎn)。在其他實(shí)施方案中，兩個(gè)連鎖位點(diǎn)是以小于30cM分離的兩個(gè)位點(diǎn)。在其他 實(shí)施方案中，兩個(gè)連鎖位點(diǎn)是以小于25cM分離的兩個(gè)位點(diǎn)。在其他實(shí)施方案中，兩個(gè)連鎖 位點(diǎn)是以小于20cM分離的兩個(gè)位點(diǎn)。在其他實(shí)施方案中，兩個(gè)連鎖位點(diǎn)是以小于15cM分 離的兩個(gè)位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，連鎖的囊括范圍確定在例如10-20cM之間，或10-30cM 之間，或10-40cM之間是有利的。一個(gè)標(biāo)記與第二位點(diǎn)連鎖得越緊密，標(biāo)記越成為更好的第二位點(diǎn)指示器。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，緊密連鎖的位點(diǎn)，例如標(biāo)記位點(diǎn)和第二位點(diǎn)表現(xiàn)出10%或更小，優(yōu)選約 9 %或更小，還更優(yōu)選約8 %或更小，還更優(yōu)選約7 %或更小，還更優(yōu)選約6 %或更小，還更優(yōu) 選約5%或更小，還更優(yōu)選約4%或更小，還更優(yōu)選約3%或更小，還更優(yōu)選約2%或更小的 位點(diǎn)間重組頻率。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，相關(guān)位點(diǎn)表現(xiàn)出約或更小，例如約0. 75% 或更小，更優(yōu)選約0. 5%或更小，或還更優(yōu)選0. 25%或更小的重組頻率。位于同一染色體上 且兩者距離會(huì)使兩個(gè)位點(diǎn)之間以小于10% (例如約9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%, 1%>0. 75%,0. 5%,0. 25%或更小)的頻率發(fā)生重組，則兩個(gè)位點(diǎn)稱為相互“接近”。在一些 情況中，兩個(gè)不同標(biāo)記可具有相同的遺傳圖譜坐標(biāo)(genetic mapcoordinates)。如果這樣， 兩個(gè)位點(diǎn)是相互緊密接近的以使它們之間的重組以不可檢測(cè)的低頻率發(fā)生。當(dāng)涉及兩個(gè)基因元件例如有助于抗性的基因元件和接近的標(biāo)記之間的關(guān)系時(shí)， “偶聯(lián)”相連鎖表示在抗性位點(diǎn)上的“偏好”等位基因在同一染色體鏈上作為各自連鎖的標(biāo)記位點(diǎn)的“偏好”等位基因是物理相關(guān)的狀態(tài)。在偶聯(lián)相中，這兩個(gè)偏好等位基因是通過(guò)繼承那條染色體鏈的子代共同遺傳的。在“排斥”相連鎖中，感興趣位點(diǎn)上的“偏好”等位基 因與在接近標(biāo)記位點(diǎn)上的“非偏好”等位基因物理連鎖，而這兩個(gè)“偏好”等位基因不共同 遺傳(即兩個(gè)位點(diǎn)是彼此“不同相”)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“染色體區(qū)間”或“染色體片段”指示位于單個(gè)染色體上的基 因組DNA的連續(xù)直線跨度。位于單個(gè)染色體區(qū)間上的基因元件或基因是物理連鎖的。染色 體區(qū)間的大小沒(méi)有具體限制。在一些方面，例如本發(fā)明的全文中，通常位于單個(gè)染色體區(qū)間內(nèi)的基因元件也是 遺傳連鎖的，通常在例如小于或等于20cM，或可選地，小于或等于IOcM的遺傳重組距離之 內(nèi)。即，單個(gè)染色體區(qū)間內(nèi)的基因元件以小于或等于20%或10%的頻率進(jìn)行重組。在一方面，本發(fā)明的任何標(biāo)記是與在或小于50cM距離內(nèi)的任何其他標(biāo)記連鎖的 (基因或物理地)。在另一方面，本發(fā)明的任何標(biāo)記是與緊密接近例如在或小于IOcM距離 內(nèi)的任何其他標(biāo)記緊密連鎖的(基因或物理地)。在同一染色體上的兩個(gè)緊密連鎖的標(biāo)記 可以互相距離 9、8、7、6、5、4、3、2、1、0· 75,0. 5 或 0. 25cM 或更小。短語(yǔ)“由Mal de Rio Cuarto病毒引起的疾病”或“由MRCV引起的疾病”是指由 植物感染MRCV弓I起的植物疾病。玉米植物對(duì)MRCV的“新賦予的抗性”或“抗性增強(qiáng)”表示，在導(dǎo)入該疾病的致病劑 之后，玉米植物在產(chǎn)量和/或存活率或其他相關(guān)農(nóng)藝測(cè)量方面受到更小影響。抗性是相對(duì) 的術(shù)語(yǔ)，表示受感染植物比另一同樣處理的更易感植物獲得更好的玉米產(chǎn)量。即，相對(duì)于易 感玉米植物，這種狀況在抗性玉米植物上造成玉米存活和/或產(chǎn)量降低減少。技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到玉米植物對(duì)MRCV的抗性可寬泛變化，可表示成更強(qiáng)抗性或更 小抗性表型的譜，并會(huì)依據(jù)感染嚴(yán)重度而變化。但是，通過(guò)簡(jiǎn)單觀察，技術(shù)人員可測(cè)定不同 植物、植物系或植物族對(duì)MRCV的相對(duì)抗性或易感性，而且也可認(rèn)識(shí)到“抗性”表型等級(jí)(如 以下實(shí)施例7所列的示例性評(píng)分體系)。如本領(lǐng)域所用的，“抗性”有時(shí)稱為“一般抗性”， “減級(jí)抗性”，或“部分抗性”。本發(fā)明上下文中的術(shù)語(yǔ)“雜交的”或“雜交”表示配子經(jīng)授粉融合，產(chǎn)生子代(例 如細(xì)胞、種子或植物)。該術(shù)語(yǔ)包括有性雜交(一株植物與另一株的授粉)和自交(自花授 粉，例如花粉和胚珠來(lái)自同一植物)。術(shù)語(yǔ)“基因滲入”是指所需的基因位點(diǎn)的等位基因從一個(gè)遺傳背景傳遞到另一遺 傳背景。例如，在指定位點(diǎn)的所需的等位基因的基因滲入可以是經(jīng)同一物種的兩個(gè)親代之 間的有性雜交傳遞給至少一個(gè)子代，其中至少一個(gè)親代在其基因組具有所需的等位基因。 可選地，例如等位基因的傳遞可通過(guò)例如在融合原生質(zhì)體中的兩個(gè)供體基因組之間的重組 而發(fā)生，其中至少一個(gè)供體原生質(zhì)體在其基因組中具有所需的等位基因。所需的等位基因 可以是例如所選標(biāo)記的等位基因，QTL，轉(zhuǎn)基因，等等。在任何情況中，含有所需的等位基因 的子代可與具有所需的遺傳背景的系重復(fù)回交，并選擇所需的等位基因，以使等位基因固 定在所選的遺傳背景中?！跋怠被颉捌废怠笔峭ǔ＝恢烈欢ǔ潭群屯ǔＴ诖蟛糠治稽c(diǎn)上純合和均質(zhì)的相同 來(lái)源的一組個(gè)體(等基因或接近等基因)?！皝喯?subline)”是指后代的近交子集，該后代 在基因上區(qū)別于從相同祖先遺傳下來(lái)的其他類似近交亞系。
“祖先系”是作為基因來(lái)源的親代系，例如用于發(fā)展原種系(eliteline)?！白嫦确N 群”是有助于大部分用于發(fā)展原種系的遺傳變異的一組祖先?！昂蟠?descendant) ”是祖先 的子代，且通過(guò)育種多個(gè)世代可從它們的祖先分離。例如，原種系是它們祖先的后代?！跋?譜結(jié)構(gòu)(pedigree structure) ”定義了后代和產(chǎn)生該后代的每個(gè)祖先之間的關(guān)系。系譜結(jié) 構(gòu)可跨越一個(gè)或多個(gè)世代，描述后代和其親代、祖親代、曾祖親代等之間的關(guān)系?！霸N系(elite line) ”或“原種品系(elite strain) ”是經(jīng)多輪育種和對(duì)優(yōu)良農(nóng) 藝性能選擇而獲得的農(nóng)藝優(yōu)良系。多個(gè)原種系是玉米育種領(lǐng)域技術(shù)人員已知并可獲得的。 “原種種群”是原種個(gè)體或系的分配，可用來(lái)表示在給定作物物種例如玉米的農(nóng)藝優(yōu)良基因 型方面的現(xiàn)有技術(shù)。同樣地，“原種種質(zhì)”或種質(zhì)的原種品系是通常來(lái)源于和/或能夠產(chǎn)生 具有優(yōu)良農(nóng)藝性能的植物的農(nóng)藝優(yōu)良種質(zhì)，例如現(xiàn)存或新開(kāi)發(fā)的玉米原種系。相反，“外來(lái)玉米品系”或“外來(lái)玉米種質(zhì)”是來(lái)源于不屬于可用的原種玉米系或種 質(zhì)品系的玉米的品系或種質(zhì)。在兩株玉米植物或種質(zhì)品系之間雜交的環(huán)境中，外來(lái)種質(zhì)和 與其雜交的原種種質(zhì)的子代并非密切相關(guān)。大多數(shù)情況，外來(lái)種質(zhì)不是來(lái)源于任何已知的 玉米原種系，而是經(jīng)選擇，向育種程序中引入新的基因元件(通常是新的等位基因)。在本文核酸擴(kuò)增環(huán)境中的術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”，是所選核酸(或其轉(zhuǎn)錄形式)產(chǎn)生另外 拷貝的任何過(guò)程。典型的擴(kuò)增方法包括各種基于聚合酶的復(fù)制方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)，連接酶介導(dǎo)的方法例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)和基于RNA聚合酶的擴(kuò)增(例如通過(guò) 轉(zhuǎn)錄)方法。“擴(kuò)增子”是擴(kuò)增的核酸，例如通過(guò)任何可用的擴(kuò)增方法(例如PCR、LCR、轉(zhuǎn)錄 等)，通過(guò)擴(kuò)增模板核酸而產(chǎn)生的核酸?！盎蚪M核酸”是在序列上對(duì)應(yīng)細(xì)胞中可遺傳的核酸的核酸。常見(jiàn)實(shí)例包括核基因 組DNA和其擴(kuò)增子。在一些情況中，基因組核酸不同于剪接的RNA，或相應(yīng)的cDNA，因?yàn)榧?接的RNA或cDNA通過(guò)例如剪接機(jī)制得以加工，去除內(nèi)含子?；蚪M核酸任選地包括非轉(zhuǎn)錄 (例如，染色體結(jié)構(gòu)序列、啟動(dòng)子區(qū)域或增強(qiáng)子區(qū)域)和/或非翻譯序列(例如內(nèi)含子)，而 剪接的RNA/cDNA通常不具有非轉(zhuǎn)錄序列或內(nèi)含子?！澳０搴怂帷笔窃跀U(kuò)增反應(yīng)中作為模板 的核酸(例如，基于聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)例如PCR、連接酶介導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)例如LCR，轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 等)。模板核酸可以是基因組來(lái)源的，或可選地來(lái)源于表達(dá)的序列，例如cDNA或EST?！巴庠春怂帷笔窃谛蛄?、基因組位置或兩者上非原產(chǎn)于指定的體系(例如種質(zhì)、植物 或品種)的核酸。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“外源”或“異源”當(dāng)應(yīng)用于多核苷酸或多肽時(shí)，通常 表示人為提供給生物體系(例如植物細(xì)胞、植物基因、所研究的具體植物物種或品種或植 物染色體)而非原產(chǎn)于指定的生物體系的分子。該術(shù)語(yǔ)可表示源自于除了天然存在來(lái)源外 的來(lái)源的相關(guān)材料，或可表示具有部分非天然結(jié)構(gòu)、基因位置或排列的分子。相反的，例如“天然”或“內(nèi)源”基因是不含有由除了染色體或正常天然存在的其 他基因元件之外的來(lái)源所編碼的核酸元件的基因。內(nèi)源基因、轉(zhuǎn)錄物或多肽是由其天然染 色體位點(diǎn)編碼的，而不是人為提供給細(xì)胞的。關(guān)于核酸或多肽的術(shù)語(yǔ)“重組體”表示，材料(例如重組核酸，基因，多核苷酸，或 多肽)經(jīng)人干涉而改變。通常，重組分子的部分排列不是天然結(jié)構(gòu)，或重組多核苷酸或多肽 的原始序列通過(guò)某些方式已受到操作。產(chǎn)生重組材料的改變，可在其天然環(huán)境或狀態(tài)下進(jìn) 行或從其天然環(huán)境或狀態(tài)中去除。例如，如果通過(guò)在原始細(xì)胞內(nèi)實(shí)施人為干涉的方式而改 變， 或由改變的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，可將天然存在的核酸變成重組核酸。如果基因序列遠(yuǎn)離其天然環(huán)境而被克隆至任何人工核酸載體上，則該核酸序列可讀框是重組的。產(chǎn)生重組分子特 別是重組核酸的方案和試劑在本領(lǐng)域常見(jiàn)且常規(guī)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，可形成人工染色 體并通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法(例如直接轉(zhuǎn)移法，例如PEG-誘導(dǎo)DNA攝取、原生質(zhì)體融 合、微注射、電穿孔和微粒轟擊)將其插入到玉米植物中。人工染色體是可穩(wěn)定復(fù)制并隨內(nèi) 源染色體分離的一段DNA。其具有調(diào)節(jié)和表達(dá)插入其中的異源基因的能力。異源DNA整合 至兆復(fù)制區(qū)(megar印licator region，著絲點(diǎn)的主要復(fù)制起始位點(diǎn))或與其緊密接近，啟 動(dòng)了兆堿基大小的染色體片段的大規(guī)模擴(kuò)增，這導(dǎo)致染色體重新形式。參見(jiàn)例如美國(guó)專利 6，077，697號(hào)，其被全文引入作為參考。術(shù)語(yǔ)重組體也表示包含重組材料的生物體，例如包含重組核酸的植物被認(rèn)為是重組植物。在一些實(shí)施方案中，重組生物體是轉(zhuǎn)基因生物體。術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入”在涉及異源或外源核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞時(shí)，表示采用任何方法使核酸并入 細(xì)胞中。該術(shù)語(yǔ)包括核酸導(dǎo)入方法，例如“轉(zhuǎn)染”，“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“載體”用于表示將核酸片段轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的多核苷酸或其他分 子。術(shù)語(yǔ)“媒介”有時(shí)與“載體”交替使用。載體任選地包含介導(dǎo)載體維持并激活其預(yù)期用 途(例如復(fù)制必需的序列、賦予藥物或抗生素抗性的基因、多克隆位點(diǎn)，或能使克隆的基因 表達(dá)的可操作連接的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件)的部分。載體通常來(lái)源于質(zhì)粒、噬菌粒或植物 或動(dòng)物病毒。“克隆載體”或“穿梭載體”或“亞克隆載體”含有促使亞克隆步驟的可操作連 接部分(例如含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn))。本文所用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指含有促進(jìn)具體宿主生物體內(nèi)編碼序列表達(dá)的可 操作連接的多核苷酸序列的載體(例如細(xì)菌表達(dá)載體或植物表達(dá)載體)。促進(jìn)原核生物中 表達(dá)的多核苷酸序列通常包括，例如啟動(dòng)子、操作子(任選地)，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，其常與 其他序列連在一起。真核細(xì)胞可使用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止和多腺苷酸化信號(hào)，以及通常不 同于原核細(xì)胞所用的其他序列。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因植物”是指在其細(xì)胞內(nèi)含有異源多核苷酸的植物。通常，該異源多核 苷酸在基因組內(nèi)被穩(wěn)定地整合，以使該多核苷酸傳遞至連續(xù)世代。異源多核苷酸可單獨(dú)或 作為重組表達(dá)盒的一部分被整合至基因組。本文使用“轉(zhuǎn)基因”表示因異源核酸的存在而 基因型發(fā)生改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些初始即被 改變的轉(zhuǎn)基因生物體或細(xì)胞，以及那些由初始轉(zhuǎn)基因生物體或細(xì)胞的雜交或無(wú)性繁殖而產(chǎn) 生的。本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”不包括由常規(guī)植物育種方法(例如雜交)或由天然發(fā)生 的事件例如隨機(jī)異體受精、非重組體病毒感染、非重組體細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組體轉(zhuǎn)座或自發(fā)突 變引起的基因組(染色體的或染色體外的)改變。“定位克隆”是通過(guò)與標(biāo)記核酸的基因組接近度鑒定并分離靶核酸的克隆程序。例 如，基因組核酸克隆可包括彼此接近的部分或全部?jī)蓚€(gè)或更多染色體區(qū)域。如果標(biāo)記可用 于從基因組文庫(kù)中鑒定基因組核酸克隆，則可使用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如亞克隆或測(cè)序，鑒定和/ 或分離位于標(biāo)記附近的克隆的子序列。當(dāng)使用給定的核酸序列進(jìn)行構(gòu)建時(shí)，或當(dāng)使用給定核酸構(gòu)建指定的核酸時(shí)，即指 定的核酸“來(lái)源于”給定的核酸。例如，cDNA或EST來(lái)源于表達(dá)的mRNA。術(shù)語(yǔ)“基因元件”或“基因”是指具有功能意義的可遺傳的DNA序列，即基因組序 列。術(shù)語(yǔ)“基因”也可用于表示例如由基因組序列編碼的cDNA和/或mRNA，以及該基因組序列。術(shù)語(yǔ)“基因型”是個(gè)體(或個(gè)體集合)在一個(gè)或多個(gè)基因位點(diǎn)的基因組成，與可觀 察到的性狀(表型)相對(duì)?；蛐捅欢x為由親代遺傳至個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)已知位點(diǎn)的等 位基因。術(shù)語(yǔ)基因型可用于表示在單個(gè)位點(diǎn)、多個(gè)位點(diǎn)的個(gè)體基因組成，更普遍的是，術(shù)語(yǔ) 基因型可用于表示在基因組上所有基因的個(gè)體基因構(gòu)成?！皢卧汀笔窃诙鄠€(gè)基因位點(diǎn)上 的個(gè)體基因型。通常，由單元型描述的基因位點(diǎn)是物理和基因連接的，即在同一染色體片段 上。術(shù)語(yǔ)“表型”或“表型性狀”或“性狀”，指生物體的一個(gè)或多個(gè)性狀。表型是可通 過(guò)肉眼或通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何其他評(píng)估方法，例如顯微鏡法、生物化學(xué)分析、基因組分析 或具體抗病性的分析所可觀察到的。在一些情況中，表型受單個(gè)基因或基因位點(diǎn)的直接控 制，即“單基因性狀”。在其他情況中，表型是幾個(gè)基因作用的結(jié)果。
“分子表型”是在一群(一個(gè)或多個(gè))分子水平上可檢測(cè)的表型。這種分子可以是 核酸，例如基因組DNA或RNA，蛋白，或代謝物。例如，分子表型可以是例如在植物發(fā)育的特 定階段、應(yīng)對(duì)環(huán)境狀況或應(yīng)激等的一個(gè)或多個(gè)基因產(chǎn)物的表達(dá)譜。通常在RNA或蛋白水平 上評(píng)估表達(dá)譜，例如在核酸陣列或“芯片”上或使用抗體或其他結(jié)合蛋白。術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量”是指單位面積的具有商業(yè)價(jià)值的具體植物產(chǎn)物的生產(chǎn)率。例如，通常 以每英畝的蒲式耳種子或每個(gè)季節(jié)每公頃的公噸種子來(lái)度量玉米產(chǎn)量。產(chǎn)量受到基因和環(huán) 境因素兩方面的影響。“農(nóng)藝”，“農(nóng)藝性狀”，和“農(nóng)藝性能”指在生長(zhǎng)季節(jié)過(guò)程中有助于給 定植物品種產(chǎn)量的性狀(和潛在基因元件)。個(gè)體農(nóng)藝性狀包括顯現(xiàn)勢(shì)、營(yíng)養(yǎng)勢(shì)、脅迫耐受、 抗病性或耐病性、除草劑抗性、分枝、開(kāi)花、種組(seed set)、種子大小、種子密度、直立性、 脫粒性等。因此產(chǎn)量是所有農(nóng)藝性狀的最終頂點(diǎn)。一“組”標(biāo)記或探針是指用于普通目的例如鑒定具有所需性狀(例如對(duì)MRCV的抗 性)玉米植物的標(biāo)記或探針的集合或群，或由此衍生的數(shù)據(jù)。對(duì)應(yīng)標(biāo)記或探針的數(shù)據(jù)，或源 自它們應(yīng)用的數(shù)據(jù)，經(jīng)常被存儲(chǔ)在電子介質(zhì)中。當(dāng)組內(nèi)每個(gè)成員具有對(duì)應(yīng)指定目的的用途 時(shí)，選自組中以及包括部分但非全部標(biāo)記的亞組中的單個(gè)標(biāo)記，也可有效地實(shí)現(xiàn)特定目的?！安樵儽怼笔菍⒁环N數(shù)據(jù)形式與另一種，或一種或多種數(shù)據(jù)形式與數(shù)據(jù)相關(guān)的預(yù)期 結(jié)果關(guān)聯(lián)的表格。例如，查詢表可包括等位基因數(shù)據(jù)和包含給定等位基因的植物可能顯現(xiàn) 的預(yù)期性狀之間的關(guān)聯(lián)。這些表可以是，且通常是多維的，例如在進(jìn)行性狀預(yù)測(cè)時(shí)同時(shí)考慮 多個(gè)等位基因，和任選地考慮其他因素，例如遺傳背景?！坝?jì)算機(jī)可讀介質(zhì)”是使用可用或用戶界面由計(jì)算機(jī)訪問(wèn)的信息存儲(chǔ)介質(zhì)。實(shí)例包 括存儲(chǔ)器(例如ROM、RAM或閃存)、光學(xué)存儲(chǔ)介質(zhì)(例如CD-ROM)、磁存儲(chǔ)介質(zhì)(計(jì)算機(jī)硬 盤，軟盤等)、穿孔卡片，和許多其他商業(yè)可供介質(zhì)。信息可在感興趣的系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)之間傳 遞，或?yàn)榇鎯?chǔ)或訪問(wèn)存儲(chǔ)信息而傳遞至計(jì)算機(jī)和計(jì)算可讀取介質(zhì)中或從其中傳送出來(lái)。這 種傳遞可以是電傳遞，或可由其他可用方法進(jìn)行，例如IR連接，無(wú)線連接等。“系統(tǒng)指令”是可部分或全部由系統(tǒng)執(zhí)行的指令組。通常地，該指令組作為系統(tǒng)軟 件而存在。附圖和序列的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖IA顯示了阿根廷組的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)分析。注意65. 99-85. 84的顯著區(qū)間(ρ值小 于0. 00005)。X軸以cM表示距Chr2末端的距離。Y軸概率值。圖IB顯示了 SS組的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)分析。注意在位置54. 62的MRCV1，MZA1525和在位置65. 99的MZAl 1826的主要顯 著標(biāo)記。X軸以cM表示距染色體2末端的距離。Y軸概率值。圖IC顯示了另一 SS組 的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)分析。注意在染色體2短臂上的最相關(guān)標(biāo)記是在位置53. 83的MZA12899 (ρ = 0. 000298)。X軸以cM表示距染色體2末端的距離。Y軸概率值。
圖2顯示了 PH3DTxPH7WT雜交的區(qū)間作圖。染色體2，L0D得分峰值位置65. 89， 46%的表型變異。圖3A顯示了表現(xiàn)出MRCV癥狀的玉米照片。圖3B顯示了具有MRCV易感性的玉米 照片。圖4A顯示了來(lái)自雜交PH3DTxPH7WT的高分辨率作圖BC5F3種群的一組重組體在 QTL區(qū)域的基因型和平均表型(MRCVSC)圖。顯示了進(jìn)入易感背景的抗性親代片段和重組區(qū) 域。該區(qū)域包括位于MZA1525-98-A和MZA10094-9-A之間的重組體。圖4B顯示了來(lái)自雜 交PH3DTxPH7WT的高分辨率作圖BC5F3種群的一組重組體在QTL區(qū)域的基因型和平均表型 (MRCVSC)圖。顯示了進(jìn)入易感背景的抗性親代片段和重組區(qū)域。該區(qū)域包括位于MZA15490 和MZA18224之間的重組體。它也包括在區(qū)間MZA11826至MZA9105基因表征的三個(gè)重組 體。表型以圖右面的圓圈表示(黑圈易感；白圈抗性；對(duì)角線圈抗性和易感的混合；灰 圈未知)。圖5顯示了 PH3DTxPH7WT雜交的區(qū)間作圖。染色體2，LOD得分峰值位置 65. 99 (MZA2038)。MZAl 1826和MZA9105不包括在分析中，因?yàn)樵谠摼唧w種群中不存在有關(guān) MZA2038的重組體。注意調(diào)整遺傳圖譜以實(shí)現(xiàn)在位置65. 99的區(qū)間作圖；標(biāo)記MZA16656、 MZA15490和MZA2038在0. 5cM之下的距離是高度連鎖的，但在這個(gè)具體分析中它們被人為 定位成0. 5cM的距離。圖6顯示了 PH9TJxPH890雜交在Chr2和Chr5的具體QTL區(qū)域的區(qū)間作圖分析。 染色體2、LOD得分峰值位置65. 99-68. 8。在優(yōu)選標(biāo)記和位置68. 8標(biāo)記之間不存在重組 體；因而，僅包括MZA9105，作為該分析的代表性優(yōu)選標(biāo)記。圖7顯示了受MRCV嚴(yán)重影響的植物圖片；它對(duì)應(yīng)于在含有來(lái)自雜交PH3DTxPH7WT 的易感單元型的優(yōu)選標(biāo)記上的等基因系(isoline)。圖7B顯示了并排種植在阿根廷Rio Cuarto易感地區(qū)的兩排，其中左邊的一排對(duì)應(yīng)于含有易感單元型的等基因系，而右邊的一 排對(duì)應(yīng)于在優(yōu)選的標(biāo)記上含有抗性等位基因的等基因系。這些等基因系來(lái)源于在來(lái)自雜交 PH3DTxPH7WT的優(yōu)選標(biāo)記上是雜合的單個(gè)BC5F2植物。圖8顯示了在標(biāo)記MZA15490和MZA2038之間的染色體2QTL區(qū)域。圖9顯示了在MZAl5490-MZA2038區(qū)間上的區(qū)域圖，其中標(biāo)明了在一組代表性易感 和抗性近交后代(inbreds)中具體測(cè)序片段的位置。

圖10顯示了在MZA15490-MZA2038區(qū)間上重組體的示意圖。重組點(diǎn)位于PC0644442 內(nèi)部，從自抗性(PH7WT)和易感(PH3DT)親代產(chǎn)生quimeric基因。在序列區(qū)域標(biāo)明了 SNPs 和插入缺失的位置。圖11顯示了感染MRDV的在優(yōu)選的標(biāo)記區(qū)域基因型類別間的玉米雜種的性能 (MRDV得分)。在X坐標(biāo)(基因型類別)上才“_2”、“0”和“2”分別代表易感單元型、雜合 單元型和純合抗性單元型的基因型類別。圖12是關(guān)于PH7WTxPH3DT作圖種群在三個(gè)作物季中的平均表型分的區(qū)間圖譜。應(yīng)該注意的是LOD得分峰值靠近umcl756。圖13是關(guān)于PH7WTxPH3DT作圖種群在三個(gè)作物季中的平均表型得分的復(fù)合區(qū)間 圖譜。應(yīng)該注意的是LOD得分峰值靠近umc1756-umcl518區(qū)間。圖14是PH9TJxPH890作圖種群的復(fù)合作譜。MRCV1QTL的LOD得分峰值位于 位置 65. 99-68. 8。圖 15是在SEQ ID NO 丨11 (來(lái)自 ΡΗ7ΤΓ 的pco644442啟動(dòng)子)和SEQID N0:212(來(lái) 自PH3DT的pco644442啟動(dòng)子)之間的ClustalW序列比對(duì)。圖 16 是 SEQ ID NOs :213_236 之間的 ClustalW 序列比對(duì)。以下序列描述概括了所附的序列表。序列表含有核苷酸序列的單字母密碼和 在 Nucleic Acids Research 13:3021—3030(1985)禾口 BiochemicalJournal 219(2) 345-373(1984)中描述的IUPAC-IUB標(biāo)準(zhǔn)所定義的單和三字母密碼。SEQ ID NOs :1-5、8-11、14、15、18、21、25、29、30、32、34_37、39 以及 42-48 是表6 中 MZA標(biāo)記的共有序列。SEQ ID NOs :6、7、12、13、16、17、19、20、22-24、26-28、31、33、38、40 以及 41 是表 7
中SNP標(biāo)記的SNP共有序列。SEQ ID NOs :49_56是表3中公共標(biāo)記的左和右引物序列。SEQ ID NOs :57_172是表6中MZA標(biāo)記的正向外部、正向內(nèi)部、反向內(nèi)部以及反向 外部引物。SEQ ID NOs :173_210是表7中SNP標(biāo)記的正向和反向引物。SEQ ID NO 211是玉米近交系PH7WT的PC0644442啟動(dòng)子區(qū)域。SEQ ID NO 212是玉米近交系PH3DT的PC0644442啟動(dòng)子區(qū)域。SEQ ID NO 213是玉米近交系PH3DT的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO :214 是玉米近交系 AP19506160 的包括 MRQV8381 和 MRQV10673 的序列 區(qū)域。SEQ ID NO 215 是玉米近交系 AP19506157 的包括 MRQV8381 和 MRQV10673 的序列區(qū)域。SEQ ID NO 216 是玉米近交系 AP19506156 的包括 MRQV8381 和 MRQV10673 的序列區(qū)域。SEQ ID NO 217是玉米近交系PH7WT的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 218是玉米近交系630的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 219是玉米近交系PHG63的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 220是玉米近交系PHK09的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 221是玉米近交系PHR33的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 222是玉米近交系501的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 223是玉米近交系157的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 224是玉米近交系PHK56的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 225是玉米近交系661的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 226是玉米近交系PHR03的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 227是玉米近交系1047的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。
SEQ ID NO 228是玉米近交系PHJ40的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 229是玉米近交系274的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 230是玉米近交系165的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 231是玉米近交系B73的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 232是玉米近交系PHN47的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 233是玉米近交系PH26N的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 234是玉米近交系PHDG9的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。SEQ ID NO 235是玉米近交系ST10H60的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū) 域。SEQ ID NO 236是玉米近交系PHKP5的包括MRQV8381和MRQV10673的序列區(qū)域。發(fā)明的詳細(xì)描述使用MAS鑒定和選擇表現(xiàn)出MRCV抗性的玉米植物，可提供克服該疾病所造成的損 失的有效且環(huán)境友好的方法。本發(fā)明提供了在統(tǒng)計(jì)上表現(xiàn)出與MRCV抗性顯著共分離的玉 米標(biāo)記位點(diǎn)。這些位點(diǎn)或其他連鎖位點(diǎn)的檢測(cè)，可用于標(biāo)記輔助的玉米育種程序，產(chǎn)生抗 性植物，或MRCV抗性或相關(guān)斐濟(jì)病毒抗性獲得改善的植物。本文鑒定的連鎖的SSR和SNP 標(biāo)記提供于表 1 和 2 中。這些標(biāo)記包括 MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、 MZAl 1826 以及 MZA9105。每個(gè)SSR型標(biāo)記都表現(xiàn)出可顯現(xiàn)成不同大小PCR擴(kuò)增子的多個(gè)等位基因。用于產(chǎn) 生SSR標(biāo)記擴(kuò)增子的PCR引物如表3所列。使用本領(lǐng)域已知的等位基因特異性雜交方案測(cè) 定SNP型標(biāo)記的等位 基因。用于擴(kuò)增SNP結(jié)構(gòu)域的PCR引物和用于對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型的 等位基因特異性探針如表6和7所列。表6，7列出了表現(xiàn)出與MRCV抗性基因型連鎖不平衡的SNP標(biāo)記。這些表格提供了用于產(chǎn)生含有SNP的擴(kuò)增子的PCP引物序列，和用于在等位基因特異性雜交試驗(yàn)(ASH試驗(yàn))中鑒定SNP等位基因的等位基因特異性探針。
如本領(lǐng)域所公認(rèn)的，與QTL標(biāo)記連鎖的任何其他標(biāo)記(例如抗病性標(biāo)記)也發(fā)現(xiàn) 可用于相同目的。提供了與本文所述的抗病性標(biāo)記連鎖的其他標(biāo)的記實(shí)例。例如由表8所 提供的緊密連鎖的標(biāo)記確定連鎖的標(biāo)記。表8 然而發(fā)現(xiàn)可用于本文的連鎖標(biāo)記并不限于表8所列的那些。本發(fā)明也提供了與MRCV抗性關(guān)聯(lián)的染色體QTL區(qū)間。這些區(qū)間位于連鎖群2。位 于這些區(qū)間內(nèi)的任何標(biāo)記可用作MRCV抗性的標(biāo)記。這些區(qū)間包括(i)MZA8381 禾口 MZA18180 ；(ii)MZA4305 和 MZA2803 ；(iii)MZA15490 和 MZA2038 ；(iv)bnlgl458b 和 umcl261a ；(v)bnlgl458b 禾口 umcl262a ；(vi)bnlgl327 和 umcl261a ；以及(viii)bnlgl327 和 umcl262a。鑒定攜帶抗性標(biāo)記位點(diǎn)的優(yōu)選的等位基因的玉米植物或種質(zhì)的方法是本發(fā)明一 方面。在這些方法中，根據(jù)標(biāo)記位點(diǎn)的類型，可使用任何多種標(biāo)記檢測(cè)方案鑒定標(biāo)記位點(diǎn)。 用于標(biāo)記檢測(cè)的典型方法包括通過(guò)例如PCR、LCR、基于擴(kuò)增方法的轉(zhuǎn)錄等擴(kuò)增并檢測(cè)所獲 的擴(kuò)增標(biāo)記。這些方法包括ASH、SSR檢測(cè)、RFLP分析以及多種其他方法。盡管具體標(biāo)記等位基因可表現(xiàn)出與抗病性或疾病易感性表型的共分離，但應(yīng)該重 點(diǎn)注意的是，標(biāo)記位點(diǎn)并非負(fù)責(zé)抗性或易感性的QTL位點(diǎn)的必需部分。例如，不要求標(biāo)記多 核苷酸序列是賦予抗病性的基因的一部分(例如，基因可讀框的一部分)。具體標(biāo)記等位 基因與抗性或易感性表型之間的關(guān)聯(lián)是由于，在產(chǎn)生抗性或易感性等位基因的祖先玉米系 中，標(biāo)記等位基因和QTL抗性或易感性等位基因之間的原始“偶聯(lián)”連鎖相造成的。最終，通 過(guò)重復(fù)重組，標(biāo)記和QTL位點(diǎn)之間的交換事件可改變這種方向。為此，根據(jù)存在于用于產(chǎn)生 分離種群的抗性親代內(nèi)的連鎖相，可改變偏好標(biāo)記等位基因。這不會(huì)改變遺傳標(biāo)記可用于 監(jiān)測(cè)表型分離的事實(shí)。它僅改變哪個(gè)標(biāo)記等位基因在給定的分離種群中被認(rèn)為是偏好的。鑒定包括標(biāo)記位點(diǎn)或與抗性性狀或性狀連鎖的標(biāo)記位點(diǎn)的玉米植物或種質(zhì)，為實(shí)施玉米的標(biāo)記輔助選擇提供了基礎(chǔ)。可選擇包含偏好標(biāo)記或偏好等位基因的玉米植物，而 可剔除包含與抗性負(fù)相關(guān)的標(biāo)記或等位基因的玉米植物。所需的標(biāo)記和/或等位基因可被 基因滲入至具有所需(例如原種或外來(lái))的遺傳背景的玉米，以產(chǎn)生基因滲入的抗性玉米 植物或種質(zhì)。在一些方面，構(gòu)想多個(gè)抗性標(biāo)記被依次或同時(shí)選擇和/或基因滲入。選擇用 于單個(gè)植物的抗性標(biāo)記組合是沒(méi)有限制的，可包括表1和2所述標(biāo)記的任何組合，與表1和 2所述標(biāo)記連鎖的任何標(biāo)記，或位于本文所定義的QTL區(qū)間內(nèi)的任何標(biāo)記。 作為將感興趣的性狀導(dǎo)入玉米的標(biāo)準(zhǔn)育種方法(例如基因滲入)的可選方案，也 可使用轉(zhuǎn)基因方法。在這些方法中，將編碼與標(biāo)記連鎖的性狀的外源核酸導(dǎo)入靶植物或種 質(zhì)。例如，通過(guò)例如定位克隆克隆編碼抗性性狀的核酸，并將其導(dǎo)入靶植物或種質(zhì)。通過(guò)可用的抗性方案進(jìn)行抗性驗(yàn)證(參見(jiàn)例如實(shí)施例10)?？剐栽囼?yàn)可用于在任 何具體植物或種群中驗(yàn)證抗性性狀與標(biāo)記的分離，從而測(cè)定通過(guò)將性狀基因滲入或重組導(dǎo) 入所需背景所實(shí)現(xiàn)的抗性改善程度。系統(tǒng)，包括用于選擇包含感興趣的標(biāo)記的植物和/或用于使標(biāo)記的存在與抗性關(guān) 聯(lián)的自動(dòng)系統(tǒng)，也是本發(fā)明的一方面。這種系統(tǒng)可包括與標(biāo)記位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)的探針、檢測(cè)探 針標(biāo)記的檢測(cè)器、適宜的流體處理元件和混合探針和模板和/或擴(kuò)增模板的溫度控制器， 以及使標(biāo)記檢測(cè)與具體標(biāo)記位點(diǎn)或等位基因的存在關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)指令。試劑盒也是本發(fā)明的一方面。例如，試劑盒可包括用于檢測(cè)抗性相關(guān)標(biāo)記位點(diǎn)的 適宜引物或探針和使用引物或探針檢測(cè)標(biāo)記位點(diǎn)并使該位點(diǎn)與預(yù)期MRCV抗性關(guān)聯(lián)的說(shuō) 明。該試劑盒還可包括用于包裝探針、弓丨物或說(shuō)明的包裝材料，控制器例如控制包括用于擴(kuò) 增的探針、引物或模板核酸的擴(kuò)增反應(yīng)，分子標(biāo)記等。抗件標(biāo)記和偏好等位基因在傳統(tǒng)的連鎖分析中，不需要直接認(rèn)識(shí)染色體上的基因的物理關(guān)系。孟德?tīng)柕谝?法則是成對(duì)特征的因子是分離，意味著二倍體性狀的等位基因分離至兩個(gè)配子中然后進(jìn)入 不同的子代。經(jīng)典的連鎖分析可被認(rèn)為是不同性狀共分離相對(duì)頻率的統(tǒng)計(jì)描述。連鎖分 析被很好地表征為在共同分離頻率基礎(chǔ)上性狀如何集合的描述性框架。即，如果兩個(gè)非等 位性狀以高于隨機(jī)頻率而共同遺傳，則它們被稱為“連鎖的”。性狀共同遺傳的頻率是性狀 連鎖緊密程度的主要測(cè)量手段，即以更高頻率共同遺傳的性狀比以更低頻率(但仍高于隨 機(jī))共同的性狀連鎖的更緊密。性狀之所以連鎖是因?yàn)樾誀钏蕾嚨幕虼嬖谟谕蝗旧?體上?；蛟谌旧w上相距越遠(yuǎn)，它們共同分離的可能性越小，因?yàn)樵跍p數(shù)分裂期間同源染 色體會(huì)重組。從而，基因在染色體上相距越遠(yuǎn)，減數(shù)分裂期間出現(xiàn)會(huì)造成兩個(gè)基因分別分離 至子代的交換事件的可能性越大。連鎖的常用測(cè)量手段是性狀共分離的頻率。這可表達(dá)成共分離的百分比(重組百 分比)或也通常表達(dá)成厘摩(cM)。CM以先驅(qū)遺傳學(xué)家托馬斯亨特摩根命名的，是遺傳重組 頻率的測(cè)量單位。一 cM等于在一個(gè)基因位點(diǎn)上的性狀與在另一基因位點(diǎn)上的性狀由于單 代交換而有的機(jī)會(huì)分離(意即性狀99%的時(shí)間都共同分離)。因?yàn)槿旧w距離與性狀 之間交換事件頻率近似成比例，存在與重組頻率相關(guān)的近似物理距離。例如，在玉米中，IcM 平均與大約2，140，000個(gè)堿基對(duì)(2. 14Mbp)相關(guān)。標(biāo)記位點(diǎn)是性狀本身，并可通過(guò)在分離期間追蹤標(biāo)記位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)連鎖分析進(jìn)行分 析。因此，在本發(fā)明上下文中，一 cM等于標(biāo)記位點(diǎn)與另一位點(diǎn)(其可以是任何其他性狀，例如另一標(biāo)記位點(diǎn)，或另一編碼QTL的性狀位點(diǎn))由于單代交換而有的機(jī)會(huì)分離。發(fā) 現(xiàn)本文的標(biāo)記如表1 和 2 所述的，例如 MZA625、MZA16656、MZA1545U MZA15490、MZA2038、 MZAl 1826和MZA9105，以及任何染色體區(qū)間，(i)MZA8381 禾口 MZA18180 ；(ii)MZA4305 和 MZA2803 ；(iii)MZA15490 和 MZA2038 ；(iv)bnlgl458b 和 umcl261a ；(v)bnlgl458b 和 umcl262a ；(vi)bnlgl327 和 umcl261a ；以及(viii)bnlgl327 和 umc 1262a ；與玉米中對(duì)MRCV的新賦予的抗性、抗性增強(qiáng)或易感性關(guān)聯(lián)。這意味著這些標(biāo)記相 當(dāng)接近抗性性狀，因而它們可用作抗性性狀的預(yù)測(cè)器。這對(duì)本文中詳細(xì)討論的標(biāo)記輔助選 擇(MAS)是非常有用的。簡(jiǎn)而言之，可針對(duì)與抗性正相關(guān)的標(biāo)記或標(biāo)記等位基因而選擇玉 米植物或種質(zhì)，而無(wú)需實(shí)際種植玉米和測(cè)量新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)(或相反，如果玉米 植物擁有與新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)負(fù)相關(guān)的標(biāo)記，則可剔除它們)。MAS是可選擇所需表 型和將所需性狀基因滲入至玉米培育種(例如將所需性狀基因滲入至原種系中)的有利捷 徑。MAS可便利地適用于高通量分子分析方法，并且比種植和觀察植物可見(jiàn)性狀更加經(jīng)濟(jì)， 所述高通量分子分析方法可以快速篩選大量感興趣標(biāo)記的植物或種質(zhì)遺傳物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，最優(yōu)選的QTL標(biāo)記是表1和2所列標(biāo)記的子集。例如，最優(yōu)選 的標(biāo)記是 MZA15490 和 MZA2038。當(dāng)涉及兩個(gè)基因元件例如有助于抗性的基因元件和接近標(biāo)記之間的關(guān)系時(shí)，“偶 聯(lián)”相連鎖表示，在抗性位點(diǎn)上的“偏好”等位基因在同一染色體鏈上作為各自連鎖的標(biāo)記 位點(diǎn)的“偏好”等位基因是物理相關(guān)的狀態(tài)。在偶聯(lián)相中，兩個(gè)偏好等位基因是通過(guò)繼承那 條染色體鏈的子代共同遺傳的。在“排斥”相連鎖中，感興趣位點(diǎn)(例如抗性的QTL)上的 “偏好”等位基因與在接近標(biāo)記位點(diǎn)上的“非偏好”等位基因是物理連鎖的，而兩個(gè)“偏好” 等位基因不共同遺傳(即兩個(gè)位點(diǎn)是彼此“不同相”)。標(biāo)記的偏好等位基因是與所需的表型(例如抗病性)共分離的標(biāo)記等位基因。如 本文所用的，QTL標(biāo)記具有一個(gè)偏好等位基因的最少值，盡管該標(biāo)記可能具有在種群中發(fā)現(xiàn) 的兩個(gè)或多個(gè)偏好等位基因。該標(biāo)記的任何偏好等位基因可優(yōu)選用于鑒定和構(gòu)建抗性玉米 系。任選地，在植物中鑒定不同標(biāo)記的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多偏好等位基因或?qū)⑺鼈兓?滲入至植物，并在MAS期間進(jìn)行選擇或剔除。理想地，鑒定具有至少一個(gè)這種與新賦予的抗 性或抗性增強(qiáng)正相關(guān)的偏好等位基因的植物或種質(zhì)?？蛇x地，與疾病易感性共分離的標(biāo)記等位基因可用于本發(fā)明中，因?yàn)樵摰任换?可用于鑒定和反選擇疾病易感植物。這種等位基因可用于育種期間的排除目的，以鑒定與 抗性負(fù)相關(guān)的等位基因，以在后輪育種中排除易感植物或種質(zhì)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可在單個(gè)植物或植物種群中同時(shí)選擇多個(gè)標(biāo)記等位 基因。在這些方法中，選擇含有來(lái)自多個(gè)抗性標(biāo)記的偏好等位基因的植物，或可選地將來(lái)自 多個(gè)抗性標(biāo)記的偏好等位基因基因滲入至所需的玉米種質(zhì)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí) 到，從同一植物的多個(gè)抗病性標(biāo)記中同時(shí)選擇偏好等位基因，可能引發(fā)植物的加成(或甚至協(xié)同)保護(hù)作用。技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到，偏好等位基因的鑒定是種質(zhì)特異性的。確定哪個(gè)標(biāo)記等位基 因與抗性(或易感性)關(guān)聯(lián)，是針對(duì)研究的具體種質(zhì)而確定的。技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到，鑒定偏 好等位基因的方法是常規(guī)的且本領(lǐng)域公知的，而且，這種偏好等位基因鑒定和使用全部處 于本發(fā)明范圍內(nèi)。另外，在本文所用或所述的種群之外的玉米種群中鑒定偏好標(biāo)記等位基 因全部處于本發(fā)明范圍內(nèi)。用于擴(kuò)增SSR型標(biāo)記位點(diǎn)的擴(kuò)增引物是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的另一部分是特 異性擴(kuò)增SNP結(jié)構(gòu)域(SNP標(biāo)記)的引物，和用于對(duì)SNP序列進(jìn)行基因分型的探針。表6和 7提供了用于標(biāo)記位點(diǎn)擴(kuò)增的特異性引物和用于檢測(cè)擴(kuò)增標(biāo)記位點(diǎn)的探針。但是，技術(shù)人員 應(yīng)當(dāng)立即認(rèn)識(shí)到，給定引物任一側(cè)的其他序列可用于替代給定的引物，只要引物可擴(kuò)增包 括待檢測(cè)的等位基因的區(qū)域。而且，應(yīng)該理解的是，用于檢測(cè)的精確探針可以變化，例如可 鑒定待檢測(cè)的標(biāo)記擴(kuò)增子的區(qū)域的任何探針可被本文提供的那些實(shí)例所替換。此外，擴(kuò)增 引物和檢測(cè)探針的結(jié)構(gòu)當(dāng)然可以變化。因而，本發(fā)明不限于本文具體敘述的引物和探針。在一些方面，本發(fā)明方法利用擴(kuò)增步驟檢測(cè)標(biāo)記位點(diǎn)/對(duì)標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行基因分 型。但是，應(yīng)該理解的是，擴(kuò)增不是標(biāo)記檢測(cè)必需的一例如，僅通過(guò)在基因組DNA樣品中 進(jìn)行DAN印跡法即可直接檢測(cè)未擴(kuò)增的基因組DNA。進(jìn)行DNA印跡法的程序、擴(kuò)增(PCR、 LCR等)和許多其他核酸檢測(cè)方法，是建立已久的并在例如Sambrook et al.，Molecular Cloning-ALaboratory Manual (分子克降實(shí)騎室手冊(cè))(3ri Ed.)，Vol. 1-3, Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,2000 ( “Sambrook，，)；Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))，F(xiàn). Μ. Ausubel et al.， eds. , Current Protocols, a joint venture between GreenePublishing Associates, Inc. and John ffiley&Sons, Inc.，(2002 年補(bǔ)增)(“Ausubel”)和 PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis etal. eds)Academic Press Inc. San Diego, CA(1990) ( "Innis")中有教導(dǎo)。有關(guān)植物中核酸檢測(cè)的其他細(xì)節(jié)也可見(jiàn)于，例如Plant Molecular Biology (植物分子生物學(xué))(1993)Croy (ed.)BIOS Scientific Publishers, Inc. ( “Croy”)。在擴(kuò)增/檢測(cè)方法中也可省略單獨(dú)的檢測(cè)探針，例如通過(guò)實(shí)施檢測(cè)由修飾相關(guān)擴(kuò) 增引物并入產(chǎn)物，標(biāo)記的核苷酸并入擴(kuò)增子所形成的產(chǎn)物的實(shí)時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)，或通過(guò)監(jiān)測(cè)擴(kuò) 增子與未擴(kuò)增的前體相比的分子旋轉(zhuǎn)特性的變化(例如通過(guò)熒光偏振)。通常，可通過(guò)本領(lǐng)域已建立的任何可用方法檢測(cè)分子標(biāo)記，包括但不限于等位 基因特異性雜交(ASH)或檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的其他方法，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (AFLP)檢測(cè)，擴(kuò)增可變序列檢測(cè)，隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性性(RAPD)檢測(cè)，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài) 性(RFLP)檢測(cè)，自主序列復(fù)制檢測(cè)，簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)檢測(cè)，單鏈構(gòu)型多態(tài)性(SSCP)檢 測(cè)，同工酶標(biāo)記檢測(cè)等。盡管本文圖表中所列的示例性標(biāo)記是SSR或SNP(ASH)標(biāo)記，但任 何前述標(biāo)記類型都可用于本發(fā)明中，以鑒定包含有助于優(yōu)良農(nóng)藝性能(例如新賦予的抗性 或抗性)增強(qiáng)的基因元件的染色體片段。QTL染餼體區(qū)間在一些方面，本發(fā)明提供了 QTL染色體區(qū)間，其中與MRCV抗性分離的QTL (或多個(gè) QTL)包含在這些區(qū)間中。本領(lǐng)域公知的多種方法都可用于鑒定染色體區(qū)間(如實(shí)施例1和2所詳細(xì)描述的)。這些染色體區(qū)間的邊界被拉拽至包含與一個(gè)或多個(gè)QTL連鎖的標(biāo)記。換 而言之，染色體區(qū)間被拉拽以使位于該區(qū)間(包括定義區(qū)間邊界的終止標(biāo)記)內(nèi)的任何標(biāo) 記都可用作抗病性的標(biāo)記。每個(gè)區(qū)間包含至少一個(gè)QTL，而且，實(shí)際上可包含多于一個(gè)QTL。 在同一區(qū)間上緊密接近的多個(gè)QTL可模糊具體標(biāo)記與具體QTL的關(guān)聯(lián)，因?yàn)橐粋€(gè)標(biāo)記可表 現(xiàn)出與多于一個(gè)QTL的連鎖。相反，例如，若緊密接近的兩個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)出與所需的表型性狀 的共分離，則每個(gè)標(biāo)記是否鑒定相同QTL或兩個(gè)不同的QTL有時(shí)會(huì)不清楚。不管怎樣，操作 或?qū)嵺`本發(fā)明不需要知道在具體區(qū)間中有多少Q(mào)TL。本發(fā)明提供了玉米染色體區(qū)間，其中在該區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記表現(xiàn)出與MRCV抗性共分 離。因此，每個(gè)區(qū)間包含至少一個(gè)如表9所示的MRCV抗性QTL。表9 上述的每個(gè)區(qū)間表現(xiàn)為與MRCV抗性共分離的成簇標(biāo)記。這種成簇標(biāo)記的出現(xiàn)于 連鎖群上的小結(jié)構(gòu)域中，表明在這些染色體區(qū)域上存在一個(gè)或多個(gè)QTL。QTL區(qū)間被拉拽至 包含與抗性共分離的標(biāo)記。由在其末端的標(biāo)記定義區(qū)間，其中區(qū)間包括繪制在區(qū)間內(nèi)的所 有標(biāo)記以及定義末端的標(biāo)記。在一些情況中，區(qū)間可被拉拽為區(qū)間由與優(yōu)選標(biāo)記的連鎖所定義。例如，染色體2 上的區(qū)間被定義成與標(biāo)記MZA16656連鎖的任何標(biāo)記都是該區(qū)間的成員。例如，如本文所用 的，連鎖被定義成距MZA16656在25cM之內(nèi)的任何標(biāo)記。與MZA16656 (例如MZA16656的 5cM之內(nèi))連鎖的標(biāo)記可通過(guò)任何適宜的遺傳連鎖圖譜(例如在Maize⑶B網(wǎng)站上查到的 IBM22005Neighbors Frame 2圖譜)測(cè)定。這些標(biāo)記按基因順序顯示。所列的每個(gè)標(biāo)記，包 括末端標(biāo)記pco061820a和sog5758o，都是區(qū)間的成員。pco061820a和sog5758o標(biāo)記是本 領(lǐng)域已知的。如上所述的，區(qū)間(例如染色體區(qū)間或QTL區(qū)間)不需要依賴區(qū)間大小的絕對(duì)測(cè) 量值例如厘摩值。區(qū)間可通過(guò)定義區(qū)間端點(diǎn)的末端標(biāo)記所描述，且通常區(qū)間可包括定義區(qū) 間長(zhǎng)度的末端標(biāo)記。區(qū) 間 可包括位于染色體域內(nèi)的任何標(biāo)記，而無(wú)論這些標(biāo)記是目前已知 或未知的。本發(fā)明提供了定義例如表8連鎖標(biāo)記列表和本文參考文獻(xiàn)中的染色體區(qū)間的多種方式。遺傳圖譜如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)為的，任何具體種群內(nèi)的重組頻率(以及作為結(jié)果的遺傳 圖譜位置)不是固定的。分離兩個(gè)標(biāo)記(或一個(gè)標(biāo)記和一個(gè)QTL)的遺傳距離，可根據(jù)如何 測(cè)定圖譜位置而變化。例如，變量例如所用的親代作圖種群，標(biāo)記作圖或QTL作圖所用的軟 件，和作圖軟件用戶所輸入的參數(shù)，都對(duì)QTL/標(biāo)記遺傳圖譜關(guān)系有貢獻(xiàn)。但是，本發(fā)明并不 限于任何具體的作圖種群，使用任何具體的軟件，或任何具體軟件參數(shù)組，以便確定具體標(biāo) 記或染色體區(qū)間與MRCV抗性表型的連鎖。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全有能力將本文所述的 新特征外推至任何感興趣的玉米基因池或種群，和使用任何具體軟件和軟件參數(shù)。實(shí)際上， 使用本發(fā)明的教導(dǎo)可容易地做出除本文所述之外的有關(guān)種群中抗性標(biāo)記和染色體區(qū)間的 觀察。作圖軟件多種商業(yè)軟件可用于遺傳作圖和標(biāo)記關(guān)聯(lián)研究(例如QTL作圖)。這些軟件包括 但不限于表10所列的那些。表 10 統(tǒng)一遺傳圖譜 已產(chǎn)生“統(tǒng)一”，“共有”或“整合”遺傳圖譜，其可合并來(lái)自一個(gè)或多個(gè)來(lái)源的作圖 數(shù)據(jù)而形成，包括使用不同作圖種群和不同統(tǒng)計(jì)分析的來(lái)源。遺傳圖譜信息的合并增加了 圖譜上的標(biāo)記密度，以及改善了圖譜分辨率。這些改善的圖譜可有利地用于標(biāo)記輔助選擇， 基于圖譜的克隆，為定位新鑒定的分子標(biāo)記提供了改善的框架，并幫助鑒定QTL染色體區(qū) 間和成簇的有利連鎖標(biāo)記。在一些方面，共有圖譜是由一個(gè)圖譜與另一圖譜頂部的簡(jiǎn)單重疊而得到的。在 其方面，多種算法例如JoinMap 分析，可允許來(lái)自不同來(lái)源的遺傳作圖數(shù)據(jù)的組合，并 協(xié)調(diào)原始來(lái)源的作圖數(shù)據(jù)之間的偏差。參見(jiàn)Van Ooijen and Voorrips (2001) "JoinMap 3. O software for the calculation ofgenetic linkage maps，，，Plant Research International,ffageningen, theNetherlands ；Stam(1993)"Construction of integrated genetic linkage mapsby means of a new computer package JoinMap", The Plant Journal3(5) :739_744。連鎖標(biāo)記根據(jù)本發(fā)明和本領(lǐng)域的廣泛共識(shí)，顯然，具有與感興趣的表型性狀(例如在本發(fā) 明中，新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)性狀)共分離的顯著概率的任何遺傳標(biāo)記，都可用作該性 狀的標(biāo)記。本發(fā)明所提供的可用QTL標(biāo)記的列表，如表1和2所述。除了表1和2注明的QTL標(biāo)記之外，與QTL標(biāo)記連鎖的其他標(biāo)記也用于預(yù)測(cè)玉米 植物中新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)性狀。換而言之，表現(xiàn)出與本發(fā)明QTL標(biāo)記(例如表1和 2所述的標(biāo)記)具有小于50%重組頻率(分離的遺傳距離小于50cM)的任何其他標(biāo)記，也 是本發(fā)明的一方面。與QTL標(biāo)記連鎖的任何標(biāo)記，也可有利地用于具體性狀的標(biāo)記輔助選 擇。若它們與給定的QTL標(biāo)記足夠接近(例如緊密連鎖)，以致遺傳標(biāo)記和QTL標(biāo)記表 現(xiàn)出低的重組頻率，則與QTL標(biāo)記(例如表1和2所提供的QTL標(biāo)記)連鎖的遺傳標(biāo)記是 特別有用的。在本發(fā)明中，這種緊密連鎖的標(biāo)記是本發(fā)明的一方面。如本文所定義的，緊密 連鎖標(biāo)記表現(xiàn)出大約10%或更低的重組頻率(給定的標(biāo)記在QTL的IOcM之內(nèi))。換而言 之，這種緊密連鎖位點(diǎn)至少90%的時(shí)間共分離。實(shí)際上，標(biāo)記與QTL標(biāo)記越緊密，標(biāo)記越成 為所需性狀更有效和有利的指示器。因此，在其他實(shí)施方案中，緊密連鎖位點(diǎn)例如QTL標(biāo)記位點(diǎn)和第二位點(diǎn)表現(xiàn)出 10%或更小、優(yōu)選約9%或更小、還更優(yōu)選約8%或更小、還更優(yōu)選約7%或更小、還更優(yōu)選 約6%或更小、還更優(yōu)選約5%或更小、還更優(yōu)選約4%或更小、還更優(yōu)選約3%或更小、還更 優(yōu)選約2%或更小的位點(diǎn)間重組頻率。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，相關(guān)位點(diǎn)(例如標(biāo)記位點(diǎn)和 靶位點(diǎn)例如QTL)表現(xiàn)出約或更小，例如約0. 75%或更小，更優(yōu)選約0. 5%或更小，或還 更優(yōu)選0. 25%或更小的重組頻率。因而，位點(diǎn)相距大約10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、 3cM、2cM、lcM、0. 75cM、0. 5cM或0. 25cM或更小。換而言之，位于同一染色體上且兩者距離 會(huì)使兩個(gè)位點(diǎn)之間以小于10% (例如約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0. 75%, 0. 5%,0. 25%或更小)的頻率發(fā)生重組，則兩個(gè)位點(diǎn)稱為相互“接近”。在一些方面，本發(fā)明的連鎖標(biāo)記(包括緊密連鎖標(biāo)記)可通過(guò)瀏覽遺傳圖譜，例如 在Maize⑶B網(wǎng)站上發(fā)現(xiàn)的整合遺傳圖譜來(lái)確定。例如，本文顯示了連鎖群2標(biāo)記MZA625、MZA16656、MZA1545U MZA15490、MZA2038、MZAl 1826 以及 MZA9105，與至少一個(gè) MRCV 抗性 QTL 關(guān)聯(lián)。與 MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZAl 1826 以及 MZA9105 連 鎖的標(biāo)記，可從表8提供的列表中確定(參見(jiàn)表11，顯示了 MZA625和MZA9105之間遺傳標(biāo) 記的水稻位點(diǎn)和工作玉米基因ID)。 例如,連鎖群2上的與MZA625.MZA16656,MZA15451.MZA15451.MZA15490.MZA2038.MZA11826以及MZA9105連鎖的標(biāo)記包括表12所列的那些.
表 12同樣，本發(fā)明的連鎖標(biāo)記(包括緊密連鎖標(biāo)記)可通過(guò)瀏覽任何適宜的玉米遺傳 圖譜來(lái)確定。例如整合遺傳圖譜可見(jiàn)于Maize⑶B網(wǎng)站。連鎖或緊密連鎖標(biāo)記的確定并不限于使用任何具體的玉米遺傳圖譜。實(shí)際上，大 量的玉米遺傳圖譜是可用的，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。可選地，連鎖和緊密連鎖標(biāo)記的 確定可通過(guò)形成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)組和連鎖分析來(lái)進(jìn)行。與本文所鑒定的MRCV抗性QTL標(biāo)記連鎖(例如在約50cM之內(nèi)或在約IOcM之內(nèi)) 的標(biāo)記的鑒定，也不限于任何具體圖譜或方法。MaizeGDB網(wǎng)站所提供的整合遺傳圖譜僅作 為鑒定連鎖標(biāo)記的實(shí)例。事實(shí)上，本文所定義的連鎖標(biāo)記可由本領(lǐng)域已知的任何遺傳圖譜 (實(shí)驗(yàn)圖譜或整合圖譜)確定，或可選地，由任何新作圖數(shù)據(jù)組確定。應(yīng)該注意的是連鎖和緊密連鎖標(biāo)記的列表可根據(jù)不同因素在圖譜和方法之間變 化。首先，位于任意兩個(gè)圖譜上的標(biāo)記可以不相同，而且，一些圖譜可以具有比其他圖譜更 大的標(biāo)記密度。用于構(gòu)建遺傳圖譜的作圖種群、方法和法也可以不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 認(rèn)識(shí)到，一個(gè)遺傳圖譜并不需要比另一個(gè)更精確或更不精確，而且，還應(yīng)認(rèn)識(shí)到，任何玉米 遺傳圖譜都可用于確定與本發(fā)明QTL標(biāo)記連鎖和緊密連鎖的標(biāo)記。標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)本發(fā)明提供了具有與賦予MRCV抗性表型的QTL共分離的顯著概率的分子標(biāo)記。這 些QTL標(biāo)記可用于所需性狀(新賦予的抗性或抗性增強(qiáng))的標(biāo)記輔助選擇，以及其他用途。 本發(fā)明并不限于檢測(cè)這些標(biāo)記的任何具體方法。對(duì)應(yīng)種群成員之間遺傳多態(tài)性的標(biāo)記可通過(guò)本領(lǐng)域建立已久的多種方法來(lái)檢測(cè) (例如，基于PCR的序列特異性擴(kuò)增、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLPs)、同工酶標(biāo)記、等位基 因特異性雜交(ASH)、擴(kuò)增植物基因組可變序列、自主序列復(fù)制、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)、單核 苷酸多態(tài)性(SNP)、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(“RAPD”)或擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP))。在一 另外實(shí)施方案中，可簡(jiǎn)單地通過(guò)多態(tài)標(biāo)記區(qū)域的核苷酸測(cè)序確定分子標(biāo)記的存在或缺失。本方法可便利地適用于高通量分析，如上述的其他方法，例如使用可用的高通量測(cè)序方法， 例如雜交測(cè)序。通常，大部分遺傳標(biāo)記依賴于它們所檢測(cè)的核酸的一個(gè)或多個(gè)特性。例如，用于 檢測(cè)遺傳標(biāo)記的一些方法是利用探針核酸與對(duì)應(yīng)于遺傳標(biāo)記的核酸的雜交(例如使用玉 米基因組DNA作模板所產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸)。雜交形式包括但不限于溶液相、固相、混合相， 或原位雜交分析，都可用于等位基因檢測(cè)。核酸雜交的廣泛指南可見(jiàn)于TijSSen(1993) LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization withNucleic Acid Probes (牛物化學(xué)和分鐘牛物學(xué)實(shí)驗(yàn)摶術(shù)-核酸探針雜交)Elsevier， New York，以及 Sambrook 和 Ausubel (本文)；和 Berger andKimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques (分子克降技術(shù)指南)，Methods in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego, CA( “Berger，，)。例如，包含限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的標(biāo)記，可通過(guò)例如使通常為待檢測(cè)核 酸的子片段(或?qū)?yīng)于該子片段的合成的寡核苷酸)的探針與限制性消化的基因組DNA雜 交來(lái)檢測(cè)。選擇限制性內(nèi)切酶，以在不同個(gè)體或種群中提供至少兩個(gè)可選(或多態(tài))長(zhǎng)度 的限制性片段。產(chǎn)生每次雜交的信息片段的一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶的確定，是一個(gè)簡(jiǎn)單 的程序，是本領(lǐng)域公知的。在適當(dāng)基質(zhì)(例如瓊脂糖或聚丙烯酰胺)中按長(zhǎng)度分離并轉(zhuǎn)移 至膜(如硝酸纖維素、尼龍等)之后，在可使探針和靶標(biāo)平衡結(jié)合的條件下，使標(biāo)記的探針 雜交，隨后通過(guò)洗滌去除過(guò)量的探針?？梢钥寺『?或合成標(biāo)記位點(diǎn)的核酸探針。任何適宜標(biāo)記都可與本發(fā)明的探針一 起使用。適宜與核酸探針一起使用的可檢測(cè)標(biāo)記包括，例如可通過(guò)分光鏡、放射同位素、光 化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)手段檢測(cè)的任何組合物?？捎玫臉?biāo)記包括以標(biāo) 記的鏈霉抗生物素偶聯(lián)物染色的生物素、磁珠、熒光染料、放射標(biāo)記、酶和顯色標(biāo)記。其他 標(biāo)記包括與標(biāo)記有熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑和酶的抗體結(jié)合的配體。探針也可構(gòu)建用于生成放 射標(biāo)記的擴(kuò)增子的放射標(biāo)記的PCR引物。標(biāo)記核酸的標(biāo)記策略和相應(yīng)的檢測(cè)策略可見(jiàn)于 例如 Molecular Probes, Inc. (Eugene OR)的 Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals Sixth Edition (熒光探針和化學(xué)品研究手冊(cè)，第 6 版)； 或 Molecular Probes, Inc. (Euggene OR)的 Haugland(2001)Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals Ei Rhth Edition(熒光探針和化學(xué)品研究手冊(cè)，第8版 以CD ROM提供)?；跀U(kuò)增的檢測(cè)方法PCR、RT-PCR和LCR是特別可廣泛使用的用于擴(kuò)增感興趣核酸(例如含有標(biāo)記位 點(diǎn)的那些)，促進(jìn)標(biāo)記檢測(cè)的擴(kuò)增和擴(kuò)增檢測(cè)方法。有關(guān)使用這些和其他擴(kuò)增方法的細(xì)節(jié) 可見(jiàn)于多種標(biāo)準(zhǔn)教科書中的任何教科書，包括例如Sambrook、Ausubel, Berger以及Croy。 許多可用的生物學(xué)教科書也具有關(guān)于PCR和相關(guān)擴(kuò)增方法的廣泛討論。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理 解，本質(zhì)上任何RNA都可轉(zhuǎn)化成適宜于限制性消化、PCR延伸和使用逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶的 測(cè)序(“逆轉(zhuǎn)錄PCR”或“RT-PCR”)的雙鏈DNA。還可參見(jiàn)上文的Ausubel、Sambrook以及 Berger0實(shí)時(shí)擴(kuò)增/檢測(cè)方法在一方面，使用例如分子信標(biāo)或TaqMan 探針，對(duì)本文所述擴(kuò)增混合物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR或LCR。分子信標(biāo)(MB)是在適宜雜交條件下可自雜交形成莖和環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷 酸或PNA。MB在寡核苷酸或PNA末端具有標(biāo)記和淬滅劑；因此，在實(shí)現(xiàn)分子內(nèi)雜交的條件 下，標(biāo)記通常被淬滅劑淬滅(或至少改變其熒光性)。在MB不顯示分子內(nèi)雜交的條件下 (如，結(jié)合于靶核酸，如在擴(kuò)增過(guò)程中結(jié)合于擴(kuò)增子的區(qū)域)，MB標(biāo)記不被淬滅。制備和使 用MBs的標(biāo)準(zhǔn)方法相關(guān)細(xì)節(jié)，在文獻(xiàn)中建立已久，且MBs可來(lái)源于多種商業(yè)試劑源。還參 見(jiàn)例如 Leone et al. (1995) "Molecular beaconprobes combined with amplification by NASBA ena ble homogenousreal-time detection of RNA，，，Nucleic Acids Res. 26 2150-2155 ；Tyagi andKramer(1996) "Molecular beacons :probes that fluoresce upon hybridizationMature BiotechnoIory 14 303-308 ；Blok and Kramer(1997)"Amplifiab lehybridization probes containing a molecular sWitcWol Cell Probesll 187-194 ； Hsuih et al. (1997)"Novel,ligation-dependent PCR assay fordetection of hepatitis C in serum” T Clin Microbiol 34 501-507 ；Kostrikis et al. (1998) "Molecular beacons :spectral ggenotypingof human alleles，，Science279 1228-1229 ；Sokol et al. (1998) "Real time detection of DNA :RNAhybridization in living cells”Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95 11538~11543 :Tyagi et al. (1998) "Multicolor molecular beacons for allele discrimination，，Nature BiotechnoloRY 16 :49_53 ；Bonnet et al. (1999) "Thermodynamic basisof the chemical specificity of structured DNA probes，，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 6171~6176 :Fang et al. (1999) "Designing a novel moIecularbeacon for surface-immobilized DNA hybridization studies，，J. Am.Chem. Soc. 121 2921-2922 ；Marras et al. (1999) "Multiplex detection ofsingle-nucleotide variation using molecular beacons"Genet.Anal. Biomol. EnR. 14 151~156 禾口 Vet et al. (1999) "Multiplex detection of four pathogenieretroviruses using molecular beacons，，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 6394-6399。關(guān)于MB構(gòu)建和使用的其他細(xì)節(jié)，可見(jiàn)于專利文獻(xiàn)，例如美國(guó)專利5925517、 6150097 和 6037130 號(hào)。本發(fā)明中也可實(shí)施使用雙標(biāo)記熒光寡核苷酸探針通常稱為“TaqMan ”探針的PCR 檢測(cè)和定量。這些探針可由以兩種不同熒光染料標(biāo)記的短(例如20-25堿基)寡脫氧核苷 酸所組成。在每個(gè)探針的5’端是報(bào)告染料，而在每個(gè)探針的3’端是淬滅染料。寡核苷酸 探針序列與存在于PCR擴(kuò)增子中的內(nèi)部靶序列互補(bǔ)。當(dāng)探針是完整的，在兩個(gè)熒光團(tuán)之間 會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，且由報(bào)告基團(tuán)的發(fā)光被淬滅劑通過(guò)FRET所淬滅。在PCR延伸階段，探針 被反應(yīng)中所用的聚合酶的5’核酸酶活性所切割，因此從寡核苷酸_淬滅劑中釋放報(bào)告基團(tuán) 并提高了報(bào)告發(fā)光強(qiáng)度。因此，TaqMan 探針是具有標(biāo)記和淬滅劑的寡核苷酸，其中標(biāo)記在 擴(kuò)增期間因擴(kuò)增所用聚合酶的外切核酸酶作用而被釋放。這提供了合成期間擴(kuò)增的實(shí)時(shí)測(cè) 量。多種TaqMan 試劑是商業(yè)可供的，例如來(lái)自AppliedBiosystemM在加拿大福斯特市的 分部)以及來(lái)自多個(gè)專業(yè)供應(yīng)商例如Biosearch Technologies (例如，黑洞淬滅劑探針)。關(guān)于擴(kuò)增可變序列、SSR、AFLP. ASH、SNPs以及同工酶標(biāo)記的其他細(xì)節(jié)擴(kuò)增的可變序列指在同一物種的成員之間表現(xiàn)出核酸殘基高度可變性的植物基 因組的擴(kuò)增的序列。所有生物體都具有可變基因組序列且每個(gè)生物體(除克隆之外)具有 不同的可變序列組。一經(jīng)鑒定，具體可變序列的存在可用于預(yù)測(cè)表型性狀。優(yōu)選地，來(lái)自植物的DNA作為位于DNA可變序列側(cè)翼的引物擴(kuò)增的模板。擴(kuò)增可變序列然后對(duì)其測(cè)序。可選地，自主序列復(fù)制可用于鑒定遺傳標(biāo)記。自主序列復(fù)制指使用靶核酸序列的核酸擴(kuò)增方法，通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制涉及的三種酶活性(1)逆轉(zhuǎn)錄酶，(2) RNA酶H，和 (3)依賴DNA的RNA聚合酶，可使所述靶核酸序列在基本等溫條件下在體外進(jìn)行指數(shù)復(fù)制 (Guatelli et al. (1990)Proc NatlAcad Sci USA 87:1874)。通過(guò) cDNA 中間物的方式模 擬逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA復(fù)制策略，該反應(yīng)會(huì)積累最初靶標(biāo)的cDNA和RNA拷貝。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)也可用作遺傳標(biāo)記(Vos et al. (1995)Nucleic Acids Res 23:4407)。短語(yǔ)“擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性”是指經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶切割之前或 之后擴(kuò)增的所選的限制性片段。擴(kuò)增步驟可使特異性限制性片段的檢測(cè)更容易。AFLP可實(shí) 現(xiàn)大量多態(tài)標(biāo)記的檢測(cè)，并可用于植物的遺傳作圖(Becker et al. (1995)Mol Gen Genet 249 65 ；禾口 Meksem et al. (1995)Mol Gen Genet 249 74)。等位基因特異性雜交(ASH)可用于鑒定本發(fā)明的遺傳標(biāo)記。ASH技術(shù)是基于短的 單鏈寡核苷酸探針與完全互補(bǔ)單鏈靶核酸的穩(wěn)定退火。檢測(cè)憑借附著在探針上的同位素或 非同位素標(biāo)記。對(duì)于每個(gè)多態(tài)性，兩個(gè)或多個(gè)不同ASH探針被設(shè)計(jì)成具有相同DNA序列，除了多態(tài) 核苷酸之外。每個(gè)探針都與一個(gè)等位基因具有正確的同源性，以便探針的范圍可區(qū)別所有 已知可選的等位基因序列。每個(gè)探針與靶DNA雜交。在適宜的探針設(shè)計(jì)和雜交條件下，探針 和靶DNA之間的單堿基錯(cuò)配將阻礙雜交。按這種方式，僅唯一的可選探針會(huì)和與等位基因 純合或同質(zhì)的靶樣品雜交。與兩個(gè)等位基因雜合或異質(zhì)的樣品會(huì)和兩個(gè)可選探針都雜交。在由唯一探針的雜交或缺乏雜交來(lái)確定唯一等位基因的存在或缺失中，用ASH標(biāo) 記作為主要標(biāo)記?？捎扇狈﹄s交推斷可選等位基因。ASH探針和靶分子任選地是RNA或 DNA ；靶分子是超出與探針互補(bǔ)的序列的任何長(zhǎng)度的核苷酸；探針被設(shè)計(jì)成可與靶DNA任一 鏈雜交；探針大小發(fā)生變動(dòng)，以便符合多種嚴(yán)格雜交條件等。PCR在相對(duì)小體積中由低濃度核酸擴(kuò)增ASH的靶序列。此外，以限制性內(nèi)切核酸酶 消化來(lái)自基因組DNA的靶序列，并通過(guò)凝膠電泳按大小進(jìn)行分離。雜交通常發(fā)生在結(jié)合到 膜表面的靶序列上，或如美國(guó)專利5，468，613號(hào)所述，ASH探針序列結(jié)合到膜上。在一個(gè)實(shí)施方案中，通常利用PCR由基因組DNA擴(kuò)增核酸片段(擴(kuò)增子)，將擴(kuò)增 子靶DNA轉(zhuǎn)移至點(diǎn)斑點(diǎn)印跡形式的膜上，使標(biāo)記的寡核苷酸探針與擴(kuò)增子靶雜交，并通過(guò) 放射自顯影術(shù)觀察雜交斑點(diǎn)，從而獲得ASH數(shù)據(jù)。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是由在單個(gè)核苷酸基礎(chǔ)上有區(qū)別的共享序列組成的標(biāo)記。 通常，這種區(qū)別可通過(guò)包含SNP的擴(kuò)增子在例如丙烯酰胺凝膠上的差速遷移模式來(lái)檢測(cè)。 但是，可選的檢測(cè)方式例如雜交，如ASH或RFLP分析也是適宜的。同工酶標(biāo)記可用作遺傳標(biāo)記，例如以追蹤除本文抗性標(biāo)記之外的標(biāo)記，或追蹤與 本文標(biāo)記連鎖的同工酶標(biāo)記。同工酶是在其氨基酸序列上和核酸序列上互相區(qū)別的多種形 式的酶。一些同工酶是包含略有區(qū)別的亞基的多體酶。其他同工酶是多體或單體的，但在 氨基酸序列的不同位點(diǎn)由酶原切割而得?？稍诘鞍姿缴媳碚骱头治鐾っ?，或可選地，可 測(cè)定在核酸水平上有區(qū)別的同工酶。在這種情況中，本文所述的任何基于核酸的方法，都可 用于分析同工酶標(biāo)記。關(guān)于核酸擴(kuò)增的其他細(xì)節(jié)
應(yīng)注意，核酸擴(kuò)增技術(shù)，例如PCR和LCR，是本領(lǐng)域已知的，并可用于本發(fā)明以擴(kuò)增 和/或檢測(cè)感興趣核酸，例如包含標(biāo)記位點(diǎn)的核酸。足以通過(guò)這些體外方法指導(dǎo)技術(shù)人員 的技術(shù)實(shí)例，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、Qi3 復(fù)制酶擴(kuò)增和其 他RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如NASBA)，可見(jiàn)于上文所述的文獻(xiàn)中，例如Innis、Sambrook、 Ausubel、Berger 以及 Croy。其他細(xì)節(jié)可見(jiàn)于Mullis et al. (1987)美國(guó)專利 4，683，202 號(hào); Arnheim&Levinson(October 1,1990)C&EN36-47 :The Tournal Of NIH Research(1991)3 81-94 ；Kwoh et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 1173 ；Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 1874 ；Lomell et al. (1989) Τ. Clin. Chem 35:1826; Landegren et al. (1988)Science 2411077-1080 ；Van Brunt (1990)Biotechnology 8 291-294 ；Wu and Wallace (1989)Gene 4560 ；Barringer et al. (1990)Gene 89 117 ；和 Sooknanan and Malek(1995)Biotechnology 13:563-564。在參考的 Cheng etal. (1994) Nature 369 684中還進(jìn)一步概述了通過(guò)PCR擴(kuò)增大核酸的改良方法，其中，可形成高達(dá) 40kb的PCR擴(kuò)增子，這可用于本文的定位克隆。定位克降標(biāo)記的檢測(cè) 在一些實(shí)施方案中，核酸探針用于檢測(cè)包含標(biāo)記序列的核酸。這種探針可用于例 如定位克隆以分離與標(biāo)記核苷酸序列連鎖的核苷酸序列。本發(fā)明的核酸探針并不限于任何 具體大小。在一些實(shí)施方案中，核酸探針的長(zhǎng)度是至少20個(gè)核苷酸，可選地，至少50個(gè)核 苷酸，或可選地，至少100個(gè)核苷酸，或可選地至少200個(gè)核苷酸。根據(jù)待檢測(cè)的標(biāo)記，可使用放射自顯影術(shù)、熒光顯影或其他類似檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)雜 交探針。特異性雜交方案的實(shí)例是本領(lǐng)域中廣泛可用的，參見(jiàn)例如本文所的述Berger、 Sambrook 以及 Ausubel0探針/引物合成方法通常，制備包括探針、引物、分子信標(biāo)、PNAs (鎖定核酸)等寡核苷酸的合成方法 是公知的。例如可根據(jù) Beaucage and Caruthers (1981)，Tetrahedron Letts. 22 (20) 859-1862所述的固相亞磷酰胺三酯法，例如使用Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 =6159-6168所述的商業(yè)可供自動(dòng)化合成器，化學(xué)合成寡核苷酸。 寡核苷酸，包括修飾的寡核苷酸，也可從技術(shù)人員已知的多種商業(yè)來(lái)源訂購(gòu)。存在許多提 供寡核苷酸合成服務(wù)的供應(yīng)商，因此，這是一種廣泛可用的技術(shù)。任何核酸都可從任何多 種商業(yè)來(lái)源訂購(gòu)，例如 The Midland Certified ReagentCompany, The Great American Gene Company, ExpressGen Inc. , OperonTechnologies Inc. (Alameda, CA)以及其他來(lái) 源。同樣，PNAs可從任何多種商業(yè)來(lái)源訂購(gòu)，例如P印tidoGenic，HTI Bio-Products, Inc.， BMABiomedicals Ltd(U. K.)，Bio. Synthesis, Inc.以及其他來(lái)源。^^feip^lil (in siIio marker detection)在可選實(shí)施方案中，電子方法(in silio method)可用于檢測(cè)感興趣標(biāo)記位點(diǎn)。例 如，包含感興趣標(biāo)記位點(diǎn)的核酸的序列可存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中。使用以例如易得程序如BLAST 或甚至簡(jiǎn)單的文字處理器所提供的適宜核酸檢索法則可鑒定所需標(biāo)記位點(diǎn)序列或其同源 物。用于標(biāo)記檢測(cè)的擴(kuò)增引物在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，使用適宜的基于PCR的檢測(cè)方法檢測(cè)本發(fā)明的分子標(biāo)記，其中PCR擴(kuò)增子的大小或序列可指示標(biāo)記(例如具體標(biāo)記等位基因)的缺失或存在。在這類方法中，PCR引物與位于多態(tài)標(biāo)記區(qū)側(cè)翼的保守區(qū)雜交。如本領(lǐng)域所用的，用于擴(kuò)增分 子標(biāo)記的PCR引物有時(shí)稱為“PCR標(biāo)記”或簡(jiǎn)稱“標(biāo)記”。應(yīng)該理解的是，盡管本文提供了許多具體引物的實(shí)例(參見(jiàn)表3)，但可使用任何 適宜的方法設(shè)計(jì)用于本發(fā)明的適宜引物。本發(fā)明并不限于具體的引物或引物對(duì)。例如，可 使用適宜軟件程序例如LASERGENE 設(shè)計(jì)引物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明引物是放射標(biāo)記的，或任何適宜方法標(biāo)記的(例如使 用非放射活性熒光標(biāo)簽)，以在擴(kuò)增反應(yīng)之后快速顯現(xiàn)不同大小的擴(kuò)增子而無(wú)需任何其他 標(biāo)記步驟或顯現(xiàn)步驟。在一些實(shí)施方案中，不標(biāo)記引物，而根據(jù)其大小分辨率，例如根據(jù)瓊 脂糖凝膠電泳，顯現(xiàn)擴(kuò)增子。在一些實(shí)施方案中，按大小分辨率以溴化乙啶染色PCR擴(kuò)增 子，可顯現(xiàn)不同大小的擴(kuò)增子。本發(fā)明引物并不限于產(chǎn)生任何具體大小的擴(kuò)增子。例如，用于擴(kuò)增本文標(biāo)記位點(diǎn) 和等位基因的引物不限于擴(kuò)增相關(guān)位點(diǎn)的全部區(qū)域。引物可以產(chǎn)生任何合適長(zhǎng)度的擴(kuò)增 子。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)生長(zhǎng)度為至少20個(gè)核苷酸的擴(kuò)增子，或可選地，至少50 個(gè)核苷酸，或可選地，至少100個(gè)核苷酸，或可選地至少200個(gè)核苷酸。標(biāo)記輔助詵擇和棺物育種在作物物種中開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的主要目的在于，通過(guò)標(biāo)記輔助選擇(MAS)有效地 提高植物育種效能。遺傳標(biāo)記可用于鑒定在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上含有所需基因型，并預(yù)期 將所需基因型隨所需表型一起轉(zhuǎn)移至它們的子代的植物。遺傳標(biāo)記可用于鑒定在一個(gè)位 點(diǎn)或在多個(gè)非連鎖或連鎖位點(diǎn)含有所需基因型(例如單元型)，并預(yù)期將所需基因型隨所 需表型一起轉(zhuǎn)移至它們的子代的植物。本發(fā)明提供了通過(guò)鑒定在這些位點(diǎn)例如MZA625、 MZA16656、MZA1545U MZA15490、MZA2038、MZAl 1826 或 MZA9105 之一具有指定的等位基因 的植物，鑒定具有對(duì)MRCV的新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)，或易感性的植物，特別是玉米植物 的方式。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)鑒定的抗性植物具有單元型在MRQV_08351-173的C，在 MRQV_08351-262 的 A，在 MRQV_08351_280 的 G，在 MRQV_08351_323 的 G，在 MRQV_08351_369 的 C，在 MRQV_08351-372 的 C。同樣，通過(guò)鑒定缺乏所需標(biāo)記位點(diǎn)的植物，可鑒定并例如從隨后的雜交中排除易 感或低抗性植物。同樣，這些標(biāo)記位點(diǎn)可被基因滲入至任何所需的基因組背景、種質(zhì)、植 物、系、品種等，如作為設(shè)計(jì)成增加玉米產(chǎn)量的整體MAS育種程序的一部分。在一個(gè)實(shí)施方 案中，經(jīng)鑒定的易感植物具有單元型在MRQV_08351-173的T，在MRQV_08351_262的T，在 MRQV_08351-280 的 A，在 MRQV_08351_323 的 C，在 MRQV_08351_369 的 T，在 MRQV_08351_372 的Τ。本發(fā)明也提供了可在MAS等同使用的染色體QTL區(qū)間，以選擇表現(xiàn)出新賦予的或 增強(qiáng)的MRCV抗性的植物。同樣，QTL區(qū)間也可用于反選擇易感MRCV或MRCV抗性降低的植 物。繪制在QTL區(qū)間內(nèi)的任何標(biāo)記(包括區(qū)間的端點(diǎn))可用于本發(fā)明。這些區(qū)間通過(guò)以下 成對(duì)標(biāo)記定義(i)MZA8381 禾口 MZA18180 ；
(ii)MZA4305 和 MZA2803 ；
(iii)MZA15490 和 MZA2038 ；
(iv)bnlgl458b 和 umcl261a ；(ν)bnlgl458b 和 umcl262a ；(vi)bnlgl327 和 umcl261a ；以及 (viii)bnlgl327 和 umc 1262a。通常，MAS使用經(jīng)鑒定具有與抗性性狀共分離顯著可能性的多態(tài)標(biāo)記。這些標(biāo)記被 假定繪制在賦予植物抗性表型的基因附近，并被認(rèn)為是所需抗性的指示器，且稱為QTL標(biāo) 記。對(duì)于QTL標(biāo)記中所需等位基因的存在，檢驗(yàn)植物。最優(yōu)選標(biāo)記(或標(biāo)記等位基因)是 與抗性性狀具有最強(qiáng)關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。連鎖分析可用于確定哪個(gè)標(biāo)記等位基因表現(xiàn)出與抗性表型共分離的統(tǒng)計(jì)概率 (因而，“抗性標(biāo)記等位基因”)。鑒定與抗性表型共分離的標(biāo)記等位基因之后，可以使用這 種標(biāo)記用于快速、準(zhǔn)確地篩選抗性等位基因植物系，而無(wú)需使植物生長(zhǎng)經(jīng)過(guò)它們的生命周 期并等待表型評(píng)估，而且，甚至在實(shí)際抗性QTL的分子特性還未知時(shí)，實(shí)現(xiàn)具體抗性等位基 因的基因選擇。組織樣品可取自例如植物的第一葉，并經(jīng)適當(dāng)?shù)姆肿訕?biāo)記篩選，快速確定哪 個(gè)子代是優(yōu)良的。連鎖標(biāo)記也可去除通常影響表型表達(dá)的環(huán)境因素的影響。多態(tài)QTL標(biāo)記位點(diǎn)可用于選擇含有與所需抗性表型關(guān)聯(lián)的標(biāo)記等位基因的植物， 通常稱為標(biāo)記輔助選擇(MAS)。簡(jiǎn)而言之，在來(lái)自待選擇植物的生物樣品中，檢測(cè)對(duì)應(yīng)于標(biāo) 記核酸等位基因的核酸。這種檢測(cè)可采取探針核酸與標(biāo)記等位基因或其擴(kuò)增子雜交的形 式，例如適宜等位基因特異性雜交、Southern分析、northern分析、原位雜交、引物雜交之 后標(biāo)記區(qū)域的PCR擴(kuò)增等。用于檢測(cè)標(biāo)記的多種程序在例如標(biāo)題為“標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)”的章 節(jié)中有描述。證實(shí)生物樣品中存在(或缺失)具體標(biāo)記等位基因之后，選擇植物(例如通 過(guò)選擇性育種用于制備子代植物)。玉米植物育種者需要抗性位點(diǎn)與高產(chǎn)量和其他所需性狀基因的組合，以培育改良 的玉米品種。通過(guò)非分子方法(例如玉米植物中的性狀評(píng)估)篩選大量樣品是昂貴、耗時(shí) 且不可靠的。使用本文所述的多態(tài)標(biāo)記，其與抗性位點(diǎn)遺傳連鎖時(shí)，可提供在育種程序中選 擇抗性品種的有效方法。例如，標(biāo)記輔助選擇在田間抗性評(píng)估的優(yōu)勢(shì)在于，MAS可在一年中 的任何時(shí)間進(jìn)行，而不管生長(zhǎng)季節(jié)如何。而且，環(huán)境作用與標(biāo)記輔助選擇很不相關(guān)。當(dāng)種群在影響一個(gè)或多個(gè)性狀的多個(gè)位點(diǎn)上分離時(shí)，例如涉及抗性的多個(gè)位點(diǎn)， 或每個(gè)都涉及對(duì)不同抗病性的多個(gè)位點(diǎn)，與表型篩選相比MAS效率更高，因?yàn)樗形稽c(diǎn)可 和單個(gè)DNA樣品一起在實(shí)驗(yàn)室中評(píng)估。在這種情況中，來(lái)自單個(gè)樣品或樣品群中的MZA625、 MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZAl 1826 和 MZA9105 標(biāo)記，以及任何染色體區(qū)間(i)MZA8381 和 MZA18180 ；(ii)MZA4305 和 MZA2803 ；(iii)MZA15490 和 MZA2038 ；(iv)bnlgl458b 和 umcl261a ；(v)bnlgl458b 禾口 umcl262a ；(vi)bnlgl327 和 umcl261a ；以及(viii)bnlgl327 和 umcl262a，可同時(shí)或依次進(jìn)行分析。MAS在植物育種中的另一用途是，通過(guò)回交育種幫助恢復(fù) 輪回親代基因型?；亟挥N是將子代與其親代或親代系回交的過(guò)程。通常是為將一個(gè)或幾個(gè)來(lái)自供體親代(例如包含所需抗性標(biāo)記位點(diǎn)的親代)的位點(diǎn)基因滲入至另外的來(lái)自輪回 親代的所需遺傳背景(例如另外的高產(chǎn)玉米系)的目的進(jìn)行回交。進(jìn)行回交的輪數(shù)越多， 輪回親代對(duì)所得的基因滲入品種的基因貢獻(xiàn)越大。這通常是必需的，因?yàn)榭剐灾参锟赡茉?其他方面是不需要的，例如由于低產(chǎn)量，低生殖力等。相反，經(jīng)強(qiáng)度育種程序得到的植株可 能具有極好的產(chǎn)量、生殖力等，僅缺乏一個(gè)所需性狀例如MRCV抗性。植物基因組中的具體遺傳標(biāo)記或等位基因的存在和/或缺失，例如MZA625、 MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZAl 1826 和 MZA9105 標(biāo)記，以及任何染色體區(qū)間(i)MZA8381 和 MZA18180 ；(ii)MZA4305 和 MZA2803 ；(iii)MZA15490 和 MZA2038 ；(iv)bnlgl458b 和 umcl261a ；(v)bnlgl458b 和 umcl262a ；(vi)bnlgl327 和 umcl261a ；以及(viii)bnlgl327 和 umc 1262a ；可通過(guò)本文所述任何方法可判斷。如果來(lái)自植物的核酸在所需遺傳標(biāo)記等位基因 上是陽(yáng)性，則該植物可自體受精，產(chǎn)生具有相同基因型的純育種系(true breeding line), 或它可與具有相同標(biāo)記或具有其他所需特性的植物雜交，產(chǎn)生兩性有性雜交的雜交世代。-榆附示蹄測(cè)在本發(fā)明上下文中，MAS的一個(gè)應(yīng)用是，使用新賦予的抗性或抗性 增強(qiáng)的標(biāo)記提高 旨在將抗性QTL導(dǎo)入所需(通常是高產(chǎn)量的)背景的基因滲入或回交的效率。來(lái)自供體源 的具體標(biāo)記(和相關(guān)QTL)標(biāo)記輔助回交至例如原種或外來(lái)遺傳背景中，可在回交子代中選 擇供體性狀然后使用與原種或外來(lái)系的重復(fù)回交以重構(gòu)盡可能多的原種/外來(lái)背景基因組。因而，可利用本發(fā)明的標(biāo)記和方法指導(dǎo)標(biāo)記輔助選擇或具有與優(yōu)良農(nóng)藝性能(抗 性，和任何其他可用產(chǎn)量標(biāo)記等)相關(guān)的染色體片段的等位基因形式的所需成分(組)的 玉米品種育種。任何公開(kāi)的標(biāo)記等位基因可通過(guò)傳統(tǒng)育種經(jīng)基因滲入(或經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入，或 兩者)導(dǎo)入玉米系中，產(chǎn)生具有優(yōu)良農(nóng)藝性能的玉米植物?？梢詫?dǎo)入或存在于本發(fā)明玉米 植物中的與抗性相關(guān)的等位基因數(shù)量在1至本文公開(kāi)的等位基因數(shù)量的范圍內(nèi)，其中每個(gè) 整數(shù)都并入文本，如同明確引用。本發(fā)明還擴(kuò)展至制備子代玉米植物的方法和這些子代玉米植物本身。該方法包括 第一親代玉米植物與第二玉米植物雜交，并在植物生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)雌性玉米植物，產(chǎn)生玉 米植物子代。使玉米植物雜交和生長(zhǎng)的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全能實(shí)施的?？煞治?這些玉米植物子代與抗性相關(guān)的等位基因，從而選擇所需子代。這些子代植物或種子可商 業(yè)銷售，用于玉米生產(chǎn)，用于食物，加工獲得所需的玉米成分，或進(jìn)一步用在后續(xù)育種輪回 中。第一或第二玉米植物的至少一個(gè)是本發(fā)明的玉米植物，因?yàn)槠浒辽僖粋€(gè)本發(fā)明的 等位基因形式的標(biāo)記，以便子代能夠繼承該等位基因。本發(fā)明的方法可用于至少一個(gè)相關(guān)玉米植物，例如來(lái)自主題玉米植物系譜的祖先 或后代系，以便所需抗性等位基因的遺傳可被追蹤。經(jīng)受本發(fā)明方法的分離玉米植物的世 代數(shù)量通常從1-20，一般1-5，且經(jīng)常是1、2或3個(gè)分離世代，非常普遍的是將該玉米植物的直接后代或親代經(jīng)受該方法(例如一個(gè)分離世代)。髓··__入-#入“夕卜前Φ辦艦
在任何育種程序中，遺傳多樣性對(duì)長(zhǎng)期遺傳增益(genetic gain)很重要。受多樣 性限制，當(dāng)所有偏好等位基因固定于原種種群內(nèi)時(shí)，遺傳增益最終平穩(wěn)。一個(gè)目標(biāo)是將多樣 性并入原種池，而不損失已經(jīng)產(chǎn)生的遺傳增益并具有盡可能最小的投資。MAS指示了來(lái)自所 選擇的原始祖先的哪個(gè)基因組區(qū)域和哪個(gè)偏好等位基因被選擇并隨時(shí)間保留，促進(jìn)嘗試將 來(lái)自外來(lái)種質(zhì)源(與原種基因池?zé)o關(guān)的親代)的偏好變異并入，以期望能找到原種基因池 中不存在的偏好等位基因。例如本發(fā)明的標(biāo)記可在涉及原種χ外來(lái)玉米系的雜交中用于MAS，通過(guò)將分離子 代進(jìn)行MAS以與本文的抗性標(biāo)記等位基因一起，維持主要產(chǎn)量等位基因。定位克降如前所述的，本發(fā)明的分子標(biāo)記位點(diǎn)和等位基因例如MZA625、MZA16656、 MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZAl 1826 和 MZA9105 標(biāo)記，以及任何染色體區(qū)間(i)MZA8381 禾口 MZA18180 ；(ii)MZA4305 和 MZA2803 ；(iii)MZA15490 和 MZA2038 ；(iv)bnlgl458b 和 umcl261a ；(v)bnlgl458b 和 umcl262a ；(vi)bnlgl327 和 umcl261a ；以及(viii)bnlgl327 和 umc 1262a ；可用于鑒定抗性QTL，抗性QTL可通過(guò)建立已久的程序來(lái)克隆，例如在Ausubel、 Berger以及Sambrook中所詳述的。首先通過(guò)它們與本發(fā)明標(biāo)記的遺傳連鎖鑒定這些抗性克隆。通過(guò)在如本文中 的 Ausubel, Berger and Sambrook, 禾口 Clark, Ed. (1997)PlantMolecular Biology :A Laboratory Manual Springer-Verlag,Berlin的參考文獻(xiàn)中詳細(xì)討論的任意數(shù)量的方法， 可實(shí)現(xiàn)感興趣核酸的分離。例如，“定位基因克隆”采用抗性標(biāo)記的接近度物理定義含有抗性QTL基因的分 離的染色體片段。分離的染色體片段可通過(guò)公知方法產(chǎn)生，如以一種或多種限制性內(nèi)切酶 消化染色體DNA，或在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中擴(kuò)增染色體區(qū)域，或任何適宜的可選擴(kuò)增反 應(yīng)。通常將消化或擴(kuò)增的片段連接到適宜插入的片段復(fù)制和例如表達(dá)的載體上。鄰近與 表型性狀相關(guān)的可讀框(ORF)的標(biāo)記，可與DNA克隆(例如來(lái)自基因組DNA文庫(kù)的克隆) 雜交，因此鑒定定位有ORF(或ORF片段)的克隆。如果標(biāo)記較遠(yuǎn)，可通過(guò)連續(xù)輪的篩選 和分離共同包含DNA連續(xù)序列的克隆來(lái)鑒定含有ORF的片段，該過(guò)程被稱為“染色體步移 (chromosome walking) ”，獲得“重疊群(contig) ”或“重疊群圖譜”。足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn) 行分離與連鎖標(biāo)記相關(guān)的克隆的方案，見(jiàn)于例如本文所述的Berger、Sambrook和Ausubel 中。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和植物的產(chǎn)生本發(fā)明還涉及以對(duì)應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明鑒定的抗性QTL的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和生 物體。例如，這種核酸包括編碼新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)性狀的染色體區(qū)間(例如基因組片段)、ORFs和/或cDNAs。此外，本發(fā)明提供了通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生可提供新賦予的抗性或 抗性增強(qiáng)的多肽。描述克隆和操作核酸并產(chǎn)生編碼的多肽的分子生物技術(shù)的一般文獻(xiàn)，包括上文的 Berger, Sambrook以及Ausubel。這些文獻(xiàn)描述了誘變，載體使用，啟動(dòng)子和許多其他涉及 例如產(chǎn)生含有感興趣核酸的克隆，例如標(biāo)記位點(diǎn)、標(biāo)記探針、與標(biāo)記位點(diǎn)分離的QTL等的相
關(guān)主題。以本發(fā)明載體(例如載體，如包含來(lái)源于或與抗性QTL相關(guān)的ORF的表達(dá)載體)將 宿主細(xì)胞基因工程化(例如轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化等)，載體可以是例如克隆載體、穿梭載體或表 達(dá)載體。這些載體采用例如質(zhì)粒、噬菌粒、農(nóng)桿菌(Agrobacterium)、病毒、裸多核苷酸(線 性或環(huán)狀)，或綴合多核苷酸的形式。也可將載體導(dǎo)入細(xì)菌，特別是為繁殖和擴(kuò)增的目的。 也可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種標(biāo)準(zhǔn)方法，將這些載體導(dǎo)入植物組織、培養(yǎng)的植物細(xì)胞或植物 原生質(zhì)體，包括但不限于電穿孔(From et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 5824), 通過(guò)感染病毒載體例如花椰菜花葉病毒(CaMV) (Hohn et al. (1982)Molecular Biology of Plant Tumors (AcademicPress, New York)，pp. 549-560 ；美國(guó)專利 4，407，956 號(hào))，通 過(guò)在小球或顆?；|(zhì)內(nèi)或在表面上帶有核酸的微粒高速?zèng)_擊穿透(Klein et al. (1987) Nature 327 :70)，使用花粉作為載體(W085/01856)，或使用攜帶T-DNA質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)或生根農(nóng)桿菌(A. rhizogenes)，在所述質(zhì)粒中含克隆DNA 片段。通過(guò)感染根瘤農(nóng)桿菌將T-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞，其中一部分穩(wěn)定整合至植物基 因組中(Horsch et al. (1984) Science 233 496 ；Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 4803)。關(guān)于核酸導(dǎo)入方法的其他細(xì)節(jié)，可見(jiàn)于上文的Sambrook、Berger以及 Ausubel。將本發(fā)明核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法不是本發(fā)明的關(guān)鍵，本發(fā)明并不限于將外源遺 傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的任何具體方法。因此，可采用任何適宜方法，例如包括但不限于本文 所提供的，可有效將核酸導(dǎo)入細(xì)胞或原生質(zhì)體的方法，并用于本發(fā)明。如果對(duì)于此類活性，如激活啟動(dòng)子或選擇轉(zhuǎn)化體適當(dāng)可將工程宿主細(xì)胞培養(yǎng)于修 飾的常規(guī)培養(yǎng)中。可將這些任選地培養(yǎng)至轉(zhuǎn)基因植物中。除上文的SambrooKBerger以及 Ausubel t夕卜，$ Evans et al. (1983) "Protoplast Isolation and Culture，，Handbook of Plant Cell Cultures 1, 124-176 (MacMillan Publishing Co.), New York ； Davey (1983) "RecentDevelopments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts", Protoplasts, pp.12-29, (Birkhauser, Basel) ；Dale(1983) "Protoplast Cultureand Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops，，， Protoplastspp. 31-41, (Birkhauser,Basel) ；Binding(1985) "Regeneration of Plants，，， Plant Protoplasts, pp. 21—73，(CRC Press, Boca Raton, FL)中描述了 由培養(yǎng)的原生 質(zhì)體再生植物。關(guān)于植物細(xì)胞培養(yǎng)和再生的其他細(xì)節(jié)包括，Payneet al. (1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems (液體系統(tǒng)中植物細(xì)胞和組織培養(yǎng))John Wiley&Sons，Inc. New York,NY ；Gamborg andPhillips(eds)(1995)Plant Cell,Tissue and OrRan Culture :FundamentalMethods (植物細(xì)胞、組織 和器官培養(yǎng)，基本方法)Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)禾口 Plant Molecular Biology (植物分子生物學(xué))(1993)R. R. D. Croy，Ed. Bios Scientific Publishers,Oxford, U. K. ISBN O 12 1983706。通常，細(xì)胞培養(yǎng)基還列于 Atlas and Parks (eds) The Handbookof Microbiological Media (微牛物培養(yǎng)基手冊(cè))(1993)CRCPress, Boca Raton, FL中。 細(xì)胞培養(yǎng)的其他信息可見(jiàn)于商業(yè)文獻(xiàn)，例如來(lái)自Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) (“Sigma-LSRCCC”)的 Life ScienceResearch Cell Culture Catalogue (1998)和例如 也是來(lái)自 Sigma-Aldrich，Inc. (St Louis, MO) ( “Sigma-PCCS”)的 the Plant Culture CataloRue andsupplement (例如 1997 或之后)。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生以本發(fā)明核酸(例如含有本文所述標(biāo)記位點(diǎn)和/或QTL的核 酸)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因生物體，其可以是細(xì)菌、酵母、真菌、動(dòng)物或植物。與細(xì)菌、單細(xì)胞真核生 物和細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)的全面討論，可見(jiàn)于本文所列的參考文獻(xiàn)并簡(jiǎn)單總結(jié)如下。將靶核 酸導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的幾種公知方法是可用的，任意一種都可用于本發(fā)明。其包括受體細(xì)胞 與含有DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體的融合，以含DNA的脂質(zhì)體處理細(xì)胞，電穿孔，發(fā)射物轟擊(生 物彈道學(xué))，碳纖維送遞，和感染病毒載體(以下將進(jìn)一步討論)等。細(xì)菌細(xì)胞可用于擴(kuò)增 許多含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的質(zhì)粒。將細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，和可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方 法分離細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒(參見(jiàn)例如Sambrook)。此外，很多試劑盒是商購(gòu)獲得，用于從細(xì)菌純 化質(zhì)粒。為了正確使用它們，遵循生產(chǎn)商的說(shuō)明(參見(jiàn)例如均來(lái)自PharmaciaBiotech的 EasyPr印 ，F(xiàn)lexiPi^p ；來(lái)自 Stratagene 的 StrataClean ；和來(lái)自 Qiagen 的 QIApi^p )。 然后進(jìn)一步操作分離和純化的質(zhì)粒，產(chǎn)生其他質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞或并入根瘤農(nóng)桿菌 相關(guān)的載體以感染植物。典型的載體含有用于調(diào)控具體靶核酸表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、 轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列以及啟動(dòng)子。載體任選地包含含有至少一個(gè)獨(dú)立的終止子序列的基 因表達(dá)盒，允許該盒再真核生物或原核生物或兩者中復(fù)制的序列(例如穿梭載體)，以及 在原核和真核體系都可用的選擇標(biāo)記。載體適宜在原核生物、真核生物或優(yōu)選兩者中復(fù) 制和整合。參見(jiàn) Giliman&Smith(1979)Gene 8 81 ；Roberts et al. (1987)Nature 328 731 ；Schneider et al. (1995) Protein Expr. Purif. 6 10 ；Ausubel、Sambrook、Berger (都 如上文)。用于克隆的細(xì)菌和細(xì)菌噬菌粒目錄由如美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)提 供，例如 ATCC 出版的 The ATCC CataloRue of Bacteria and BacteriophaRe (1992) Gherna et al. (eds)。用于測(cè)序、克隆和分子生物學(xué)其他方面和潛在理論因素的其他基 礎(chǔ)程序，也可見(jiàn)于 Watson et al. (1992)RecombinantDNA, Second Edition, Scientific American Books，NY。此外，本質(zhì)上任何核酸(和實(shí)際上任何標(biāo)記的核酸，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)或 非標(biāo)準(zhǔn))都可從多個(gè)商業(yè)來(lái)源的任何來(lái)源定購(gòu)或標(biāo)準(zhǔn)定制，例如the Midland Certified ReagentCompany(Midland, TX)、The Great American Gene Company(Ramona, CA)、 ExpressGen Inc. (Chicago, IL)、Operon Technologies Inc. (Alameda, CA)等。導(dǎo)入核酸至植物本發(fā)明的實(shí)施方案涉及轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因植物包含編碼抗性基因 的克隆的核酸，例如分離的ORFs和cDNAs。以核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的技術(shù)是廣泛可用的， 并可容易地適用于本發(fā)明。除上文的Berger、Ausubel以及Sambrook之外，可用的植 物細(xì)胞克隆、培養(yǎng)和再生的一般參考文獻(xiàn)包括Jones(ed) (1995)Plant Gene Transfer and ExpressionProtocoIs—Methods in Molecular Biology, Volume 49Humana Press TowataNJ( “Jones，，)；Payne et al. (1992)Plant Cell and Tissue Culture in LiquidSystems John Wiley&Sons, Inc. New York, NY ( “Payne，，)； 禾口 Gamborg andPhillips(eds)(1995)Plant Cell, ssue and Organ Culture ；FundamentalMethodsSpringer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York) ( “Gamborg，，)。 在 Atlas and Parks (eds)The Handbook of MicrobiologicalMedia(1993)CRC Press, Boca Raton, FL( “Atlas”)中描述了多種細(xì)胞培養(yǎng)基。植物細(xì)胞培養(yǎng)的其他信息可見(jiàn)于 可用的商業(yè)文獻(xiàn)，例如來(lái)自 Sigma-Aldrich，Inc. (St Louis, MO) (Sigma-LSRCCC)的 Life ScienceResearch Cell Culture Catalogue (1998)禾口，例如也來(lái)自 Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO)(Sigma-PCCS)的 the Plant Culture CataloRue and supplement(1997)。 關(guān)于植物細(xì)胞培養(yǎng)的其他細(xì)節(jié)可見(jiàn)于Croy?？赏ㄟ^(guò)多種常規(guī)技術(shù)，將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，例如質(zhì)粒、粘粒、人工染色體、DNA 和RNA多核苷酸，導(dǎo)入在培養(yǎng)物或植物器官中的植物細(xì)胞。在序列表達(dá)的地方，序列任選地 與轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)控序列結(jié)合，所述轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)控序列指導(dǎo)外源DNA序列在轉(zhuǎn)化 植物的既定組織中的轉(zhuǎn)錄或翻譯。按照本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)中的任何技術(shù)，可將本發(fā)明分離的核酸導(dǎo)入植物中。 用于轉(zhuǎn)化多種高等植物物種的技術(shù)也是公知的，并在可用的技術(shù)、科技和專利文獻(xiàn)中有廣 泛記載。參見(jiàn)例如 Weising et al. (1988) Ann Rev Genet. 22:421-477。
使用例如電穿孔和植物細(xì)胞原生質(zhì)體微注射技術(shù)，可將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體例如 質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、噬菌體、裸或各種綴合DNA的多核苷酸(例如多賴氨酸綴合的DNA，肽綴 合的DNA，脂質(zhì)體綴合的DNA)，或人工染色體，直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因組DNA中，或使用彈 道方法(ballistic method)，例如DNA顆粒轟擊，將DNA構(gòu)建體直接導(dǎo)入植物細(xì)胞。用于注射植物例如細(xì)胞、胚芽、愈傷組織和原生質(zhì)體的微注射技術(shù)，是本領(lǐng)域已知 的，并在科技和專利文獻(xiàn)中描述得很清楚。例如，在Jones以及本文所述得其他參考文獻(xiàn)和 可用文獻(xiàn)中，描述了多種方法。例如，在Paszkowski et al.，EMBO J. 3 =2717(1984)描述了使用聚乙二醇沉淀導(dǎo) 入 DNA 構(gòu)建體。在 Fromm et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 5824 (1985)中描述了電穿 孔技術(shù)。在 Klein et al.，Nature 327:70-73(1987)中描述了彈道轉(zhuǎn)化技術(shù)(ballistic transformation technique)。其他細(xì)節(jié)可見(jiàn)于上文的Jones禾口 Gamborg禾口美國(guó)專利 5，990，387 號(hào)。可選地，并在一些情況中優(yōu)選地，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括消除和使用二元載體，也在科技文獻(xiàn)上描述得很清楚。參見(jiàn)例 如 Horsch，et al. (1984)Science 233 496 ；Fraleyet al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 4803 ；以及 Hansen and Chilton (1998) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240 21 和 Das (1998)SubcellularBiochemistry 29 :Plant Microbe Interactions,pp. 343-363 中的 綜述。DNA構(gòu)建體任選地與適宜T-DNA側(cè)翼區(qū)組合，并被導(dǎo)入常規(guī)的根瘤農(nóng)桿菌宿主載 體中。若細(xì)胞被細(xì)菌感染，根瘤農(nóng)桿菌宿主的毒力功能會(huì)指導(dǎo)構(gòu)建體和鄰近標(biāo)記直接插入 植物細(xì)胞DNA中。參見(jiàn)美國(guó)專利5591616號(hào)。盡管農(nóng)桿菌主要用于雙子葉植物，但某些單 子葉植物也可被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。例如在美國(guó)專利5，550，318號(hào)描述了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的玉米。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的其他方法包括(1)生根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如Lichtenstein and Fuller (1987) In :Genetic Engineering，vol. 6，PWJ Rigby，Ed.，London, Academic Press ；禾口 Lichtenstein and Draper (1985) In :DMCloning, Vol. II，D. M. Glover, Ed.，Oxford, IRI Press ； 1988年4月7日公開(kāi)的WO 88/02405，描述了生根農(nóng)桿菌株A4及其Ri 質(zhì)粒以及根瘤農(nóng)桿菌載體PARC8或pARC16的用途)，(2)脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝取(參見(jiàn)例 如 Freeman et al. (1984)Plant Cell Physiol. 25 1353),以及(3)漩渦方法(參見(jiàn)例如 Kindle (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)87 1228)。 也可通過(guò)如 Zhou et al. (1983) Me th. Enzymol. 101 433 :D. Hess (1987) Intern Rev. Cvtol. 107 :367、Luo et al. (1988)Plant Mol. Biol. Rep. 6 :165 所沭的將 DNA 盲接 轉(zhuǎn)移至花粉，將DNA導(dǎo)入植物?？赏ㄟ^(guò)如Pena et al. (1987)Nature 325 :274所述的注 射DNA至植物生殖器官，實(shí)現(xiàn)多肽編碼基因的表達(dá)。也可如Neuhaus et al. (1987) Theor. Appl.Genet. 75 30 禾口 Benbrook et al. (1986)in ProceedinRs Bio Expo Butterworth, Stoneham,Mass.，pp. 27-54所述將DNA直接注射至未成熟胚和再水合干燥胚的細(xì)胞中?？?作為載體的多種植物病毒是本領(lǐng)域已知的，包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙粒病毒組、雀麥 草花葉病毒和煙草花葉病毒。轉(zhuǎn)基因棺物的產(chǎn)牛/再牛可培養(yǎng)由上述任意轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以再生擁有轉(zhuǎn)化基因型及其所 需表型的完整植物。這種再生技術(shù)依賴于對(duì)組織培養(yǎng)生長(zhǎng)基中某些植物激素的操作，通常 依賴于與所需核酸共同導(dǎo)入的生物殺滅劑和/或除草劑標(biāo)記。由培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生植物 描述于Payne ；Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag(BerlinHei delberg New York) ；Evans et al. (1983)Protoplasts Isolation and Culture,Handbook of Plant Cell Culture pp. 124-176, Macmillian Pub 1 ishingCompany, New York ；禾口 Binding(1985)Regeneration of Plants, PlantProtoplasts pp. 21-73，CRC Press, Boca Raton中。也可由植物愈傷組織、外植體、體細(xì)胞胚(Dandekar et al. (1989) J. Tissue Cult. Meth. 12 145 ；McGranahan et al. (1990)Plant Cell Rep. 8 512)器官或其部分實(shí) 現(xiàn)再生。在 Klee et al. (1987) Ann. Rev. Plant Phys. 38 467-486 中概要描述了這些再生 技術(shù)。其他細(xì)節(jié)可見(jiàn)于上文的 Payne 和 Jones 和 Weissbach and ffeissbach, eds. (1988) Methods for Plant Molecular BioloRy (植物分子生物學(xué)方法)Academic Press, Inc., San Diego，CA中。這種再生和生長(zhǎng)過(guò)程包括如下步驟選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞和嫩芽，使轉(zhuǎn)化的嫩 芽生根，以及使小苗在土壤中生長(zhǎng)。這些方法適用于本發(fā)明以產(chǎn)生具有按本發(fā)明方法分離 的QTL和其他基因的轉(zhuǎn)基因植物。此外，如Horsch et al. (1985) Science 227 1229-1231 所述，可實(shí)現(xiàn)含有本發(fā)明 多核苷酸的植物的再生，并經(jīng)農(nóng)桿菌導(dǎo)入葉片外植體。在這種程序中，將轉(zhuǎn)化體在存在選 擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)化的植物物種再生嫩芽，如Fraley et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. Α.) 80 :4803所述。這種程序通常在兩至四周內(nèi)產(chǎn)生嫩芽，然后將這 些轉(zhuǎn)化嫩芽轉(zhuǎn)移至適宜誘導(dǎo)生根的含有選擇劑和預(yù)防細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素的培養(yǎng)基中。本發(fā) 明的轉(zhuǎn)基因植物可以是可育或不育的。如本發(fā)明所提供的，植物轉(zhuǎn)化和提供抗病性的多肽表達(dá)并不限于玉米物種。實(shí)際 上，構(gòu)想在玉米中提供所需抗性的多肽，當(dāng)在其他重要的農(nóng)藝和園藝物種中轉(zhuǎn)化和表達(dá)時(shí)， 也會(huì)提供這種抗性。例如，這樣的物種包括大豆、加拿大油菜(canola)、紫花苜蓿、小麥、 向日葵以及高粱。在構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)盒時(shí)，該表達(dá)盒包括例如包含毒力功能的輔助質(zhì)粒和包含外源DNA序列例如結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)?；虿《荆芜x地使用指導(dǎo)核酸在再生植物的任何和所有 組織中表達(dá)的植物啟動(dòng)子片段。組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S轉(zhuǎn)錄 起始區(qū)域，來(lái)源于根瘤農(nóng)桿菌T-DNAWl'-或2'-啟動(dòng)子，和來(lái)自技術(shù)人員已知的各種 植物基因的其他轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。可選地，植物啟動(dòng)子可指導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸在具體組織中 的表達(dá)(組織特異性啟動(dòng)子)或可以是在更精確的環(huán)境控制下(可誘導(dǎo)啟動(dòng)子)。在發(fā)育 控制下的組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括，僅在某些組織例如果實(shí)、種子或花中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的 啟動(dòng)子。 在植物細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的許多啟動(dòng)子中的任何啟動(dòng)子都是適宜的。啟動(dòng)子可以是 組成型的或誘導(dǎo)型的。除上述啟動(dòng)子之外，在植物中運(yùn)轉(zhuǎn)的細(xì)菌源啟動(dòng)子包括，章魚堿合酶 啟動(dòng)子、胭脂堿合酶啟動(dòng)子和來(lái)自天然Ti質(zhì)粒的其他啟動(dòng)子。參見(jiàn)Herrara-Estrella et al. (1983)Nature 303:209。病毒啟動(dòng)子包括花椰菜花葉病毒的35S和19S RNA啟動(dòng)子。 參見(jiàn)Odell etal. (1985) Nature 313 :810。其他植物啟動(dòng)子包括Kunitz胰蛋白酶抑制劑啟 動(dòng)子(KTI)、SCPl、SUP、U⑶3、核酮糖-1，3- 二磷酸羧化酶小亞基啟動(dòng)子以及菜豆蛋白啟動(dòng) 子。也可使用來(lái)自E8基因和其他基因的啟動(dòng)子序列。在Deikman and Fischer (1988)EMBO 1^7 3315中具體描述了 E8啟動(dòng)子的分離和序列。許多其他啟動(dòng)子是目前采用的并可與外 源DNA序列偶聯(lián)，指導(dǎo)核酸的表達(dá)。如果需要由cDNA表達(dá)多肽，則通常在編碼區(qū)域的3’端具有多腺苷酸化區(qū)域。多 腺苷酸化區(qū)域可來(lái)源于天然基因、多種其他植物基因或例如T-DNA。包含來(lái)自編碼表達(dá)產(chǎn)物的基因和本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的序列(例如啟動(dòng)子或編碼區(qū)域) 的載體，通常包括核酸子序列，即賦予植物細(xì)胞可選擇或可選地可篩選表型的標(biāo)記基因。例 如，標(biāo)記可編碼生物殺滅劑耐性，特別是抗生素耐性，例如對(duì)卡那霉素、G418、博來(lái)霉素、潮 霉素的耐性，或除草劑耐性，例如氯磺隆(chlorosulforon)或膦絲菌素(在除草劑雙丙 氨磷(bialaphos)或Basta中的活性成分)耐性。參見(jiàn)例如Padgette et al. (1996) In Herbicide-Resistant Crops(Duke,ed. ),ρρ 53-84,CRC Lewis Publishers,Boca Raton。 例如，通過(guò)將編碼適宜的來(lái)自其他生物體例如微生物的除草劑代謝酶的基因改造進(jìn)作物 中，可賦予作物對(duì)具體除草劑的選擇性。參見(jiàn)例如Vasil (1996) In =Herbicide-Resistant Crops(Duke, ed. ),ρρ 85-91, CRC Lewis Publishers, Boca Raton)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在將重組表達(dá)盒穩(wěn)定并入轉(zhuǎn)基因植物并確認(rèn)可操作之后， 通過(guò)有性雜交可將其導(dǎo)入其他植物中。根據(jù)待雜交的物種，可使用許多標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)中的 任何技術(shù)。在種子繁殖作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)切段獲取或組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖，以 產(chǎn)生多個(gè)相同的植物。選擇所需轉(zhuǎn)基因，獲得新品種，并生長(zhǎng)繁殖，用于商業(yè)用途。在種子 繁殖作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物可以自交以產(chǎn)生純合近交植物。近交植物產(chǎn)生含有新導(dǎo)入 的異源核酸的種子?？膳囵B(yǎng)這些種子，產(chǎn)生會(huì)出現(xiàn)所需表型的植物。由再生植物獲得的部 分，例如花、種子、葉片、分枝、果實(shí)等，包括于本發(fā)明中，只要這些部分含有包含本發(fā)明的分 離的核酸的細(xì)胞。子代和變體，和再生植物的突變體也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要這些部 分包含導(dǎo)入的核酸序列?？赏ㄟ^(guò)例如標(biāo)準(zhǔn)核酸檢測(cè)方法或免疫印跡方案，對(duì)表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的轉(zhuǎn)基因 或基因滲入植物進(jìn)行本發(fā)明核酸傳遞的篩選。可測(cè)定RNA水平的表達(dá)，以鑒定和定量表達(dá) 陽(yáng)性的植物?？墒褂肦NA分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括使用設(shè)計(jì)成僅擴(kuò)增異源或基因滲入的RNA模板的寡核苷酸引物的RT-PCR擴(kuò)增分析和采用標(biāo)記或連鎖QTL特異性探針的溶液雜交分 析。也可分析植物的蛋白表達(dá)，例如通過(guò)使用識(shí)別編碼多肽的抗體的Western免疫印跡分 析(Western immunoblot analysis) 0此外，可分別使用異源核酸特異性多核苷酸探針和 抗體，進(jìn)行符合標(biāo)準(zhǔn)方案的原位雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)，以定位轉(zhuǎn)基因組織內(nèi)的表達(dá)位點(diǎn)。通 常，篩選并入核酸的多個(gè)轉(zhuǎn)基因系，以鑒定和選擇具有最適宜表達(dá)譜的植物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是與添加的異源核酸純合的轉(zhuǎn)基因植物；例如含有兩個(gè) 添加的核酸序列拷貝的轉(zhuǎn)基因植物，例如在同源染色體對(duì)的每條染色體的相同位點(diǎn)處的基 因。通過(guò)使含有單個(gè)添加的異源核酸的雜合轉(zhuǎn)基因植物有性交配(自體受精)，萌發(fā)一些所 產(chǎn)生的種子，并分析獲得的植物，獲得純合的轉(zhuǎn)基因植物，所述獲得的植物因?yàn)楸景l(fā)明的多 核苷酸的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照植物(例如天然非轉(zhuǎn)基因植物)發(fā)生改變而產(chǎn)生。與親代植物的 回交和與非轉(zhuǎn)基因植物的遠(yuǎn)交，可用于將異源核酸基因滲入至所選背景中(例如原種或外 來(lái)玉米系)。MRCV抗件玉米棺物的方法有經(jīng)驗(yàn)的植物育種者可識(shí)別田間中的抗性玉米植物，并選擇抗性個(gè)體或種群用于 育種目的或繁殖。在本文中，植物育種者可識(shí)別“抗性”和“非抗性”，或“易感”玉米植物。這類植物育種從業(yè)者應(yīng)當(dāng)理解，植物抗性是含有極端的抗性、易感性和連續(xù)的中 間抗性表型的表型譜?？剐砸矔?huì)由于環(huán)境影響和病原體感染的嚴(yán)重性而變化。用可再現(xiàn)分 析的表型評(píng)估和抗性評(píng)分方法對(duì)于尋求例如鑒定賦予抗性的基因位點(diǎn)、實(shí)施抗性種群的標(biāo) 記輔助選擇，和采用基因滲入技術(shù)將抗性性狀引入原種玉米系的科學(xué)家是很有價(jià)值的。與將植物歸類為“抗性”或“易感”的偶然的田間觀察相反，已知為植物抗性或易 感性程度評(píng)分的多種系統(tǒng)。這些技術(shù)可用于不同時(shí)間的不同地點(diǎn)，并提供近似的抗性得分， 以用于表征給定植株而無(wú)論生長(zhǎng)條件或位置。本發(fā)明的自動(dòng)檢測(cè)/關(guān)聯(lián)系統(tǒng)在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于檢測(cè)本發(fā)明標(biāo)記和/或使標(biāo)記與所需表型 (例如抗性)關(guān)聯(lián)的自動(dòng)系統(tǒng)。因此，典型系統(tǒng)可包括一組標(biāo)記探針或引物，其經(jīng)配置檢測(cè) 與對(duì)MRCV的新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的至少一個(gè)偏好等位基 因。這些探針或引物經(jīng)配置檢測(cè)本文表格和實(shí)施例所述的標(biāo)記等位基因，例如使用任何可 用的等位基因檢測(cè)模式，例如基于固相或液相陣列的檢測(cè)，基于微流體樣品的檢測(cè)等。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記位點(diǎn)是MZA625、MZA16656、MZA1545U MZA15490、 MZA2038、MZAl 1826和MZA9105或其任意組合，以及任何染色體區(qū)間(i)MZA8381 禾口 MZA18180 ；(ii)MZA4305 和 MZA2803 ；(iii)MZA15490 和 MZA2038 ；(iv)bnlgl458b 和 umcl261a ；(v)bnlgl458b 和 umcl262a ；(vi)bnlgl327 和 umcl261a ；以及(viii) bnlgl327和umcl262a ；或其任意組合，且探針組經(jīng)配置檢測(cè)位點(diǎn)。典型的系統(tǒng)包括經(jīng)配置檢測(cè)由標(biāo)記探針或引物組或其擴(kuò)增子的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)輸出的檢測(cè)器，由此鑒定等位基因的存在或缺失。多種信號(hào)檢測(cè)裝置都是可用的，包括光電倍增管(photo multiplier tubes)、分光光度計(jì)、CCD陣列、陣列和排列掃描儀、掃描檢測(cè)器、光電器和光電二極管、顯微鏡臺(tái)、檢流掃描計(jì)、微流體核酸擴(kuò)增檢測(cè)器具等。檢測(cè)器的準(zhǔn) 確配置將部分取決于用于檢測(cè)標(biāo)記等位基因的標(biāo)記類型，以及用戶最方便獲得的設(shè)備。可 使用檢測(cè)熒光、磷光、放射性、PH、電荷、吸光率、發(fā)光、溫度、磁性等的檢測(cè)器。典型檢測(cè)器的 實(shí)施方案包括光(例如熒光)檢測(cè)器或放射性檢測(cè)器。例如，對(duì)光發(fā)射(例如熒光發(fā)射) 或其他探針標(biāo)記的檢測(cè)可指示標(biāo)記等位基因的存在或缺失。熒光檢測(cè)是特別優(yōu)選的，通常 用于檢測(cè)擴(kuò)增核酸(但是，也可對(duì)擴(kuò)增子實(shí)施涉及其他檢測(cè)方法的上游和/或下游操作)。 通常，檢測(cè)器檢測(cè)由探針標(biāo)記發(fā)射的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志(例如光)，其可指示標(biāo)記等位基因的 存在或缺失。檢測(cè)器任選地監(jiān)測(cè)來(lái)自擴(kuò)增反應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)。例如，檢測(cè)器可監(jiān)測(cè)對(duì)應(yīng)于 “實(shí)時(shí)”擴(kuò)增分析結(jié)果的光學(xué)信號(hào)。使偏好等位基因的存在或缺失與預(yù)期抗性關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)說(shuō)明，也是本發(fā)明的一方 面。例如，該說(shuō)明可包括至少一個(gè)包括偏好等位基因的存在或缺失與預(yù)期新賦予的抗性或 抗性增強(qiáng)之間關(guān)聯(lián)的查詢表。說(shuō)明的精確形式可依據(jù)系統(tǒng)組成而變化，例如它們可作為系 統(tǒng)軟件而存在于系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)集成單元(例如微處理器、計(jì)算機(jī)或計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)) 中，或存在于可與檢測(cè)器關(guān)聯(lián)操作的一個(gè)或多個(gè)單元(例如計(jì)算機(jī)或計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì))中。 如上所述，在一個(gè)典型的實(shí)施方案中，系統(tǒng)說(shuō)明包括至少一個(gè)包括偏好等位基因的存在或 缺失與預(yù)期新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)之間的關(guān)聯(lián)的查詢表。該說(shuō)明還通常包括為系統(tǒng)提供 用戶界面的說(shuō)明，例如以允許用戶瀏覽樣品分析結(jié)果和將參數(shù)輸入系統(tǒng)。系統(tǒng)通常包括用于存儲(chǔ)或傳送表示或指明由本發(fā)明方法檢測(cè)的等位基因的計(jì)算 機(jī)可讀數(shù)據(jù)的部件，例如在自動(dòng)系統(tǒng)中。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括高速緩存、主群組和存儲(chǔ)器和 /或用于存儲(chǔ)計(jì)算機(jī)代碼的其他電子數(shù)據(jù)存儲(chǔ)部件(硬驅(qū)、軟驅(qū)、存儲(chǔ)驅(qū)動(dòng)等)。表示由本 發(fā)明方法檢測(cè)的等位基因的數(shù)據(jù)也可以以收錄在傳送介質(zhì)中的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)信號(hào)在網(wǎng)絡(luò)例 如內(nèi)部網(wǎng)或互聯(lián)網(wǎng)或其組合中進(jìn)行電子、光學(xué)或磁力傳送。系統(tǒng)也可或可選地經(jīng)無(wú)線、IR或 其他可用傳送供選方案來(lái)傳送數(shù)據(jù)。操作期間，系統(tǒng)通常包括待分析樣品，例如植物組織或從組織分離的材料例如基 因組DNA、擴(kuò)增的基因組DNA、cDNA、擴(kuò)增的cDNA、RNA、擴(kuò)增的RNA等。本發(fā)明上下文中的短語(yǔ)“等位基因檢測(cè)/關(guān)聯(lián)系統(tǒng)”是指這樣一個(gè)系統(tǒng)和過(guò)程，在 該系統(tǒng)中，進(jìn)入計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于計(jì)算機(jī)外部的物理客體或物理過(guò)程，例如標(biāo)記等位基 因，該程序在計(jì)算機(jī)內(nèi)使輸入信號(hào)物理轉(zhuǎn)化成不同的輸出信號(hào)。換而言之，輸入數(shù)據(jù)例如 具體標(biāo)記等位基因的擴(kuò)增被轉(zhuǎn)化成輸出數(shù)據(jù)，例如等位基因形式的染色體片段的鑒定。計(jì) 算機(jī)內(nèi)的過(guò)程是一組指令，或“程序”，集成系統(tǒng)通過(guò)它可識(shí)別陽(yáng)性擴(kuò)增或雜交信號(hào)并歸于 基因型個(gè)體樣品。其他程序使個(gè)體樣品的特性與表型值或標(biāo)記等位基因關(guān)聯(lián)，例如統(tǒng)計(jì)方 法。此外，存在用于計(jì)算的多種C/C++程序，用于GUI界面的Delphi和/或Java程序，和 用于作圖或生成有關(guān)等位基因_性狀關(guān)聯(lián)的查詢表的產(chǎn)能工具(例如微軟Excel和/或 SigmaPlot)。本發(fā)明集成系統(tǒng)中的其他可用軟件工具包括，統(tǒng)計(jì)軟件包例如SAS、Genstat、 Mat lab, Mathematica和S_Plus，和基因模型軟件包例如QU-GENE。而且，其他程序語(yǔ)言例 如Visual Basic也適宜用于本發(fā)明集成系統(tǒng)中。例如，指定給從原種系之間雜交遺傳下來(lái)的子代種群的抗性標(biāo)記等位基因值，被記錄在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中，由此建立了使子代種群成員的獨(dú)特標(biāo)識(shí)符與抗性等位基因?qū)?yīng) 的數(shù)據(jù)庫(kù)。適宜用于在計(jì)算機(jī)可讀取介質(zhì)中記錄數(shù)據(jù)的任何文件或文件夾，作為本發(fā)明上 下文中的數(shù)據(jù)庫(kù)，無(wú)論是定制的或商業(yè)可供的(例如來(lái)自O(shè)racle或Sybase)，都是可接受 的。關(guān)于一個(gè)或多個(gè)分子標(biāo)記例如本文所述的ASH、SSR、RFLP、RAP D、AFLP、SNP、同工酶標(biāo) 記或其他標(biāo)記的基因型數(shù)據(jù)，同樣可被記錄在計(jì)算機(jī)可存取數(shù)據(jù)庫(kù)中。任選地，標(biāo)記數(shù)據(jù)的 獲得可使用集成系統(tǒng)，其可自動(dòng)將一個(gè)或多個(gè)方面分析用于測(cè)定標(biāo)記基因型。在這樣的系 統(tǒng)中，對(duì)應(yīng)于分子標(biāo)記的基因型的輸入數(shù)據(jù)是由檢測(cè)器轉(zhuǎn)播的，例如陣列、掃描儀、CCD或直 接提交至可存取入中央處理器的計(jì)算機(jī)可讀取介質(zhì)中的其他檢測(cè)裝置。然后通過(guò)計(jì)算機(jī)裝 置執(zhí)行編碼抗性和本發(fā)明等位基因之間關(guān)聯(lián)的一組系統(tǒng)指令(通常體現(xiàn)為一個(gè)或多個(gè)程 序)以鑒定標(biāo)記等位基因和預(yù)期的性狀表型之間的關(guān)聯(lián)。通常，系統(tǒng)也包括用戶輸入裝置，例如鍵盤、鼠標(biāo)、觸摸屏等(用于例如選擇文件、 檢索數(shù)據(jù)、瀏覽標(biāo)記信息表)，和輸出裝置(例如監(jiān)視器、打印機(jī))用于查看或回收統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含計(jì)算機(jī)或計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的集成系統(tǒng)，該 計(jì)算機(jī)或計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包含具有至少一個(gè)對(duì)應(yīng)于本文標(biāo)記等位基因的數(shù)據(jù)組的一組 文件和/或數(shù)據(jù)庫(kù)。該系統(tǒng)也包括允許用戶選擇性查看一個(gè)或多個(gè)這種數(shù)據(jù)庫(kù)的用戶 界面。此外，標(biāo)準(zhǔn)文檔操作軟件例如word處理軟件(例如Microsoft Word 或Corel WordPerfect )和數(shù)據(jù)庫(kù)或電子表格軟件(例如例如電子表格軟件如微軟Excel 、Corel QuattroPro 或數(shù)據(jù)庫(kù)程序例如微軟Access 或Paradox )可與用戶界面(例如標(biāo)準(zhǔn)操作 系統(tǒng)如Windows、Macintosh、Unix或Linux系統(tǒng)的⑶I)結(jié)合使用，以操作對(duì)應(yīng)于等位基因 或數(shù)據(jù)庫(kù)其他特征的字符串。系統(tǒng)任選地包括樣品操作部件，例如并入機(jī)器人裝置。例如，可任選地將用于將 溶液(例如植物細(xì)胞提取液)從一個(gè)來(lái)源轉(zhuǎn)移至目的地例如從微量滴定板至陣列基質(zhì)的 機(jī)器人液體控制臂，操作連接至數(shù)字計(jì)算機(jī)(或集成系統(tǒng)的其他計(jì)算機(jī))。將數(shù)據(jù)輸入 數(shù)字計(jì)算機(jī)以控制機(jī)器人液體控制臂的高通量液體轉(zhuǎn)移和任選地以控制由臂轉(zhuǎn)移至固相 載體的輸入裝置，也是集成系統(tǒng)的常見(jiàn)特征。許多這種自動(dòng)機(jī)器人流體處理系統(tǒng)是商業(yè) 可供的。例如多種自動(dòng)系統(tǒng)可從Caliper Technologies (Hopkinton，ΜΑ)獲得，其利用不 同Zymate系統(tǒng)，通常包括例如機(jī)器人和流體處理模塊。同樣，用于多種實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的普通 ORCA .機(jī)器人，例如用于微量滴定架操作，也是商業(yè)可供的，例如從Beckman Coulter, Inc. (Fullerton,CA)獲得。作為常規(guī)機(jī)器人的替代方案，用于實(shí)施流體處理和檢測(cè)的微流 體系統(tǒng)是可廣泛獲取的，例如從 Caliper Technologies Corp. (Hopkinton,ΜΑ)禾口 Agilent Technologies (Palo Alto, CA)。用于本發(fā)明分子標(biāo)記分析的系統(tǒng)可因此包括，具有一個(gè)或多個(gè)高通量液體控制軟 件、用于分析來(lái)自標(biāo)記標(biāo)簽數(shù)據(jù)的圖像分析軟件、數(shù)據(jù)解釋軟件的數(shù)字計(jì)算機(jī)，可操作地連 接至數(shù)字計(jì)算機(jī)的用于將溶液從一個(gè)來(lái)源轉(zhuǎn)移至目的地的機(jī)器人液體控制臂，將數(shù)據(jù)輸入 數(shù)字計(jì)算機(jī)以控制機(jī)器人液體控制臂的高通量液體轉(zhuǎn)移的輸入裝置(例如計(jì)算機(jī)鍵盤)， 和任選地可操作地連接至數(shù)字計(jì)算機(jī)的圖像掃描儀，其使來(lái)自與例如固體載體上的標(biāo)記雜 交的標(biāo)記的探針的標(biāo)記信號(hào)數(shù)字化。圖像掃描儀與圖像分析軟件連接，以提供例如與排成 陣列的樣品核酸種群(例如包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記)雜交之后核酸探針標(biāo)記強(qiáng)度的測(cè)量，其中通過(guò)數(shù)據(jù)解釋軟件解釋探針標(biāo)記強(qiáng)度測(cè)量值，以顯示標(biāo)記的探針是否與標(biāo)記核酸(例如 擴(kuò)增標(biāo)記等位基因)雜交，和雜交到什么程度。然后將由此派生的數(shù)據(jù)與樣品特性關(guān)聯(lián)，以 確定具有具體標(biāo)記或等位基因的具體基因型的植物的特性，標(biāo)記或等位基因是例如促成對(duì) 具有涉及農(nóng)藝性能(例如新賦予的抗性或抗性增強(qiáng))的偏好等位基因形式的染色體片段的 玉米植物的標(biāo)記輔助選擇。在本文的任何實(shí)施方案中，可通過(guò)例如數(shù)字化圖像和/或在計(jì)算機(jī)中存儲(chǔ)和分析 圖像，任選地對(duì)光學(xué)圖像，例如由照相機(jī)或其他記錄裝置(例如光電二極管和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝 置)查看(和，任選地記錄)的雜交模式，作進(jìn)一步處理。多種商業(yè)可供的外圍設(shè)備和軟 件可用于數(shù)字化、存儲(chǔ)和分析數(shù)碼視頻或數(shù)碼光學(xué)圖像，例如使用PC(例如基于兼容DOS 、 0S2 , WINDOWS , WINDOWS NT , WINDOWS 95 , WINDOWS 97 , WINDOWS 2000 , WINDOWS XP 或 WINDOWS VISTA 的 Intelx86 或 Pentium 芯片的機(jī)器)，基于 MACINTOSH 、LINUX 或 UNIX (例如SUN 工作站)的計(jì)算機(jī)。
實(shí)施例以下實(shí)施例用于示例說(shuō)明，而不限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所述的實(shí)施例和 實(shí)施方案僅用于示例目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，只要不偏離本發(fā)明實(shí)質(zhì)或所附權(quán) 利要求范圍，可改變多個(gè)試劑或參數(shù)。通過(guò)兩種不同的關(guān)聯(lián)分析方法完成本研究1)基于種群的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)分析和2) 基于系譜的關(guān)聯(lián)分析。通過(guò)鑒定這種遺傳標(biāo)記，標(biāo)記輔助選擇(MAS)可用于提高育種效 能，用于改善玉米MRCV感染抗性。關(guān)聯(lián)作圖是本領(lǐng)域已知的，在多種來(lái)源都有描述，例如 Jorde(2000)Genome Res. 10 1435-1444 ；Remington et al. (2001)"Structure of linkage disequilibriumand phenotype associations in the maize genome,，，Proc Natl Acad Sci USA98 11479-11484 ；Weiss and Clark(2002)Trends Genet. 18 :19-24 ；和 Shu etal. (2003)"Detection Power of Random,Case-Control,禾口Case-Parent ControlDesigns for Association Tests and Genetic Mapping of Complex Traits,，，Proceedings of 15th Annual KSU Conference on Applied Statistics inAgriculture 15 :191_204o實(shí)施例1 關(guān)聯(lián)作圖分析進(jìn)行關(guān)聯(lián)作圖策略，鑒定與MRCV感染抗性相關(guān)的玉米遺傳標(biāo)記，MRCV是“Mai de Rio Cuarto，，的致病劑(causative agent)。關(guān)聯(lián)作圖對(duì)基因組中連鎖不平衡(LD)程度和模式的了解，是發(fā)展有效關(guān)聯(lián)方法以鑒定和 繪制數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)的必要條件。連鎖不平衡(LD)是指在一組個(gè)體中等位基因的非 隨機(jī)關(guān)聯(lián)。若在連鎖位點(diǎn)上的等位基因之間觀察到LD，則測(cè)量為染色體的具體區(qū)域之間的 LD衰退。LD的范圍反映該區(qū)域的重組歷史?；蚪M中LD衰退的平均速度可輔助預(yù)測(cè)進(jìn)行 全基因組關(guān)聯(lián)研究所要求的標(biāo)記的數(shù)量和密度，并提供可預(yù)期的分辨率估計(jì)值。關(guān)聯(lián)或LD作圖旨在鑒定顯著的基因型-表型關(guān)聯(lián)。已經(jīng)開(kāi) 發(fā)出有力工具用 于遠(yuǎn)交物種的精細(xì)作圖，所述遠(yuǎn)交物種例如人(Corder et al. (1994) "Protective effect of apolipoprotein-E type-2 allele for late-onsetAlzheimer-disease,，，N at Genet 7 :180-184 ；Hastbacka et al. (1992) "Linkagedisequilibrium mapping inisolated founder populations :diastrophic dysplasiain Finland,，，Nat Genet 2: 204-211 ；Kerem et al. (1989) "Identification of thecystic fibrosis gene :genetic analysis, "Science 245:1073-1080)和玉米(Remington et al.，(2001) "Structure of linkage disequilibrium and phenotypeassociations in the maize genome,"Proc Natl Acad Sci USA98 11479-11484 ；Thornsberry et al. (2001)"Dwarf8 polymorphisms associatewith variation in flowering time,，，Nat Genet 28 286-289 ；Flint-Garcia et al. (2003) "Structure of linkage disequilibrium in plants,，，Annu Rev Plant Biol. 54 357-374所做的綜述)，其中雜合子之間的重組是頻繁的，且造成LD的快速衰退。 在純合基因型之間的重組通常是可檢測(cè)的近交物種中，LD的程度更大(即更大塊的連鎖標(biāo) 記是共同遺傳的)，且大幅增強(qiáng)關(guān)聯(lián)作圖的檢測(cè)力(Wall and Pritchard(2003)"Haplotype blocks and linkagedisequilibrium in the human genome, " Nat Rev Genet 4: 587-597)。種群的重組和突變歷史是種群交配習(xí)慣以及有效大小和年齡的函數(shù)。更大的種 群大小提供了檢測(cè)重組的更大可能性，而更老的種群通常與更高水平的多態(tài)性相關(guān)，而這 兩者都有助于LD的衰退明顯加速。另一方面，更小的有效種群大小，例如最近經(jīng)歷了遺傳 瓶頸的那些，傾向于表現(xiàn)出更低速率的LD衰退，造成更廣泛的單元型保守(Flint-Garcia et al. (2003) "Structure of linkage disequilibrium in plants,，，Annu Rev Plant Biol. 54 357-374)。 原種育種系為關(guān)聯(lián)分析提供了重要起點(diǎn)。關(guān)聯(lián)分析在分析中使用定量表型得分 (例如將每個(gè)玉米系的疾病耐性分成1-9級(jí))(相對(duì)于僅關(guān)注耐性與組內(nèi)等位基因分布類 型分析中的抗性等位基因頻率分布)。從多年育種程序和大量原種系環(huán)境中收集的詳細(xì)表 型性能數(shù)據(jù)的有效性，為遺傳標(biāo)記關(guān)聯(lián)作圖分析提供了重要的數(shù)據(jù)組。這為研究和應(yīng)用之 間的無(wú)縫整合奠定了基礎(chǔ)，并利用了歷史累積數(shù)據(jù)組。但是，對(duì)多態(tài)性與重組之間關(guān)系的理 解，可用于開(kāi)發(fā)適當(dāng)策略以從這些資源中有效提取最多信息。這種類型的關(guān)聯(lián)分析既不產(chǎn)生也不需要任何圖譜數(shù)據(jù)，而是不依賴圖譜位置。這 種分析將植物表型得分與在各種位點(diǎn)的基因型比較。隨后，任何適宜的玉米圖譜(例如復(fù) 合圖譜)可任選地用于幫助使用之前測(cè)定的標(biāo)記的圖譜位置來(lái)觀察經(jīng)鑒定的QTL標(biāo)記和/ 或QTL標(biāo)記簇的分布。玉米系和表型評(píng)分根據(jù)對(duì)MRCV感染的抗性程度，對(duì)玉米系進(jìn)行表型評(píng)分(相對(duì)于簡(jiǎn)單歸類為 “耐受”或“易感”)。分析所用的植物品種來(lái)自多種來(lái)源，包括原種種質(zhì)，商業(yè)核發(fā)品種 (commercially released cultivar)和其他公共品種。收集物包含475個(gè)玉米系。研究所 用的品系具有較寬的的成熟度范圍，從CRM(對(duì)照相對(duì)成熟度)90-CRM140，表示先鋒種質(zhì)的 主要近交后代。植物對(duì)MRCV感染的抗性程度差異很大，如使用從1 (高度易感)至9 (高度抗性) 所衡量的。通常得分為2 (2)表示最易感植株，得分為4 (4)分指定認(rèn)定植物易感或抗性的閾 值(小于4，易感；4或更高為抗性)，而得分為7 (5-7)指定為最抗性系?？剐缘梅譃? (8) 和9(9)專指非常罕見(jiàn)的、通常在現(xiàn)有種質(zhì)中觀察不到的抗性水平。如果田間中沒(méi)有疾病， 則不作抗性評(píng)分。但是，如果在具體田間位置確實(shí)出現(xiàn)疾病，則對(duì)該位置所有的系都進(jìn)行評(píng)分。在多個(gè)位置和多個(gè)年份中對(duì)檢驗(yàn)植株累積得分，最終的平均(例如共有)得分指定給 每個(gè)品系。在幾個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)中收集了 475個(gè)近交收集物的抗性得分(在生長(zhǎng)季節(jié)的同一時(shí)間 對(duì)394個(gè)近交后代進(jìn)行評(píng)估)。通常在花期之后在一次評(píng)分中進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。 在耐性與標(biāo)記連鎖的評(píng)估中，采用了定量方法，其中評(píng)估了每種玉米的抗性得分 且并入關(guān)聯(lián)作圖統(tǒng)計(jì)分析。玉米基因分型通過(guò)在4000-10000個(gè)基因(基因位點(diǎn))上的DNA測(cè)序?qū)σ唤M475個(gè)玉米系進(jìn)行 了分析。在近交后代之間每個(gè)位點(diǎn)上使用SNP變異產(chǎn)生具體單元型。這些數(shù)據(jù)用于在基因 組水平上鑒定等位基因和MRCV抗性之間的關(guān)聯(lián)。統(tǒng)計(jì)方法采用標(biāo)準(zhǔn)關(guān)聯(lián)作圖方法進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)分析，其中通過(guò)使用標(biāo)記數(shù)據(jù)控制 種群結(jié)構(gòu)。使用Pritchard等開(kāi)發(fā)的基于模型的簇分析軟件Structure，和880個(gè)原種玉 米近交后代在二百個(gè)標(biāo)記上的單元型數(shù)據(jù)，估算混合系數(shù)，并將近交后代分配至七個(gè)亞種 群(J. K. Pritchard, M. Stephensand P. J. Donnelly (2000) "Inference of population structure using multilocusgenotype data，，，Genetics 155 :945_959)。這降低了由 于種群結(jié)構(gòu)對(duì)關(guān)聯(lián)作圖統(tǒng)計(jì)的影響而產(chǎn)生的假陽(yáng)性的發(fā)生。使用檢驗(yàn)兩個(gè)分配是否相 同的Kuiper統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)在給定亞種群中單元型和表型之間的給定標(biāo)記關(guān)聯(lián)(W. H. Press， S. A. Teukolsky, W. Τ. Vetterling, B. P. Flannery, 2002 ；NumericalRecipes in C, second edition, Cambridge University Press, NY)。使用由 Shu 等(Guoping Shu, Beiyan Zeng, and Oscar Smith, 2003 ；Detection Power of Random, Case-Control, and Case-Parent Control Designsfor Association Tests and Genetic Mapping of Complex Traits. Proceedingsof 15th Annual KSU Conference on Applied Statistics in Agriculture. 15 191-204)開(kāi)發(fā)的 GPA，進(jìn)行基 于系譜的關(guān)聯(lián)作圖。GPA程序是以SAS計(jì)算機(jī)語(yǔ)言第9. 0版(2001，SAS Institute, Cary, North Carolina)執(zhí)行的基于條件可能性的作圖軟件。MM表1和2提供了使用關(guān)聯(lián)作圖方法證實(shí)與MRCV表型連鎖不平衡的玉米標(biāo)記列表， 這些標(biāo)記在分離種群上得到驗(yàn)證。表1和2也表明了標(biāo)記所在的染色體和它們相對(duì)于已知 標(biāo)記的大概圖譜位置，以cM表示，并以已知在染色體開(kāi)始端的第一個(gè)標(biāo)記(離著絲粒最遠(yuǎn) 端)的位置為0。這些圖譜位置不是絕對(duì)的，表示估計(jì)的圖譜位置。表6和7提供了對(duì)SNP 標(biāo)記分型所用的引物和探針序列。標(biāo)記等位基因和疾病耐性表型是獨(dú)立分離的統(tǒng)計(jì)概率，反映在表1和2中的關(guān)聯(lián) 作圖調(diào)整概率值中，其是來(lái)自于基因型和表型之間關(guān)聯(lián)分析的概率(P)。概率值越低，在位 點(diǎn)上的標(biāo)記基因型和MRCV感染耐性表型之間的關(guān)聯(lián)越顯著。對(duì)命名為SS組的非結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)分析表明，在染色體2的由標(biāo)記MZA2038(p = 0. 00000266)和 MZA 11826 (ρ = 0. 00000179)表示的位置 65. 99 和由標(biāo)記 ΜΖΑ11806 (ρ = 0. 000002)和ΜΖΑ14212(ρ = 0. 00000327)表示的位置127. 18-131. 13上的兩個(gè)概率峰值的
存在。非結(jié)構(gòu)分析還表明，基因組上的幾個(gè)其他關(guān)聯(lián)。由獨(dú)立方法驗(yàn)證的唯一一致關(guān)聯(lián)，對(duì)應(yīng)于染色體2的位置65. 99。非結(jié)構(gòu)分析增強(qiáng)了評(píng)估靶區(qū)域全體等位基因可變性的能力，但同時(shí)增強(qiáng)了假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)的數(shù)量，因?yàn)榉N群結(jié)構(gòu)不是由該分析校準(zhǔn)的。圖IA顯示了一組阿根廷近交后代(用于阿根廷育種程序的近交后代靶標(biāo))的結(jié) 構(gòu)關(guān)聯(lián)分析，其中在位置65. 99-85. 84區(qū)域上的幾個(gè)標(biāo)記的顯著性在0. 0005p水平，包括 MZA16656 (P = 0. 000194)，MZA18224(p = 0. 000066)和 MZA5057(p = 0. 000045)。圖 IB 顯示 了 SS組的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)分析，其中在染色體2短臂上，最相關(guān)的標(biāo)記是位置54. 62的MZA1525 (ρ =0. 00043)和位置 65. 99 的 ΜΖΑ11826(ρ = 0.00168)。在由標(biāo)記 ΜΖΑ13812 表示的位置 91. 19 (ρ = 0. 000299)和由標(biāo)記 ΜΖΑ10682 表示的位置 154. 06 (ρ = 0. 000024)上觀察到兩 個(gè)其他關(guān)聯(lián)。圖IC顯示了具有不同組表型數(shù)據(jù)的SS組的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)分析。染色體2短臂上的最 相關(guān)標(biāo)記是在位置53. 83的ΜΖΑ12899 (ρ = 0. 000298)。在染色體2長(zhǎng)臂上存在其他關(guān)聯(lián)標(biāo) 記，其中最相關(guān)標(biāo)記是ΜΖΑ1067(圖譜位置141. 9 ;ρ = 0. 000094)和ΜΖΑ10832 (圖譜位置 159. 8 ;ρ = 0.000086)。實(shí)施例2 =QTL區(qū)間作圖和單標(biāo)記回歸分析進(jìn)行QTL區(qū)間作圖和單標(biāo)記回歸分析(single marker regressionanalysis)，以 (分別)鑒定與抗性相關(guān)并實(shí)現(xiàn)玉米對(duì)MRCV感染的植物抗性的玉米染色體區(qū)間和遺傳標(biāo) 記。QTL作圖和標(biāo)記回歸是廣泛應(yīng)用的鑒定與所需表型共分離的基因位點(diǎn)的方法。通過(guò)鑒 定這些基因位點(diǎn)，可使用標(biāo)記輔助選擇(MAS)提高育種效能，用于改善玉米近交后代和雜 種。玉米系由近交后代PH7WT (抗性基因型)及PH3DT (高度易感基因型)和PH9TJ (抗性基因 型)及PH890(易感基因型)的雜交，產(chǎn)生了 MRCV抗性的兩個(gè)主要作圖種群。PH7WTxPH3DT 種群由120個(gè)F5/F7家族組成而PH9TJxPH890由212個(gè)BC2F4/BC2F5家族組成。表型評(píng)分每個(gè)系的表型評(píng)分是基于在兩個(gè)(PH890xPH9TJ雜交)或三個(gè)不同作物季節(jié) (PH7WTxPH3DT)中從田間收集的表型數(shù)據(jù)組。玉米基因分型使用總共246個(gè)多態(tài)和優(yōu)質(zhì)標(biāo)記，對(duì)玉米PH7WTxPH3DT的F5子代進(jìn)行基因分型， 并以167個(gè)多態(tài)和優(yōu)質(zhì)標(biāo)記，對(duì)PH890xPH9TJ的BC2F4子代進(jìn)行基因分型。第一輪基因分 型包括SSR標(biāo)記。對(duì)F7PH7WTxPH3DT子代用一組101個(gè)多態(tài)和優(yōu)質(zhì)標(biāo)記進(jìn)行第二輪基因分 型。通過(guò)使用在具體基因組區(qū)域上的一組標(biāo)記，對(duì)PH890xPH9TJ種群實(shí)施第二輪基因分型。在標(biāo)記回歸分析和QTL區(qū)間作圖中都使用Windows QTLCartographer (根據(jù)QTL 作圖的日期使用該軟件的最新版本)。按照標(biāo)準(zhǔn)QTL作圖程序，在基因組間估計(jì)LOD得分 (優(yōu)勢(shì)比的對(duì)數(shù))。術(shù)語(yǔ)“優(yōu)勢(shì)可能性(likelihood of odds)”用于描述性狀變異來(lái)源的兩 種或多種解釋的相對(duì)概率。這些兩種不同解釋(模型)的概率是可以計(jì)算的，并是所選的 最可能的模型。如果模型A比模型B更可能1000倍，則優(yōu)勢(shì)比值是1000 1而優(yōu)勢(shì)比的 對(duì)數(shù)是3。個(gè)體復(fù)制和年份以及平均得分的原始數(shù)據(jù)都用于QTL區(qū)間作圖。LOD閾值是2. 5。 為每個(gè)QTL估算置信區(qū)間。然后將獲得的位置繪制成重疊區(qū)間作形的柱狀圖。
MM.QTL區(qū)間作圖
本研究鑒定了與QTL相關(guān)的多個(gè)染色體區(qū)間，且所述QTL與MRCV感染的抗性/易 感性關(guān)聯(lián)。使用田間數(shù)據(jù)鑒定QTL。一個(gè)主要、顯著的QTL位于兩個(gè)作圖雜交種的連鎖群2 上(參見(jiàn)圖12-14，也可參見(jiàn)表13，其顯示了對(duì)PH890xPH9TJ雜交的QTL標(biāo)記回歸分析)。 在連鎖群5上的位置150－160鑒定了第二個(gè)QTL(PH890*PH9TJ種群)二另一個(gè)在連鎖群5上的位置200－220(PH7WT*PH3DT種群).第三個(gè)QTL繪制與染色體2的位置165-1850 的 PH7WTxPH3DT 上。單標(biāo)記回歸使用單標(biāo)記回歸，如表1和2所示，有多個(gè)標(biāo)記都表現(xiàn)出在P = 0. 05或更高置信 水平上與抗性表型關(guān)聯(lián)。在標(biāo)記回歸分析中鑒定的一些標(biāo)記表現(xiàn)出關(guān)觀察結(jié)果與關(guān)聯(lián)作圖 一致，其中以不同方法鑒定相同標(biāo)記。例如，在染色體2的55-70cM區(qū)域存在由標(biāo)記回歸和 關(guān)聯(lián)作圖所鑒定的標(biāo)記。討論/結(jié)論本研究鑒定了與MRCV抗性相關(guān)的染色體區(qū)間和單個(gè)標(biāo)記。位于這些區(qū)間內(nèi)的標(biāo) 記可用于MAS，以及其他目的。實(shí)施例3 通過(guò)標(biāo)記輔助選擇的QTL驗(yàn)證進(jìn)行QTL區(qū)間作圖和單標(biāo)記回歸分析，以(分別)鑒定與抗性相關(guān)并實(shí)現(xiàn)對(duì)MRCV 感染的抗性的玉米染色體區(qū)間和遺傳標(biāo)記。QTL作圖和標(biāo)記回歸是廣泛應(yīng)用的鑒定與所需 表型共分離的基因位點(diǎn)的方法。通過(guò)鑒定這些基因位點(diǎn)，可使用標(biāo)記輔助選擇(MAS)提高 育種效能，用于改善玉米近交后代和雜種。玉米系由近交后代PH7WT和PH3DT的雜交產(chǎn)生用于MRCV抗性驗(yàn)證和作圖的一主要種群。 生成其他種群以驗(yàn)證該QTL在背景中的作用。PH7WTxPH3DT種群由82個(gè)通過(guò)繪制在染色 體2上的QTL標(biāo)記基因滲入至PH3DT生成的BC2F3家族組成。存在由標(biāo)記輔助選擇生成的 4個(gè)其他BC1F3種群，其由來(lái)自PH6KWxPH7WT雜交的24個(gè)BC1F3、來(lái)自PH6B8xPH7WT雜交的 12 個(gè) BC1F3、來(lái)自 PHP3PlxPH7WT 雜交的 3 個(gè) BC1F3 和來(lái)自 PH6GFxPH7WT 雜交的 6 個(gè) BC1F3 組成。這些種群通過(guò)具體BC3或BCl植物自交生成并衍生在QTL區(qū)域具有等位基因變異的 BC3F3或BC1F3而產(chǎn)生。表型評(píng)分每個(gè)BC1F3，BC3F3和親代的表型評(píng)分是基于在一個(gè)作物季節(jié)中從田間收集的表 型數(shù)據(jù)組。玉米基因分型采用在QTL區(qū)域的多態(tài)SNP，對(duì)來(lái)自不同雜交的玉米BC1F2子代和來(lái)自 PH7WTxPH3DT雜交的BC3F3進(jìn)行基因分型。在BC3階段對(duì)BC3F3進(jìn)行背景清洗，特別是在染 色體5QTL。標(biāo)記包括SNP標(biāo)記。在標(biāo)記回歸分析和QTL區(qū)間作圖中都使用Windows QTLCartographer (根據(jù)QTL 作圖的日期使用最新版本)。按照標(biāo)準(zhǔn)QTL作圖程序在基因組上估計(jì)LOD分(優(yōu)勢(shì)比的對(duì) 數(shù))。個(gè)體復(fù)制和平均得分的原始數(shù)據(jù)都用于QTL作圖。LOD閾值是2. 5。為每個(gè)QTL 估算置信區(qū)間。然后將獲得的位置繪制成重疊區(qū)間作形的柱狀圖。因?yàn)橛蓸?biāo)記輔助選擇生成這些種群(重組的非隨機(jī)事件)，因而標(biāo)記回歸分析被認(rèn)為與區(qū)間作圖分析一樣有效。結(jié)果QTL區(qū)間作圖本研究鑒定了與QTL相關(guān)的單個(gè)染色體區(qū)間，且所述QTL與對(duì)MRCV感染的抗性/易感性相關(guān)。使用田間數(shù)據(jù)鑒定QTL。一個(gè)主要顯著的QTL位于主要驗(yàn)證BC3F3種群的連鎖群2上。在其他BC1F3子代檢查時(shí)，主要驗(yàn)證種群的這個(gè)QTL上的主要標(biāo)記證實(shí)該QTL 對(duì)于MRCV感染的抗性/易感性的作用。單標(biāo)記回歸使用單標(biāo)記回歸，如表1和2所示，存在多個(gè)標(biāo)記，其在P = 0. 05或更高置信水平 上都表現(xiàn)出與抗性表型關(guān)聯(lián)。在標(biāo)記回歸分析中鑒定的一些標(biāo)記表現(xiàn)出觀察結(jié)果與關(guān)聯(lián)作 圖一致，其中不同方法鑒定相同標(biāo)記。例如，在染色體2的55-70cM區(qū)域存在標(biāo)記回歸和關(guān) 聯(lián)作圖所鑒定的標(biāo)記。對(duì)于PH3DTxPH7WT雜交，參見(jiàn)圖2的區(qū)間作圖和表14的標(biāo)記回歸分 析。注意復(fù)制#3受除草劑應(yīng)激的作用。MRCVSC = MRCV表型得分。Inc. Sev. Symp.=在每 個(gè)實(shí)驗(yàn)單元中具有嚴(yán)重癥狀的植物的頻率。
通過(guò)來(lái)自在MRCV1區(qū)域具有等位基因變異的BC1F3子代的表型數(shù)據(jù)，評(píng)估數(shù)據(jù)，評(píng)估了MRCV1等位基因變異對(duì)幾個(gè)背景的作用。MRCV1抗性等位基因顯示了在其他4個(gè)遺傳背景的正作用(PH6GF、PHP3P1、PH6B8和PH6KW近交后代)。下表15顯示了在MRCVl區(qū)域具有等位 基因變異的BC1F3子代的平均表型得分。表 15 討論/結(jié)論本研究鑒定了與MRCV抗性相關(guān)的染色體區(qū)間和單個(gè)標(biāo)記。位于這些區(qū)間內(nèi)的標(biāo) 記可用于MAS，以及其他目的。實(shí)施例4 對(duì)DH近交系群的QTL驗(yàn)證進(jìn)行QTL標(biāo)記回歸分析，以(分別)鑒定與抗性相關(guān)并實(shí)現(xiàn)對(duì)MRCV感染的抗性的 玉米染色體區(qū)間和遺傳標(biāo)記。QTL作圖和標(biāo)記回歸是廣泛應(yīng)用的鑒定與所需表型共分離的 基因位點(diǎn)的方法。通過(guò)鑒定這些基因位點(diǎn)，可使用標(biāo)記輔助選擇(MAS)提高育種效能，用于 改善玉米近交后代和雜種。玉米系標(biāo)記增強(qiáng)型系譜選擇(markerenhanced pedigree selection，MEPS)種群是育種 種群示意圖，MRCV抗性種群由不同近交后代的雜交形成。雜交包括a)具有固定MRCVl的 雜交PHKEFxPHBNA、PHKEFxPHS2G、PHKFDxPHS3J、PHKFAxPHBNA、PHKFAxPHKEF、PHS2YxPHKEF， 和 b)具有分離 MRCVl 的雜交PH3DTxPHKEF、PHKEFxPH9PR、PHKEFxPH9PR、PHKEFxPHKDK、 PHKDNxPHKFD、PHKDNxPHS3J, PHKFDxPHCOG、PHKDKxPHKFA、PHKDNxPH9PH。表16 通過(guò)重雙單倍體過(guò)程生成這些種群。表16中包括一定數(shù)量的具有MRCV抗性特征 的個(gè)體。使用在主要QTL區(qū)域的指紋數(shù)據(jù)和血統(tǒng)同一性信息以確定QTL分離和QTL固定的 種群。表型評(píng)分每個(gè)DH MEPS種群的表型評(píng)分是基于在一個(gè)作物季節(jié)中從田間收集的表型數(shù)據(jù)組。玉米基因分型使用分布在玉米基因組中的一組756個(gè)SNP，對(duì)來(lái)自不同雜交的玉米DH子代進(jìn)行 基因分型。然后將獲得的位置繪制成與區(qū)間作形重疊的柱狀圖。結(jié)果
QTL區(qū)間作圖若來(lái)自SS雜交抗性χ易感(Resistant χ Susceptible)并在染色體2上的MRCV 主要QTL分離被選擇為“先驗(yàn)(priori) ”2時(shí)，本研究鑒定了與QTL相關(guān)的單個(gè)主要染色體 區(qū)間，所述QTL與對(duì)MRCV感染的抗性/易感性相關(guān)，。使用田間數(shù)據(jù)鑒定QTL。一個(gè)主要顯 著的QTL位于連鎖群2上。在染色體2上含有主要QTL的陽(yáng)性等位基因(由親代固定QTL) 的近交后代之間的遺傳雜交顯示了大部分子代具有4或更高的田間MRCV得分。單標(biāo)記回歸使用單標(biāo)記回歸，如表1和2所示，有多個(gè)標(biāo)記在P = 0. 05或更高置信水平上表現(xiàn) 出與抗性表型關(guān)聯(lián)。在標(biāo)記回歸分析中鑒定的一些標(biāo)記表現(xiàn)出觀察結(jié)果與關(guān)聯(lián)作圖一致， 其中不同方法鑒定相同標(biāo)記。例如，在染色體2的55-70cM區(qū)域存在由標(biāo)記回歸和關(guān)聯(lián)作圖鑒定的標(biāo)記。在一組SS近交后代中，主要關(guān)聯(lián)位于MZA10538標(biāo)記(位置54. 5)上。在 一組NSS近交后代中，主要關(guān)聯(lián)位于72cM的位置。討論/結(jié)論本研究鑒定了與MRCV抗性關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)間和單個(gè)標(biāo)記。位于這些區(qū)間內(nèi)的標(biāo) 記可用于MAS，以及其他目的。實(shí)施例5 主要的近交后代表征對(duì)一組關(guān)鍵阿根廷遺傳材料進(jìn)行表型和基因型表征，以驗(yàn)證與MRCV抗性相關(guān)的 玉米遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。通過(guò)鑒定這些遺傳標(biāo)記，可使用標(biāo)記輔助選擇(MAS)提高育種效能，用 于改善玉米的MRCV抗性。玉米系和抗件評(píng)分分析所用的植物品種來(lái)自于多種來(lái)源，包括原種種質(zhì)、商業(yè)核發(fā)品種和代表寬范 圍的與阿根廷育種程序相關(guān)的種質(zhì)并包括MRCV抗性的主要來(lái)源的其他公共系。根據(jù)對(duì)MRCV感染的表型反應(yīng)，對(duì)玉米系分組，進(jìn)行分析，其中植物被劃分為高度 易感或高度抗性品種?？剐院鸵赘械臍w類僅基于在幾年的田間檢驗(yàn)中對(duì)偶爾且天然發(fā)生疾 病的發(fā)病率的觀察結(jié)果。植物對(duì)MRCV感染的抗性程度差異很大，如使用從1 (高度易感) 至9(高度耐受)的等級(jí)所衡量的。通常得分為2 (2)表示最易感植株，得分為4(4)被指定 為認(rèn)定植物易感或抗性的閾值(小于4，易感；4或更高為抗性)而得分為7 (5-7)指定為最 抗性品系?？剐缘梅譃? (8)和9 (9)專指非常罕見(jiàn)的通常在現(xiàn)有種質(zhì)中觀察不到的抗性水 平。如果田間中沒(méi)有疾病，則不作抗性評(píng)分。但是，如果在具體田間位置確實(shí)出現(xiàn)疾病，則 對(duì)該位置所有系都進(jìn)行評(píng)分。在多個(gè)位置和多個(gè)年份中對(duì)檢驗(yàn)植株累積得分，最終的平均 得分(例如共有)被分配給每個(gè)系。通常，在一次評(píng)分時(shí)間中完成數(shù)據(jù)收集。評(píng)分時(shí)間在花期之后。評(píng)估抗性與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)中，使用了單回歸方法的對(duì)比。通過(guò)血統(tǒng)同一性方式檢查 等位基因起源。使用這種方法，這些被認(rèn)定為代表抗性或易感類別的玉米系被用于評(píng)估關(guān) 聯(lián)。構(gòu)建了抗性系列表，其中具有4或更高的抗性得分的近交后代被認(rèn)定為“抗性”。同樣， 具有3或更低分的玉米系都被認(rèn)定為易感。僅使用可被確定置入兩個(gè)組中的系。一旦一個(gè) 系被歸入“抗性”或“易感”組，其作為該組的等同物被處理。實(shí)際定量分級(jí)也用于關(guān)聯(lián)檢 驗(yàn)。除該檢驗(yàn)之外，血統(tǒng)同一性信息也用于證實(shí)在最相關(guān)標(biāo)記中抗性等位基因的起源。在研究中，鑒定了在表型譜中認(rèn)為是抗性的85個(gè)玉米系；這些植物形成“抗性” 組。此外，鑒定了被判斷為易感MRCV的35個(gè)玉米系；這植株形成“易感”組。玉米基因分型使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，用跨越染色體2的QTL區(qū)域的一組63個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)每個(gè) 耐受和易感系進(jìn)行基因分型?；蚍中头桨赣墒占廴~組織并從每個(gè)近交的混合組織中分 離基因組DNA 組成。通過(guò)如 Maroof etal. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81 :8014_8018 所述的CTAB方法，提取玉米基因組DNA。將分離的基因組DNA用在使用對(duì)涵蓋QTL區(qū)域的大量標(biāo)記具有特異性的擴(kuò)增引物 的PCR反應(yīng)中。使用ASH方案對(duì)SNP型標(biāo)記進(jìn)行基因分型?；镜倪壿嬍牵诳剐院鸵赘薪M之間具有明顯不同等位基因分布(即非隨機(jī)分 布)的標(biāo)記，可能與性狀相關(guān)，并出于標(biāo)記輔助選擇具有之前未表征或表征的MRCV抗性或易感性的玉米系的目的，可用來(lái)對(duì)它們進(jìn)行分離。本分析檢測(cè)了一次檢查一個(gè)標(biāo)記并測(cè)定了在抗性組內(nèi)部的等位基因分布是否明顯不同于易感組內(nèi)的等位基因分布。該分析將植物 表型得分與靶位點(diǎn)基因型進(jìn)行了比較。MM表1和2列舉了表現(xiàn)出與MRCV抗性/易感性表型連鎖不平衡的玉米標(biāo)記。這些 表也表明，標(biāo)記所在位置和它們相對(duì)于已知標(biāo)記的大概圖譜位置，以cM表示，并以已知在 染色體開(kāi)始端的第一個(gè)標(biāo)記(離著絲粒最遠(yuǎn)端)的位置為0。這些圖譜位置不是絕對(duì)的，表 示估計(jì)的圖譜位置。標(biāo)記等位基因和耐性表型獨(dú)立分離的統(tǒng)計(jì)概率反應(yīng)在調(diào)整概率值中。表6和7提供了這些標(biāo)記位點(diǎn)定型所用的PCR引物序列。抗性和易感植物組之間的等位基因在表1和2的各種標(biāo)記位點(diǎn)的非隨機(jī)分布很好 地證明了，影響MRCV抗性的QTL與這些標(biāo)記位點(diǎn)連鎖?？紤]到大部分該組的近交后代對(duì)應(yīng) 于具體育種程序(阿根廷育種程序)，可以預(yù)期的是，申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)與在該基因的側(cè)翼區(qū)域 的其他標(biāo)記連鎖不平衡。最相關(guān)的標(biāo)記對(duì)應(yīng)于之前認(rèn)為的優(yōu)選標(biāo)記。如本領(lǐng)域公知的，靶標(biāo)記與感興趣性狀的關(guān)聯(lián)水平，可通過(guò)在具體組遺傳材料中 靶區(qū)域的連鎖不平衡水平來(lái)測(cè)定。下表17顯示了 SNP標(biāo)記的基因型數(shù)據(jù)和對(duì)MRCV的反應(yīng) 之間靶區(qū)域的關(guān)聯(lián)水平。表17 為評(píng)估在雜交水平上該QTL的等位基因變異的作用，根據(jù)來(lái)自親代系的一個(gè)(QTL 雜合的)或兩個(gè)抗性等位基因(QTL純合的)的存在，表征一組371個(gè)雜種(異源遺傳背 景)。在雜種組合中，觀察到在主要QTL的抗性等位基因的正作用和加成作用；未觀察到母 體作用。下表18顯示了在主要QTL具有不同基因型的雜種的田間性能。表 18 存在多種方式使用本分析提供的信息發(fā)展改良的玉米品種。一種應(yīng)用是使用相關(guān) 標(biāo)記(或更基于更高概率截?cái)嘀?作為具體種群作圖QTL的候選者，該種群對(duì)于具有MRCV 感染耐性的植物而言是分離的。在該應(yīng)用中，在分離種群中繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)QTL作圖，但關(guān)注 與MRCV感染耐性相關(guān)的標(biāo)記，以替代使用跨越整個(gè)基因組的標(biāo)記。通過(guò)大幅降低項(xiàng)目所涉 及的實(shí)驗(yàn)室資源，使得作圖努力具有更高性價(jià)比。例如，替代用跨越整個(gè)基因組的一大組標(biāo) 記篩選分離種群，僅用在等位基因關(guān)聯(lián)研究中滿足一定統(tǒng)計(jì)截?cái)嗟哪菐讉€(gè)標(biāo)記篩選。這不 僅會(huì)降低作圖成本還可清除在大組標(biāo)記中不可避免會(huì)出現(xiàn)的假性。在任何給定雜交中，可 能僅有一小組關(guān)聯(lián)標(biāo)記實(shí)際上是與對(duì)MRCV感染的耐性相關(guān)。一旦在任何耐受親代中鑒定 了幾個(gè)相關(guān)標(biāo)記，以后的標(biāo)記輔助選擇(MAS)努力就可僅關(guān)注對(duì)耐性來(lái)源至關(guān)重要的那些 標(biāo)記。通過(guò)經(jīng)MAS預(yù)選擇具有與耐性相關(guān)的等位基因的系，可清除非期望的易感系，并將昂 貴的田間檢驗(yàn)資源集中于具有更高的抗MRCV感染概率的品系。實(shí)施例6 對(duì)F3育種種群的QTL評(píng)估標(biāo)記關(guān)聯(lián)是廣泛使用的鑒定與所需表型共分離的基因位點(diǎn)的方法。通過(guò)鑒定這些 基因位點(diǎn)，可使用標(biāo)記輔助選擇(MAS)提高育種效能，用于改善玉米近交后代和雜種。玉米系舊的育種方案是以使Fl雜交并衍生出幾個(gè)自交世代(F2、F3、F4等)的基于傳統(tǒng) 系譜的方法為基礎(chǔ)的。為了在具體阿根廷育種材料組中檢驗(yàn)在主要QTL上的陽(yáng)性和陰性 等位基因?qū)RCV抗性的重要性，步驟如下a)選擇預(yù)期其抗性是基于主要MRCVl的抗性親 代；b)選擇源于多個(gè)育種雜交的總計(jì)2372個(gè)F3家族；c)制成兩組F3族，第一組，基于不具 有主要QTL陽(yáng)性等位基因的親代之間的雜交，第二組具有雙方親代都在主要QTL上含有陽(yáng)性等位基因。使用在主要QTL區(qū)域的指紋數(shù)據(jù)和血統(tǒng)同一性信息以確定QTL分離和QTL固 定種群(陽(yáng)性/陰性)。MZA16656和/或側(cè)翼標(biāo)記是確定MRCVl陽(yáng)性等位基因存在的關(guān)鍵標(biāo)記。位于這些組中的總個(gè)體數(shù)量是2372。使用在主要QTL區(qū)域的指紋數(shù)據(jù)和血統(tǒng)同一 性信息以確定QTL分離和QTL固定種群。表型評(píng)分每個(gè)F3種群的表型評(píng)分是基于在一個(gè)作物季節(jié)中從田間收集的表型數(shù)據(jù)組。玉米基因分型個(gè)體F3族不進(jìn)行基因分型。根據(jù)親代雙方的具體等位基因估計(jì)每個(gè)F3個(gè)體在主 要QTL的基因型。如果具體F3種群中親代雙方在MRCVl含有陽(yáng)性等位基因，則來(lái)自該雜交 的所有子代都被認(rèn)為具有陽(yáng)性等位基因。如果具體F3種群中親代雙方在MRCVl含有陰性等 位基因，則來(lái)自該雜交的所有子代都被認(rèn)為具有陰性等位基因。將標(biāo)準(zhǔn)軟件用于標(biāo)記ANOVA 分析。MMQTL標(biāo)記分析本研究支持以下結(jié)論當(dāng)“先驗(yàn)”選擇來(lái)自在染色體2上的MRCV主要QTL固定的 的雜交的種群時(shí)，主要染色體區(qū)間與QTL相關(guān)，該QTL與對(duì)MRCV感染的抗性/易感性相關(guān)。單標(biāo)記ANOVA使用單標(biāo)記AN0VA，如表1和2所示，有許多標(biāo)記都在P = 0. 05或更高置信水平上 表現(xiàn)出與耐性表型關(guān)聯(lián)。在標(biāo)記ANOVA分析中鑒定的一些標(biāo)記表現(xiàn)出觀察結(jié)果與關(guān)聯(lián)作圖 的一致，其中不同方法鑒定相同標(biāo)記。例如，在染色體2的55-70cM區(qū)域存在由標(biāo)記回歸和 關(guān)聯(lián)作圖都鑒定出的標(biāo)記。討論/結(jié)論本研究已鑒定了與MRCV抗性相關(guān)的染色體區(qū)間和單個(gè)標(biāo)記。位于這些區(qū)間內(nèi)的 標(biāo)記可用于MAS，以及其他目的。在該實(shí)施例中，申請(qǐng)人評(píng)估了對(duì)在MRCVl上等位基因變異 的MRCV抗性的作用，在該等位基因變異和在大量F3子代的預(yù)期表型之間存在清楚的關(guān)聯(lián)。下表19顯示了模型的F檢驗(yàn)，其中來(lái)源(Source)是QTL，并考慮兩個(gè)水平的來(lái)源 水平AA:在靶區(qū)域(位置65. 99或由側(cè)翼標(biāo)記推斷)具有固定的易感等位基因的F3種群， 和水平BB 在靶區(qū)域(位置65. 99或由側(cè)翼的標(biāo)記推斷)具有固定的抗性等位基因的F3種 群。表 19 S=L 094 ；R-Sq = 36. 87% ；R-Sq(adj) = 36. 84%參照符DF 自由度；SS 平方和；MS 方差；F =F值；P 概率值。下表20顯示了平均檢驗(yàn)，其中水平AA和水平BB代表靶QTL上的等位基因變異并 符合表19所包括的模型。水平AA表型均值是3. 42 (MRCV易感類別)而水平BB表型均值 是5. 138(MRCV抗性類別)。表 20 混合StDev = 1. 094參照符N :F3族數(shù)量；Mean 每個(gè)水平的表型均值；StDev 標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)施例7 高分辨率遺傳作圖和近_等基因系(near-isogenic line)通過(guò)純合重組植物的子代檢驗(yàn)，進(jìn)行高分辨率遺傳作圖，用于MRCV抗性基因的高 分辨率定位。進(jìn)行QTL區(qū)間作圖和單標(biāo)記回歸分析，以(分別)鑒定與抗性相關(guān)并增強(qiáng)對(duì) MRCV感染的抗性的玉米染色體區(qū)間和遺傳標(biāo)記。QTL作圖和標(biāo)記回歸是廣泛應(yīng)用的鑒定與 所需表型共分離的基因位點(diǎn)的方法。通過(guò)鑒定這些基因位點(diǎn)，可使用標(biāo)記輔助選擇(MAS) 提高育種效能，用于改善玉米近交后代和雜種。玉米系用于MRCV高分辨率遺傳作圖的一個(gè)主要種群是由近交后代PH7WT和PH3DT的雜 交產(chǎn)生的。另一用于在獨(dú)立來(lái)源中精細(xì)作圖的種群是由近交后代PH9TJ和PH890的雜交產(chǎn) 生的。PH7WTxPH3DT種群由256個(gè)BC5F3家族組成，該家族由自交和從在染色體2的50_80cM 區(qū)域含有雜合片段的總共3000個(gè)BC5植物中固定所選的重組BC5植物產(chǎn)生。該策略允許 整個(gè)QTL區(qū)域的重組體的覆蓋(表7和8，和圖4A和圖4B)。PH9TJxPH890種群由245個(gè) BC3F3家族組成，其由以下生成a)將所選的在染色體2和5的主要QTL是純合的BC2F4植 物與PH890(易感親代)雜交；b)產(chǎn)生兩個(gè)自交世代以促進(jìn)固定的BC3F3家族。表21顯示了由雜交PH3DTxPH7WT產(chǎn)生的BC5F3重組數(shù)量。也包括每個(gè)標(biāo)記區(qū)間 的預(yù)期Kb大小。表22顯示了由雜交PH3DTxPH7WT產(chǎn)生的BC5F3重組數(shù)量。包括與基因含 量的第一估計(jì)值的比較。
具體重組體而產(chǎn)生的。通過(guò)使在優(yōu)選標(biāo)記區(qū)含有雜合片段的個(gè)體BC5F2植物的自交，衍生 出陰性或陽(yáng)性近-等基因系，而QTL被認(rèn)為是單個(gè)孟德?tīng)栆蜃?。表型評(píng)分來(lái)自PH7WTxPH3DT雜交的每個(gè)BC5F3家族和來(lái)自PH9TJxPH890雜交和親代的245 個(gè)BC3F3家族的表型評(píng)分，是基于在一個(gè)作物季節(jié)中從田間(在自然感染下的田間試驗(yàn)，科 爾多瓦省(C0rdoba Province)，阿根廷)收集的表型數(shù)據(jù)組。除表型評(píng)分之外，在優(yōu)選標(biāo)記區(qū)的具體等基因系由在阿根廷布宜諾斯艾利斯進(jìn)行 的病毒ELISA檢驗(yàn)表征。玉米基因分型使用在染色體2QTL區(qū)域上的多態(tài)SNP，對(duì)來(lái)自PH7WTxPH3DT雜交的玉米BC5F3子 代和來(lái)自PH9TJxPH890雜交的BC3F3進(jìn)行基因分型(參見(jiàn)實(shí)施例2)。此外，設(shè)計(jì)了兩個(gè)CAPS 標(biāo)記以用于對(duì)BC5F3子代的基因分型；將這兩個(gè)CAPS標(biāo)記定位于區(qū)間MZA9105-MZA18224。 如果是PH9TJxPH890雜交，其他標(biāo)記位于染色體5的QTL上。在BC3階段對(duì)來(lái)自PH7WTxPH3DT 雜交的BC5F3進(jìn)行背景清洗，特別是在染色體5QTL。在BC2階段對(duì)來(lái)自PH9TJxPH890雜交 的BC3F3進(jìn)行背景清洗。在標(biāo)記回歸分析和QTL區(qū)間作圖中都使用Windows QTLCartographer (根據(jù)QTL 作圖的日期使用最新版本)。按照標(biāo)準(zhǔn)QTL作圖程序，在靶區(qū)域上估計(jì)LOD得分(優(yōu)勢(shì)比的 對(duì)數(shù))。將平均得分用于QTL區(qū)間作圖。LOD閾值是2. 5。為每個(gè)QTL估算置信區(qū)間。然 后將獲得的位置繪制成與區(qū)間作形重疊的柱狀圖。因?yàn)橛蓸?biāo)記輔助選擇產(chǎn)生這些種群(重組的非隨機(jī)事件)，因而標(biāo)記回歸分析被 認(rèn)為與區(qū)間作圖分析一樣有效。MMQTL區(qū)間作圖本研究鑒定了與QTL相關(guān)的單個(gè)染色體區(qū)間，且所述QTL與對(duì)MRCV感染的抗性 /易感性相關(guān)。使用田間數(shù)據(jù)鑒定QTL。一個(gè)主要顯著的QTL位于來(lái)自PH7WTxPH3DT和 PH9TJxPH890雜交的高分辨率作圖種群的“優(yōu)選標(biāo)記”位置上的連鎖群2。來(lái)自PH9TJxPH890 雜交的染色體5上的其他QTL在本分析中不明顯。單標(biāo)記回歸使用單標(biāo)記回歸，如表23和24所示，有多個(gè)標(biāo)記都在P = 0. 05或更高置信水平上表現(xiàn)出與抗性表型關(guān)聯(lián)。在標(biāo)記回歸分析中鑒定的一些標(biāo)記顯示了靶QTL的高分辨率基 因位置，這與優(yōu)選的標(biāo)記的位置一致。參見(jiàn)表23為標(biāo)記回歸分析(MRCVSC = MRCV表型分) 和圖5為PH7WTxPH3DT雜交的區(qū)間作圖。對(duì)于PH9TJxPH890雜交在染色體2和5的具體 QTL上的QTL標(biāo)記回歸(MRCVSC = MRCV表型得分)參見(jiàn)表24，和對(duì)于PH7WTxPH3DT雜交的 區(qū)間作圖，參見(jiàn)圖6。表 23
因型(陰性等基因系=易感單元型；陽(yáng)性等基因系=抗性單元型)；基因滲入的片段是由 MZA16656-19-A至MZA9105-8-A的標(biāo)記處的SNP多態(tài)所代表，而側(cè)翼單態(tài)標(biāo)記MZA625-30-A 和MZA18224-801-A代表在兩個(gè)近等基因系上的易感單元型。病毒的ELISA檢驗(yàn)(來(lái)自布宜諾斯艾利斯省的樣品)顯示了在含有抗性等位基因的等基因系中0%的植物是病毒陽(yáng)性， 而在含有易感性等位基因的等基因系中，38%的植物是病毒陽(yáng)性。
表明了植物中存在病毒。討論/結(jié)論本研究鑒定了與MRCV抗性關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)間和個(gè)體標(biāo)記。位于這些區(qū)間內(nèi)的標(biāo) 記可用于MAS，以及其他目的。高分辨率基因定位促進(jìn)了靶QTL的克隆。實(shí)施例8 基因定位、測(cè)序和候選基因整合優(yōu)選標(biāo)記區(qū)的測(cè)序、基因和物理信息，以表征靶區(qū)域。來(lái)自獨(dú)立方法的信息 (重組數(shù)據(jù)、關(guān)聯(lián)分析和保守片段)用于鑒定生成其他測(cè)序數(shù)據(jù)的具體區(qū)間。玉米系和表型評(píng)分根據(jù)對(duì)MRCV感染的抗性程度，對(duì)玉米系進(jìn)行表型評(píng)分(相對(duì)于簡(jiǎn)單歸類為“耐受” 或“易感”)。分析所用的植物品種來(lái)自于多種來(lái)源，包括原種種質(zhì)、商業(yè)核發(fā)品種和其他公 共品種。收集物包含883種玉米系。研究所用的系具有從CRM (對(duì)照相對(duì)成熟度)90-CRM140 的較寬成熟度范圍，表示先鋒種質(zhì)的主要近交后代。植物對(duì)MRCV感染的抗性程度差異很大，如使用從1 (高度易感)至9 (高度抗性) 等級(jí)所衡量的。通常得分為2(2)表示最易感植株，得分為4(4)被指定為認(rèn)定植物易感或 抗性的閾值(小于4，易感；4或更高為抗性)而得分為7 (5-7)指定為最抗性系?？剐苑种?8(8)和9(9)專指非常罕見(jiàn)的通常在現(xiàn)有種質(zhì)中觀察不到的抗性水平。如果田間中沒(méi)有疾 病，則不作抗性評(píng)分。但是，如果在具體田間位置確實(shí)出現(xiàn)疾病，則對(duì)該位置所有系都進(jìn)行 評(píng)分。在多個(gè)位置和多個(gè)年份中對(duì)檢驗(yàn)植株累積評(píng)分，最終的平均分(例如共有)指定為 每個(gè)品系的分值。在幾個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)中收集了 883個(gè)近交收集物的部分抗性得分(在生長(zhǎng)季節(jié)的同一 時(shí)間對(duì)394個(gè)近交后代進(jìn)行評(píng)估)。通常在花期之后在一次評(píng)分中進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。玉米基因分型通過(guò)在4000-10000個(gè)基因(基因位點(diǎn))上的DNA測(cè)序，對(duì)一組883個(gè)玉米系進(jìn)行 分析。在每個(gè)位點(diǎn)的近交后代之間，使用SNP變異產(chǎn)生具體單元型。這些數(shù)據(jù)用于在基因 組水平上鑒定等位基因和MRCV抗性之間的關(guān)聯(lián)。玉米系譜_抗性來(lái)源使用先鋒系譜數(shù)據(jù)庫(kù)理解近交后代和單元型之間的關(guān)系。這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)含有1919 以來(lái)的先鋒近交后代之間的系譜關(guān)系。對(duì)于公共近交后代，并入有關(guān)系譜和起源的公共信 息，以理解近交系和單元型的關(guān)系。通過(guò)使用系譜、表型和基因型數(shù)據(jù)，產(chǎn)生表示在先鋒種 質(zhì)(包括公共系)中對(duì)MRCV的抗性和易感性來(lái)源的關(guān)鍵創(chuàng)立者列表。大部分易感近交后代 可追溯至來(lái)自美國(guó)種質(zhì)(公共系如B37、B73、B14、0H07、C103，和先鋒近交后代165和938) 的一組具體單元型；一個(gè)例外是來(lái)自熱帶種質(zhì)的PH26N?；蚨ㄎ粯?biāo)記MZA15490和MZA2038之間的區(qū)間(圖8)被認(rèn)定為是研究抗性基因區(qū)域上的 等位基因多樣性的候選區(qū)。通過(guò)使用來(lái)做以下的信息選擇這個(gè)區(qū)域a)重組體。重組體的定位如實(shí)施 例7所示。MZA16656至MZA15490區(qū)間的兩個(gè)重 組體和MZA15490至MZA2038區(qū)間的一個(gè)重組體的表型數(shù)據(jù)，用于對(duì)基因位置的左側(cè)定界。 在重組種群中，在MZA2038-MZA11826-MZA9105區(qū)域不存在可用的重組體。b)用先鋒種質(zhì)近交后代中的基因型信息和表型信息檢測(cè)抗性/易感近交后代中的保守片段。若在獨(dú)立創(chuàng)建者中有足夠的保守SNP，則在具體系譜內(nèi)和多個(gè)獨(dú)立創(chuàng)建者中實(shí) 施保守片段的檢測(cè)。天然等位基因的多樣性和創(chuàng)建者關(guān)系
選擇區(qū)間MZA15490至MZA2038，進(jìn)行等位基因多樣性分析，因?yàn)槠浜芸赡芎泻?選基因或與候選基因高度連鎖不平衡。在MZA15490至MZA2038區(qū)間的全序列對(duì)于B73是 可用的(B73 = 274)，一組13個(gè)小序列片段被靶向，用于一組檢驗(yàn)系(tester’ s line)的 測(cè)序中。檢驗(yàn)系(表26)包括a) —些關(guān)節(jié)的抗性和易感的近交后代和單元型；b)來(lái)自作 圖種群PH7WTxPH3DT和PH9TJxPH890的抗性和易感親代；c)來(lái)自近交組和重組種群的關(guān)鍵 重組體(PHG63和MZA15490至MZA2038區(qū)間的重組體)。表26顯示了包括在先鋒種質(zhì)中的MRCV抗性和易感性來(lái)源和MZAl5490至MZA2038 區(qū)間的重組體的檢驗(yàn)系的列表。表 26 圖9顯示在ΜΖΑ15490至ΜΖΑ2038區(qū)間中的靶向片段的位置和候選基因的位 置。獲得命名為以下的序列的測(cè)序結(jié)果MRQV_00005-1 ；MRQV_1318_1 ；MRQV_02352_1 ； MRQV_03828-1 ；MRQV_06374_1 ； MRQV_08351-1 ；MRQV_09551-1-1 ；MRQV_10673_1 禾口 MRQV_11074-1 ο本文提供了用于片段MRQV_08351_1和MRQV_10673_1的檢驗(yàn)近交后代組之 間的序列，包括多態(tài)SNP，以表征單元型(參見(jiàn)圖16)。在MZA15490至MZA2038區(qū)間的序列 位置包括在圖9中。用序列數(shù)據(jù)通過(guò)抗性和易感性獨(dú)立來(lái)源之間的血統(tǒng)片段(descentsegments)鑒 定假定的同源物。MRQV_00005-1至MRQV_08351-1區(qū)域?qū)τ诖蟛糠忠赘行元?dú)立來(lái)源而言是 共享的。關(guān)鍵重組的數(shù)據(jù)(來(lái)自高分辨率作圖種群；對(duì)疾病易感)表明，該遺傳材料的重 組點(diǎn)位于假定的Myb轉(zhuǎn)錄因子(PC0644442)內(nèi)部，且產(chǎn)生抗性的序列變異應(yīng)該位于從該候 選基因的位置至MZA2038。在PC0644442區(qū)域或附近的抗性獨(dú)立來(lái)源之間也存在預(yù)期的 IBD (血統(tǒng)同一性)關(guān)系如
a)PHR33 和 PH467。b) PHR33, PH9TJ, PHJ40 和 PHDG9。c)表現(xiàn)出具體單元型的PHK09。d)表現(xiàn)出具體單元型的630。
在MRQV_08351_1的一組靶SNP對(duì)大部分抗性來(lái)源是非常特異性的。但是，重組數(shù) 據(jù)表明，靶序列應(yīng)該位于從MRQV_08351-1 (位于PC0644442)至MZA2038?？紤]到在MRQV_08351-1的SNP的特異性，在來(lái)自先鋒種質(zhì)的共625個(gè)近交后代中 對(duì)該具體片段進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)使用來(lái)自以下的組合信息發(fā)展了關(guān)于部分先鋒種質(zhì)的MRCV 抗性的基因描述a)該區(qū)間的側(cè)翼標(biāo)記(MZA15490和MZA2038)，b)625個(gè)近交后代和檢驗(yàn) 系的序列數(shù)據(jù)，c)近交后代之間的系譜關(guān)系，和d)這些近交后代的表型數(shù)據(jù)。在MRQV_08351-1的或結(jié)合MRQV_10673_1和MZA2038的單元型信息的一組具體單 元型，用于增強(qiáng)在先鋒種質(zhì)中主要抗性來(lái)源的表征和血統(tǒng)同一性信息，并考慮靶區(qū)域的假 定的變體。表27顯示了具體單元型的描述和在材料之間單元型對(duì)疾病的預(yù)期反應(yīng)和觀察 結(jié)果。包括了作為參考的代表性來(lái)源。
使用BRQV-08351-1的信息或結(jié)合側(cè)翼序列(MRQV_10673-1和MZA2038)，申請(qǐng)人作出了以下推斷。
a)抗性來(lái)源1。來(lái)源PHR33和PH467可能在MRQV_08351_1共享共同祖先。與來(lái) 自LACAUNE開(kāi)放式授粉品種的歐洲材料的共享區(qū)，支持可能共同起源于單個(gè)單元型區(qū)域。b)抗性來(lái)源 2。來(lái)源 PHR33，PH9TJ，PHJ40 和 PHDG9 可能在 MRQV_08351_1 側(cè)翼區(qū) 共享共同祖先。此外，推斷PHP51可能是該組的一部分。與來(lái)自LACAUNE開(kāi)放式授粉品種 的歐洲材料的共享區(qū)，支持可能共同起源于單個(gè)單元型區(qū)域。c)抗性來(lái)源3。PHK09表現(xiàn)出與PHBD6在MRQV_08351_1的共享單元型，且它們應(yīng) 該是共享了來(lái)自Tuxpen種質(zhì)的共同起源。d)抗性來(lái)源4。630表現(xiàn)出具體單元型，以及其他來(lái)源中不存在確定的IBD關(guān)系。根據(jù)作圖種群結(jié)果，申請(qǐng)人由此證實(shí)了在這些獨(dú)立來(lái)源中優(yōu)選區(qū)的QTL
-630。-PH9TJ.與 630 等位。-PHP51.與 630 等位。-PHBD6.與 630 等位。重組、序列和系譜分析的整合和獨(dú)立來(lái)源之間預(yù)期IBD關(guān)系的推論，使申請(qǐng)人認(rèn) 識(shí)到兩個(gè)優(yōu)選標(biāo)記區(qū)(MZA15490和MZA2038)的四種主要單元型可用于表征先鋒種質(zhì)中的 大部分抗性來(lái)源。這四種主要單元型可分成以下種質(zhì)來(lái)源(a)抗性來(lái)源1和2。與來(lái)自歐洲flint LACAUNE開(kāi)放式授粉種群的材料共享同 源區(qū)的Flint SWAN種質(zhì)。(b)抗性來(lái)源3。來(lái)自TUXPEN起源的材料。(c)抗性來(lái)源4。具體來(lái)源，630是代表性近交。該近交的發(fā)展包括寬泛的基因基 礎(chǔ)，其包括TUXPEN和MEXICAN JUNE種質(zhì)。PC0644442(圖8，假定的Myb轉(zhuǎn)錄因子)看起來(lái)是最可能的對(duì)MRCV抗病性的候選 基因。與PC0644442緊密連鎖的序列應(yīng)該也被認(rèn)為是基因克隆的靶點(diǎn)，包括假定是EPSim 和區(qū)間MZA11826至MZA9105的側(cè)翼序列。表征了在來(lái)自雜交PH3DT和PH7WT的MZA15490至MZA2038的單個(gè)重組體，且重組 點(diǎn)位于PC0644442內(nèi)。從PC0644442的內(nèi)含子3至PC0644442啟動(dòng)子序列的區(qū)域，被認(rèn)為 是驗(yàn)證變異對(duì)于基因型之間抗性/易感性反應(yīng)影響的關(guān)鍵靶點(diǎn)。圖10顯示了在MZA15490 至 MZA2038 重組體的特征；quimeric PC0644442 是源于 PH3DT 和 PH7WT 基因型。PH3DT (SEQ ID NO 212)和PH7WT(SEQ ID NO 211)的PC0644442的啟動(dòng)子區(qū)序列也包括在本文中，顯 示了多態(tài)位點(diǎn)(參見(jiàn)表15為序列排列)。實(shí)施例9 =MRDV-主要雜交系表征-歐洲對(duì)一組關(guān)鍵的歐洲遺傳材料進(jìn)行表型和基因型表征，以確認(rèn)與MRDV抗性相關(guān)的 玉米遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。通過(guò)鑒定這些遺傳標(biāo)記，可使用標(biāo)記輔助選擇(MAS)提高育種效能，用 于改善玉米對(duì)MRDV的抗性。玉米雜種和抗性評(píng)分分析所用的植物品種來(lái)自于多種來(lái)源，包括原種種質(zhì)、商業(yè)核發(fā)品種和代表寬范 圍的與歐洲育種程序相關(guān)的種質(zhì)的預(yù)商業(yè)化雜種。將玉米雜種組在田間實(shí)驗(yàn)中種植在西班牙?？剐院鸵赘械臍w類僅基于田間檢驗(yàn)中 對(duì)偶爾且天然發(fā)生疾病的發(fā)病率的觀察結(jié)果。植物對(duì)MRDV感染的抗性程度差異很大，如使用MRDV癥狀發(fā)病率的等級(jí)所衡量的。通常在一次評(píng)分時(shí)間中完成數(shù)據(jù)收集。評(píng)分時(shí)間在花期之后。在標(biāo)記與抗性關(guān)聯(lián)的評(píng)估中，采用通過(guò)使用親代系的IBD信息的對(duì)比。通過(guò)血統(tǒng) 同一性方法檢查等位基因起源。使用這種方法，用被認(rèn)為是代表任一基因型類別的那些玉 米系評(píng)估關(guān)聯(lián)和預(yù)測(cè)雜種水平的性能。玉米基因分型 對(duì)這些雜種的每個(gè)親代系進(jìn)行基因分型，并為每個(gè)系估算IBD計(jì)算值?；镜倪壿嬍?，在抗性和易感組之間具有明顯不同的等位基因分布(即非隨機(jī)分 布)的標(biāo)記，可能與性狀相關(guān)，并出于標(biāo)記輔助選擇具有之前未表征或表征為MRDV抗性或 易感的玉米系的目的，可用來(lái)對(duì)它們進(jìn)行分離。本分析檢測(cè)了在優(yōu)選的標(biāo)記區(qū)基因位置上 的IBD信息，并測(cè)定了在抗性組內(nèi)部的等位基因分布是否明顯不同于易感組內(nèi)的等位基因 分布。該分析比較了植物表型得分與在靶位點(diǎn)的基因型；該基因型是由IBD預(yù)測(cè)的。MM為在雜交水平上評(píng)估該QTL的等位基因變異的作用，根據(jù)存在來(lái)自親代系的一個(gè) (QTL雜合的)或兩個(gè)抗性等位基因(QTL純合的)，表征一組212個(gè)雜種(異源遺傳背景)。 在雜種組合中，觀察到主要QTL的抗性等位基因的正作用和加成作用。表28顯示在主要QTL 具有不同基因型的雜種的田間性能。田間性能表征為MRDV得分，類似于MRCV得分方案。表 28 圖11表示在MRDV感染時(shí)玉米雜種的性能。田間性能以MRDV得分表示。討論/結(jié)論該實(shí)施例鑒定了與MRDV抗性關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)間。位于這些區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記可用于 MAS,以及其他目的。通過(guò)使用MRCV抗性的優(yōu)選標(biāo)記預(yù)測(cè)MRDV抗性增強(qiáng)，表明這些標(biāo)記可 用于不同斐濟(jì)病毒的MAS。由此預(yù)期了優(yōu)選標(biāo)記對(duì)其他斐濟(jì)病毒例如水稻黑條矮縮病毒抗 性的正作用。實(shí)施例10 =MRCV抗性表型分析是什么Mal de Rio Cuarto病毒的得分1_9，1表示無(wú)抗性(矮小、節(jié)間縮短、無(wú) 穗)，而9表示該遺傳材料對(duì)疾病有抗性(無(wú)癥狀)。什么時(shí)候從開(kāi)花至收獲檢查已知易感系的得分，以觀察它們的現(xiàn)有分級(jí)是否符合歷史分級(jí)。怎么辦1.將目前給予少數(shù)已知易感系的分級(jí)與它們的歷史分級(jí)進(jìn)行比較，看兩 者是否相符。
2.如果分級(jí)太高，則沒(méi)有對(duì)此位置評(píng)分的足夠的疾病壓力。但是，注意比易感檢查 具有更多疾病的任意圖。3.在圖基礎(chǔ)上的得分。圖內(nèi)的植物癥狀由于感染時(shí)長(zhǎng)而可以變化，或某些植物可以避開(kāi)疾病(天然感染取決于載體的種群)。4.考慮癥狀的嚴(yán)重性和具有癥狀的植物的頻率。得分1-3屬于易感類別；4-6是抗性類別；7-9是高度抗性類別。田間評(píng)分的描述a)得分1-3,易感類別。癥狀包括嚴(yán)重矮小、節(jié)間嚴(yán)重縮短、無(wú)穗或穗的發(fā)育非常差，植物過(guò)早死亡。b)得分4-6,抗件類別。棺物具有突起和輕微的節(jié)間縮短的癥狀。具有嚴(yán)重癥狀的植物頻率較低。C)得分7-9,高度抗件類別。健康棺物。存在突起或無(wú)癥狀。
權(quán)利要求
鑒定表現(xiàn)出對(duì)斐濟(jì)病毒的新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)的第一玉米植物或種質(zhì)的方法，該方法包括，在所述第一玉米植物或種質(zhì)中檢測(cè)與所述新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)相關(guān)的第一標(biāo)記位點(diǎn)的至少一個(gè)等位基因，其中所述第一標(biāo)記位點(diǎn)位于側(cè)翼為并包括MZA8381和MZA18180的染色體區(qū)間內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一標(biāo)記位點(diǎn)位于側(cè)翼為并包括MZA4305和 MZA2803的染色體區(qū)間內(nèi)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一標(biāo)記位點(diǎn)位于側(cè)翼為并包括MZA15490和 MZA2038的染色體區(qū)間內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一標(biāo)記位點(diǎn)是MZA625、MZA16656、MZA15451、 MZA15490、MZA2038、MZAl1826 或 MZA9105。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)表型田間得分，分析所述新賦予的抗性或抗性 增強(qiáng)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個(gè)等位基因包含MZA625、MZA16656、 MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826 或 MZA9105。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一玉米植物具有單元型 在 MZA16656-19-A 的 G在 MZA15490-80I-A 的 G 在 MZA15490-137-A 的 C 在 MZA2038-71-A 的 A 在 MZA2038-76-A 的 T 在 MZAl 1826-801-A 的 A 在 MZA11826-803-A 的 C在MZA9105-8-A的A，并且與缺乏所述單元型的等基因玉米植物相比，表現(xiàn)出對(duì)斐濟(jì)病 毒的新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個(gè)等位基因與新賦予的抗性或抗性增強(qiáng) 關(guān)聯(lián)，所述方法還包括將所述第一玉米植物或種質(zhì)中的等位基因基因滲入至第二玉米植物 或種質(zhì)，以產(chǎn)生基因滲入的玉米植物或種質(zhì)。
9.由權(quán)利要求8所述的方法產(chǎn)生的基因滲入的玉米植物或種質(zhì)。
10.如權(quán)利要求9所述的基因滲入的玉米植物或種質(zhì)，其中所述基因滲入的玉米植物 或種質(zhì)包含 MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZAl 1826 和 MZA9105。
11.如權(quán)利要求9所述的基因滲入的玉米植物或種質(zhì)，具有單元型 在 MRQV_08351-173 的 C在 MRQV_08351-262 的 A 在 MRQV_08351-280 的 G 在 MRQV_08351-323 的 G 在 MRQV_08351-369 的 C 在 MRQV_08351-372 的 C。
12.如權(quán)利要求9所述的基因滲入的玉米植物或種質(zhì)，包含SEQIDNO :49。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述斐濟(jì)病毒是Malde RioCuarto病毒(MRCV)。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述斐濟(jì)病毒是玉米粗縮病毒(MRDV)。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一玉米植物或種質(zhì)具有單元型 在 MRQV_08351-173 的 C在 MRQV_08351-262 的 A 在 MRQV_08351-280 的 G 在 MRQV_08351-323 的 G 在 MRQV_08351-369 的 C 在 MRQV_08351-372 的 C。
16.產(chǎn)生具有對(duì)斐濟(jì)病毒的新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)的玉米植物的方法，該方法包括 將外源核酸導(dǎo)入靶玉米植物或其子代中，其中所述外源核酸是來(lái)自與對(duì)斐濟(jì)病毒的新賦予 的抗性或抗性增強(qiáng)關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)的至少一個(gè)偏好等位基因連鎖的核苷酸序列，其中所述 標(biāo)記位點(diǎn)位于側(cè)翼為并包含MZA8381和MZA18180的染色體區(qū)間內(nèi)；由此獲得的轉(zhuǎn)基因植物 表現(xiàn)出對(duì)斐濟(jì)病毒的新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中使用作圖種群PH7WTxPH3DT或PH9TJxPH890測(cè)定 連鎖標(biāo)記位點(diǎn)。
18.通過(guò)與對(duì)斐濟(jì)病毒的新賦予的抗性或抗性增強(qiáng)關(guān)聯(lián)的數(shù)量性狀位點(diǎn)的標(biāo)記輔助選 擇，選擇至少一個(gè)玉米植物的方法，其中所述數(shù)量性狀位點(diǎn)位于由連鎖群2上的MZA8381和 MZA18180界定并包含它們的染色體區(qū)間，所述方法包括(a)為所述數(shù)量性狀位點(diǎn)檢驗(yàn)在所述染色體區(qū)間的至少一個(gè)標(biāo)記；和(b)選擇包含所述數(shù)量性狀位點(diǎn)的所述玉米植物。
19.鑒定表現(xiàn)出對(duì)斐濟(jì)病毒易感性的第一玉米植物或種質(zhì)的方法，所述方法包括在所 述第一玉米植物或種質(zhì)中檢測(cè)與所述易感性相關(guān)的第一標(biāo)記位點(diǎn)的至少一個(gè)等位基因，其 中所述第一標(biāo)記位點(diǎn)位于側(cè)翼為并包含MZA8381和MZA18180的染色體區(qū)間內(nèi)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述第一玉米植物或種質(zhì)具有單元型 在 MRQV_08351-173 的 T在 MRQV_08351-262 的 T 在 MRQV_08351-280 的 A 在 MRQV_08351-323 的 C 在 MRQV_08351-369 的 T 在 MQRV_08351-372 的 T。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定具有對(duì)斐濟(jì)病毒，尤其是Mal de Río Cuarto病毒(MRCV)和/或玉米粗縮病毒(MRDV)的新賦予的抗性或該抗性增強(qiáng)，或易感該病毒的玉米植物的組合物和方法。該方法使用分子遺傳標(biāo)記鑒定、選擇和/或構(gòu)建抗性植物或鑒定和反選擇易感植物。由本發(fā)明方法產(chǎn)生的表現(xiàn)出新賦予的斐濟(jì)病毒抗性或該抗性增強(qiáng)的玉米植物，也是本發(fā)明的一方面。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101849023SQ200880114461
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月1日
發(fā)明者何塞·阿勒詹德羅·弗朗奇諾, 國(guó)平·G·舒, 安娜·瑪麗亞·布魯科皮烏克, 恩瑞克·多明戈·克里夫, 斯坦利·D·盧克, 特瑞希塔·馬丁, 艾德里安納·托馬斯 申請(qǐng)人:先鋒國(guó)際良種公司;納幕爾杜邦公司