專利名稱：熒光素酶分析方法、試劑和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用生物發(fā)光檢測(cè)酶活性的方法、試劑和試劑盒。特別涉及一種新的熒 光素酶分析系統(tǒng)，其具有降低的本底發(fā)光，從而增加檢測(cè)的靈敏度。
背景技術(shù)：
熒光素酶是通常在分析細(xì)胞中分子活動(dòng)時(shí)用作指示劑的一種酶。當(dāng)用作指示劑 時(shí)，特定的細(xì)胞活動(dòng)或條件會(huì)指示出細(xì)胞中熒光素酶的量。因此，開(kāi)發(fā)了許多檢測(cè)技術(shù)來(lái)測(cè) 定生物樣品中含有的熒光素酶的量。這些檢測(cè)技術(shù)通常包括通過(guò)測(cè)定熒光素酶的酶活來(lái) 評(píng)估樣品中出現(xiàn)的熒光素酶的量；而熒光素酶的酶活是通過(guò)破壞熒光素酶的酶反應(yīng)底物或 制得相應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物體現(xiàn)的。熒光素酶可以與合適的底物反應(yīng)發(fā)光，其也是反應(yīng)產(chǎn)物之一。 上述發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光量可以測(cè)定并用來(lái)確定樣品中熒光素酶的存在或含量。用腔腸素(coelenterazine)作為底物發(fā)光的熒光素酶包括=Renilla, Gaussia, Metridia和Obelia。這些熒光素酶催化腔腸素(coelenterazine)氧化產(chǎn)生 coelenteramide、CO2禾口光。該反應(yīng)如下所示 眾所周知，腔腸素在缺少熒光素酶時(shí)也能被氧化并發(fā)光。以這種方式產(chǎn)生的光被 稱為自發(fā)光。自發(fā)光產(chǎn)生了本底信號(hào)，并因此降低了熒光素酶檢測(cè)分析的靈敏度。特別是， 腔腸素的自發(fā)光會(huì)降低微量熒光素酶的檢測(cè)能力，例如當(dāng)自發(fā)光信號(hào)與由熒光素酶產(chǎn)生的 發(fā)光信號(hào)有相似的量級(jí)時(shí)。某些分析成分會(huì)增加不期望的腔腸素自發(fā)光的產(chǎn)生，其包括檢測(cè)樣品的成分和期 望分析的成分，例如洗滌劑和蛋白質(zhì)。例如，非離子型洗滌劑就常被用做細(xì)胞溶解劑來(lái)使熒 光素酶增溶并使底物容易進(jìn)入，而蛋白質(zhì)則通常存在于被測(cè)樣品中(如細(xì)胞，添加了血清 的細(xì)胞培養(yǎng)基)。因此，在許多期望的分析條件下，腔腸素自發(fā)光會(huì)降低熒光素酶分析的靈 敏度。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是降低該不希望的腔腸素自發(fā)光，從而提高熒光素酶檢測(cè)分 析的靈敏度并使更少量的熒光素酶可被檢測(cè)。如本文所述，減少腔腸素自發(fā)光及其其類似 物的條件已經(jīng)確定。具體而言，已觀察到向熒光反應(yīng)混合物中添加碘化物可以顯著降低腔腸素的自發(fā)光。因此，本發(fā)明涉及一種用腔腸素(coelenterazine)或其類似物作為底物，檢測(cè)樣品中熒光素酶活性的方法，其包括(a)通過(guò)將所述樣品與熒光素酶檢測(cè)試劑接觸啟動(dòng)熒 光素酶催化發(fā)光，產(chǎn)生反應(yīng)混合物，所述的試劑包括腔腸素(coelenterazine)和至少一種 其量足以降低所述腔腸素自發(fā)光的碘化物源，(b)在適于發(fā)光的條件下培養(yǎng)所述的試劑混 合物，和(c)測(cè)定發(fā)出的光。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“碘化物源”是指任何能夠在水溶液中提供碘離子的化合物。 碘離子是具有-1電荷的碘原子。具有氧化態(tài)-1的碘的化合物因此被稱為碘化物。其包括 離子化合物，例如碘鹽。考慮到與分析條件的相容性，優(yōu)選使用在水性條件下能溶解的碘化 物源。除了黃色的碘化銀和黃色的碘化鉛，大多數(shù)離子碘化物都是可溶的。一個(gè)碘化合物 的試驗(yàn)是，通過(guò)加入幾滴酸酸化水性化合物，以去除存在的任何碳酸鹽離子，然后加入硝酸 鉛，產(chǎn)生嫩黃色的碘化鉛沉淀。具體的碘化物源由使用者選擇，并可在考慮下列因素的基礎(chǔ) 上選擇溶解性、毒性、碘化鹽的可獲得性。示例性的碘化物源包括碘化物鹽，如NaI、KI、LiI、NH4I及類似物，和它們之間的任 意組合。實(shí)施本發(fā)明也可使用那些在溶液中會(huì)在一定程度上分離并產(chǎn)生游離碘的碘化合物。如下面的實(shí)施例中所示，當(dāng)包括腔腸素的熒光素酶反應(yīng)混合物還包括至少一種碘 化物源時(shí)，腔腸素及其類似物的自發(fā)光顯著降低。據(jù)觀察碘化物降低腔腸素及其類似物的自發(fā)光的能力與檢測(cè)到得熒光素酶的類 型無(wú)關(guān)，因此，當(dāng)檢測(cè)Renilla和Gaussia熒光素酶時(shí)都可以觀察到上述的效果。此外，碘 化物能夠有效降低9種不同的腔腸素類似物的自發(fā)光(實(shí)施例6)。因此，在，本發(fā)明中一個(gè) 具體實(shí)施方案中使用的腔腸素(coelenterazine)選自由野生型腔腸素(coelenterazine native)和腔腸素類似物構(gòu)成的組，上述類似物例如腔腸素cp、腔腸素f、腔腸素fcp、腔腸 素h、腔腸素hep、腔腸素I、腔腸素ip和腔腸素η。腔腸素及其類似物可以常用的濃縮的 形式使用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，腔腸素或其類似物以2-5 μ M的濃度在反應(yīng)混合物中存 在，優(yōu)選在存在金屬螯合劑下，在例如1-lOmM，pH 7. 2-8. OEDTA的緩沖液中存在。包含有碘化合物源的熒光素酶反應(yīng)混合物是本領(lǐng)域已知的。W096/40988涉及酶介 導(dǎo)發(fā)光的猝滅試劑和分析技術(shù)。其公開(kāi)了一種用猝滅試劑降低不同樣品孔之間“折射串?dāng)_ (cross-talk)，，的方法，猝滅試劑是在啟動(dòng)并檢測(cè)到熒光素酶催化發(fā)光之后加入的。通過(guò)這種方式，可以防止樣品與其中熒光素酶反應(yīng)還未被啟動(dòng)的周圍樣品孔發(fā)生 不希望的串?dāng)_。試驗(yàn)公開(kāi)了，使Renilla熒光素酶與腔腸素接觸，之后加入作為猝滅試劑的Nal。因此，與本發(fā)明中的通過(guò)將樣品和底物在碘化物源存在下結(jié)合而啟動(dòng)熒光素酶反 應(yīng)相反，現(xiàn)有技術(shù)的方法中，是在測(cè)定到發(fā)光之后將碘化物加入到與底物分離開(kāi)的樣品中。在熒光素酶反應(yīng)的啟動(dòng)和培育階段是沒(méi)有碘化物的。因此，現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有披露 包含腔腸素和碘化物源而不包含熒光素酶的檢測(cè)試劑。當(dāng)?shù)饣镆约s0. 02mM至約500mM碘化物的濃度出現(xiàn)在熒光素酶檢測(cè)試劑或最終 的熒光素酶反應(yīng)混合物(例如，與熒光素酶檢測(cè)試劑混合的樣品)中時(shí)，按照本發(fā)明中的方 法能夠獲得降低腔腸素自發(fā)光的良好結(jié)果。下文中的例子給出了碘化物濃度為0. 25mM(實(shí)施例4和5) ；0. 5mM(實(shí)施例6)；2. 5mM(實(shí)施例1)；和50mM(實(shí)施例2和3)的效果。因此，在本發(fā)明中的一個(gè)具體實(shí)施方案中，用包含腔腸素(類似物)和至少一種碘化物源的熒光素酶檢測(cè)試劑啟動(dòng)熒光素酶反應(yīng)，是在存在約0. 02mM至約500mM碘化物，如1 至250mM，或10至IOOmM下進(jìn)行的。在一個(gè)具體的方面，熒光素酶反應(yīng)混合物含有0. 02至 500mM的碘化物鹽，優(yōu)選KI。因此，本發(fā)明公開(kāi)了碘化物作為熒光素酶檢測(cè)試劑中的有新穎性的和有創(chuàng)造性的 成分的用途。本發(fā)明中的檢測(cè)試劑通常不包含熒光素酶，因?yàn)槊?如果出現(xiàn))將由檢測(cè) 樣品提供。故本發(fā)明還提供了一種熒光素酶檢測(cè)試劑，其包含與碘化物源結(jié)合的腔腸素 (coelenterazine)或其類似物，其中所述的試劑不包含熒光素酶。本文中提供的示例性反應(yīng)條件中還描述了其它成分。一般而言，為了檢 測(cè)含有細(xì)胞的樣品中的熒光素酶，熒光素酶檢測(cè)試劑包括熒光素酶底物，如腔腸素 (coelenterazine)；維持pH的緩沖系統(tǒng)(如Good緩沖液，磷酸鹽，Tris based緩沖液及類 似物)；用于溶解細(xì)胞和/或抑制熒光素酶的活性(增長(zhǎng)發(fā)光半衰期)的非離子型洗滌劑 (如 Tergitol NP-9，Ig印al CA-630，Thesit, Triton XlOO 及類似物)。其它有用成分可以包括，例如，通過(guò)抑制金屬依賴蛋白酶的活性而防止熒光素酶 降解的金屬螯合劑(如EDTA)；和減少熒光素酶檢測(cè)試劑中腔腸素降解的還原劑(如硫代 硫酸鈉，TCEP, DTT及類似物)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了一種熒光素酶檢測(cè)試劑，其包括與一種碘化物源 結(jié)合的腔腸素或其類似物，并進(jìn)一步包括緩沖系統(tǒng)，非離子型洗滌劑，金屬螯合劑和/或還 原劑，其中該試劑不包含熒光素酶。另一方面本發(fā)明還涉及一種實(shí)施本發(fā)明中方法的分析試劑盒。所述用于檢測(cè)樣品中熒光素酶的試劑盒包括包含本發(fā)明中熒光素酶檢測(cè)試劑的第一容器，包含其它有用分析成分，如緩沖劑 或熒光素酶標(biāo)準(zhǔn)的第二容器，和/或使用該試劑盒的說(shuō)明書(shū)。每種試劑可以有其自己的容器或者幾種試劑可被預(yù)混合并一同裝入一個(gè)容器中。 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，分析試劑盒中的腔腸素選自由野生型腔腸素(coelenterazine native)和包括腔腸素cp，腔腸素f，腔腸素fcp，腔腸素h，腔腸素hcp，腔腸素i，腔腸素ip 和腔腸素η的腔腸素類似物構(gòu)成的組。如上文所述，各種類型的碘化物都可用來(lái)減少腔腸素的自發(fā)光。一個(gè)示例性分析 試劑盒包括碘鹽，優(yōu)選選自由NaI，KI，LiI和NH4I構(gòu)成的組。其它有用的試劑盒成分是本 領(lǐng)域已知的。通過(guò)將碘化物與腔腸素結(jié)合使用，該分析試劑盒得到可靠的線性結(jié)果，其具有 最小的自發(fā)光背景和較高的靈敏度。本發(fā)明還提供了碘化物源減少腔腸素或其類似物的自發(fā)光，而提高使用腔腸素或 其類似物作為底物的生物發(fā)光分析系統(tǒng)檢測(cè)靈敏度的用途。所述的分析系統(tǒng)優(yōu)選是熒光素 酶分析系統(tǒng)。本文中披露的令人驚訝的效果可用于任何體外(vitro)，原位(situ)和/或 體內(nèi)(in vivo)的情況，其中腔腸素或其類似物被用作底物。


圖1 熒光素酶分析混合物中存在碘化物源(KI)提高了檢測(cè)Renilla熒光素酶活性的能力；實(shí)施例1分析了不同量的熒光素酶；
圖2 碘化鉀(KI)和五水硫代硫酸鈉(Na2S2O3)減少了腔腸素的自發(fā)光，可以檢測(cè) 低于0. Ipg的熒光素酶；具體參見(jiàn)實(shí)施例2 ；圖3 在存在KI的條件下測(cè)定Renilla熒光素酶活性(參見(jiàn)實(shí)施例4)；圖4 在存在(4A欄)或不存在(4B欄)碘化物源的條件下分析表達(dá)Gaussia熒 光素酶(陽(yáng)性)的CHO細(xì)胞或用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的上清液；具體參見(jiàn)實(shí)施例5 ；圖5 碘化物的加入減少了野生型腔腸素和腔腸素類似物的自發(fā)光。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例描述了熒光素酶分析組合物，其中熒光素酶的檢測(cè)靈敏度通過(guò)減少 熒光素酶底物腔腸素(coelenterazine)的自發(fā)光而得到增強(qiáng)。盡管在下面的實(shí)施例中使 用了碘化鉀作為碘化合物源，但是顯然其它碘鹽也會(huì)產(chǎn)生基本相同的效果。實(shí)施例1該實(shí)施例表明在熒光素酶試劑混合物中存在碘化物源能提高對(duì)Renilla熒光素 酶活性的檢測(cè)能力。測(cè)試的用來(lái)獲得含碘反應(yīng)混合物的熒光素酶檢測(cè)試劑的成分見(jiàn)下表1。制備缺少 碘化合物源的相應(yīng)對(duì)照熒光素酶檢測(cè)試劑作為陰性對(duì)照。表 1 總體而言，要加入的腔腸素(coelenterazine)來(lái)自含1. 4mM腔腸素的酸化乙醇的 貯液。該貯液按如下方法制備向ImL無(wú)水乙醇中加入25 μ L的2Μ的HCl。向該溶液中加 入腔腸素(3mg)并溶解。然后，補(bǔ)入4mL的無(wú)水乙醇，得到腔腸素貯液。用來(lái)自Chemicon (Cat. no 4400)的GST-fused Renilla熒光素酶作為熒光素酶樣 品。將Renilla熒光素酶溶解到ImL的Dulbecco’ sPBS/0. 1 % BSA中，制得7. 3 μ g/mL的 貯液。將10 μ L的該貯液加入到IOmL的細(xì)胞培養(yǎng)基中(無(wú)酚紅DMEM，添加10% FBS、2mM L-谷氨酸鹽和ImM丙酮酸鹽，均來(lái)自Invitrogen)，得到濃度為7. 3ng/mL的熒光素酶。將 該熒光素酶溶液連續(xù)稀釋1/2(1 over 2)，制得培養(yǎng)基中Renilla熒光素酶從7. 3ng/mL下 降到110pg/mL系列稀釋液。將該系列稀釋液中每種熒光素酶檢測(cè)溶液制成一式三份，以 100 μ L每孔的量加入到白色的培養(yǎng)板-96 (PerkinElmer Cat. no 6005680)中。以每孔IOOyL的量將熒光素酶檢測(cè)試劑或?qū)φ杖芤杭尤氲竭@些孔中啟動(dòng)發(fā)光。然后將得到的反應(yīng)混合物培育而進(jìn)行熒光素酶催化發(fā)光。在稍微搖動(dòng)平板以使 孔中的成分混合之后，平板被載入到TopCount NXT Scintillation和Luminescence Counter (PerkinElmer)中，并在5分鐘計(jì)數(shù)延遲之后測(cè)定發(fā)出的光。在圖1中給出了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。這些結(jié)果表明在存在2. 5mM KI時(shí)，可以檢測(cè)到樣品中更低量的熒光素酶，這是減少了腔腸素自發(fā)光的結(jié)果。實(shí)施例2進(jìn)行與實(shí)施例1基本相同的實(shí)驗(yàn)。所測(cè)定的熒光素酶檢測(cè)試劑的成分如下表2所示。表2
(五水硫代硫酸鈉)
腔腸素BiosynthAG / C-7000 14 μΜ
用NaOH調(diào)ρΗ至7.0也制備相應(yīng)的對(duì)照熒光素酶檢測(cè)試劑，其缺少碘化物和無(wú)水硫代硫酸鈉。在該實(shí)驗(yàn)中，Renilla熒光素酶在細(xì)胞培養(yǎng)基(無(wú)酚紅DMEMj^W 10% FBS, 2mM L-谷氨酸鹽和ImM丙酮酸鹽，所有均來(lái)自Invitrogen)中被連續(xù)稀釋1/5(1 over 5)。如前所述，以每孔100 μ L的量將熒光素酶檢測(cè)試劑或?qū)φ杖芤杭尤氲竭@些孔 中，以啟動(dòng)發(fā)光。然后培育得到的反應(yīng)混合物使熒光素酶催化產(chǎn)光。在稍微搖動(dòng)平板 使孔中成分混合之后，將平板載入到TopCount NXT Scintillation和Luminescence Counter (PerkinElmer)中，并在5分鐘計(jì)數(shù)延遲之后測(cè)定發(fā)出的光。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)圖2。這些結(jié)果表明50mM KI和5mM的五水硫代硫酸鈉的存在顯 著減少腔腸素自發(fā)光。在該條件下，可以檢測(cè)到少于0. Ipg每孔的熒光素酶。實(shí)施例3進(jìn)行與實(shí)施例1基本相同的實(shí)驗(yàn)。表3 Renilla熒光素酶，在細(xì)胞培養(yǎng)基(參見(jiàn)實(shí)施例2)中的連續(xù)稀釋物1/5(1 over 5)
被用作該實(shí)驗(yàn)的樣品。結(jié)果(圖3)表明50mM KI的存在顯著降低腔腸素的自發(fā)光，在此
條件下可以檢測(cè)到低于0. Ipg每孔的熒光素酶。實(shí)施例4在該實(shí)施例中，用熒光素酶分析試劑來(lái)檢測(cè)Gaussia熒光素酶。所測(cè)的熒光素酶
檢測(cè)試劑的成分見(jiàn)下表4。制備了兩種相應(yīng)的對(duì)照熒光素酶檢測(cè)試劑，一種缺少碘化物，而
另一種缺少碘化鉀和還原劑五水硫代硫酸鈉(Na2S2O3. 5H20)。表 4 加入的腔腸素來(lái)自含1. 4mM腔腸素(coelenterazine)的酸化乙醇的貯液(參見(jiàn)
實(shí)施例1)。使用的Gaussia熒光素酶樣品上清液(Gaussia熒光素酶是由細(xì)胞分泌)來(lái)自CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24小時(shí)(培養(yǎng)基
MEM+酚紅，添加L-谷氨酸鹽和5% FBS)。陽(yáng)性由CMV-GLUC (6 μ g的DNA)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞陰性由Basic-GLUC (陰性對(duì)照)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞將這些上清液在培養(yǎng)基中(MEM+Phenol Red/5% FBS)稀釋100倍，得到最終的Gaussia熒光素酶樣品。(MEM=Invitrogen Cat no :41090)。陽(yáng)性、陰性對(duì)照樣品和簡(jiǎn)單培養(yǎng)基作為空白以每孔100 μ L的量加入到白色培養(yǎng)平板-96中。對(duì)這些孔而言，每個(gè)孔中加入了 3種不同的熒光素酶檢測(cè)溶液，而啟動(dòng)發(fā)光。然后 將得到的反應(yīng)混合物培育使熒光素酶催化發(fā)光。在略微搖動(dòng)平板使孔中成分混合之后，將 平板載入到TopCoimt NXT，并在15分鐘的計(jì)數(shù)延遲之后測(cè)定發(fā)出的光。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表5。表 5 顯然，反應(yīng)混合物中碘化物源的存在大大減少了發(fā)光背景。該效果比還原劑硫代 硫酸鈉的效果顯著得多。實(shí)施例5在該實(shí)施例中，用熒光素酶分析試劑來(lái)檢測(cè)Gaussia熒光素酶。所測(cè)熒光素酶檢 測(cè)試劑的成分見(jiàn)下表6。也制備缺少碘化物的相應(yīng)的對(duì)照熒光素酶檢測(cè)試劑表6 將Gaussia熒光素酶樣品(陽(yáng)性和陰性)在MEM/5% FBS培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋1/5(1 over 5)。將這些稀釋物以100 μ L每孔的量加入白96槽培養(yǎng)平板的孔中。然后，將IOOyL 的不同熒光素酶檢測(cè)試劑加入這些孔中，啟動(dòng)發(fā)光。再將得到的反應(yīng)混合物培育以使熒光 素酶催化產(chǎn)光。在略微搖動(dòng)平板之后，將平板載入TopCoimt NXT，并在計(jì)數(shù)延遲15分鐘之 后測(cè)定發(fā)出的光。
2種不同檢測(cè)溶液的結(jié)果見(jiàn)表4A和4B。它們表明碘化物源的存在提高了檢測(cè)靈敏度。實(shí)施例6該實(shí)施例表明碘化物源的使用對(duì)于減少腔腸素類似物的自發(fā)光也是有用的。測(cè)試了碘化物對(duì)9種不同腔腸素類似物的自發(fā)光的影響。所測(cè)熒光素酶檢測(cè)試劑 的成分見(jiàn)下表7。也制備缺少碘化物源的相應(yīng)對(duì)照熒光素酶檢測(cè)試劑。表 7 測(cè)定的腔腸素類似物有野生型腔腸素，腔腸素CP，腔腸素f，腔腸素fcp，腔腸素h，腔腸素hcp，腔腸素i， 腔腸素ip和腔腸素η。將腔腸素類似物以25 μ g/50 μ L溶解到乙醇中。向ImL的檢測(cè)溶液中加入5 μ L 的腔腸素貯液，得到腔腸素濃度為2. 5μ g/mL的檢測(cè)溶液。測(cè)定了 9種不同腔腸素類似物的檢測(cè)溶液(含有和不含有KI)。向白96-孔培養(yǎng)平 板的孔中加入 100 μ L 的 Dulbecco，S PBS (Invitrogen Cat. no. 14040)，用 0· 1% BSA (Sigma A7030)補(bǔ)足。然后，向該孔中加入IOOyL的檢測(cè)溶液，啟動(dòng)產(chǎn)光。然后培育得到的反應(yīng) 混合物以使熒光素酶催化產(chǎn)光。接著，將平板略微搖動(dòng)以混合孔中成分。之后將平板載入 TopCount NXT，并在5分鐘計(jì)數(shù)延遲之后測(cè)定發(fā)出的光。圖5中的結(jié)果表明，碘化物的加入減少了所有測(cè)定腔腸素類似物的自發(fā)光。
權(quán)利要求
一種用腔腸素(coelenterazine)或其類似物作為底物檢測(cè)樣品中熒光素酶活性的方法，包括(a)通過(guò)使所述樣品與熒光素酶檢測(cè)試劑接觸以啟動(dòng)熒光素酶-催化發(fā)光反應(yīng)，得到反應(yīng)混合物，所述的試劑包括腔腸素和至少一種其量足以減少所述腔腸素的自發(fā)光的碘化物源，(b)在適于發(fā)光的條件下培養(yǎng)所述的試劑混合物，和(c)測(cè)定產(chǎn)生的光。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的至少一種碘化物源是碘鹽，優(yōu)選選自由 NaI、KI、LiI和NH4I或它們的任意組合所構(gòu)成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中的腔腸素選自由野生型腔腸素、腔腸素cp、腔 腸素f、腔腸素fcp、腔腸素h、腔腸素hep、腔腸素i、腔腸素ip和腔腸素η構(gòu)成的組。
4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述腔腸素或其類似物以2-5μΜ的濃度 出現(xiàn)在反應(yīng)混合物中，優(yōu)選出現(xiàn)在PH 7. 2-8. 0的I-IOmM濃度的EDTA緩沖溶液中。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的反應(yīng)混合物包括約0.02mM至約 500mM的碘化物。
6.一種熒光素酶檢測(cè)試劑，其包括腔腸素或其類似物與至少一種碘化物源的結(jié)合，其 中所述的試劑不包含熒光素酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑，還包括緩沖體系，非離子型洗滌劑，金屬螯合劑和/或 還原劑。
8.—種檢測(cè)樣品中熒光素酶的分析試劑盒，包括含有權(quán)利要求6或7中的熒光素酶檢 測(cè)試劑的第一容器和含有其它有用分析成分，如緩沖試劑或熒光素酶標(biāo)準(zhǔn)的第二容器，和/ 或該試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中的腔腸素選自由野生型腔腸素、腔腸素cp、腔腸 素f、腔腸素fcp、腔腸素h、腔腸素hep、腔腸素i、腔腸素ip和腔腸素η構(gòu)成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的試劑盒，其中至少一種碘化物源是碘鹽，優(yōu)選選自由 NaI、KI、Li I和NH4I構(gòu)成的組。
11.碘化物源在減少腔腸素或其類似物的自發(fā)光中的應(yīng)用，以提高使用腔腸素或其類 似物作為底物的生物發(fā)光分析系統(tǒng)中的檢測(cè)靈敏度。
全文摘要
本發(fā)明涉及用生物發(fā)光檢測(cè)酶活性的方法、試劑和試劑盒。特別涉及一種新的熒光素酶分析系統(tǒng)，其具有降低的背景發(fā)光，能提高檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明提供了一種用腔腸素或其類似物作為底物檢測(cè)樣品中熒光素酶活性的方法，其包括(a)通過(guò)使所述樣品與熒光素酶檢測(cè)試劑接觸而啟動(dòng)熒光素酶催化發(fā)光，得到反應(yīng)混合物，所述試劑包括腔腸素和至少一種其量足以減少所述腔腸素的自發(fā)光的碘化物源，(b)在適于發(fā)光的條件下培養(yǎng)所述試劑混合物，和(c)測(cè)定產(chǎn)生的光。本發(fā)明還提供該方法中所用的檢測(cè)試劑和試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/66GK101889095SQ200880114055
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日
發(fā)明者哈里·萬(wàn)·路尼 申請(qǐng)人:珀金埃爾默健康科學(xué)有限公司