專利名稱：與大麥黃矮病毒運動蛋白互作的小麥蛋白mip1及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種與植物病毒運動蛋白互作的蛋白及其編碼基因與應用，特別涉及一種與大麥黃矮病毒運動蛋白相互作用的蛋白及其編碼基因MIPl (movement protein interacting protein 1，MIP1)，以及在提高小麥對黃矮病抗性中的應用方法。
背景技術：
大麥黃矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus,BYDV)是黃癥病毒屬(Luteovirus) 的代表成員，其基因組為單鏈正義RNA分子。該病毒依靠介體蚜蟲在植株間傳播、擴散而引起小麥、大麥等禾本科作物的黃矮病。該病的流行難以預測，發(fā)病后又不可治愈，被稱為 “黃色瘟疫”。其發(fā)病癥狀表現(xiàn)為植株黃化、紅化、矮化等(Plant Disease Report, 1979,63 426-430)。其中，以大麥和小麥受害最為嚴重。在流行年份，可使大麥產量損失40%，小麥也有20%的損失，因此引起世界各個國家和地區(qū)的普遍關注。由大麥黃矮病毒引起的小麥黃矮病，也是我國華北、西北、華東等小麥主產區(qū)流行最廣危害最嚴重的病毒病之一，對麥類作物的生產造成嚴重的威脅(植物病理學報，1986，16 17-22)。20世紀60-90年代，國內外學者對大麥黃矮病毒開展了生物學、血清學、流行學等方面的研究。RochOW等根據(jù)蚜蟲宿主種類和血清學關系，將大麥黃矮病毒分為MAV、PAV, SGV、RPV、RMV、GPV、GAV 等株系(Phytopathology, 1969,59 :1580-1589)。周廣和等鑒定出 4 種在我國流行的大麥黃矮病毒株系，分別為GAV(由麥二叉蚜和麥長管蚜傳播)，GPV(由麥二叉蚜和禾縊管蚜傳播)，PAV(由禾縊管蚜和麥長管蚜傳播)和RMV(由玉米蚜傳播)(中國農業(yè)科學，1987，20 :7-1 。根據(jù)基因組結構和血清學特點將大麥黃矮病毒分為兩個亞組亞組I包括PAV，MAV和SGV株系；亞組II包括RMV和RPV株系。其中GAV在近幾年成為我國小麥生產上的主流株系(Phytopathology，1984，74 :1450-1453)。近年來，對大麥黃矮病毒的研究主要集中在BYDV不同株系的基因組結構和基因產物的功能研究上。國外主要集中在PAV和MAV株系，而國內主要是GPV和GAV株系。黃矮病毒是單鏈正義RNA病毒，基因組約為5. 71Λ。對BYDV-PAV的基因組結構研究表明PAV 基因組RNA有6個開放閱讀框(ORF)。其中，ORFl編碼一個39kDa蛋白，0RF2和ORFl通過移碼作用產生99kDa的病毒RNA聚合酶(RdRp)。ORFl和0RF2產物可能與病毒RNA轉錄有關。0RF3編碼病毒的外殼蛋白(CP)，參與外殼的組裝。0RF3中還含有一個完全重疊的編碼17kDa蛋白的0RF4，可能編碼一個運動蛋白(movement protein，MP)，與病毒的胞間移動有關。已有研究表明PAV的0RF4編碼的17kDa蛋白是病毒在植物中擴散所必需的 (Virology, 1996,219 :57-65 ；Phytopathology, 1998,88 :1031-1039)。對 GAV-MP 的生化分析表明BYDV-GAV MP具有較強的病毒RNA的結合活性，其C末端富含精氨酸的結構域負責與RNA分子的結合，N端的α螺旋結構對于MP的核膜定位是必需的(Biopolymers，2005， 79 :86-96 ；Functional Plant Biology，2008，35 :40-50)。近年來，酵母雙雜交技術成為研究病毒與寄主植物互作的有力工具。Jin等(2007)利用酵母雙雜交技術，以馬鈴薯Y病毒HC-Pro蛋白為誘餌篩選擬南芥cDNA文庫，分離出三個編碼20S蛋白酶體亞基的互作蛋白(Journal of Virology, 2007,81 12881-12888) ；Cheng等Q008)以甘蔗花葉病毒HC-Pro蛋白為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交技術篩選玉米cDNA文庫，篩選出一個編碼鐵氧還蛋白的互作蛋白，并研究了其互作對甘蔗花葉病毒侵染的影響(Journal of General Virology，2008，89 :2046-2054)。小麥是我國重要的糧食作物，由大麥黃矮病毒引起的小麥黃矮病，也是我國小麥主產區(qū)流行最廣危害最嚴重的病毒病之一，因此，開展黃矮病毒運動蛋白在病毒侵染寄主小麥過程中的作用機制的研究尤為重要。然而，目前尚未見大麥黃矮病毒運動蛋白與寄主互作機制的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種與大麥黃矮病毒運動蛋白相互作用的小麥蛋白MIPl及其編碼基因與應用；通過抑制該基因的表達能提高小麥對黃矮病的抗性。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供了一種與大麥黃矮病毒運動蛋白相互作用的蛋白MIPl (SEQ ID N0:1) 及其編碼基因(SEQ ID NO 2)；采用大麥條紋花葉病毒(BSMV)載體介導的基因沉默方法， 證實MIPl基因的沉默能夠增強小麥對黃矮病毒的抗性。本發(fā)明將在防治大麥黃矮病毒和培育抗大麥黃矮病毒的小麥新品種方面發(fā)揮重要作用。


圖1 大麥黃矮病毒運動蛋白的互作蛋白編碼基因TaMIPl的PCR擴增電泳；圖2 小麥TaMIPl與大麥黃矮病毒運動蛋白MP互作的酵母雙雜交驗證；圖3 小麥TaMIPl與大麥黃矮病毒運動蛋白MP在植物細胞中互作的雙分子熒光互補驗證；圖4 =TaMIPl基因植物沉默表達載體構建示意圖；圖5 =TaMIPl沉默表達小麥植株的分子檢測；圖6 接種大麥黃矮病毒10天后，轉染空載體小麥植株(對照)和TaMIPl沉默表達株系的抗性表現(xiàn)照片；圖7 =TaMIPl沉默表達株系與轉染空載體小麥植株(對照)接種大麥黃矮病毒后的病株率柱狀圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。1 /Jn^ MIPl (movement protein interacting protein 1， MIP1) 白勺
克隆Α.小麥葉片總RNA的分離和純化1.總RNA的提取(1)液氮研磨葉片至粉末狀，取適量加入2ml離心管中，同時加入Iml TRIZOL裂解液，震蕩混勻，室溫靜置5min。O) 4°C，12，OOOrpm離心15min，取上清于新的離心管中。
(3)加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3分鐘。(4) 40C，12，OOOrpm 離心 15min。(5)吸取上層水相400-600 μ 1，于新的離心管中。(6)加入和上步吸取液等體積的異丙醇，輕柔混勻，室溫靜置5-lOmin。(7) 4°C，12，OOOrpm離心lOmin，棄上清，RNA此時沉于管底。(8)加入Iml 75%乙醇，輕柔振蕩離心管，懸浮沉淀，室溫靜置5min。(9) 4°C，8，OOOrpm 離心 5min，盡量棄凈上清。(10)重復步驟(8)，(9) 一次。(11)室溫晾干或真空干燥5-lOmin。(12)加入40 60 μ 1 DEPC處理并高壓滅菌過的H2O溶解RNA。2. RNA的純化(以總RNA為50 μ 1為例)(1)純化體系
RNA50 μ 1DNase (RNase Free, lu/μ 1)6. 25 μ 1RNase Inhibitor0. 5 μ 10 XDNaseBuffer7. 5 μ
DEPC-H2O加至總體系100 μ 1(2) 37°C溫浴 3Omin,去除 RNA 中的 DNA。(3)力口 DEPC-H2O 至 300 μ 1。(4)加入300 μ 1的酚/氯仿(1:1)，搖勻靜置5min。(5) 4°C，12，OOOrpm 離心 15min，吸上清。(6)加入等體積的異丙醇，-20°C沉淀l_2h。(7) 4°C，12，OOOrpm 離心 lOmin，棄上清，晾干沉淀。(8)加入30 40 μ 1用DEPC處理并高壓滅菌過的H2O溶解RNA。B. RT-PCR 擴增小麥 ZmMIPl 基因1.小麥葉片第一鏈cDNA合成將所述的小麥葉片總RNA吸取1-2 μ g于1. 5ml離心管中，按照!^ermentas公司的 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit產品說明進行反轉錄，得到小麥葉片第一鏈 cDNA。2. TaMIPl 基因的 PCR 擴增以所述的第一鏈cDNA為模板，進行小麥MIPl基因的PCR擴增，得到PCR擴增產物 (圖 1)。根據(jù)前期文庫篩選得到互作陽性克隆的測序信息，獲得MIPl的部分cDNA序列，在小麥數(shù)據(jù)庫中進行EST序列拼接，獲得小麥MIPl全長的電子克隆，并依據(jù)此信息設計小麥 MIPl基因的全長cDNA引物上游引物5，-ATGGCCGCCCCGACGCCGCAG-3，；下游引物5，-CTAACTATATAAGTCGTCATC-3，。
PCR反應體系組成為 cDNA 模板(約 5Ong) 1 μ 1，上游引物2 μ 1，下游引物2 μ 1，10 XPCR Buffer 5μ 1，Ex-Taq 酶1 μ 1，IOXdNTPs :2μ 1，滅超水:37 μ 1。PCR擴增程序
94 "C5min94 0C45s -52 °C45s72 "C60 s"72 0CIOmin
35個循環(huán)將所述的PCR產物在1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠照相系統(tǒng)檢測到一條分子量約為2500bp的片段(圖1)。3.電泳結束后，用生工生物工程上海公司的膠回收試劑盒，按照產品說明回收純化所述的PCR擴增產物；經(jīng)測序驗證，與預測的片段大小一致，該基因開放閱讀框(ORF)全長 2442bp。實施例2 小麥MIPl與大麥黃矮病毒運動蛋白MP互作的酵母雙雜交驗證A. MIPl 與MP酵母雙雜交表達載體的構建以實施例1中克隆的MIPl為模板，用含有NdeI和BamHI接頭序列的特異引物進行 PCR擴增，擴增產物經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切、回收后，正向插入表達載體pGADT7 (Clontech 公司)的NdeI和BamHI位點之間，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定無誤，得到重組載體pGADT7_MIPl。引物序列如下上游引物5，-TACCATATGGCCGCCCCGACGCCGCAG-3’(SEQ ID NO 3)；下游引物5，-GATGGATCCCTAACTATATAAGTCGTCATC-3，(SEQ ID NO :4)。以實施例1中方法提取大麥黃矮病毒感染的小麥葉片總RNA，按照!^rmentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit產品說明進行反轉錄，得到小麥葉片第一鏈cDNA。以所述的第一鏈cDNA為模板(大麥黃矮病毒運動蛋白編碼基因MP)，用含有 NdeI和BamHI接頭序列的特異引物進行PCR擴增，擴增產物經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切、回收后，正向插入表達載體PGBKT7 (Clontech公司)的NdeI和BamHI位點之間，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定正確，得到重組載體PGBKT7-MP。引物序列如下上游引物5，-GATCATATGGCCCAAGGAGAGCAAG-3’(SEQ ID NO 5)；下游引物5，-TCCGGATCCTCACCGAGCTCTCCCTG-3’(SEQ ID NO :6)。B. MIPl與MP在酵母中的互作利用LiAC轉化法將重組載體pGBKT7-MP和pGADT7_MIPl分別轉化酵母菌株 AH109，發(fā)現(xiàn)對酵母細胞生長無毒性和自激活現(xiàn)象，表明可以進行互作實驗。將四種載體組合pGBKT7+pGADT7， pGBKT7+pGADT7_MIPl， pGBKT7_MP+pGADT7， pGBKT7_MP+pGADT7_MIPl共轉化AH109酵母細胞，將菌液涂在SD/-LeU/-Trp培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)至單克隆出現(xiàn)。單克隆經(jīng)擴大培養(yǎng)后，不同質粒組合的酵母菌落劃線于SD/-LeU/-Trp/-Ade/-HiS缺陷培養(yǎng)基上，觀察菌落生長狀況。圖2可以看出，只有pGBKT7-MP+pGADT7-MIPl共轉化的酵母菌落能夠在四缺培養(yǎng)基上生長，而其它三種質粒組合都不能在四缺的培養(yǎng)基上生長。這一現(xiàn)象表明， MIPl與MP能夠在酵母細胞體內發(fā)生互作。實施例3 小麥MIPl與大麥黃矮病毒運動蛋白MP在植物體內互作驗證A MIPl與MP雙分子熒光互補實驗表達載體的構建以實施例1中克隆的MIPl為模板，用含有BamHI和B10I接頭序列的特異引物進行PCR擴增，擴增產物經(jīng)BamHI和BioI雙酶切、回收后插入表達載體pSPYNE_35S的BamHI 和BioI位點之間，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定無誤，得到重組載體pSPYNE-35S-MIP 1 (簡稱 NE-MIP1)。引物序列如下上游引物5，-TACGGATCCATGGCCCAAGGAGAGCAAG-3‘(SEQ ID NO 7)；下游引物5，-GATCTCGAGCCGAGCTCTCCCTG-3’(SEQ ID NO :8)。以實施例2中獲得的運動蛋白MP基因片段為模板，用含有BamHI和B10I接頭序列的特異引物進行PCR擴增，擴增產物經(jīng)BamHI和)(h0I雙酶切、回收后，正向插入表達載體pSPYCE-35S的BamHI和BioI位點之間，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定正確，得到重組載體 PSPYCE-35S-MP (簡稱 CE-MP)。引物序列如下上游引物5，-GATGGATCCATGGCCCAAGGAGAGCAAG-3‘(SEQ ID NO 9)；下游引物5，-TCCCTCGAGCCGAGCTCTCCCTG-3’(SEQ ID NO 10)。B MIPl與MP在煙草葉肉表皮細胞中的互作利用基因槍轉化法將重組載體pSPYNE-35S-MIPl和pSPYCE_35S_MP共轉化煙草葉片，放于MS培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)24h后，利用熒光顯微鏡觀察YFP熒光蛋白的表達情況。圖 3可以看出，黃色熒光主要聚集在煙草葉肉表皮細胞的核中，因為以前的研究發(fā)現(xiàn)MP能進入細胞核(Functional Plant Biology，2008，；35 :40-50)，這一結果表明 MIPl 與 MP 在細胞體內確實發(fā)生了互作。實施例4 大麥條紋花葉病毒(BSMV)載體系統(tǒng)介導的小麥MIPl基因沉默及沉默表達小麥株系的分子檢測A植物表達載體的構建以實施例1中克隆的MIPl為模板，用兩端都含有BamHI接頭序列的特異引物進行PCR擴增，獲得MIPl部分片段(長為480bp)的擴增產物，經(jīng)BamHI單酶切、回收后，插入大麥條紋花葉病毒(BSMV) γ基因組的載體(該病毒載體的構建方法詳見Petty ITD, Hunter BG, Wei N and Jackson AO(1989)Infectious barley stripe mosaic virus RNA transcribed in vitro from full-length genomic cDNA clones. Virology 171, 342-349)的BamHI位點，得到重組載體BSMV-MIPlgs (圖4)。引物序列如下上游引物5，-TACGGATCCCTTGCAGATGACACTTGTG-3，(SEQ ID NO 11)；下游引物5，-GATGGATCCCAGACTTGAAAAGCTGAGGGTG-3‘(SEQ ID NO :12)。B BSMV-MIPlgs重組質粒轉染小麥1) BSMV 病毒載體由 pRNA α、pRNA β、pRNA γ 組成，將 BSMV :00 (pRNA α、pRNA β、pRNA Yb)體外轉錄反應液各25 μ 1混合作為對照，BSMV-MIPlgs (pRNA α、pRNA β、 PRNAy-MIPlgs)體外轉錄反應液各25 μ 1混合作為檢驗樣品。每個混合樣品中加入等體積白勺 GKP _禾中_7中1 (50mM glycine, 30mM dipotassium hydro genphosphate, pH9. 2,1% bentonite,l% celite)，混勻，接種小麥葉片。2)接種完成后，在葉片上噴灑少量滅菌水，用塑料膜罩住麥苗過夜。24h后移去，
正常培養(yǎng)。C轉染BSMV 00和BSMV-MIPlgs小麥株系的分子檢測對獲得BSMV 00和BSMV-MIPlgs小麥株系，挑選代表性的株系按照實施例1中所述的方法提取總RNA，并反轉錄成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，采用半定量RT-PCR技術進行了分子檢測(圖5)。圖5表明轉染BSMV-MIPlgs的S1-S4株系都表現(xiàn)出較好的基因沉默效果，其表達水平顯著低于BSMV 00 (對照CK)，表明我們已經(jīng)獲得了 MIPl沉默的小麥株系。根據(jù)MIPl基因全長cDNA序列設計的半定量PCR特異引物為上游引物:5，-ACACTTGTGAGGAGCCAAAG-3，(SEQID NO 13)；下游引物5，-GACGCAGTGGGAGTTCAACCAG-3，(SEQID NO 14)。PCR反應體系(25 μ 1)組成為cDNA 模板(約 25ng) :0. 5 μ 1，上游引物1μ 1，下游引物1μ 1，2XPCR Mix 12. 5 μ 1，滅超水:10μ 1。PCR擴增程序
940C3 min
94 0C20 s^
52 0C20 s ^ 30 個循環(huán)
72 °C25 s
720C10 min半定量PCR所用的小麥內參基因Tubulin的特異引物為上游引物5，-ACATCTGCCGCCGCTCCCTT-3，(SEQID NO 15)；下游引物5，-GCGCTGTTGGTGATTTCG-3，(SEQID NO 16)。PCR反應體系和程序如本實施例中所述。實施例5 =MIPl沉默表達小麥株系對黃矮病毒的抗性表現(xiàn)對實例4中獲得的小麥MIPl沉默株系和對照(轉染空載體的株系)，通過麥二叉蚜和麥長管蚜傳毒BYDV-GAV接種小麥植株，每株5頭蚜蟲，接種3d后，殺滅蚜蟲，培養(yǎng)1_2 周，觀察各株系發(fā)病情況。圖6表明，接種10天后MIPl沉默株系表現(xiàn)出較強的抗性，癥狀較輕，植株生長較好；而對照株系出現(xiàn)葉尖發(fā)黃，植株生長遲緩，生長勢明顯較弱(圖6)。 對接種病毒后的沉默株系和對照株各統(tǒng)計60株，鑒定抗感表現(xiàn)型，根據(jù)抗病表現(xiàn)計算病株率。圖7顯示，MIPl沉默株系對黃矮病毒表現(xiàn)出較高的抗性，病株率僅10%，而對照株感病較多，病株率達90% (圖7)。由此表明，通過沉默或抑制MIPl的表達可以顯著提高小麥對黃矮病毒的抗性。
應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.與大麥黃矮病毒運動蛋白互作的小麥蛋白MIP1，其氨基酸序列由SEQID NO :1定義。
2.與大麥黃矮病毒運動蛋白互作的小麥蛋白MIPl的編碼基因，其核苷酸序列由SEQ ID NO 2 定義。
3.根據(jù)權利要求1所述的與大麥黃矮病毒運動蛋白互作的小麥蛋白MIPl在提高小麥對黃矮病抗性中的應用，通過下調或沉默MIPl基因的表達，達到抑制病毒擴散，提高小麥對黃矮病毒抗性的效果。
全文摘要
本發(fā)明提供一種與大麥黃矮病毒運動蛋白相互作用的小麥蛋白(movement protein interacting protein 1，MIP1)及其編碼基因與應用。其目的是提供一種與大麥黃矮病毒運動蛋白相互作用的蛋白及其編碼基因，以及在提高小麥對黃矮病抗性中的應用方法。通過下調或沉默MIP1基因的表達達到抑制病毒擴散，提高小麥對黃矮病毒抗性的效果。MIP1在小麥抗黃矮病毒病育種方面具有廣闊的應用前景。
文檔編號A01H5/00GK102558322SQ20111041613
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月14日 優(yōu)先權日2011年12月14日
發(fā)明者吳建宇, 夏宗良, 曹汝菲, 李志敏, 王美平 申請人:河南農業(yè)大學