專(zhuān)利名稱(chēng)：與腹部疾病有關(guān)的表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在腹部疾病的診斷和治療中有用的表位，包括診斷劑、治療劑、試劑盒和使用前述的方法。
腹部疾病由免疫介導(dǎo)的對(duì)飲食谷蛋白的超敏反應(yīng)造成。小麥、黑麥、大麥和有些情況下燕麥中的谷蛋白，在腹部疾病中是毒性的。谷蛋白由小麥中的α/β、γ和ω麥醇溶蛋白和低和高分子量(LMW和HMW)麥谷蛋白，大麥中的大麥醇溶蛋白，黑麥中的黑麥醇溶蛋白，和燕麥中的燕麥蛋白組成。大麥醇溶蛋白和黑麥醇溶蛋白與小麥中的γ和ω麥醇溶蛋白和低和高分子量麥谷蛋白是同源的。燕麥蛋白在種系發(fā)生上比大麥醇溶蛋白和黑麥醇溶蛋白離小麥谷蛋白更遠(yuǎn)。
研究腹部疾病的目的是，通過(guò)定義刺激谷蛋白-特異性的T-細(xì)胞的肽來(lái)定義谷蛋白的有毒組分。谷蛋白表位的準(zhǔn)確定義，允許開(kāi)發(fā)新的診斷、治療、食物中的谷蛋白污染的測(cè)試和保留傳統(tǒng)谷蛋白的烹飪/烘烤質(zhì)量的無(wú)毒谷物。許多這樣的應(yīng)用，需要全面理解谷蛋白中的全部而不是最常見(jiàn)的有毒肽。
與大約35％一般高加索人口相比，編碼HLA-DQ2和/或HLA-DQ8的基因存在于超過(guò)99％患有腹部疾病的個(gè)體中。谷蛋白-衍生的結(jié)合HLA-DQ2或HLA-DQ8的肽(表位)刺激特定的T-細(xì)胞。HLA-DQ2和DQ8-限制的表位包括“核心”9氨基酸序列，其直接與HLA-DQ2或DQ8的肽結(jié)合溝和同源的T-細(xì)胞受體相互作用。通常，含有抗原中的所有獨(dú)特的10或12聚體肽的重疊肽(通常15-20聚體)文庫(kù)，已經(jīng)用于繪制HLA II類(lèi)-限制的T-細(xì)胞表位的圖譜。
已知一系列的谷蛋白肽在腹部疾病中激活谷蛋白特異性的T-細(xì)胞。以前的研究已經(jīng)從選擇的谷蛋白或谷蛋白消化物中鑒別出了谷蛋白肽。從腸活組織檢查分離的T-細(xì)胞克隆和系，已經(jīng)用于篩選這些谷蛋白組分。
酶(存在于腸組織中的組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG))對(duì)谷蛋白的修飾相當(dāng)大地增加谷蛋白對(duì)谷蛋白特異性的T-細(xì)胞的刺激能力。谷蛋白-特異性的T-細(xì)胞的大多數(shù)已知表位，對(duì)應(yīng)著tTG-脫酰胺的谷蛋白肽。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶介導(dǎo)谷蛋白中的特定谷氨酰胺殘基的脫酰胺作用(生成谷氨酸)。對(duì)tTG的脫酰胺作用易感的含有谷氨酰胺的序列通常符合基序QXPX或QXX(FYMILVW)，(見(jiàn)Vader W.等2002J.Exp.Med.195643-649，PCT WO 03/066079和Fleckenstein B.2002.J Biol Chem27734109-16)。結(jié)合HLA-DQ2且對(duì)tTG的脫酰胺作用易感的肽的基序，已經(jīng)用于預(yù)測(cè)某些谷蛋白表位(Vader等J Exp Med 2002 J.Exp.Med.195643-649，PCT WO 03/066079)。
但是，其它組已經(jīng)使用一系列11種重組α/β(11)和5種γ麥醇溶蛋白(Arentz-Hansen H.2000.J.Exp.Med.191603-612，Arentz-Hansen H.2002.Gastroenterology 123803-809，PCT WO 02/083722)和純化的谷蛋白蛋白的裂解物(Sjostrom H.等1998.Scand.J.Immunol.48，111-115；van de Wal，Y.等1998.J.Immunol.161(4)1585-1588；van de Wal，Y.等1999.Eur.J.Immunol.293133-3139；Vader W.等2002.Gastroenterology 1221729-1737.)，鑒別出了谷蛋白-特異性的腸T-細(xì)胞克隆和系的表位。
我們的工作已利用了下述發(fā)現(xiàn)，即谷蛋白體內(nèi)攻擊誘導(dǎo)外周血中表達(dá)腸-歸巢的整聯(lián)蛋白(α4β7)的HLA-DQ2限制的CD4+谷蛋白-特異性的T-細(xì)胞。該技術(shù)允許對(duì)A-麥醇溶蛋白(57-73QE65)中的優(yōu)勢(shì)表位繪制圖譜(Anderson，RP等2000.Nat.Med.6337-342.，WO 01/25793)。A-麥醇溶蛋白57-73QE65對(duì)應(yīng)著使用腸T-細(xì)胞克隆鑒別出的2種重疊表位(Arentz-Hansen H.等2000.J.Exp.Med.191603-612，Arentz-Hansen H.等2002.Gastroenterology 123803-809)。體內(nèi)谷蛋白攻擊誘導(dǎo)谷蛋白特異性的T-細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是，可以消耗任意的食物，且得到的在血液中誘導(dǎo)的T-細(xì)胞(使用簡(jiǎn)單的過(guò)夜干擾素γELISPOT測(cè)定，在外周血中定量的)，會(huì)受到內(nèi)源地存在的表位的體內(nèi)刺激，而不是由合成的或純化的抗原體外預(yù)處理。新鮮的多克隆的外周血T-細(xì)胞的過(guò)夜測(cè)定，也會(huì)避免與T-細(xì)胞克隆的非常長(zhǎng)的純化有關(guān)的假象的可能性。
有趣地，對(duì)幾種γ-麥醇溶蛋白表位特異性的T-細(xì)胞克隆和系(Arentz-Hansen H.2002.Gastroenterology 123803-809，PCT WO02/083722)與最初定義的A-麥醇溶蛋白表位57-73QE65交叉反應(yīng)。
盡管在α/β麥醇溶蛋白中存在相當(dāng)大的同源性，但早期的工作(見(jiàn)WO 03/104273)已經(jīng)表明，在HLA-DQ2-相關(guān)的腹部疾病中識(shí)別出的優(yōu)勢(shì)表位“A-麥醇溶蛋白57-73QE65”，是由Genbank中存在的少數(shù)α/β麥醇溶蛋白編碼的。
發(fā)明概述本研究的目的是開(kāi)發(fā)一種方法，其允許對(duì)谷蛋白中的所有T-細(xì)胞表位繪制圖譜。使用小麥面包(每天200g，持續(xù)3天)或燕麥(每天100g，持續(xù)3天)的消耗，誘導(dǎo)外周血中的谷蛋白或燕麥蛋白-特異性的T-細(xì)胞(在開(kāi)始攻擊后6天收集)。使用谷蛋白和燕麥蛋白肽文庫(kù)，包括在小麥谷蛋白和/或燕麥的燕麥蛋白的每個(gè)Genbank登記項(xiàng)中包含的所有獨(dú)特的12聚體序列，在過(guò)夜干擾素γELISPOT測(cè)定中評(píng)價(jià)外周血單核細(xì)胞(PBMC)。通過(guò)確立一種算法，以設(shè)計(jì)跨過(guò)Genbank中的谷蛋白的所有潛在表位的肽(2922個(gè)20聚體包括所有14964獨(dú)特的9聚體-潛在的T-細(xì)胞表位)，將干擾素-γELISPOT測(cè)定修改成能用單一個(gè)體血液篩選超過(guò)1000種肽的高通量測(cè)定，并開(kāi)發(fā)用于分析和解釋產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)工具，可以實(shí)現(xiàn)該目的。
將小麥谷蛋白肽的一系列的41個(gè)“超家族”鑒別為推定的T-細(xì)胞表位。超家族共有基序，其中允許有限水平的冗余。許多最有效的家族包括已知的T-細(xì)胞表位，其中包括以前描述的優(yōu)勢(shì)表位A-麥醇溶蛋白57-73。
通過(guò)使用谷蛋白攻擊后的PBMC，對(duì)谷蛋白表位詳盡地繪制圖譜，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了與HLA-DQ2和HLA-DQ8有關(guān)的腹部疾病的一系列新的麥醇溶蛋白、LMW和HMW麥谷蛋白和燕麥蛋白表位。為HLA-DQ2和HLA-DQ8-相關(guān)的腹部疾病，鑒別了新表位。在識(shí)別的T-細(xì)胞表位的范圍方面，HLA-DQ2和HLA-DQ8相關(guān)的腹部疾病在遺傳上和功能上是不同的。另外，在HLA-DQ2+腹部疾病受試者中進(jìn)行燕麥攻擊后，存在于燕麥的燕麥蛋白中的3種肽也會(huì)激活外周血單核細(xì)胞(PBMC)，首次定義了燕麥表位。體內(nèi)燕麥攻擊后由T-細(xì)胞識(shí)別的燕麥蛋白肽的鑒別，提供了觀察到的燕麥暴露后腹部疾病的偶然復(fù)發(fā)的分子基礎(chǔ)(Lundin KEA等2003Gut 521649-52)，并可以提供燕麥的預(yù)測(cè)性診斷或遺傳解毒作用的基礎(chǔ)。
這里顯示的數(shù)據(jù)會(huì)提供詳盡的基礎(chǔ)，用于定義腹部疾病中常見(jiàn)的“優(yōu)勢(shì)的”和偶然的“較弱的”T-細(xì)胞表位。該信息是諸如診斷、食品測(cè)試、免疫治療和預(yù)防的功能應(yīng)用的平臺(tái)，和用于設(shè)計(jì)在改良的谷物中有用的無(wú)毒的谷蛋白的平臺(tái)。
具體地，通過(guò)谷蛋白T細(xì)胞表位的詳盡繪圖，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有類(lèi)似的核心序列(例如，SEQ ID NO1-199)和類(lèi)似的延伸序列(例如，SEQ ID NO200-1554、1555-1655、1656-1671和1830-1903)的小麥麥醇溶蛋白和麥谷蛋白中的在HLA-DQ2+患者的腹部疾病中有生物活性的表位。發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了下述物質(zhì)中的在HLA-DQ2+患者的腹部疾病中有生物活性的表位具有類(lèi)似的核心序列(例如，SEQ ID NO1684-1695)和類(lèi)似的延伸序列(例如，SEQ ID NO1672-1683、1696-1698和1764-1768)的燕麥的燕麥蛋白；黑麥的黑麥醇溶蛋白(SEQ ID NO1769-1786)；和大麥的大麥醇溶蛋白(SEQID NO1787-1829)。另外，在具有類(lèi)似的核心序列(例如，SEQ ID NO1699-1721)和類(lèi)似的延伸序列(例如，SEQ ID NO1722-1763和1908-1927)的小麥麥醇溶蛋白中已經(jīng)鑒別出了在HLA-DQ8+患者的腹部疾病中有生物活性的表位。因而，該詳盡的繪圖提供了腹部疾病患者中由T細(xì)胞識(shí)別的優(yōu)勢(shì)表位。因而使用這些鑒別出的表位、其類(lèi)似物和等價(jià)物中的任一種，可以實(shí)現(xiàn)本文所述的本發(fā)明的方法。也就是說(shuō)，本發(fā)明的試劑包括這些表位。另外，已經(jīng)表明，表位的組合即“combitope”或包含2個(gè)或更多個(gè)表位的單個(gè)肽誘導(dǎo)與單獨(dú)的表位等價(jià)的反應(yīng)，從而表明幾個(gè)表位可以用于本發(fā)明的治療、診斷和其它用途。這樣的combitope可以是例如SEQ ID NO1906的形式。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑包括一個(gè)或多個(gè)具有在SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中列出的序列的表位，如本文定義的其類(lèi)似物和等價(jià)物。
優(yōu)選的在HLA-DQ8+患者的腹部疾病中有生物活性的試劑在序列中具有谷氨酰胺，其指示著對(duì)脫酰胺作用的易感性，其與也對(duì)脫酰胺作用易感的第二個(gè)谷氨酰胺由7個(gè)殘基隔開(kāi)(例如，如在QGSFQPSQQ中發(fā)現(xiàn)的)，其中在tTG的脫酰胺作用后，脫酰胺的序列是HLA-DQ8的高親和力結(jié)合劑(HLA-DQ8的結(jié)合基序偏好在位置1和9處的谷氨酸)。在一個(gè)次優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑具有對(duì)脫酰胺作用易感的谷氨酰胺殘基，但是與對(duì)tTG-介導(dǎo)的脫酰胺作用易感的第二個(gè)谷氨酰胺之間沒(méi)有被7個(gè)殘基隔開(kāi)。
因而，本發(fā)明提供了診斷個(gè)體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包含下述步驟(a)使來(lái)自宿主的樣品接觸選自下述的試劑(i)表位，其包含選自SEQ ID NO1-1927，優(yōu)選選自SEQ IDNO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的氨基酸序列，或來(lái)自天然產(chǎn)生的谷蛋白的等價(jià)序列，(ii)(i)的類(lèi)似物，其能被識(shí)別(i)的T細(xì)胞受體識(shí)別，在肽類(lèi)似物的情況下，它的長(zhǎng)度不超過(guò)50個(gè)氨基酸，或(iii)產(chǎn)物，其包含兩種或更多種如(i)或(ii)中所定義的試劑；和(b)體外測(cè)定樣品中的T細(xì)胞是否識(shí)別該試劑，其中T細(xì)胞的識(shí)別指示著該個(gè)體患有或易感腹部疾病。
術(shù)語(yǔ)“谷蛋白”包括小麥中的α/β、γ和ω麥醇溶蛋白，和低和高分子量(LMW和HMW)麥谷蛋白，大麥中的大麥醇溶蛋白，黑麥中的黑麥醇溶蛋白，和燕麥中的燕麥蛋白。本發(fā)明特別地涉及麥醇溶蛋白和燕麥蛋白。
本發(fā)明也提供了試劑在制備用于診斷個(gè)體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒ㄖ械脑\斷工具中的用途，所述方法包含，測(cè)定個(gè)體的T細(xì)胞是否識(shí)別該試劑，其中T細(xì)胞的識(shí)別指示著該個(gè)體患有或易感腹部疾病。
被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾的表位的發(fā)現(xiàn)，也允許基于測(cè)定是否存在針對(duì)這些表位的其它類(lèi)型的免疫反應(yīng)來(lái)診斷腹部疾病。因而，本發(fā)明也提供了診斷個(gè)體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包含測(cè)定來(lái)自個(gè)體的樣品中能結(jié)合表位的抗體的存在，其中抗體的存在指示著該個(gè)體患有或易感腹部疾病。
本發(fā)明提供了測(cè)定組合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含測(cè)定組合物中是否存在能被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成如上定義的寡肽序列的蛋白，其中所述蛋白的存在指示著該組合物能造成腹部疾病。
本發(fā)明也提供了突變的谷蛋白，其野生型序列可被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成包含表位的序列，所述表位包含如上定義的序列，但是該突變的谷蛋白已經(jīng)被修飾，該修飾方式使它不含有可以被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成包含這樣的包含所述序列的表位的序列的序列；或這樣的突變的谷蛋白的片段，其長(zhǎng)度為至少7個(gè)氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸長(zhǎng))，且其包含已經(jīng)以所述方式修飾的序列。
本發(fā)明也提供了蛋白，其包含能結(jié)合T細(xì)胞受體的序列，該T細(xì)胞受體識(shí)別試劑，且該序列能造成攜帶這樣的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的拮抗作用。
另外，本發(fā)明提供了包含如上定義的蛋白的食物。
另外，本發(fā)明提供了試劑，其任選地與載體相結(jié)合，用于通過(guò)使識(shí)別試劑的T細(xì)胞耐受來(lái)治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。還提供了具有識(shí)別(i)的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的拮抗劑，其任選地與載體相結(jié)合，用于通過(guò)拮抗這樣的T細(xì)胞來(lái)治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。另外，提供了結(jié)合抗體(其結(jié)合試劑)的試劑或類(lèi)似物，其用于通過(guò)使個(gè)體耐受以預(yù)防這樣的抗體的生成來(lái)治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。
本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個(gè)體施用至少一種選自下述的試劑a)肽，其包含至少一個(gè)表位，所述表位包含選自SEQ ID NO1-1927，優(yōu)選地選自SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的序列，和其等價(jià)物；和b)a)的類(lèi)似物，其能被識(shí)別a)的肽的T細(xì)胞受體識(shí)別，且其長(zhǎng)度不超過(guò)50個(gè)氨基酸。在有些實(shí)施方案中，試劑是HLA-DQ2-限制的、HLA-DQ8-限制的，或一種試劑是HLA-DQ2-限制的，且第二種試劑是HLA-DQ8-限制的。在有些實(shí)施方案中，試劑包含小麥表位、燕麥表位、黑麥表位、大麥表位或其任意組合，或者是作為單一試劑或者是作為復(fù)合試劑。
本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個(gè)體施用藥物組合物，所述組合物包含如上定義的試劑和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個(gè)體施用藥物組合物，所述組合物包含具有如上定義的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的拮抗劑，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個(gè)體施用組合物，以用于使個(gè)體耐受谷蛋白，以抑制生成對(duì)如上定義的試劑的T細(xì)胞或抗體反應(yīng)，該組合物包含如上定義的試劑。
本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，這通過(guò)下述來(lái)實(shí)現(xiàn)1)診斷個(gè)體的腹部疾病，這通過(guò)下述來(lái)實(shí)現(xiàn)a)使來(lái)自宿主的樣品接觸至少一種選自下述的試劑i)肽，其包含至少一個(gè)表位，所述表位包含選自SEQ ID NO1-1927，優(yōu)選地選自SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的序列，和其等價(jià)物；和ii)i)的類(lèi)似物，其能被識(shí)別i)的T細(xì)胞受體識(shí)別，且其長(zhǎng)度不超過(guò)50個(gè)氨基酸；和體外測(cè)定樣品中的T細(xì)胞是否識(shí)別該試劑；T細(xì)胞的識(shí)別指示著個(gè)體患有或易感腹部疾?。换騜)施用如上定義的試劑，和體內(nèi)測(cè)定個(gè)體中的T細(xì)胞是否識(shí)別該試劑，其中試劑的識(shí)別指示著個(gè)體患有或易感腹部疾??；和2)給診斷為患有或易感腹部疾病的個(gè)體，施用用于預(yù)防或治療腹部疾病的治療劑。
本發(fā)明也提供了如上定義的試劑，其任選地與載體相結(jié)合，以用于通過(guò)使識(shí)別試劑的T細(xì)胞耐受來(lái)治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。
本發(fā)明也提供了具有如上定義的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的拮抗劑，其任選地與載體相結(jié)合，以用于通過(guò)拮抗這樣的T細(xì)胞來(lái)治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。
本發(fā)明也提供了蛋白，其包含能結(jié)合T細(xì)胞受體的序列，該T細(xì)胞受體識(shí)別如上定義的試劑，且該序列能造成攜帶這樣的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的拮抗作用。
本發(fā)明也提供了藥物組合物，其包含如上定義的試劑或拮抗劑，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明也提供了組合物，其用于使個(gè)體耐受谷蛋白，以抑制生成對(duì)如上定義的試劑的T細(xì)胞或抗體反應(yīng)，該組合物包含如上定義的試劑。
本發(fā)明也提供了組合物，其用于拮抗對(duì)如上定義的試劑的T細(xì)胞反應(yīng)，該組合物包含如上定義的拮抗劑。
本發(fā)明也提供了突變的谷蛋白，其野生型序列可以被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成作為如上定義的試劑的序列，該突變的谷蛋白包含一個(gè)突變，所述突變可以預(yù)防它被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成作為如上定義的試劑的序列；或這樣的突變的谷蛋白的片段，其長(zhǎng)度為至少7個(gè)氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸長(zhǎng))，且其包含該突變。
本發(fā)明也提供了多核苷酸，其包含編碼如上定義的蛋白或片段的編碼序列。
本發(fā)明也提供了細(xì)胞，其包含如上定義的多核苷酸，或其已經(jīng)被這樣的多核苷酸轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明也提供了哺乳動(dòng)物，其表達(dá)如上定義的T細(xì)胞受體。
本發(fā)明也提供了診斷個(gè)體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包含a)使來(lái)自宿主的樣品接觸至少一種選自下述的試劑i)肽，其包含至少一個(gè)表位，所述表位包含選自SEQ ID NO1-1927，優(yōu)選地選自SEQ ID NOSEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的序列，和其等價(jià)物；和ii)i)的類(lèi)似物，其能被識(shí)別i)的T細(xì)胞受體識(shí)別，且其長(zhǎng)度不超過(guò)50個(gè)氨基酸；和b)體外測(cè)定樣品中的T細(xì)胞是否識(shí)別該試劑；T細(xì)胞的識(shí)別指示著該個(gè)體患有或易感腹部疾病。
本發(fā)明也提供了測(cè)定該組合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含測(cè)定組合物中是否存在能被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成寡肽序列的蛋白，其中蛋白的存在指示著該組合物能造成腹部疾病。
本發(fā)明也提供了鑒別T細(xì)胞的拮抗劑的方法，該T細(xì)胞識(shí)別如上定義的試劑，所述方法包含使候選物質(zhì)接觸T細(xì)胞，和檢測(cè)該物質(zhì)是否造成T細(xì)胞經(jīng)歷抗原特異性的反應(yīng)的能力的降低，其中所述能力的任何這樣的降低的檢測(cè)，指示著所述物質(zhì)是拮抗劑。
本發(fā)明也提供了用于實(shí)施上述的任一種方法的試劑盒，其包含如上定義的試劑和用于檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)肽的識(shí)別的工具。
本發(fā)明也提供了鑒別作為腹部疾病的治療劑的產(chǎn)物的方法，其包含給如上定義的患有或易感腹部疾病的哺乳動(dòng)物施用候選物質(zhì)，并測(cè)定該物質(zhì)是否預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中的腹部疾病，其中腹部疾病的預(yù)防或治療指示著該物質(zhì)是治療產(chǎn)物。
本發(fā)明也提供了生產(chǎn)由如上定義的編碼序列編碼的蛋白的方法，該方法包含a)在允許表達(dá)蛋白的條件下，培養(yǎng)上述的細(xì)胞；和任選地b)回收表達(dá)的蛋白。
本發(fā)明也提供了得到轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞的方法，其包含用如上所述的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了得到第一代轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包含再生用如上所述的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞，以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明也提供了得到轉(zhuǎn)基因植物種子的方法，其包含從可如上得到的轉(zhuǎn)基因植物得到轉(zhuǎn)基因種子。
本發(fā)明也提供了得到轉(zhuǎn)基因后代植物的方法，其包含從可由如上所述的方法得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，得到第二代轉(zhuǎn)基因后代植物，并任選地從由此得到的第二代后代植物，得到再后一代或多代的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明也提供了可由任一種上述的方法得到的轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞、植物、植物種子或后代植物。
本發(fā)明也提供了轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，其包含如上所述的植物細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞愈傷組織，其包含如上所述的可從如上定義的轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞、第一代植物、植物種子或后代得到的植物細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了得到作物產(chǎn)物的方法，其包含從根據(jù)任一種上述的方法的植物收獲作物產(chǎn)物，和任選地進(jìn)一步加工收獲的產(chǎn)物。
本發(fā)明也提供了食物，其包含如上定義的蛋白。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了從一組蛋白產(chǎn)生所有可能的肽表位的方法。
圖2顯示了在2003年6月16日的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的谷蛋白基因產(chǎn)物的Genbank登記號(hào)。
圖3A顯示了分析來(lái)自ELISpot的數(shù)據(jù)的期望最大化(EM)算法。
圖3B顯示了對(duì)腹部疾病患者的數(shù)據(jù)集的測(cè)試。
圖4顯示了發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性表位的最小集的迭代過(guò)程。
圖5顯示了麥醇溶蛋白和麥谷蛋白序列(SEQ ID NO1-1554)。在“一致”列中，小寫(xiě)字母使用標(biāo)準(zhǔn)的單字母氨基酸代碼，但是大寫(xiě)字母具有不同的含義E＝[e或q]，F(xiàn)＝[f或y或w]，I＝[i或l或v]，S＝[s或t]，R＝[r或k或h]?！靶蛄小绷惺褂脴?biāo)準(zhǔn)的單字母氨基酸代碼。
圖6顯示了在HLA-DQ2+腹部疾病志愿者中谷蛋白攻擊后6天收集的PBMC中，刺激γ干擾素的谷蛋白肽(SEQ ID NO1555-1655)。標(biāo)示的9聚體是200組生物活性的“結(jié)構(gòu)上”有關(guān)的20聚體肽共有的。根據(jù)受試者反應(yīng)的生物活性X比例，排列谷蛋白序列。
圖7顯示了小麥攻擊實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(SEQ ID NO1656-1671)。在小麥攻擊后，這些肽在10位受試者(A-J)中產(chǎn)生高質(zhì)量反應(yīng)(標(biāo)示‘Y’)。
圖8顯示了在HLA-DQ2+腹部疾病志愿者中谷蛋白攻擊后6天收集的PBMC中，刺激干擾素-γ的燕麥蛋白肽(+/-tTG的脫酰胺作用)(SEQ ID NO1672-1698)。標(biāo)有*的那些是燕麥攻擊后誘導(dǎo)IFN-γ的最佳的獨(dú)特的20聚體。
圖9顯示了在2位根據(jù)共有的核心序列分組的HLA-DQ8(不是HLA-DQ2)受試者中最有效的40種20聚體(SEQ ID NO1699-1763)。組6的核心序列(QGSFQPSQQ)對(duì)應(yīng)著van de Wal等(J.Immunol.1998，161(4)1585-1588)所述的α-麥醇溶蛋白表位。受試者A中的最大反應(yīng)是271SFC(單獨(dú)的介質(zhì)，沒(méi)有肽反應(yīng)4SFC)，且在B中，是26SFC(單獨(dú)的介質(zhì)，沒(méi)有肽反應(yīng)1SFC)。
圖10顯示了基于氨基酸測(cè)序的A-麥醇溶蛋白(SEQ ID NO1928)的氨基酸序列。
發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)“腹部疾病”包括通過(guò)改變谷蛋白敏感度的程度造成的多種狀況，其包括特征在于扁平小腸粘膜(增生性絨毛萎縮)的嚴(yán)重形式和特征在于輕癥狀的其它形式。
上面(在診斷或治療的上下文中)提及的個(gè)體是人。他們可能患有或被懷疑患有腹部疾病(有癥狀的或無(wú)癥狀的)。他們可能采用無(wú)谷蛋白的飲食。他們可能是在急性期反應(yīng)中(例如，他們可能患有腹部疾病，但是在最近的24小時(shí)，僅僅攝入谷蛋白，然后他們采用無(wú)谷蛋白的飲食14-28天)。
個(gè)體可能易感腹部疾病，例如遺傳易感性(例如通過(guò)有患有腹部疾病的親戚或具有會(huì)造成對(duì)腹部疾病的素因的基因的個(gè)體來(lái)確定)。
試劑試劑一般地是肽，例如長(zhǎng)為7-50個(gè)氨基酸，例如長(zhǎng)為10-40、12-35或15-30個(gè)氨基酸。
試劑可以是由SEQ ID NO1-1927中的任一個(gè)代表的肽，或包含序列的表位，所述序列包含SEQ ID NO1-1927中的任一個(gè)，其是分離的源自谷蛋白蛋白的寡肽；或來(lái)自天然產(chǎn)生的谷蛋白蛋白的這些序列的等價(jià)物。在本發(fā)明的另一組實(shí)施方案中，試劑是燕麥谷蛋白的任意肽表位(例如，燕麥蛋白的任意T細(xì)胞表位)。
優(yōu)選地，試劑是由SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個(gè)代表的肽，或包含序列的表位，所述序列包含SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個(gè)，其是分離的源自谷蛋白的寡肽；或來(lái)自天然產(chǎn)生的谷蛋白的這些序列的等價(jià)物。
因而，表位可以是天然產(chǎn)生的谷蛋白的衍生物，尤其是來(lái)自小麥或燕麥谷蛋白。這樣的衍生物一般地是谷蛋白的片段，或整個(gè)蛋白或片段的突變的衍生物。因此，本發(fā)明的表位不包括天然產(chǎn)生的整個(gè)谷蛋白，且不包括其它的整個(gè)的天然產(chǎn)生的谷蛋白。
一般地，這樣的片段長(zhǎng)為至少7個(gè)氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸長(zhǎng))。
一般地，在本文所述的使用來(lái)自腹部疾病患者的樣品的任意測(cè)定中，T細(xì)胞會(huì)以至少與識(shí)別片段所來(lái)源的試劑相同的程度識(shí)別這樣的片段。
試劑可以是由SEQ ID NO1-1927中的任一個(gè)代表的肽，優(yōu)選地由SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個(gè)代表的肽，或蛋白，所述蛋白包含與SEQ ID NO1-1927中的任一個(gè)相對(duì)應(yīng)的序列，優(yōu)選地包含與SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個(gè)相對(duì)應(yīng)的序列(例如包含SEQ ID NO1-1927中的任一個(gè)，優(yōu)選地包含SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個(gè)的谷蛋白片段，例如，在已經(jīng)用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理谷蛋白后)。這樣的序列的生物活性的片段，也是本發(fā)明的試劑。一般地，這樣的片段長(zhǎng)為至少7個(gè)氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸長(zhǎng))。與SEQ ID NO1-1927中的任一個(gè)等價(jià)的序列或這些序列的類(lèi)似物，也是本發(fā)明的試劑。
在表位包含與來(lái)自另一種谷蛋白(例如，任一種本文提及的谷蛋白或任一種會(huì)造成腹部疾病的谷蛋白)的上述表位(包括片段)等價(jià)的序列的情況下，這樣的等價(jià)序列對(duì)應(yīng)著一般地用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(部分地或完全地)處理的谷蛋白的片段。通過(guò)比對(duì)其它谷蛋白和原始表位所來(lái)源的谷蛋白的序列(例如，使用任一種本文提及的程序)，可以確定這樣的等價(jià)肽。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是可商業(yè)上得到的(例如，SigmaT-5398)。
作為類(lèi)似物的試劑能被識(shí)別(i)的TCR識(shí)別。因此，通常當(dāng)在存在(i)的情況下，且一般地，也在抗原呈遞細(xì)胞(APC)(例如本文提及的APC中的任一種)存在的情況下，將類(lèi)似物添加給T細(xì)胞時(shí)，類(lèi)似物抑制(i)的識(shí)別，即類(lèi)似物能在這樣的系統(tǒng)中與(i)競(jìng)爭(zhēng)。
類(lèi)似物可以是能結(jié)合識(shí)別(i)的TCR的一種類(lèi)似物。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，可以檢測(cè)這樣的結(jié)合。從已經(jīng)表明能識(shí)別(i)的T細(xì)胞，可以分離這樣的TCR(例如，使用本發(fā)明的方法)。然后，通過(guò)測(cè)定TCR是否抑制類(lèi)似物與結(jié)合類(lèi)似物的物質(zhì)(例如，類(lèi)似物的抗體)的結(jié)合，可以證實(shí)類(lèi)似物與TCR的結(jié)合，一般地，在這樣的結(jié)合測(cè)定的抑制中，類(lèi)似物結(jié)合于II類(lèi)MHC分子(例如HLA-DQ2)。
一般地，類(lèi)似物抑制(i)與TCR的結(jié)合。在該情況下，在有類(lèi)似物存在下，可以結(jié)合TCR的(i)的量會(huì)減少。這是因?yàn)椋?lèi)似物能結(jié)合TCR，并因此與(i)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TCR。
從腹部疾病患者中，可以分離出在上面的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中使用的T細(xì)胞，例如，在本發(fā)明的方法的輔助下。類(lèi)似物的其它結(jié)合特征也可以與(i)相同，并且因而一般地，類(lèi)似物結(jié)合與肽結(jié)合的相同的MHC II類(lèi)分子(HLA-DQ2或-DQ8)。一般地，類(lèi)似物結(jié)合對(duì)(i)特異性的抗體，并從而抑制(i)與這樣的抗體的結(jié)合。
一般地，類(lèi)似物是肽。它可以與(i)具有同源性，一般地，與(i)具有至少70％同源性，優(yōu)選地至少80、90％、95％、97％或99％同源性，例如，在至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個(gè)鄰接氨基酸的區(qū)域內(nèi)(例如類(lèi)似物和/或(i)的整個(gè)長(zhǎng)度，或跨過(guò)接觸TCR或結(jié)合MHC分子的區(qū)域)。測(cè)量蛋白同源性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，在上下文中，在氨基酸同一性(有時(shí)稱(chēng)作“硬同源性(hard homology)”)的基礎(chǔ)上，計(jì)算同源性。
例如，UWGCG包提供了BESTFIT程序，其可以用于計(jì)算同源性(例如，在它的缺省設(shè)置下使用)(Devereux等(1984)Nucleic AcidsResearch 12，p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用于計(jì)算同源性或比對(duì)序列(一般地，在它的缺省設(shè)置下)，例如，如AltschulS.F.(1993)J Mol Evol 36290-300；Altschul，S，F(xiàn)等(1990)J Mol Biol215403-10所述。
在環(huán)球網(wǎng)上，通過(guò)因特網(wǎng)在例如“www.ncbi.nlm.nih.gov/”，可以從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公開(kāi)地得到進(jìn)行BLAST分析的軟件。該算法包含，首先通過(guò)鑒別查詢(xún)序列中長(zhǎng)為W的短字，其在與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)，會(huì)匹配或滿(mǎn)足一些正值閾分?jǐn)?shù)T，來(lái)鑒別高分序列對(duì)(HSP)。T被稱(chēng)作相鄰字分?jǐn)?shù)閾(Altschul等，同上)。這些初步的相鄰字命中值(hit)作為開(kāi)始搜索的種子，以發(fā)現(xiàn)含有它們的HSP。字命中值沿著每個(gè)序列向兩方盡可能遠(yuǎn)地延伸，只要可以增加累積比對(duì)分?jǐn)?shù)。在下述情況下，終止字命中值在每個(gè)方向的延伸累積比對(duì)分?jǐn)?shù)從它達(dá)到的最大值下降量X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)分?jǐn)?shù)殘基比對(duì)的積累，累積分?jǐn)?shù)達(dá)到0或以下；或達(dá)到任一個(gè)序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定著比對(duì)的敏感度和速度。BLAST程序使用下述缺省值字長(zhǎng)度(W)為11，BLOSUM62評(píng)分矩陣(見(jiàn)Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)比對(duì)(B)為50，期望(E)為10，M＝5，N＝4，且對(duì)比兩條鏈。
BLAST算法進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；見(jiàn)例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787。BLAST算法提供的相似性的一種度量是最小總和概率(P(N))，其指示著兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列偶然發(fā)生匹配的概率。例如，如果在將第一個(gè)序列與另一個(gè)序列相比較時(shí)，最小總和概率小于約1，優(yōu)選地小于約0.1，更優(yōu)選地小于約0.01，且最優(yōu)選地小于約0.001，則認(rèn)為序列與另一個(gè)序列類(lèi)似。
一般地，同源的肽類(lèi)似物與(i)的差異在于1、2、3、4、5、6、7、8或更多個(gè)突變(其可以是取代、缺失或插入)。關(guān)于計(jì)算同源性，可以跨過(guò)上述區(qū)域中的任一個(gè)，測(cè)量這些突變。取代優(yōu)選地是“保守的”。根據(jù)下表，定義它們。在第二列的相同單元中的氨基酸，且優(yōu)選地在第三列的相同行中的氨基酸，可以彼此取代。
一般地，在與(i)中的氨基酸等價(jià)位置處的類(lèi)似物中的氨基酸，是相同的或保守的，其有助于結(jié)合MHC分子或負(fù)責(zé)被TCR識(shí)別。
一般地，類(lèi)似物肽包含一個(gè)或多個(gè)修飾，其可以是天然的翻譯后修飾或人工修飾。修飾可以提供化學(xué)部分(一般地，通過(guò)氫、例如C-H鍵中的氫的取代)，例如氨基、乙?；⒘u基或鹵素(例如，氟)基團(tuán)或碳水化合物基團(tuán)。一般地，修飾存在于N或C末端。
類(lèi)似物可以包含一個(gè)或多個(gè)非天然的氨基酸，例如具有與天然氨基酸不同的側(cè)鏈的氨基酸。通常，非天然的氨基酸具有N末端和/或C末端。非天然的氨基酸可以是L-或D-氨基酸。
一般地，類(lèi)似物具有與(i)基本上類(lèi)似的形狀、大小、柔性或電子構(gòu)型。一般地，它是(i)的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，類(lèi)似物是融合蛋白，其包含SEQ ID NO1-1927中的任一個(gè)的序列和非-谷蛋白序列。優(yōu)選地，根據(jù)該實(shí)施方案的類(lèi)似物是融合蛋白，其包含SEQ IDNO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個(gè)的序列和非-谷蛋白序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，類(lèi)似物是或模仿結(jié)合MHC II類(lèi)分子的(i)。2、3、4或更多個(gè)這樣的復(fù)合物可以彼此締合或結(jié)合，例如，使用基于生物素/鏈霉抗生物素蛋白的系統(tǒng)，一般地，其中2、3或4個(gè)生物素標(biāo)記的MHC分子結(jié)合一個(gè)鏈霉抗生物素蛋白部分。一般地，該類(lèi)似物抑制(i)/MHC II類(lèi)復(fù)合物與對(duì)該復(fù)合物特異性的TCR或抗體的結(jié)合。
一般地，類(lèi)似物是抗體或抗體的片段，例如Fab或F(ab′)2片段?？梢詫㈩?lèi)似物固定化到固體支持物上，尤其是模仿結(jié)合MHC分子的肽的類(lèi)似物。
一般地，通過(guò)計(jì)算機(jī)方法設(shè)計(jì)類(lèi)似物，并然后使用本領(lǐng)域已知的方法合成?；蛘?，可以從化合物文庫(kù)中選擇類(lèi)似物。該文庫(kù)可以是組合文庫(kù)或展示文庫(kù)，例如噬菌體展示文庫(kù)?；衔镂膸?kù)可以以結(jié)合到MHC II類(lèi)分子(例如HLA-DQ2或-DQ8)上的形式，在展示文庫(kù)中表達(dá)。通常，基于它們模仿(i)的結(jié)合特征的能力，從文庫(kù)中選擇類(lèi)似物。因而，可以基于結(jié)合能識(shí)別(i)的TCR或抗體的能力，來(lái)選擇它們。
一般地，類(lèi)似物將以與試劑(i)中的任一種相同的程度被T細(xì)胞識(shí)別，例如，以至少與在本文所述的任一種測(cè)定中等價(jià)表位被識(shí)別的程度相同的程度，其中一般使用來(lái)自腹部疾病患者的T細(xì)胞。類(lèi)似物可以在體內(nèi)被識(shí)別至這樣的程度，并從而能誘導(dǎo)腹部疾病癥狀至至少與本文提及的試劑中的任一種相同的程度(例如，在人患者或動(dòng)物模型中)。
可以在包含下述步驟的方法中鑒別類(lèi)似物測(cè)定候選物質(zhì)是否能被識(shí)別本發(fā)明的表位的T細(xì)胞受體識(shí)別，其中該物質(zhì)的識(shí)別指示著該物質(zhì)是類(lèi)似物。這樣的TCR可以是本文提及的TCR中的任一種，且可以存在于T細(xì)胞上?？梢允褂帽疚奶峒暗娜我环N合適的測(cè)定來(lái)鑒別類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，體內(nèi)地實(shí)施該方法。如上所述，優(yōu)選的類(lèi)似物被以至少與等價(jià)表位相同的程度識(shí)別，所以該方法可以用于鑒別以該程度被識(shí)別的類(lèi)似物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包含，測(cè)定候選物質(zhì)是否能抑制本發(fā)明的表位的識(shí)別，其中識(shí)別的抑制指示著該物質(zhì)是類(lèi)似物。
試劑可以是包含至少2、5、10或20種由(i)或(ii)定義的試劑的產(chǎn)物。一般地，組合物包含來(lái)自不同谷蛋白的本發(fā)明的表位(或等價(jià)類(lèi)似物)，例如本文提及的任何物種或種類(lèi)或類(lèi)型的谷蛋白。優(yōu)選的組合物包含至少一種本發(fā)明的表位，或等價(jià)類(lèi)似物，其來(lái)自存在于本文提及的任何物種或種類(lèi)中的所有谷蛋白，或來(lái)自本文提及的物種中的2、3、4或更多種(例如來(lái)自由小麥、黑麥、大麥、燕麥和黑小麥組成的物種系列)。因而，試劑可以是單價(jià)的或多價(jià)的。
根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，試劑不具有或不是基于WO02/083722和/或WO 01/25793和/或WO 03/104273中公開(kāi)的序列，和/或SEQ ID NO1555-1577、1580-1581、1584-1586、1594-1599、1621-1622中的任一個(gè)所述的序列，和/或不是源自其序列如圖10所示的A-麥醇溶蛋白的試劑。
在SEQ ID NO1-1927中，優(yōu)選的子集是SEQ ID NO1-1763。在SEQ ID NO1764-1927中，優(yōu)選的子集是(a)燕麥序列1764-1768，(b)黑麥序列1769-1786，(c)大麥序列1787-1829，(d)小麥序列1895-1903，(e)小麥DQ8序列1908-1927，和(f)combitope序列1906。其它優(yōu)選的子集是(a)1764-1768，(b)1769-1773，(c)1774-1786，(d)1787-1792，(e)1793-1829，(f)1830-1894，(g)1895-1903，(h)1830-1903，(i)1904-1906，(j)1908-1916，(k)1917-1927，和(l)1908-1913、1915-1923和1925-1927。
在SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763和1764-1927中，特別優(yōu)選的小麥表位是SEQ ID NO1656-1671、1830-1903和1907-1927。
在SEQ ID NO1830-1894(表1)中，一些序列具有N-末端和C-末端甘氨酸。本發(fā)明擴(kuò)展至省略C-末端甘氨酸和/或N-末端甘氨酸的這些序列。優(yōu)選地，省略C-末端甘氨酸和N-末端甘氨酸兩者。
診斷如上所述，本發(fā)明的診斷方法可以基于能結(jié)合試劑的T細(xì)胞的檢測(cè)，或能識(shí)別試劑的抗體的檢測(cè)。
能在本方法(其包括上述的用途)中識(shí)別試劑的T細(xì)胞通常是已經(jīng)體內(nèi)地對(duì)一種或多種谷蛋白預(yù)敏化的T細(xì)胞。如上所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣的抗原-處理的(antigen-experienced)T細(xì)胞存在于外周血中。
在本方法中，T細(xì)胞可以體外或體內(nèi)地接觸試劑，并可以體外或體內(nèi)地測(cè)定T細(xì)胞是否識(shí)別試劑。因而，本發(fā)明提供了在人體上實(shí)踐的診斷方法中使用的試劑。提供了不同的試劑，用于在這樣的方法中同時(shí)、分開(kāi)或先后地使用。
一般地，在加入了試劑的水溶液中實(shí)施體外方法。溶液也可以包含T細(xì)胞(以及在某些實(shí)施方案中，下面討論的APC)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“接觸”包括向溶液中加入特定的物質(zhì)。
通常，通過(guò)檢測(cè)在有試劑存在下T細(xì)胞狀態(tài)的變化，或測(cè)定T細(xì)胞是否結(jié)合試劑，來(lái)完成T細(xì)胞是否能識(shí)別試劑的測(cè)定。通常，狀態(tài)的變化是由TCR結(jié)合試劑后T細(xì)胞的抗原特異性的功能活性造成的。可以在T細(xì)胞內(nèi)(例如，蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的變化)或外(例如，檢測(cè)分泌的物質(zhì))測(cè)量狀態(tài)的變化。
T細(xì)胞狀態(tài)的變化，可能是T細(xì)胞分泌物質(zhì)的開(kāi)始或增加，例如細(xì)胞因子，尤其是IFN-γ、IL-2或TNF-α。IFN-γ分泌的測(cè)定是特別優(yōu)選的。一般地，通過(guò)允許它結(jié)合特異性的結(jié)合劑，然后測(cè)量特異性的結(jié)合劑/物質(zhì)復(fù)合物的存在，可以檢測(cè)物質(zhì)。一般地，特異性的結(jié)合劑是抗體，例如多克隆或單克隆抗體。細(xì)胞因子的抗體是商業(yè)上可得到的，或可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。
一般地，將特異性的結(jié)合劑固定化到固體支持物上。允許物質(zhì)結(jié)合后，固體支持物可以任選地被洗滌，以去除未特異性地結(jié)合試劑的物質(zhì)。使用結(jié)合復(fù)合物的第二種結(jié)合劑，可以檢測(cè)試劑/物質(zhì)復(fù)合物。一般地，第二種試劑在與結(jié)合第一種試劑的位點(diǎn)不同的位點(diǎn)結(jié)合該物質(zhì)。第二種試劑優(yōu)選地是抗體，且用檢測(cè)標(biāo)記直接或間接地進(jìn)行標(biāo)記。
因而，第二種試劑可以被第三種試劑檢測(cè)到，所述第三種試劑一般地用檢測(cè)標(biāo)記直接或間接地標(biāo)記。例如，第二種試劑可以包含生物素部分，從而允許被包含鏈霉抗生物素蛋白部分的第三種試劑檢測(cè)到，且一般地，堿性磷酸酶作為檢測(cè)標(biāo)記。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用的檢測(cè)系統(tǒng)是WO 98/23960所述的離體(ex-vivo)ELISPOT測(cè)定。在該測(cè)定中，T細(xì)胞分泌的IFN-γ被固定化到固體支持物上的第一種IFN-γ特異性的抗體結(jié)合。然后，使用用檢測(cè)標(biāo)記標(biāo)記的第二種IFN-γ特異性的抗體，檢測(cè)結(jié)合的IFN-γ。這樣的標(biāo)記的抗體可以從MABTECH(斯德哥爾摩，瑞典)得到。下面討論了可以使用的其它檢測(cè)標(biāo)記。
可以測(cè)量的T細(xì)胞狀態(tài)的變化可以是，T細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的攝入的增加，例如胸苷的攝入。狀態(tài)的變化可以是，T細(xì)胞大小的增加，或T細(xì)胞的增殖，或T細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記的變化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)量蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)中的變化，例如，任一種上述的細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的增加，來(lái)檢測(cè)狀態(tài)的變化。通過(guò)使T細(xì)胞的內(nèi)部接觸能以特異性的方式結(jié)合表達(dá)的蛋白，且其允許通過(guò)流式細(xì)胞儀分選T細(xì)胞的部分，可以檢測(cè)這樣的細(xì)胞內(nèi)的變化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)結(jié)合TCR時(shí)，試劑結(jié)合MHC II類(lèi)分子(一般地，HLA-DQ2或-DQ8)，所述分子一般地存在于抗原呈遞細(xì)胞(APC)的表面上。但是，如本文所述，其它試劑可以結(jié)合TCR，而不需要也結(jié)合MHC分子。
通常，在本方法中接觸的T細(xì)胞取自個(gè)體的血液樣品，盡管可以使用含有T細(xì)胞的其它類(lèi)型的樣品?？梢詫悠分苯蛹尤霚y(cè)定中，或可以首先進(jìn)行處理。一般地，處理可以包含，例如用水或緩沖液稀釋樣品。一般地，將樣品稀釋1.5-100倍，例如，2-50或5-10倍。
處理可以包含樣品組分的分離。一般地，從樣品分離單核的細(xì)胞(MC)。MC包含T細(xì)胞和APC。因而，在本方法中，存在于分離的MC中的APC，可以將肽呈遞給T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從樣品中僅僅純化T細(xì)胞，例如僅僅CD4T細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如Lalvani等(1997)J.Exp.Med.186，p859-865中所述的那些，可以從樣品分離PBMC、MC和T細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在測(cè)定中使用的T細(xì)胞是未處理的或稀釋的樣品的形式，或是新分離的T細(xì)胞(例如新分離的MC或PBMC的形式)，其可以直接離體使用，即它們?cè)谟糜诒痉椒ㄖ拔唇?jīng)培養(yǎng)。因而，沒(méi)有以抗原特異性的方式，體外重新刺激T細(xì)胞。但是，可以在使用前培養(yǎng)T細(xì)胞，例如，在有一種或多種試劑存在下，且通常也存在外源的生長(zhǎng)促進(jìn)細(xì)胞因子。在培養(yǎng)過(guò)程中，試劑一般地存在于APC表面上，例如在本方法中使用的APC。T細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)，可能導(dǎo)致本方法的敏感度的增加。因而，可以將T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成細(xì)胞系，例如短期細(xì)胞系(例如，如Ota等(1990)Nature 346，p183-187所述)。
一般地存在于本方法中的APC，可以來(lái)自與T細(xì)胞相同的個(gè)體或來(lái)自不同的宿主。APC可以是天然產(chǎn)生的APC或人造的APC。APC是能將肽呈遞給T細(xì)胞的細(xì)胞。一般地，它是B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。一般地，它和T細(xì)胞分離自相同的樣品，且一般地，與T細(xì)胞共同純化。因而，APC可能存在于MC或PBMC中。一般地，APC是新分離的離體細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞。它可以是細(xì)胞系的形式，例如短期或無(wú)限增殖化的細(xì)胞系。APC可以在它的表面表達(dá)空的MHC II類(lèi)分子。
在本方法中，可以使用一種或多種(不同的)試劑。一般地，可以將源自樣品的T細(xì)胞與所有待測(cè)試劑一起置于測(cè)定中，或者可以分開(kāi)T細(xì)胞，并置于各自含有一種或多種試劑的分開(kāi)的測(cè)定中。
本發(fā)明也提供了試劑，例如上述試劑中的任一種的兩種或更多種(例如存在于上面討論的組合物試劑中的試劑的組合)，其用于同時(shí)的分開(kāi)的或先后的用途(例如，體內(nèi)用途)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將試劑本身直接加入包含T細(xì)胞和APC的測(cè)定中。如上面所討論的，這樣的測(cè)定中的T細(xì)胞和APC可以是MC的形式。當(dāng)使用能被T細(xì)胞識(shí)別、且不需要由APC呈遞的試劑時(shí)，則不需要APC。模仿結(jié)合到MHC分子上的原始(i)的類(lèi)似物，是這樣的試劑的實(shí)例。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在沒(méi)有T細(xì)胞存在下，將試劑提供給APC。然后，將APC提供給T細(xì)胞，一般地，在允許將試劑呈遞到它的表面之后。肽可能已經(jīng)被攝入到APC的內(nèi)部，且被呈遞，或被簡(jiǎn)單地?cái)z取到表面上，而沒(méi)有進(jìn)入APC的內(nèi)部。
試劑接觸T細(xì)胞的持續(xù)時(shí)間依賴(lài)于用于測(cè)定肽的識(shí)別的方法而變化。一般地，向每個(gè)測(cè)定中，加入105-107，優(yōu)選地5×105-106PBMC。在將試劑直接加入測(cè)定的情況下，它的濃度是10-1-103μg/ml，優(yōu)選地0.5-50μg/ml或1-10μg/ml。
一般地，將T細(xì)胞與試劑一起溫育的時(shí)間長(zhǎng)度是4-24小時(shí)，優(yōu)選地6-16小時(shí)。當(dāng)使用離體PBMC時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以在37℃將0.3×106PBMC在10μg/ml的肽中溫育12小時(shí)。
通過(guò)測(cè)量試劑與T細(xì)胞的結(jié)合(這可以使用本文討論的任何合適的結(jié)合測(cè)定格式來(lái)實(shí)現(xiàn))，可以測(cè)定T細(xì)胞對(duì)試劑的識(shí)別。一般地，可以基于該結(jié)合，例如，使用FACS機(jī)器，來(lái)分選結(jié)合試劑的T細(xì)胞。如果使用試劑分選的細(xì)胞的頻率在“對(duì)照”值之上，則認(rèn)為存在能識(shí)別試劑的T細(xì)胞?？乖?處理的T細(xì)胞的頻率通常是1/106至1/103，且因此，可以確定分選的細(xì)胞是否是抗原-處理的T細(xì)胞。
可以體內(nèi)測(cè)定T細(xì)胞對(duì)試劑的識(shí)別。一般地，將試劑施用給宿主，且然后可以測(cè)量指示著試劑的識(shí)別的反應(yīng)。一般地，皮內(nèi)地或表皮地施用試劑。一般地，通過(guò)接觸皮膚的外面來(lái)施用試劑，或者可以在藥膏或敷料的輔助下，保留在該部位?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)針，例如通過(guò)注射，來(lái)施用試劑，但是也可以通過(guò)其它方法例如沖擊(ballistics)(例如，已經(jīng)用于送遞核酸的沖擊技術(shù))來(lái)施用。EP-A-0693119描述了可以一般地用于施用試劑的技術(shù)。一般地，施用0.001-1000μg，例如，0.01-100μg或0.1-10μg試劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以施用能體內(nèi)提供試劑的產(chǎn)物。因而，可以施用能表達(dá)試劑的多核苷酸，一般地，以上述的施用試劑的任意一種方式。多核苷酸一般地具有下面討論的本發(fā)明提供的多核苷酸的特征的任一種。試劑由多核苷酸體內(nèi)地表達(dá)。一般地，施用0.001-1000μg，例如，0.01-100μg或0.1-10μg多核苷酸。
一般地，通過(guò)在施用部位發(fā)生炎癥(例如，硬結(jié)、紅斑或水腫)，指示著施用給皮膚的試劑的識(shí)別。這通常通過(guò)該部位的視覺(jué)檢查來(lái)測(cè)量。
一般地，通過(guò)使來(lái)自個(gè)體的樣品(例如本文提及的任何樣品，其任選地以本文提及的任何方式處理過(guò))接觸試劑，并測(cè)定樣品中的抗體是否結(jié)合試劑，這樣的結(jié)合指示著個(gè)體患有或易感腹部疾病，來(lái)實(shí)現(xiàn)基于檢測(cè)能結(jié)合試劑的抗體的診斷方法。可以使用任何合適的結(jié)合測(cè)定格式，例如，本文提及的任何這樣的格式。
治療優(yōu)勢(shì)免疫表位和本文描述的其它表位的鑒別，允許制備治療產(chǎn)物，其靶向識(shí)別該表位的T細(xì)胞(這樣的T細(xì)胞是參與針對(duì)谷蛋白的免疫反應(yīng)的細(xì)胞)。這些發(fā)現(xiàn)也允許通過(guò)抑制(通過(guò)耐受)針對(duì)表位的抗體或T細(xì)胞反應(yīng)，來(lái)預(yù)防或治療腹部疾病。
本發(fā)明的某些試劑結(jié)合識(shí)別本發(fā)明的表位(如使用上面討論的任一種結(jié)合測(cè)定所測(cè)量的)的TCR，并造成攜帶TCR的T細(xì)胞的耐受。這樣的試劑，其任選地與載體相結(jié)合，因此可以用于預(yù)防或治療腹部疾病。
通常，耐受可以由相同的肽造成，所述肽可以(在被TCR識(shí)別后)造成T細(xì)胞的抗原特異性的功能活性(例如本文提及的任何這樣的活性，例如細(xì)胞因子的分泌)。當(dāng)在“耐受”上下文中，它們被呈遞給免疫系統(tǒng)時(shí)，這樣的試劑會(huì)造成耐受。
耐受導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)T細(xì)胞或抗體表位的識(shí)別的降低。在T細(xì)胞表位的情況下，這是由識(shí)別表位的T細(xì)胞的缺失或無(wú)反應(yīng)造成的。因此，降低由表位引起的T細(xì)胞活性(例如，如在本文提及的合適的測(cè)定中所測(cè)量的)?？贵w反應(yīng)的耐受，意味著當(dāng)施用表位時(shí)，產(chǎn)生減少量的針對(duì)表位的特異性的抗體。
在這樣的上下文中，將抗原呈遞給免疫系統(tǒng)的方法是已知的，且記載在例如Yoshida等Clin.Immunol.Immunopathol.82，207-215(1997)，Thurau等Clin.Exp.Immunol.109，370-6(1997)和Weiner等Res.Immunol.148，528-33(1997)。在特定的某些施用途徑中，可以造成耐受，例如經(jīng)口的、經(jīng)鼻的或腹膜內(nèi)的。也可以通過(guò)呈遞肽的樹(shù)突細(xì)胞和四聚體來(lái)實(shí)現(xiàn)耐受?？梢越o個(gè)體施用造成耐受的特定產(chǎn)物(例如，在也包含試劑的組合物中)。這樣的產(chǎn)物包括細(xì)胞因子，例如偏好Th2反應(yīng)的細(xì)胞因子(例如，IL-4、TGF-β或IL-10)?？梢砸栽斐赡褪艿膭┝?，施用產(chǎn)物或試劑。
本發(fā)明提供了蛋白，其包含能作為T(mén)細(xì)胞(該T細(xì)胞識(shí)別試劑)的拮抗劑的序列。這樣的蛋白和這樣的拮抗劑也可以用于預(yù)防或治療腹部疾病。拮抗劑會(huì)造成T細(xì)胞反應(yīng)的降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，拮抗劑結(jié)合T細(xì)胞的TCR(通常以與HLA-DQ2或-DQ8的復(fù)合物的形式)，但是不會(huì)造成正常的功能激活，所述功能激活會(huì)使正常的信號(hào)通過(guò)TCR細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)進(jìn)行傳遞，這會(huì)使T細(xì)胞具有降低的功能活性(例如，對(duì)表位的識(shí)別的響應(yīng)，一般地，如通過(guò)本文所述的任何合適的測(cè)定所測(cè)量的)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，拮抗劑與表位競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合MHC加工和呈遞途徑的組分，例如MHC分子(一般地，HLA-DQ2或-DQ8)。因而，拮抗劑可以結(jié)合HLA-DQ2或-DQ8(且因而是由該MHC分子呈遞的肽)或其同源物。
造成拮抗作用的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，拮抗劑是上面提及的表位的同源物，且可以具有試劑(尤其是類(lèi)似物)的任一種序列、結(jié)合或其它性質(zhì)。一般地，拮抗劑與任一種上述表位(其能在T細(xì)胞中造成正常的抗原特異性的功能)的區(qū)別在于1、2、3、4或更多個(gè)突變(其中的每一個(gè)可以是取代、插入或缺失)。這樣的拮抗劑在本領(lǐng)域中稱(chēng)作“改變的肽配體”或“APL”。一般地，突變是在接觸TCR的氨基酸位置。
例如，拮抗劑與表位的區(qū)別可以在于序列中的取代，所述序列與A-麥醇溶蛋白的氨基酸64-67代表的序列(圖10所示的A-麥醇溶蛋白的序列)等價(jià)。因而優(yōu)選地，拮抗劑具有在位置64、65或67的等價(jià)物處的取代。優(yōu)選地，取代是64W、67W、67M或65T。
由于個(gè)體中針對(duì)本發(fā)明的表位的T細(xì)胞免疫反應(yīng)是多克隆的，所以可能需要施用超過(guò)一種拮抗劑，來(lái)造成具有不同TCR的反應(yīng)的T細(xì)胞的拮抗作用。因此，可以在組合物中施用拮抗劑，所述組合物包含至少2、4、6或更多種不同的拮抗劑，所述拮抗劑各自拮抗不同的T細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了鑒別T細(xì)胞(其能識(shí)別試劑)的拮抗劑的方法，其包含使候選物質(zhì)接觸T細(xì)胞，和檢測(cè)該物質(zhì)是否造成T細(xì)胞經(jīng)歷抗原特異性的反應(yīng)的能力的降低(例如，使用本文提及的任何合適的測(cè)定)，其中所述能力的任何這樣的降低的檢測(cè)，指示著物質(zhì)是拮抗劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物中存在拮抗劑(包括特定表位的拮抗劑的組合)或耐受(T細(xì)胞和抗體耐受)試劑，所述組合物包含至少2、4、6或更多種拮抗劑或拮抗或耐受本發(fā)明的不同表位(例如，上面關(guān)于試劑討論的表位的組合，所述試劑是包含超過(guò)一種物質(zhì)的產(chǎn)物)的試劑。
測(cè)試組合物是否能造成腹部疾病如上所述，本發(fā)明提供了測(cè)定組合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含檢測(cè)是否存在能被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成包含本發(fā)明的試劑或表位的序列的蛋白序列(這樣的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性可以是人腸轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性)。一般地，這通過(guò)如下實(shí)現(xiàn)使用結(jié)合測(cè)定，其中使以特異性的方式結(jié)合序列的部分接觸組合物，并檢測(cè)序列/部分復(fù)合物的形成，并將所述復(fù)合物用于確定試劑的存在。這樣的部分可以是本文提及的任何合適的物質(zhì)(或物質(zhì)類(lèi)型)，且一般地，是特異性的抗體?？梢允褂萌魏魏线m格式的結(jié)合測(cè)定(例如本文提及的那些)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使組合物接觸至少2、5、10或更多種抗體，所述抗體對(duì)來(lái)自不同谷蛋白的本發(fā)明的表位是特異性的，例如，一系列抗體，其能識(shí)別關(guān)于本發(fā)明的試劑在上面討論的表位的組合，所述試劑是包含超過(guò)一種物質(zhì)的產(chǎn)物。
一般地，組合物包含來(lái)自表達(dá)能造成腹部疾病的谷蛋白的植物的材料(例如，本文提及的任一種谷蛋白或植物)。這樣的材料可以是植物部分，例如收獲的產(chǎn)物(例如，種子)。該材料可以是植物材料的加工產(chǎn)物(例如任何本文提及的這樣的產(chǎn)物)，例如包含谷蛋白的面粉或食物。食物材料的加工和在合適的結(jié)合測(cè)定中的測(cè)試是常規(guī)的，例如，如Kricka LJ，J.Biolumin.Chemilumin.13，189-93(1998)中所提及的。
結(jié)合測(cè)定通過(guò)測(cè)量結(jié)合后改變的一種或兩種物質(zhì)的特征，例如光譜變化，可以測(cè)定本文提及的任意兩種物質(zhì)的結(jié)合。
結(jié)合測(cè)定格式可以是“條帶位移(band shift)”系統(tǒng)。這包含測(cè)定一種物質(zhì)(例如候選物質(zhì))的存在是否會(huì)促進(jìn)或延遲凝膠電泳過(guò)程中其它物質(zhì)的前進(jìn)。
格式可以是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合方法，其測(cè)定一種物質(zhì)是否能抑制其它物質(zhì)與試劑的結(jié)合，已知所述試劑結(jié)合其它物質(zhì)，例如特異性的抗體。
突變的谷蛋白本發(fā)明提供了谷蛋白，其中已經(jīng)突變了本發(fā)明的表位序列，或可以被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾以提供這樣的序列的序列，從而使它不再造成能識(shí)別該表位的T細(xì)胞反應(yīng)，或被其識(shí)別。在上下文中，術(shù)語(yǔ)識(shí)別指TCR以發(fā)生T細(xì)胞的正常的(非拮抗的)抗原-特異性的功能活性的方式結(jié)合表位。
上面討論了鑒別其它谷蛋白中的等價(jià)表位的方法。突變的谷蛋白的野生型是會(huì)造成腹部疾病的蛋白。這樣的突變的谷蛋白可以在它的整個(gè)序列或它的序列的15、30、60、100或200個(gè)鄰接氨基酸內(nèi)與突變的谷蛋白的野生型具有同源性，例如，達(dá)到上述的程度(關(guān)于類(lèi)似物)。其它天然谷蛋白的序列是本領(lǐng)域已知的。
突變的谷蛋白不會(huì)造成腹部疾病，或會(huì)造成減輕的腹部疾病的癥狀。一般地，突變減少表位誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的能力。突變的表位可以具有減小的與HLA-DQ2或-DQ8的結(jié)合，減小的被APC呈遞的能力，或減小的結(jié)合識(shí)別試劑的T細(xì)胞或被其識(shí)別的能力(即造成抗原-特異性的功能活性)。因此，關(guān)于本發(fā)明的診斷方面，突變的谷蛋白或表位會(huì)在本文提及的任何測(cè)定中不表現(xiàn)或表現(xiàn)出減少的識(shí)別。
突變可以是表位中的一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)為1-3、4-6、6-10、11-15或更多的缺失、添加或取代，例如，在SEQ ID NO1-1927中的任一個(gè)中；或在其等價(jià)物中。優(yōu)選地，突變的谷蛋白在SEQ ID NO1-1927中的任一個(gè)序列中具有至少一個(gè)突變。優(yōu)選的突變是在與A-麥醇溶蛋白的位置65等價(jià)的位置處(見(jiàn)圖10)。優(yōu)選地，天然產(chǎn)生的谷氨酰胺被取代為組氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴(lài)氨酸、脯氨酸或精氨酸。
本發(fā)明從而也提供了谷蛋白的表位中的突變(例如本文討論的任意序列中的任意突變)減少谷蛋白的造成腹部疾病的能力的用途，該表位是本發(fā)明的表位。
在一個(gè)實(shí)施方案中，突變的序列能起拮抗劑的作用。因而，本發(fā)明提供了包含能結(jié)合T細(xì)胞受體的序列的蛋白，該T細(xì)胞受體識(shí)別本發(fā)明的試劑，且該序列能造成攜帶這樣的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的拮抗作用。
本發(fā)明也提供了蛋白，其是上面的突變的谷蛋白的片段，所述蛋白是至少7個(gè)氨基酸長(zhǎng)(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、30、60、100、150、200或250個(gè)氨基酸長(zhǎng))，且其包含上面討論的減少谷蛋白被識(shí)別的能力的突變。本文提及的任一種突變蛋白(包括片段)也可以以與例如其它谷蛋白或非-谷蛋白的融合蛋白的形式存在。
與突變的谷蛋白等價(jià)的野生型蛋白一般地來(lái)自禾本科單子葉植物，例如選自下列屬的植物小麥屬(Triticum)、黑麥屬(Secale)、大麥屬(Hordeum)、黑小麥(Triticale)或燕麥屬(Avena)(例如，小麥、黑麥、大麥、燕麥或黑小麥)。例如，蛋白可以是α、αβ、β、γ或ω麥醇溶蛋白或燕麥蛋白。
試劑盒本發(fā)明也提供了用于實(shí)現(xiàn)本方法的試劑盒，其包含一種或多種試劑，和任選的檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)試劑的識(shí)別的工具。一般地，為同時(shí)的、分開(kāi)的或先后的應(yīng)用，提供不同的試劑。一般地，檢測(cè)識(shí)別的工具允許或輔助基于上面討論的技術(shù)的檢測(cè)。
因而，工具可能允許檢測(cè)T細(xì)胞在識(shí)別后分泌的物質(zhì)。試劑盒因而可以另外包含物質(zhì)的特異性的結(jié)合部分，例如抗體。一般地，部分是對(duì)IFN-γ特異性的。一般地，將部分固定化到固體支持物上。這意味著，在結(jié)合部分后，物質(zhì)會(huì)保留在分泌它的T細(xì)胞的附近。因而，在支持物上形成物質(zhì)/部分復(fù)合物的“斑點(diǎn)”，每個(gè)斑點(diǎn)代表著一個(gè)分泌物質(zhì)的T細(xì)胞。對(duì)斑點(diǎn)定量，并一般地，與對(duì)照相對(duì)比，允許測(cè)定試劑的識(shí)別。
試劑盒也可以包含檢測(cè)物質(zhì)/部分復(fù)合物的工具。在結(jié)合物質(zhì)后，可能在部分自身發(fā)生可檢測(cè)的變化，例如顏色變化?；蛘?，可以允許直接或間接標(biāo)記的用于檢測(cè)的第二種部分結(jié)合物質(zhì)/部分復(fù)合物，以允許斑點(diǎn)的測(cè)定。如上面所討論的，第二種部分可以是對(duì)物質(zhì)特異性的，但是結(jié)合物質(zhì)上與第一種部分不同的位置。
固定化的支持物可以是有孔的平板，例如微量滴定板。因此，可以在平板的分開(kāi)的孔中，進(jìn)行每個(gè)測(cè)定。
試劑盒可以另外包含T細(xì)胞的培養(yǎng)基，要在檢測(cè)步驟中使用的檢測(cè)部分或洗滌緩沖液。試劑盒可以另外包含適用于從樣品分離的試劑，例如從樣品分離PBMC或T細(xì)胞?？梢詫⒃噭┖性O(shè)計(jì)成允許在樣品中直接檢測(cè)T細(xì)胞，而不需要分離樣品中的任何組分。
試劑盒可以包含允許施用試劑的工具，例如皮內(nèi)的或表皮的施用。一般地，這樣的工具包含藥膏、敷料或一種或多種針。工具可以允許試劑的沖擊送遞。試劑盒中的試劑可以是藥物組合物的形式。
試劑盒也可以包含對(duì)照，例如陽(yáng)性或陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照可以允許測(cè)試檢測(cè)系統(tǒng)。因而，陽(yáng)性對(duì)照一般地在任一種上述的方法中模仿試劑的識(shí)別。一般地，在設(shè)計(jì)用于體外測(cè)定識(shí)別的試劑盒中，陽(yáng)性對(duì)照是細(xì)胞因子。在設(shè)計(jì)用于體內(nèi)檢測(cè)試劑的識(shí)別的試劑盒中，陽(yáng)性對(duì)照可以是大多數(shù)個(gè)體會(huì)起反應(yīng)的抗原。
試劑盒也可以包含采集樣品的工具，所述樣品含有來(lái)自宿主的T細(xì)胞，例如血液樣品。試劑盒可以包含從來(lái)自宿主的樣品分離單核的細(xì)胞或T細(xì)胞的工具。
多核苷酸、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物和抗體本發(fā)明也提供了多核苷酸，其能表達(dá)，以提供試劑或突變的谷蛋白。一般地，多核苷酸是DNA或RNA，且是單鏈的或雙鏈的。多核苷酸優(yōu)選地包含至少50個(gè)堿基或堿基對(duì)，例如，50-100、100-500、500-1000或1000-2000或更多個(gè)堿基或堿基對(duì)。因此，多核苷酸包含編碼SEQ ID NO1-1927中的任一個(gè)序列或本文提及的任一種其它試劑的序列。在該編碼序列的5′和3′，本發(fā)明的多核苷酸具有與在對(duì)應(yīng)的谷蛋白基因中的這些序列的5′和3′處的序列或密碼子不同的序列或密碼子。
在編碼肽的序列的5′和/或3′，多核苷酸具有編碼或非編碼序列。編碼序列的5′和/或3′序列可以包含能輔助編碼試劑的序列的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的序列。多核苷酸可以能在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)試劑，例如人、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物或嚙齒類(lèi)動(dòng)物(例如，小鼠或大鼠)細(xì)胞。
本發(fā)明的多核苷酸可以以顯著高于背景的水平，選擇性地與編碼試劑所來(lái)源的谷蛋白的多核苷酸雜交。一般地，使用中等至高嚴(yán)格性的條件(例如，0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，在約50℃至約60℃)，進(jìn)行選擇性的雜交。但是，可以在本領(lǐng)域已知的任何合適的條件下(見(jiàn)Sambrook等(1989)，Molecular CloningA LaboratoryManual)，進(jìn)行這樣的雜交。例如，如果需要高嚴(yán)格性，則合適的條件包括0.2×SSC，在60℃。如果需要更低的嚴(yán)格性，則合適的條件包括2×SSC，在60℃。
本發(fā)明的試劑或蛋白可以由本文所述的多核苷酸編碼。
多核苷酸可以形成或整合進(jìn)可復(fù)制的載體中。這樣的載體能在合適的細(xì)胞中復(fù)制。載體可以是表達(dá)載體。在這樣的載體中，本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接到控制序列，所述控制序列能提供多核苷酸的表達(dá)。載體可以含有選擇標(biāo)記，例如氨芐青霉素抗性基因。
多核苷酸或載體可以存在于細(xì)胞中。這樣的細(xì)胞可能已經(jīng)用多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化。細(xì)胞可以表達(dá)試劑。選擇細(xì)胞，以使其與所述載體相容，且可以是例如原核的(細(xì)菌的)、酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。使用常規(guī)技術(shù)，包括磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染或電穿孔，可以將多核苷酸或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。
本發(fā)明提供了通過(guò)重組方式生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白的方法。這可以包含(a)在允許表達(dá)蛋白的條件下，培養(yǎng)如上定義的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和優(yōu)選地(b)回收表達(dá)的多肽。任選地，通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，可以分離和/或純化多肽。
本發(fā)明也提供了TCR，其識(shí)別(或結(jié)合)試劑或它的能實(shí)現(xiàn)這樣的識(shí)別(或結(jié)合)的片段。它們可以以本文關(guān)于本發(fā)明的蛋白所討論的在本文提及的任何形式(例如，純度)存在。本發(fā)明也提供了表達(dá)這樣的TCR的T細(xì)胞，其可以本文中關(guān)于本發(fā)明的細(xì)胞所討論的任何形式(例如，純度)存在。
本發(fā)明也提供了單克隆的或多克隆的抗體，其能特異性地識(shí)別試劑(例如本發(fā)明的任一種表位)，且其能識(shí)別本發(fā)明的突變的谷蛋白(且一般地，其不能識(shí)別等價(jià)的野生型谷蛋白)，和制備這樣的抗體的方法。本發(fā)明的抗體能特異性地結(jié)合本發(fā)明的這些物質(zhì)。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括抗體片段，例如Fv、F(ab)和F(ab′)2片段以及單鏈抗體。
生產(chǎn)多克隆抗體的方法包含，用免疫原免疫合適的宿主動(dòng)物，例如，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并從血清分離免疫球蛋白。因此，可以給動(dòng)物接種免疫原，隨后從動(dòng)物取出血液，并純化IgG級(jí)分。生產(chǎn)單克隆抗體的方法包含，使生產(chǎn)需要的抗體的細(xì)胞無(wú)限增殖化。通過(guò)將來(lái)自接種的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脾細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相融合，可以生成雜交瘤細(xì)胞(Kohler和Milstein(1975)Nature 256，495-497)。
通過(guò)常規(guī)操作，可以選擇生產(chǎn)需要的抗體的無(wú)限增殖化的細(xì)胞?？梢栽谂囵B(yǎng)物中培養(yǎng)雜交瘤，或?qū)⑵涓鼓?nèi)地注射，以便形成腹水，或注射進(jìn)異源宿主或無(wú)免疫應(yīng)答的宿主的血流中。通過(guò)人淋巴細(xì)胞的體外免疫，隨后用EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，可以制備出人抗體。
為了生產(chǎn)單克隆的和多克隆的抗體，合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是山羊、兔、大鼠或小鼠。如果需要，可以將免疫原作為綴合物施用，其中免疫原偶聯(lián)到合適的載體上，例如，通過(guò)氨基酸殘基之一的側(cè)鏈。一般地，載體分子是生理上可接受的載體。可以分離得到的抗體，且如果需要，進(jìn)行純化。
本發(fā)明的多核苷酸、試劑、蛋白或抗體可以攜帶檢測(cè)標(biāo)記。允許通過(guò)視覺(jué)檢查檢測(cè)分泌的物質(zhì)的檢測(cè)標(biāo)記，任選地在光學(xué)放大裝置的輔助下，是優(yōu)選的。一般地，這樣的系統(tǒng)基于造成底物的顏色變化的酶標(biāo)記，例如，造成底物的顏色變化的堿性磷酸酶。這樣的底物是市場(chǎng)上可得到的，例如從BioRad。其它合適的標(biāo)記包括其它酶，例如過(guò)氧化物酶，或蛋白標(biāo)記，例如生物素；或放射性同位元素，例如32P或35S。使用已知的技術(shù)，可以檢測(cè)上面的標(biāo)記。
本發(fā)明的多核苷酸、試劑、蛋白、抗體或細(xì)胞可以是基本上純化的形式。它們可以是基本上分離的形式，在該情況下，它們通常在制劑中包含至少80％(例如，至少90、95、97或99％)多核苷酸、肽、抗體、細(xì)胞或干物質(zhì)。一般地，多核苷酸、試劑、蛋白或抗體基本上不含有其它細(xì)胞組分。在本方法中，可以以這樣的基本上分離的、純化的或游離的形式，使用多核苷酸、試劑、蛋白或抗體，或其以這樣的形式存在于試劑盒中。
本發(fā)明也提供了轉(zhuǎn)基因的非-人哺乳動(dòng)物，其表達(dá)本發(fā)明的TCR。這可以是本文討論的任意的哺乳動(dòng)物(例如，關(guān)于抗體的生產(chǎn))。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物患有或易感腹部疾病。哺乳動(dòng)物也可以表達(dá)HLA-DQ2或-DQ8或HLA-DR3-DQ2，和/或可以給它飼喂包含造成腹部疾病的谷蛋白(例如，本文提及的任一種谷蛋白)的飲食。因而，該哺乳動(dòng)物可以作為腹部疾病的動(dòng)物模型。
本發(fā)明也提供了鑒別作為腹部疾病的治療劑的產(chǎn)物的方法，其包含將候選物質(zhì)施用給本發(fā)明的患有或易感腹部疾病的哺乳動(dòng)物，并測(cè)定該物質(zhì)是否預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中的腹部疾病，其中腹部疾病的預(yù)防或治療指示著該物質(zhì)是治療產(chǎn)物。這樣的產(chǎn)物可以用于治療或預(yù)防腹部疾病。
本發(fā)明提供了治療(包括預(yù)防性的)試劑或診斷物質(zhì)(本發(fā)明的試劑、蛋白和多核苷酸)。通過(guò)將它們與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑相混合，可以配制這些物質(zhì)，用于臨床施用。例如，可以配制它們，用于局部的、腸胃外的、靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、皮下的、眼內(nèi)的、皮內(nèi)的、表皮的或經(jīng)皮的施用。可以將物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的且適用于所需施用途徑的載體相混合。藥學(xué)上注射用的載體或稀釋劑可以是例如無(wú)菌的或等滲的溶液，例如注射用水或生理鹽水，或用于沖擊送遞的載體顆粒。
根據(jù)各種參數(shù)，尤其是根據(jù)使用的試劑，要治療的患者的年齡、體重和狀況，使用的施用模式，要治療的狀況的嚴(yán)重性，和需要的臨床方案，可以調(diào)節(jié)物質(zhì)的劑量。作為指導(dǎo)，通過(guò)注射施用的物質(zhì)的量，合適地為0.01mg/kg-30mg/kg，優(yōu)選地為0.1mg/kg-10mg/kg。
所述的施用途徑和劑量?jī)H僅作為指導(dǎo)，因?yàn)槭炀毜膱?zhí)業(yè)醫(yī)生能容易地確定任何特定患者和狀況的最佳施用途徑和劑量。
因而，本發(fā)明的物質(zhì)可以用在治療人或動(dòng)物身體的方法中，或在人體上實(shí)現(xiàn)的診斷方法中。具體地，它們可以用在治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。本發(fā)明也提供了試劑，其用在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防腹部疾病的藥物的方法中。因而，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給需要它的人施用本發(fā)明的物質(zhì)(一般地，其無(wú)毒的有效量的)。
使用標(biāo)準(zhǔn)的合成化學(xué)技術(shù)，例如通過(guò)使用自動(dòng)合成儀，可以制備本發(fā)明的試劑。可以從更長(zhǎng)的多肽例如融合蛋白制備試劑，該多肽一般地包含該肽的序列。通過(guò)例如水解多肽，例如使用蛋白酶；或通過(guò)物理地?cái)嗔讯嚯模梢詮亩嚯难苌鲭?。使用?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如通過(guò)使用合成儀，可以制備本發(fā)明的多核苷酸。
表達(dá)突變的谷蛋白或表達(dá)包含可以作為拮抗劑的序列的蛋白的植物細(xì)胞和植物本發(fā)明的細(xì)胞可以是植物細(xì)胞，例如禾本科單子葉植物物種的細(xì)胞。該物種可以是其野生型形式表達(dá)谷蛋白的物種，例如本文提及的任一種谷蛋白。這樣的谷蛋白可以造成人的腹部疾病。細(xì)胞可以是小麥、玉米、燕麥、黑麥、稻、大麥、黑小麥、高梁或甘蔗的。一般地，細(xì)胞是小麥屬的，例如普通小麥(aestivum)、斯佩爾特小麥(spelta)、波蘭小麥(polonicum)或一粒小麥(monococcum)。
一般地，本發(fā)明的植物細(xì)胞是這樣的，其不表達(dá)一種或多種野生型谷蛋白(例如可以造成腹部疾病的本文提及的任一種谷蛋白)，或不表達(dá)一種或多種包含可以被識(shí)別試劑的T細(xì)胞識(shí)別的序列的谷蛋白。因而，如果野生型植物細(xì)胞不表達(dá)這樣的谷蛋白，則可以改造它，來(lái)預(yù)防或減少這樣的谷蛋白的表達(dá)，或改變谷蛋白的氨基酸序列，從而使它不再造成腹部疾病(一般地，通過(guò)不再表達(dá)本發(fā)明的表位)。
這可以如下實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)將突變導(dǎo)入細(xì)胞中的1、2、3或更多個(gè)或所有這樣的谷蛋白基因，例如，導(dǎo)入編碼或非編碼(例如，啟動(dòng)子)區(qū)域。這樣的突變可以是本文(例如，關(guān)于同源蛋白)討論的任意類(lèi)型或長(zhǎng)度的突變?？梢砸远ㄏ虻姆绞?例如，使用定點(diǎn)誘變或同源重組技術(shù))或隨機(jī)的方式(例如，使用誘變劑，然后一般地，選擇誘變的不再表達(dá)谷蛋白(或會(huì)造成腹部疾病的谷蛋白序列)的細(xì)胞)，來(lái)導(dǎo)入突變。
在表達(dá)包含能作為拮抗劑的序列的蛋白的植物或植物細(xì)胞的情況下，這樣的植物或植物細(xì)胞可以表達(dá)野生型谷蛋白(例如會(huì)造成腹部疾病的那些)。優(yōu)選地，通過(guò)拮抗劑序列的存在，會(huì)在攝入包含來(lái)自植物或植物細(xì)胞的蛋白的食物的個(gè)體中，造成減少的腹部疾病癥狀(例如無(wú)癥狀)。
存在于(或轉(zhuǎn)化進(jìn))植物細(xì)胞中的多核苷酸通常包含能在植物細(xì)胞中表達(dá)突變的谷蛋白的啟動(dòng)子。依賴(lài)于所需的表達(dá)模式，啟動(dòng)子可以是組成型的、組織-或階段-特異性的和/或誘導(dǎo)型的。例如，用CAMV35S、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)ssu或組蛋白啟動(dòng)子，可以在植物中得到強(qiáng)組成型表達(dá)。同樣，組織-特異性的或階段-特異性的啟動(dòng)子，可以用于將本發(fā)明的蛋白的表達(dá)靶向轉(zhuǎn)基因植物中的特定組織或它發(fā)育中的特定階段。因而，例如，可以使用種子-特異性的、根-特異性的、葉-特異性的、花-特異性的等啟動(dòng)子。種子-特異性的啟動(dòng)子包括Dalta等(Biotechnology Ann.Rev.(1997)，3，pp.269-296)所述的那些。種子-特異性的啟動(dòng)子的特定實(shí)例是napin啟動(dòng)子(EP-A-0 255,378)、菜豆蛋白啟動(dòng)子、麥谷蛋白啟動(dòng)子、helianthenine啟動(dòng)子(WO 92/17580)、清蛋白啟動(dòng)子(WO 98/45460)、油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(WO 98/45461)和ATS1和ATS3啟動(dòng)子(WO 99/20775)。
細(xì)胞可以是任意形式。例如，它可以是分離的細(xì)胞，例如原生質(zhì)體，或它可以是植物組織的一部分，例如，愈傷組織，或從植物切離的組織，或它可以是整個(gè)植物的一部分。細(xì)胞可以是任意類(lèi)型(例如，任意類(lèi)型的植物部分)。例如，未分化的細(xì)胞，例如愈傷組織細(xì)胞；或分化的細(xì)胞，例如在胚、花粉、根、莖干或葉中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞類(lèi)型。植物部分包括根；芽；葉；和參與生殖的部分，例如花粉、卵、雄蕊、花藥、花瓣、萼片和其它花部分。
本發(fā)明提供了得到轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞的方法，其包含用本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞?？梢允褂萌魏魏线m的轉(zhuǎn)化方法(在小麥的情況下，可以使用Vasil V等，Biotechnology 10，667-674(1992)公開(kāi)的技術(shù))。優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括植物原生質(zhì)體的電穿孔和粒子轟擊。轉(zhuǎn)化從而可以產(chǎn)生嵌合的組織或植物，其中一些細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因的，而一些不是。
通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，可以將本發(fā)明的細(xì)胞或由此得到的細(xì)胞再生成轉(zhuǎn)基因植物。這包括使用植物生長(zhǎng)物質(zhì)例如生長(zhǎng)素、赤霉素(giberellins)和/或細(xì)胞分裂素，以刺激轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或分裂。類(lèi)似地，可以使用諸如體細(xì)胞胚胎發(fā)生和分生組織培養(yǎng)的技術(shù)。再生技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，且實(shí)例見(jiàn)例如，US 4,459,355、US4,536,475、US 5,464,763、US 5,177,010、US 5,187,073、EP 267,159、EP 604,662、EP 672,752、US 4,945,050、US 5,036,006、US 5,100,792、US 5,371,014、US 5,478,744、US 5,179,022、US 5,565,346、US5,484,956、US 5,508,468、US 5,538,877、US 5,554,798、US 5,489,520、US 5,510,318、US 5,204,253、US 5,405,765、EP 442,174、EP 486,233、EP 486,234、EP 539,563、EP 674,725、WO 91/02071和WO 95/06128。
在許多這樣的技術(shù)中，一個(gè)步驟是形成愈傷組織，即包括擴(kuò)增和/或分裂細(xì)胞的植物組織。這樣的愈傷組織是本發(fā)明的另一個(gè)方面，其它類(lèi)型的植物細(xì)胞培養(yǎng)物和植物部分也如此。因而，例如，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物組織和部分，包括胚、分生組織、種子、莖干、根、莖、葉和花部分。它們可以是嵌合的，即它們的細(xì)胞中的一些是本發(fā)明的細(xì)胞，且一些不是。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物部分和組織、植物和種子，可以是本文提及的任何植物物種。
一般地，再生操作包含借助于標(biāo)記基因，選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
再生步驟會(huì)產(chǎn)生第一代轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明也提供了從該第一代植物得到其它代的轉(zhuǎn)基因植物的方法。它們稱(chēng)作后代轉(zhuǎn)基因植物。通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式，可以從第一代轉(zhuǎn)基因植物得到第二代、第三代、第四代、第五代、第六代和其它代的后代植物。
因而，本發(fā)明提供了得到轉(zhuǎn)基因后代植物的方法，其包含從本發(fā)明的第一代轉(zhuǎn)基因植物得到第二代轉(zhuǎn)基因后代植物，并任選地從這樣得到的第二代后代植物得到再后一代或多代的轉(zhuǎn)基因植物。
通過(guò)任何已知的技術(shù)，可以從它們的前代祖先生成后代植物。具體地，可以如下生成后代植物(a)從屬于前代的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物得到轉(zhuǎn)基因種子，然后通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因種子，得到屬于新代的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因后代植物；和/或(b)克隆繁殖屬于前代的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，以生產(chǎn)屬于新代的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因后代植物；和/或(c)使屬于前代的本發(fā)明的第一代轉(zhuǎn)基因植物與另一種相容的植物雜交，以生產(chǎn)屬于新代的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因后代植物；和任選地(d)從這樣得到的后代植物得到再后一代或多代的轉(zhuǎn)基因后代植物。
可以以任意的組合使用這些技術(shù)。例如，可以在生成適于培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植物的過(guò)程中的不同點(diǎn)使用克隆繁殖和有性繁殖。具體地，可以重復(fù)回交具有農(nóng)藝學(xué)上需要的特征的植物分類(lèi)單位。也可以采取從植物取出細(xì)胞并從其再生新植物的其它步驟。
另外，通過(guò)在上述過(guò)程中的任何合適的階段，轉(zhuǎn)化細(xì)胞、植物組織、植物或種子，以導(dǎo)入需要的除本發(fā)明的多核苷酸以外的編碼序列，可以導(dǎo)入其它需要的特征。這可以通過(guò)本文所述的導(dǎo)入本發(fā)明的多核苷酸的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
例如，可以從編碼其它除草劑抗性性狀的轉(zhuǎn)基因中，選擇其它轉(zhuǎn)基因，例如對(duì)下述物質(zhì)的耐受性草甘磷(例如，使用EPSP合酶基因(例如，EP-A-0,293,358)或草甘磷氧化還原酶(WO 92/00377)基因)；或?qū)osametin的耐受性；二鹵芐腈；草銨磷，例如，使用膦絲菌素(phosphinothrycin)乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)或谷氨酰胺合酶基因(參見(jiàn)EP-A-0,242,236)；黃草靈，例如使用二氫蝶酸(dihydropteroate)合酶基因(EP-A-0,369,367)；或磺酰脲(sulphonylurea)，例如，使用ALS基因)；二苯醚例如氟鎖草醚或氟硝草醚，例如，使用protoporphyrogen氧化酶基因)；二唑例如惡草靈；環(huán)狀亞胺例如chlorophthalim；苯基吡唑例如TNP，或其phenopylate或氨基甲酸酯類(lèi)似物。
類(lèi)似地，可以導(dǎo)入除草劑耐受性以外的有益性質(zhì)的基因。例如，可以導(dǎo)入昆蟲(chóng)抗性基因，特別地，編碼蘇蕓金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)毒素的基因。同樣地，可以導(dǎo)入疾病抗性基因，例如如WO 91/02701或WO 95/06128所述。
一般地，在本發(fā)明的植物中表達(dá)本發(fā)明的蛋白。依賴(lài)于使用的啟動(dòng)子，該表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。類(lèi)似地，它可以是組織-或階段-特異性的，即指向植物發(fā)育中的特定植物組織(例如本文提及的任一種組織)或階段。
本發(fā)明也提供了通過(guò)收獲本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，并任選地進(jìn)一步加工，來(lái)得到作物產(chǎn)物的方法。作物產(chǎn)物指任何可從作物植物得到的有用的產(chǎn)物。
含有突變的谷蛋白或包含能作為拮抗劑的序列的蛋白的產(chǎn)物本發(fā)明提供了產(chǎn)物，其包含突變的谷蛋白或包含能作為拮抗劑的序列的蛋白。一般地，它源自或包含來(lái)自本文提及的表達(dá)這樣的蛋白的植物的植物部分。這樣的產(chǎn)物可以通過(guò)收獲本發(fā)明的植物來(lái)直接得到，或通過(guò)收獲并進(jìn)一步加工本發(fā)明的植物來(lái)間接得到?？芍苯拥玫降漠a(chǎn)物包括谷物?；蛘撸@樣的產(chǎn)物可以通過(guò)收獲并進(jìn)一步加工來(lái)間接得到。可通過(guò)進(jìn)一步加工得到的產(chǎn)物的實(shí)例是面粉或蒸餾的酒精飲料；用直接得到的或進(jìn)一步加工的材料制作的食物產(chǎn)物，例如，用面粉制作的烘烤產(chǎn)物(例如，面包)。一般地，這樣的食物產(chǎn)物是人個(gè)體可攝入的和可消化的(即無(wú)毒且有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值)。
在包含蛋白(其包含拮抗劑序列)的食物產(chǎn)物的情況下，食物產(chǎn)物也可以包含野生型谷蛋白，但是優(yōu)選地，拮抗劑能在攝入這樣的食物后，減少(例如，完全地)腹部疾病癥狀。
脫酰胺作用當(dāng)本文所述的序列包括Gln殘基時(shí)，本發(fā)明也提供了這樣的序列，其中Gln殘基已經(jīng)被脫酰胺成Glu殘基。可以脫酰胺一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3、4、5等)Gln殘基/序列，但是當(dāng)存在超過(guò)一個(gè)Gln殘基時(shí)，不是必須將它們?nèi)棵擋０?。?yōu)選地，被脫酰胺的Gln殘基是對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的脫酰胺作用易感的那些。
在序列表中，給出了其中可以脫酰胺Gln的實(shí)例。例如，SEQ IDNO1的殘基4可以是Gln殘基或Glu殘基，SEQ ID NO2的殘基6可以是Gln殘基或Glu殘基，SEQ ID NO6的殘基4和7可以彼此獨(dú)立地是Gln或Glu殘基，等。對(duì)脫酰胺作用易感的Gln殘基，和它們的脫酰胺的Glu副本，稱(chēng)作“Glx”殘基。
當(dāng)試劑包含超過(guò)一個(gè)Glx殘基時(shí)，它們可以以任意的構(gòu)型排列。例如，Glx殘基可以是連續(xù)的殘基，和/或可以被一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3、4、5、6、7、8等)其它殘基隔開(kāi)。如上所述，對(duì)于HLA-DQ8表位，試劑優(yōu)選地包含Glx殘基，其與另一個(gè)Glx殘基由7個(gè)殘基隔開(kāi)。
優(yōu)選的本發(fā)明的試劑是脫酰胺的試劑，即試劑包含一個(gè)或多個(gè)Glu形式的Glx殘基。這可以通過(guò)各種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)在生產(chǎn)過(guò)程中包含Glu殘基，或通過(guò)脫酰胺作用將Gln殘基轉(zhuǎn)變成Glu。通過(guò)用脫酰胺試劑處理含有對(duì)脫酰胺作用易感的Gln殘基的試劑，可以實(shí)現(xiàn)Gln向Glu的轉(zhuǎn)變。一個(gè)或多個(gè)Gln殘基優(yōu)選地被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶脫酰胺成Glu，例如，如實(shí)施例中所述。
熟練的技術(shù)人員能確定試劑中的哪個(gè)特定Gln殘基是對(duì)脫酰胺作用易感的，從而能確定哪個(gè)殘基是由Gln殘基的脫酰胺作用生成的Glu殘基。例如，對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的脫酰胺作用易感的含有Gln的序列通常符合基序例如，QXPX、QXPF(Y)、QXX(FYMILVW)、QXPF、QXX(FY)、PQ(QL)P(FY)P。例如，序列PQ(QL)P(FY)P促進(jìn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)位置2處的標(biāo)有下劃線的Q的脫酰胺作用。
具體地，包含SEQ ID NO1-1927的脫酰胺的形式的試劑是優(yōu)選的(其中這樣的序列不是已經(jīng)脫酰胺的)。最優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑包含SEQ ID NO1-1927的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-脫酰胺的形式(同樣，不是已經(jīng)脫酰胺的)。如本文所定義的，這些試劑的類(lèi)似物和等價(jià)物，也被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例下面的非限制性的實(shí)施例解釋了本發(fā)明初步的麥醇溶蛋白表位篩選文庫(kù)在初步的包含長(zhǎng)期無(wú)谷蛋白飲食的患有腹部疾病的29個(gè)HLA-DQ2+個(gè)體的實(shí)驗(yàn)中，使用干擾素-γELISPOT測(cè)定來(lái)初步篩選以前的Pepset(如WO 03/104273所述，其在本文中引作參考)，作為肽庫(kù)，且然后在15位受試者中，作為含有和沒(méi)有tTG的脫酰胺作用的單個(gè)肽。該P(yáng)epset文庫(kù)由652種20聚體麥醇溶蛋白肽組成，所述肽跨過(guò)在2001年9月發(fā)現(xiàn)的描述為小麥麥醇溶蛋白的所有Genbank條目中包含的所有獨(dú)特的12聚體。從使用ClustalW軟件(MegAlign)比對(duì)的排列成種系發(fā)生分組的基因-衍生的蛋白序列，“手工”設(shè)計(jì)該P(yáng)epset文庫(kù)。
提供了大約0.6微摩爾652種之一的20聚體。將2種標(biāo)記20聚體肽包含在每個(gè)96個(gè)的組(VLQQHNIAHGSSQVLQESTY-肽161和IKDFHVYFRESRDALWKGPG)，并通過(guò)反相-HPLC和氨基酸序列分析進(jìn)行表征。這些標(biāo)記肽的平均純度分別是19％和50％。最初，將肽在乙腈(10％)和Hepes 100mM中溶解至10mg/ml。在IFNγELISpot測(cè)定中與PBMC一起溫育的單個(gè)肽的終濃度是20mcg/ml。通過(guò)以100∶32mcg/ml的比率，與豚鼠組織tTG(Sigma T5398)一起在37℃溫育2小時(shí)，將這些肽脫酰胺。在-20℃保藏肽溶液，并在使用前新解凍。在英國(guó)Oxford進(jìn)行這些研究。如關(guān)于在澳大利亞Melbourne進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)(本文所述的所有其它研究)所述的，進(jìn)行ELIspot測(cè)定。用“Melbourne”數(shù)據(jù)匯集關(guān)于受試者對(duì)單個(gè)肽的反應(yīng)的“Oxford”數(shù)據(jù)，以用于隨后的“EM算法”中的“最小”表位分析(見(jiàn)下面)。
第2輪麥醇溶蛋白表位篩選文庫(kù)根據(jù)從652種20聚體的初步的麥醇溶蛋白表位篩選文庫(kù)中鑒別出的生物活性的序列，設(shè)計(jì)第2輪麥醇溶蛋白表位文庫(kù)。定義了在用所有652種脫酰胺的20聚體評(píng)價(jià)的15位HLA-DQ2+受試者中，具有相當(dāng)于大于最有效的麥醇溶蛋白20聚體(91PQPFPPQLPYPQPQLPYPQP)的5％的平均生物活性的麥醇溶蛋白20聚體。由于早期的研究(見(jiàn)WO 03/104273)表明，該P(yáng)epset的脫酰胺的庫(kù)比沒(méi)有脫酰胺作用更有效，所以根據(jù)基序QXPX、QXZ(FYWILVM)，其中X是脯氨酸以外的任意氨基酸，且P是脯氨酸，Z是任意的氨基酸，且FYWILVM代表著疏水氨基酸(與Vader W.等J Exp Med 2002 J.Exp.Med.195643-649，PCT WO 03/066079和Fleckenstein B.2002.J Biol Chem 27734109-16公開(kāi)的tTG-介導(dǎo)的脫酰胺作用的基序一致)，鑒別出了在潛在地被tTG脫酰胺的生物活性的20聚體內(nèi)的谷氨酰胺殘基。
然后鑒別了12聚體肽，其中每個(gè)潛在的脫酰胺作用位點(diǎn)可能在位于HLA-DQ2結(jié)合溝中的9聚體的位置4、6或7(HLA-DQ2錨在這些位置，證實(shí)了對(duì)谷氨酸的偏好)。然后，用甘氨酸側(cè)接候選物12聚體核心表位序列，隨后是存在于親本麥醇溶蛋白多肽中的N-末端殘基，且在C-末端，是存在于親本麥醇溶蛋白多肽中的C-末端殘基，隨后是甘氨酸(即GXXXXXXXQXXXXXXG)。
合成在位置9為谷氨酰胺或谷氨酸的肽。然后，使用來(lái)自谷蛋白攻擊后的15位HLA-DQ2+腹部疾病志愿者的PBMC，在干擾素γELISPOT測(cè)定中評(píng)價(jià)肽(100mcg/ml)(+/-tTG的脫酰胺作用)。根據(jù)EM算法(見(jiàn)下面)，分析這些測(cè)定的結(jié)果。另外，合成了最有效的獨(dú)特的肽，并純化至＞80％(Mimotopes)，并使用來(lái)自小麥谷蛋白攻擊后的15位HLA-DQ2+腹部疾病志愿者的PBMC，在干擾素γELISPOT測(cè)定中評(píng)價(jià)。
完全的谷蛋白表位篩選文庫(kù)為了使跨過(guò)所有小麥麥醇溶蛋白和麥谷蛋白、黑麥、大麥和燕麥谷蛋白-樣蛋白(谷醇溶蛋白)的基本上更大的肽文庫(kù)的設(shè)計(jì)可行，且為了證實(shí)來(lái)自以前的麥醇溶蛋白肽文庫(kù)的數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā)了迭代算法，以自動(dòng)設(shè)計(jì)20聚體的最小集，其包括谷蛋白中的所有獨(dú)特的12聚體(除信號(hào)肽序列以外)。圖1顯示了ScanSet算法。
該方法測(cè)試來(lái)自一組蛋白的所有可能的肽表位是否是一定范圍的患者的潛在抗原。T-細(xì)胞表位的大小為9至15AA。為了測(cè)試一組蛋白中所有可能的12聚體，由于大數(shù)目迅速變得不可行。
在這里，我們使用下述事實(shí)，例如，20聚體肽可以覆蓋最高達(dá)9種不同的12聚體。因此，我們開(kāi)發(fā)了組合方案，以覆蓋在一個(gè)蛋白家族中代表的所有可能的12聚體。
產(chǎn)生了20個(gè)氨基酸(20聚體)長(zhǎng)的肽，將它們作為抗原進(jìn)行測(cè)試，且其覆蓋存在于蛋白組中的所有12聚體肽序列。我們將要產(chǎn)生的肽的長(zhǎng)度定義為L(zhǎng)(例如，20)，將要覆蓋的表位的長(zhǎng)度定義為S。我們開(kāi)發(fā)了計(jì)算機(jī)程序，其能從一組蛋白產(chǎn)生所有獨(dú)特地發(fā)生的L聚體。而且，我們從該組蛋白生產(chǎn)了所有獨(dú)特地發(fā)生的S聚體。接著，我們選擇了一組N個(gè)L聚體，其含有L聚體的所有序列。圖1描繪了該算法如何工作。
在2003年6月16日，Genbank包含了下述物質(zhì)的登記號(hào)來(lái)自普通小麥(T.aestivum)的53α/β、53γ和2ω麥醇溶蛋白，和77LMW和55HMW麥谷蛋白，59大麥醇溶蛋白，14黑麥醇溶蛋白，和20燕麥蛋白(見(jiàn)圖2)。共計(jì)，ScanSet鑒別了在225種谷蛋白基因產(chǎn)物中含有的18117種獨(dú)特的12聚體。
所有獨(dú)特的谷蛋白12聚體都可以被包含在2922種20聚體中。在Pepset肽文庫(kù)(Mimotopes Inc.，Melbourne，澳大利亞)中合成了這些20聚體。在96個(gè)的批中(Mimotopes Inc.，Melbourne，澳大利亞)，合成了Pepset肽。提供了大約0.7-1.3微摩爾2922種中的每一種20聚體。在每個(gè)96個(gè)的組中，包含2種標(biāo)記20聚體肽(來(lái)自每個(gè)特定平板上的94種其它肽的一種代表性的肽，和IKDFHVYFRESRDALWKGPG)，并通過(guò)反相-HPLC和質(zhì)譜法進(jìn)行表征。這些標(biāo)記肽的平均純度分別是36％(范圍5-68％)和64％(范圍55-71％)。
最初，將肽溶解在含水的乙腈(50％)中。將溶于含水的乙腈中的肽轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的96-孔平板，并在含有1mM鈣(250mcg/ml)的無(wú)菌PBS中稀釋?zhuān)胰缓笈ctTG(25mcg/ml)(Sigma T5398)一起在37℃溫育6小時(shí)，再冷凍保藏(-20℃)備用。
受試者都具有活組織檢查-證實(shí)的腹部疾病，且已經(jīng)接受了至少6個(gè)月嚴(yán)格的無(wú)谷蛋白的飲食。所有受試者都具有單獨(dú)的HLA-DQB01*02(HLA-DQ2)(n＝100)或單獨(dú)的HLA-DQA1*03和HLA-DQB1*0302(HLA-DQ8)(n＝5)。在所有情況下，在谷蛋白攻擊前評(píng)價(jià)tTG-IgA，且其在正常范圍內(nèi)(發(fā)現(xiàn)30％最初的志愿者具有升高的tTG-IgA，且將其排除，因?yàn)槁缘墓鹊鞍妆┞杜c不能通過(guò)短期谷蛋白攻擊誘導(dǎo)外周血谷蛋白-特異性的T-細(xì)胞有關(guān))。志愿者消耗Baker′sDelight“白面包塊(white bread block loaf)”(每天200g，持續(xù)3天)或Uncle Toby′s燕麥(每天100g，持續(xù)3天)。除了3位受試者以外的所有人都完成了3天攻擊(一位在吃了一口面包后退出，另兩位在吃了最初的兩片面包后嘔吐。來(lái)自后兩位的數(shù)據(jù)包含在隨后的分析中)。在開(kāi)始谷蛋白攻擊后6天，抽取血液(300ml)。在我們以前的研究中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)谷蛋白肽-特異性的IFNγELISpot反應(yīng)，所以在該組實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有評(píng)價(jià)“攻擊前(pre-challenge)”血液(Anderson，RP等2000.Nat.Med.6337-342.，WO01/25793，WO 03/104273)。
在96-孔平板(MAIP S-45，Millipore)中，進(jìn)行IFNγELISpot測(cè)定(Mabtech，瑞典)，其中每個(gè)孔含有25mcl肽溶液和100mcl PBMC(2-8×105/孔)，所述PBMC溶于含有10％熱滅活的人AB血清的RPMI中。顯色并干燥后，使用MAIP自動(dòng)化的ELISpot平板計(jì)數(shù)器，評(píng)價(jià)IFNγELISpot平板。然后，根據(jù)新的算法(期望最大化EM)分析數(shù)據(jù)，以定義和定量對(duì)包含在肽文庫(kù)中的9聚體序列的干擾素-γ反應(yīng)(見(jiàn)圖3和下面)。然后，根據(jù)假定T-細(xì)胞識(shí)別冗余的算法，“迭代串(Iterative Cluster)”算法(見(jiàn)圖4和下面)，通過(guò)允許在9聚體中的任意一個(gè)位置處有具有類(lèi)似化學(xué)性質(zhì)的氨基酸組，或允許谷氨酸替代在任何位置處的谷氨酰胺(假定已經(jīng)發(fā)生了脫酰胺作用)，合理解釋9聚體肽。
由于存在來(lái)自?xún)H僅兩個(gè)HLA-DQ8+個(gè)體(其也不是HLA-DQ2+)的數(shù)據(jù)集，且它們僅僅利用來(lái)自“完全的谷蛋白表位篩選文庫(kù)”的721種小麥麥醇溶蛋白20聚體，所以通過(guò)2位受試者的肽-特異性的IFNγELISPOT反應(yīng)的平均排列，鑒別了生物活性的肽。對(duì)于預(yù)測(cè)可能的HLA-DQ8-限制的麥醇溶蛋白表位，假定對(duì)tTG-介導(dǎo)的脫酰胺作用易感的谷氨酰胺殘基，占據(jù)表位的潛在9聚體核心區(qū)的位置1或9，這與HLA-DQ8結(jié)合基序和van de Wal等(van de Wal，Y.等1998.J.Immunol.161(4)1585-1588)的發(fā)現(xiàn)一致。
分析來(lái)自ELISpot的數(shù)據(jù)的期望最大化(EM)算法
圖3顯示了分析來(lái)自使用ELISpot的測(cè)定的數(shù)據(jù)的算法。使用T-細(xì)胞測(cè)定，在96孔平板中測(cè)量了對(duì)不同肽的T-細(xì)胞反應(yīng)。使用許多不同的肽抗原，在許多患者上進(jìn)行測(cè)定?？梢詫-細(xì)胞測(cè)定的結(jié)果總結(jié)在表中，其中行代表著肽，且列代表著患者，且單個(gè)測(cè)量值(計(jì)數(shù))在表中(例如，見(jiàn)圖 3B)。EM算法的目的是，區(qū)分患者對(duì)肽的反應(yīng)和不反應(yīng)，以及估計(jì)反應(yīng)的平均速度和對(duì)每種肽反應(yīng)的人的比例。
對(duì)于許多不同的患者(i用于指患者)和許多不同的肽(j用于指肽)，測(cè)量了反應(yīng)。每個(gè)測(cè)量值(yij)代表著來(lái)自對(duì)肽j起反應(yīng)的患者i的T-細(xì)胞的計(jì)數(shù)。為了估計(jì)患者中對(duì)某種肽的測(cè)量值是否可以稱(chēng)作反應(yīng)，或它是否更可能來(lái)自背景分布，我們?yōu)椴煌耆珨?shù)據(jù)問(wèn)題提出了模型，其中yij是觀察到的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，zij是未觀察到的指示符，無(wú)論人i是否對(duì)肽j起反應(yīng)。
將觀察到的計(jì)數(shù)yij的數(shù)目建模，以符合獨(dú)立的泊松分布泊松(αi，λj)，如果患者i對(duì)肽j起反應(yīng)，即zij＝1，且泊松(αi，λ0)，如果患者i對(duì)肽j無(wú)反應(yīng)，即zij＝0。
·完全的數(shù)據(jù)yij(觀察到的計(jì)數(shù))，zij(反應(yīng)指示符，未觀察到)。
·參數(shù)θ＝(αi，λj，λ0，pj)·αi患者總體反應(yīng)性·λj肽誘導(dǎo)的反應(yīng)速度·λ0背景反應(yīng)速度·pj對(duì)肽j起反應(yīng)的人的比例EM算法·最初將變量設(shè)定為隨機(jī)值·E-步驟計(jì)算似然·M-步驟最大化似然函數(shù)·迭代E-和M-步驟發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性表位的最小集的迭代過(guò)程開(kāi)發(fā)了基于在EM算法中估計(jì)的T-細(xì)胞反應(yīng)計(jì)算用于疫苗中的肽的最小集的程序。我們測(cè)量了對(duì)來(lái)自一組蛋白的L聚體的T-細(xì)胞反應(yīng)。產(chǎn)生了覆蓋所有可能的S聚體的肽。通過(guò)EM算法，我們?yōu)榉磻?yīng)估計(jì)了下面的參數(shù)反應(yīng)速度、起反應(yīng)的人數(shù)、起反應(yīng)的人的比例。將起反應(yīng)的人的比例乘以估計(jì)的反應(yīng)速度，用作定義是好抗原的表位的標(biāo)準(zhǔn)。許多測(cè)量的L聚體含有相同的S聚體表位。為了發(fā)現(xiàn)可以解釋L聚體中的所有反應(yīng)的表位(S聚體)，我們選擇包含在具有最高平均反應(yīng)的L聚體中的S聚體。然后，我們從我們的測(cè)量中，去除含有該S聚體的所有L聚體。接著，我們?cè)谑Ｓ嗟腖聚體中，選擇具有最高反應(yīng)的S聚體。我們迭代該過(guò)程，直到不存在具有高于特定截止值的反應(yīng)的S聚體。我們使用幾種具有不同截止值的迭代。圖4概述了該方法?？梢允褂眠@樣定義的成串的L聚體的列表作為基礎(chǔ)，以定義最佳表位，并選擇起好抗原作用的肽。
小麥谷蛋白中的HLA-DQ2表位使用在共76位HLA-DQ2+個(gè)體中在γ-干擾素ELISPOT測(cè)定中開(kāi)始谷蛋白攻擊后第6天收集的PBMC，鑒別小麥麥醇溶蛋白和麥谷蛋白中的HLA-DQ2表位(初步的麥醇溶蛋白表位文庫(kù)n＝15，第2輪麥醇溶蛋白表位篩選文庫(kù)n＝15，完全的谷蛋白表位篩選文庫(kù)n＝46)。匯集與腹部疾病患者中的單個(gè)肽反應(yīng)有關(guān)的所有數(shù)據(jù)，并通過(guò)EM算法進(jìn)行分析。
根據(jù)γ-干擾素反應(yīng)的強(qiáng)度和起反應(yīng)的個(gè)體的比例，鑒別了一系列的9聚體序列，并整理(見(jiàn)圖5)?？梢詫⒃S多鑒別的序列歸入“超家族”，從而允許具有類(lèi)似化學(xué)性質(zhì)的幾種不同的氨基酸存在于推定的表位中的任意一個(gè)位置處(見(jiàn)圖6)。例如，在圖6的“序列1”(SEQID NO1555)P(QR)P(QE)LP(FY)PQ中，谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)都可在位置2，只是除了Q產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上更有生物活性的表位以外。
通過(guò)檢查通過(guò)EM算法鑒別出的110種最“有活性的”9聚體序列，可以將9聚體基序的“列表”精簡(jiǎn)成41種9聚體，其中的許多是重疊的(例如，“序列1”和“2”(分別是SEQ ID NO1555和1558)重疊了7個(gè)殘基，且都存在于A-麥醇溶蛋白57-73QE65中)。在選擇的情況下，合成了高級(jí)肽，并證實(shí)了通過(guò)EM算法鑒別的肽的生物活性(見(jiàn)圖7)。
燕麥的燕麥蛋白中的HLA-DQ2表位用燕麥(n＝30受試者)或小麥面包(n＝8)在HLA-DQ2+腹部疾病患者中攻擊后，評(píng)價(jià)了燕麥蛋白肽。圖8給出了發(fā)現(xiàn)的對(duì)肽的ELISPOT反應(yīng)。一種反應(yīng)性的燕麥蛋白肽與小麥谷蛋白的序列(SEQID NO1590)是同源的。
燕麥(燕麥蛋白)高質(zhì)量肽研究結(jié)束用純的無(wú)小麥的燕麥進(jìn)行的燕麥攻擊(100g/d，3天)后3天，評(píng)價(jià)高級(jí)燕麥蛋白肽(“第6天”P(pán)BMC干擾素γELISPOT反應(yīng))。根據(jù)以前使用篩選級(jí)(“第1輪”)燕麥蛋白肽文庫(kù)定義的肽和潛在的脫酰胺位點(diǎn)，設(shè)計(jì)這些肽。存在25種肽(作為16聚體)，通過(guò)HPLC證實(shí)其純度＞80％，并通過(guò)質(zhì)譜法證實(shí)其序列。
在患有DQ2+腹部疾病的18位受試者中，對(duì)比了tTG的脫酰胺作用后對(duì)高級(jí)燕麥蛋白肽的干擾素γELISPOT反應(yīng)。
燕麥攻擊后優(yōu)勢(shì)的(＞70％最大反應(yīng))肽包括EQQFGQNIFSGFSVQL(SEQ ID NO1764)(11/18受試者)、QLRCPAIHSVVQAIIL(SEQ ID NO1765)(4/18受試者)和QYQPYPEQEQPILQQQ(SEQ ID NO1766)(3/18受試者)。2/18受試者不具有燕麥蛋白特異性的反應(yīng)(通過(guò)SFU(斑點(diǎn)形成單位)＞3X空白來(lái)定義)，且6/18受試者的平均最大SFU小于10。兩種另外的肽引起了陽(yáng)性反應(yīng)QIPEQLRCPAIHSVVQ(SEQ ID NO1767)(3/18受試者)和EQYQPEQQPFMQPL(SEQ ID NO1768)(5/18受試者＞40％最大肽反應(yīng))。25種肽的系列包括幾種與Arentz-Hansen，PLoSMedicine(Oct.2004，vol.1，issue 1(84-92)中報(bào)道的肽1490(SEQYQPYPEQQEPFVQ)類(lèi)似的肽，但是，該肽僅僅在1位受試者中誘導(dǎo)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，而在5位受試者中是遠(yuǎn)遠(yuǎn)更弱的反應(yīng)。
對(duì)高級(jí)燕麥蛋白肽的干擾素γELISPOT反應(yīng)，在谷蛋白攻擊之前不存在，且會(huì)受到含有抗-HLA DQ而不是抗-HLA DR抗體的PBMC的預(yù)處理的封閉。
黑麥和大麥篩選肽文庫(kù)結(jié)束黑麥(面包，100g/d，3天)或大麥(煮沸的，100g/d，3天)攻擊后3天，評(píng)價(jià)黑麥醇溶蛋白和大麥醇溶蛋白20聚體第1輪肽文庫(kù)(“第6天”P(pán)BMC干擾素γELISPOT反應(yīng))。盡管尚未進(jìn)行使用定義表位的第2輪和第3輪肽文庫(kù)的迭代分析，但發(fā)現(xiàn)用tTG預(yù)處理的20聚體誘導(dǎo)“有效的”反應(yīng)，所述20聚體與小麥攻擊后鑒別的生物活性肽具有相當(dāng)大的結(jié)構(gòu)相似性。但是，黑麥或大麥攻擊后優(yōu)勢(shì)的肽序列不包括具有PQPQLPY序列(在小麥攻擊后，發(fā)現(xiàn)其是優(yōu)勢(shì)的)的肽。在黑麥攻擊后優(yōu)勢(shì)的(＞70％最大反應(yīng))20聚體通常是PQQLFPLPQQPFPQPQQPFP(SEQ ID NO1769)(8/14受試者)，或偶爾的QPFPQPQQPTPIQPQQPFPQ(SEQ ID NO1770)(4/14)、QQPQQLFPQTQQSSPQQPQQ(SEQ ID NO1771)(1/14)、PQTQQPQQPFPQPQQPQQLF(SEQ ID NO1772)(1/14)和/或QEQREGVQILLPQSHQQLVG(SEQ ID NO1773)(1/14)。在至少1位受試者中觀察到的大于40％最大反應(yīng)的其它肽包括FPQQPQQPFPQPQQQLPLQP(SEQ ID NO1774)(3/14，2＞70％)PQQPFPQQPEQIIPQQPQQP(SEQ ID NO1775)(5/14，3＞70％)QQLPLQPQQPFPQPQQPIPQ(SEQ ID NO1776)(6/14，2＞70％)QQPQQPFPLQPQQPVPQQPQ(SEQ ID NO1777)(3/14，1＞70％)SIPQPQQPFPQPQQPFPQSQ(SEQ ID NO1778)(4/14，1＞70％)QTQQSIPQPQQPFPQPQQPF(SEQ ID NO1779)(3/14，1＞70％)NMQVGPSGQVEWPQQQPLPQ(SEQ ID NO1780)(2/14，1＞70％)VGPSGQVSWPQQQPLPQPQQ(SEQ ID NO1781)(2/14，2＞70％)QQPFLLQPQQPFSQPQQPFL(SEQ ID NO1782)(1/14，1＞70％)FPLQPQQPFPQQPEQIISQQ(SEQ ID NO1783)(5/14，1＞70％)PQQPQRPFAQQPEQIISQQP(SEQ ID NO1784)(3/14，1＞70％)SPQQPQLPFPQPQQPFVVVV(SEQ ID NO1785)(4/14，1＞70％)QQPSIQLSLQQQLNPCKNVL(SEQ ID NO1786)(1/14，1＞70％)一般地，大麥攻擊后優(yōu)勢(shì)的肽包括6個(gè)肽基序之一，或是在大麥攻擊后僅僅在17位受試者之一中是“優(yōu)勢(shì)的”的8種其它的單個(gè)的20聚體之一。鑒別的6個(gè)基序是
QQPIPQQPQPY(SEQ ID NO1787)PFPQPQQPFPW(SEQ ID NO1788)LQPQQPFPQ(SEQ ID NO1789)PQPQQASPL(SEQ ID NO1790)IIPQQPQQPF(SEQ ID NO1791)YPEQPQQPF(SEQ ID NO1792)在至少1位受試者中表現(xiàn)出至少40％最大肽反應(yīng)的大麥的大麥醇溶蛋白肽包括下面的，其中星號(hào)指示著在單個(gè)個(gè)體中表現(xiàn)出最大反應(yīng)的8種單個(gè)的肽QQQPFPQQPIPQQPQPYPQQ(SEQ ID NO1793)(8/17，2＞70％)QQPQPFSQQPIPQQPQPYPQ(SEQ ID NO1794)(9/17，8＞70％)PQQPVPQQPQPYPQQPQPFP(SEQ ID NO1795)(5/17，1＞70％)PQPFPQQPIPQQPQPYPQQP(8EQ ID NO1796)(6/17，2＞70％)YPQQPQPFPQQPIPQQPQPY(SEQ ID NO1797)(6/17，2＞70％)QPQPYPQQPQPYPQQPFQPQ(SEQ ID NO1798)(7/17，2＞70％)QPQQPQPFPQQPVPQQPQPY(SEQ ID NO1799)(5/17，2＞70％)PQPYPQQPQPFPQQPPFCQQ(SEQ ID NO1800)(1/17，1＞70％)*QPFPQPQQPFPWQPQQPFPQ(SEQ ID NO1801)(10/17，2＞70％)PFPQQPQQPFPQPQQPFRQQ(SEQ ID NO1802)(6/17，3＞70％)WQPQQPFPQPQQPFPLQPQQ(SEQ ID NO1803)(9/17，5＞70％)*PWQPQQPFPQPQEPIPQQPQ(SEQ ID NO1804)(1/17，1＞70％)QQPFPQPQQPIPYQPQQPFN(SEQ ID NO1805)(5/17，1＞70％)PQQPQQPFPQPQQPFSWQPQ(SEQ ID NO1806)(6/17，2＞70％)*QPQQPFPQPQQPIPYQPQQP(SEQ ID NO1807)(4/17，1＞70％)*QSQQQFPQPQQPFPQQPQQP(SEQ ID NO1808)(1/17，0＞70％)PFPQPQQPFSWQPQQPFLQP(SEQ ID NO1809)(1/17，0＞70％)FPQPQEPFPQQPQQPFPLQP(SEQ ID NO1810)(1/17，0＞70％)PFPQPQQPFPWQPQQPFPQP(SEQ ID NO1811)(6/17，0＞70％)FPQYQIPTPLQPQQPFPQQP(SEQ ID NO1812)(2/17，1＞70％)FPLQPQQPFPQQPQQPFPQQ(SEQ ID NO1813)(1/17，0＞70％)QQPFPLQPQQPFPQPQPFPQ(SEQ ID NO1814)(1/17，0＞70％)SPLQPQQPFPQGSEQIIPQQ(SEQ ID NO1815)(1/17，0＞70％)
PQQASPLQPQPQQASPLQPQ(SEQ ID NO1816)(1/17，1＞70％)PQQPPFWPQQPFPQQPPFGL(SEQ ID NO1817)(1/17，1＞70％)*PVLSQQQPCTQDQTPLLQEQ(SEQ ID NO1818)(1/17，1＞70％)RQLPKYIIPQQPQQPFLLQP(SEQ ID NO1819)(1/17，1＞70％)QGSEQIIPQQPQQPFPLQPH(SEQ ID NO1820)(7/17，3＞70％)*PQGSEQIIPQQPFPLQPQPF(SEQ ID NO1821)(2/17，1＞70％)QPFPTPQQFFPYLPQQTFPP(SEQ ID NO1822)(4/17，1＞70％)PFPQPPQQKYPEQPQQPFPW(SEQ ID NO1823)(1/17，1＞70％)QKYPEQPQQPFPWQQPTIQL(SEQ ID NO1824)(1/17，1＞70％)FQQPQQSYPVQPQQPFPQPQ(SEQ ID NO1825)(3/17，1＞70％)QIPYVHPSILQQLNPCKVFL(SEQ ID NO1826)(1/17，1＞70％)LAAQLPAMCRLEGGGGLLAS(SEQ ID NO1827)(1/17，1＞70％)PYLPEELSPQYQIPTPLQPQ(SEQ ID NO1828)(1/17，1＞70％)*VSPHPGQQTTVSPHQGQQTT(SEQ ID NO1829)(1/17，1＞70％)*第2輪和第3輪小麥麥谷蛋白和麥醇溶蛋白肽文庫(kù)根據(jù)在任何受試者中誘導(dǎo)至少5％反應(yīng)(干擾素γELISPOT)的20聚體小麥麥醇溶蛋白和麥谷蛋白肽的序列，所述反應(yīng)由最有活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)預(yù)處理的(酶促脫酰胺的)20聚體肽刺激，設(shè)計(jì)第2輪小麥麥醇溶蛋白和麥谷蛋白庫(kù)。在至少18位受試者中，評(píng)價(jià)所有第2輪16聚體肽。已經(jīng)在10位受試者中評(píng)價(jià)了從“Oxford”麥醇溶蛋白20聚體文庫(kù)產(chǎn)生的第2輪文庫(kù)，將該數(shù)據(jù)與從用于評(píng)價(jià)新的第2輪(擴(kuò)展的)麥醇溶蛋白/麥谷蛋白文庫(kù)的18位受試者產(chǎn)生的數(shù)據(jù)合并。因此，在18位(基于“Melbourne”20聚體文庫(kù)的新麥醇溶蛋白/麥谷蛋白序列)或28位受試者(基于“Oxford”20聚體文庫(kù)的麥醇溶蛋白序列)中，評(píng)價(jià)了用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶預(yù)處理的單個(gè)16聚體肽。從第2輪Oxford文庫(kù)鑒別的所有16聚體，也都滿(mǎn)足Melbourne第2輪文庫(kù)的選擇標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)各位受試者的干擾素γELISPOT中的肽反應(yīng)的“優(yōu)勢(shì)”，即針對(duì)個(gè)體的最大肽誘導(dǎo)的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化的個(gè)體的PBMC對(duì)特定肽的反應(yīng)百分比，分析第2輪肽文庫(kù)數(shù)據(jù)。下面的表1中顯示了在至少1位受試者中刺激至少40％的最大肽-特異性的反應(yīng)的肽的序列。該數(shù)據(jù)集支持了與用第1輪20聚體肽文庫(kù)(其使用上述的期望最大化(EM)算法)鑒別的序列一致的肽的一致性和“優(yōu)勢(shì)”。
表1在第2輪文庫(kù)中證實(shí)的、在任何一位受試者中具有最大活性的肽的至少40％活性的肽根據(jù)肽家族的效力排列
由74種肽組成的第3輪肽文庫(kù)，基于第2輪文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)在任意的受試者中誘導(dǎo)對(duì)任意肽的最大反應(yīng)的至少10％結(jié)構(gòu)上不同的序列。這些肽對(duì)應(yīng)著野生型(未脫酰胺的)序列，后者實(shí)際上與在第2輪文庫(kù)中使用的那些相同。該文庫(kù)的獨(dú)特的特征是，它由通過(guò)HPLC證實(shí)純度＞80％、并通過(guò)質(zhì)譜法證實(shí)了序列的肽組成。
在14位受試者中，對(duì)比了對(duì)tTG的脫酰胺作用后第3輪文庫(kù)肽的干擾素γELSIPOT反應(yīng)。再次，在9/14位受試者中，包含PQPQLPY基序的序列是“優(yōu)勢(shì)的”。但是，PFPQPQQPFPW(SEQ ID NO1895)在1/14受試者中，PFPQQPQQPFPQ(SEQ ID NO1896)在1/14中，PQPFLPQLPYPQP(SEQ ID NO1897)在1/14中，QPFPQPQQPQQP(SEQ ID NO1898)在4/14中(包括PQPQLPY肽在其中不是有效的表位的3位受試者)SGQGVSQSQQQSQQQ(SEQ ID NO1899)在2/14中(包括PQPQLPY肽在其中不是有效的一位)，QYEVIRSLVLRTLPNM(SEQ ID NO1900)和GLARSQMLQQSICHVG(SEQ ID NO1901)各自在PQPQLPY肽在其中不是有效的表位的一位(相同的)受試者中，RTTTSVPFGVGTGVGA(SEQ ID NO1902)在1/14受試者中，且AIHTVIHSIIMQQEQQ(SEQ ID NO1903)在1/14受試者中，刺激＞70％的最大反應(yīng)。
許多在第3輪中測(cè)試的序列在結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的，且根據(jù)某些序列的“相關(guān)性”，存在或不存在單個(gè)受試者的反應(yīng)，暗示著由體內(nèi)谷蛋白攻擊誘導(dǎo)的谷蛋白特異性的T細(xì)胞識(shí)別的肽的冗余。
對(duì)第3輪肽的干擾素γELISPOT反應(yīng)，在谷蛋白攻擊之前不存在，且受到含有抗-HLA DQ而不是HLA DR抗體的PBMC的預(yù)處理的封閉。
Combitopes通過(guò)對(duì)比小麥(n＝16HLA DQ2腹部疾病受試者)、黑麥(n＝17)或大麥(n＝13)攻擊后對(duì)下述序列的干擾素γELISPOT反應(yīng)，解決了表位冗余的問(wèn)題和在設(shè)計(jì)用于結(jié)合“獨(dú)特的”優(yōu)勢(shì)表位的肽的診斷和治療中的潛在應(yīng)用QLQPFPQPELPYPQPQL(SEQ ID NO1904)(“P04724E”)、QPEQPFPQPEQPFPWQP(SEQ ID NO1905)(“626fEE”)和QLQPFPQPELPYPQPFPQQPEQPFPQPEQPFPWQP(SEQ ID NO1906)(“Combitope”)。黑麥和大麥攻擊后，對(duì)P04724E和626fEE的中值ELISPOT反應(yīng)(斑點(diǎn)形成單位)的總和，幾乎與對(duì)類(lèi)似的(最佳的)濃度的Combitope的反應(yīng)相同(分別是99％和102％)。但是，小麥攻擊(n＝16受試者)后，中值P04724E反應(yīng)是對(duì)Combitope的反應(yīng)的89％，且中值626fEE反應(yīng)是對(duì)Combitope的反應(yīng)的70％。這些發(fā)現(xiàn)與小麥攻擊后而不是黑麥或大麥攻擊后這些有關(guān)的表位序列P04724E和626fEE的相當(dāng)大冗余相一致，且結(jié)合更長(zhǎng)的肽中的優(yōu)勢(shì)表位序列，不會(huì)減少它們的生物利用度。因此，源自選擇的有效表位的combitope，可以是基于T細(xì)胞表位的腹部疾病的治療劑和診斷劑的有效送遞裝置。
與HLA-DQ8+腹部疾病有關(guān)的小麥谷蛋白中的表位使用谷蛋白攻擊后2個(gè)個(gè)體(一個(gè)是HLA-DQ8純合的，而一個(gè)是HLA-DQ8雜合子)的PBMC，鑒別了小麥麥醇溶蛋白中的表位。其它HLA-DQ8(不是DQ2)腹部疾病個(gè)體中誘導(dǎo)的T-細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)谷蛋白攻擊較弱地反應(yīng)，且它們的數(shù)據(jù)不允許詳細(xì)的分析。
包含核心序列QGSFQPSQQ(SEQ ID NO1907)的脫酰胺的20聚體，其與已知的HLA-DQ8-限制的α-麥醇溶蛋白表位(其中為了最佳的活性，Q1和Q9是由tTG脫酰胺的)相對(duì)應(yīng)，適當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)強(qiáng)肽反應(yīng)。但是，一系列的“核心”肽與源自γ和ω麥醇溶蛋白的20聚體中的更有效的反應(yīng)有關(guān)(見(jiàn)圖9)。最有效的肽在序列中具有暗示著對(duì)脫酰胺作用的易感性的谷氨酰胺，其與也對(duì)脫酰胺作用易感的第二個(gè)谷氨酰胺由7個(gè)殘基(如在QGSFQPSQQ(SEQ ID NO1907)中發(fā)現(xiàn)的)隔開(kāi)，表明在由tTG脫酰胺后，這些脫酰胺的序列會(huì)變成HLA-DQ8的高親和力結(jié)合劑(HLA-DQ8的結(jié)合基序偏好位置1和9處的谷氨酸)。另一組20聚體具有對(duì)脫酰胺作用易感的谷氨酰胺殘基，但是其與對(duì)tTG-介導(dǎo)的脫酰胺作用易感的第二個(gè)谷氨酰胺未由7個(gè)殘基隔開(kāi)。
HLA DQ8腹部疾病麥醇溶蛋白和麥谷蛋白表位具有HLA DQ2和HLA DQ8等位基因的5位腹部疾病受試者經(jīng)歷了小麥谷蛋白攻擊。使用來(lái)自2位初始攻擊的受試者的PBMC，篩選第1輪“Melbourne”小麥麥醇溶蛋白20聚體文庫(kù)。通過(guò)在包括2位最初的受試者的5位HLA DQ8+DQ2-CD受試者中，篩選基于第1輪文庫(kù)中的反應(yīng)性的20聚體的第2輪文庫(kù)，進(jìn)一步仔細(xì)分析使用來(lái)自這兩位HLA DQ8 CD受試者的PBMC鑒別的20聚體序列。第2輪文庫(kù)由篩選級(jí)重疊16聚體和預(yù)期與tTG-介導(dǎo)的表位的脫酰胺產(chǎn)物的13聚體組成，所述表位具有位置1和/或位置9處的谷氨酰胺的脫酰胺潛力(與HLA DQ8肽結(jié)合基序相一致)。另外，在這5位受試者中，也篩選了“Melbourne”小麥谷蛋白文庫(kù)中的1400種麥谷蛋白(HMW和LMW)tTG-預(yù)處理的20聚體。
最有效的和始終如一地優(yōu)勢(shì)的麥醇溶蛋白16聚體是有關(guān)的序列VYIPPYCTIAPFGIFG(SEQ ID NO1908)(3/5受試者對(duì)最大麥醇溶蛋白16聚體＞70％反應(yīng))和也在3/5受試者中優(yōu)勢(shì)的AMCNVYIPPYCAMAPF(SEQ ID NO1908)(4/5受試者生成了對(duì)這些肽中的一種或兩種的優(yōu)勢(shì)反)。另外，鑒別了源自以前鑒別的生物活性的20聚體的一系列肽，其在ELISPOT中的反應(yīng)被增強(qiáng)，或?qū)μ囟ǖ拿擋０返墓劝滨０窔埢窃试S的(QE)QPTPIQP(QE)(SEQ ID NO1909)、(QE)QPFPLQP(QE)(SEQ ID NO1910)、(QE)QPIPVQP(QE)(SEQ ID NO1911)、(QE)QPQQPFP(QE)(SEQ ID NO1912)、(QE)QP(QE)LPFP(QE)(SEQ ID NO1913)、(QE)GSFQPSQ(QE)(SEQ ID NO1914)(以前公布的HLA DQ8表位，van der Wal 1998)、(QE)LPFP(QE)QP(QE)(SEQ ID NO1915)和(QE)QPFP(QE)QP(QE)(SEQ ID NO1916)。
篩選麥谷蛋白20聚體文庫(kù)，鑒別出了另一系列的序列，其在5位受試者中的至少一位中是優(yōu)勢(shì)的。優(yōu)勢(shì)的20聚體肽共有基序，且具有序列PQQQQQQLVQQQ(SEQ ID NO1917)、QGIFLQPH(LQ)I(AS)QLEV(SEQ ID NO1918)、QPGQGQQG(HY)Y(SEQ ID NO1919)、QSRYEAIRAII(FY)S(SEQ ID NO1920)、RTTTSVPFD(SEQ ID NO1921)、QPPFWRQQP(SEQ ID NO1922)、Q(PS)(PS)(FI)(PS)QQQQ(SEQ ID NO1923)、(QPLR)GYYPTSPQ(SEQ ID NO1924)(以前鑒別的HLADQ8表位，van der Wal 2001)、QGSYYPGQASPQ(SEQ ID NO1925)、GYYPTSSLQPEQGQQGYYPT (SEQ ID NO1926)和QGQQLAQGQQGQQPAQVQQG(SEQ ID NO1927)。在用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶預(yù)處理后，評(píng)價(jià)了麥谷蛋白肽。由此，不知道對(duì)這些表位的脫酰胺作用的需要。
在開(kāi)始體內(nèi)谷蛋白攻擊后6天，已使用來(lái)自HLA DQ2+(且在一些情況中為HLA DQ8+)腹部疾病志愿者的T細(xì)胞，評(píng)價(jià)了“未表征的”篩選級(jí)肽的詳盡文庫(kù)，所述文庫(kù)包括由存在于Genbank中的基因編碼的所有獨(dú)特的12聚體序列，所述序列定義為(制備面包的)小麥(普通小麥(Triticum aestivum))、黑麥、大麥或燕麥谷蛋白，麥醇溶蛋白，麥谷蛋白，黑麥醇溶蛋白，大麥醇溶蛋白，或燕麥蛋白。已經(jīng)在HLA DQ2腹部疾病中鑒別出了相對(duì)一致模式的表位級(jí)系，所述級(jí)系類(lèi)似于在腹部疾病中消耗其它有毒的谷物后的級(jí)系但與其不相同。小麥攻擊后，具有序列PQPQLPY的肽，在至少三分之二HLADQ2+腹部疾病中是優(yōu)勢(shì)的，但是其它表位偶爾是優(yōu)勢(shì)的，而PQLPY肽在少于1/6的患有腹部疾病的HLA DQ2+受試者中基本上是無(wú)活性的。篩選大量(例如，＞30)受試者后，能更好地評(píng)價(jià)罕見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)表位的貢獻(xiàn)(進(jìn)行中)。黑麥和大麥消耗后的表位級(jí)系類(lèi)似于小麥消耗后的，不同之處在于，類(lèi)似于麥醇溶蛋白/大麥醇溶蛋白/黑麥醇溶蛋白序列PQPQQPFP或PFPQQPQQP(而不是PQPQLPY(小麥α-麥醇溶蛋白獨(dú)有的序列))的脫酰胺的肽，通常是優(yōu)勢(shì)的。包含一系列的和部分重疊的谷蛋白表位的Combitope，與單獨(dú)的單個(gè)表位的活性相同或更高，并提供有效地送遞多種用于T細(xì)胞識(shí)別的谷蛋白表位的工具。因此，這樣的combitope可以用于設(shè)計(jì)和送遞腹部疾病中的肽治療，其靶向多種獨(dú)特的T細(xì)胞表位。
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在本文中引用的或參考的每篇PCT公開(kāi)物、美國(guó)專(zhuān)利、其它專(zhuān)利、期刊和任何其它出版物，均在本文中整體引作參考。
權(quán)利要求
1.預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個(gè)體施用至少一種選自下述的試劑(a)肽，其包含至少一個(gè)表位，所述表位包含選自SEQ ID NO1-1927的序列，和其等價(jià)物；和(b)a)的類(lèi)似物，其能被識(shí)別a)的肽的T細(xì)胞受體識(shí)別，且其長(zhǎng)度不超過(guò)50個(gè)氨基酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是HLA-DQ2-限制的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是HLA-DQ8-限制的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中一種試劑是HLA-DQ2-限制的，且第二種試劑是HLA-DQ8-限制的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑包含小麥表位。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑包含燕麥表位。
7.權(quán)利要求1的方法，其中一種試劑包含小麥表位，且一種試劑包含燕麥表位。
8.預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個(gè)體施用藥物組合物，所述組合物包含如權(quán)利要求1所定義的試劑和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
9.預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個(gè)體施用藥物組合物，所述組合物包含具有如權(quán)利要求1所定義的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的拮抗劑，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
10.預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個(gè)體施用組合物，以用于使個(gè)體耐受谷蛋白，以抑制生成對(duì)如權(quán)利要求1所定義的試劑的T細(xì)胞或抗體反應(yīng)，所述組合物包含如權(quán)利要求1所定義的試劑。
11.預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含通過(guò)下述方法，診斷個(gè)體的腹部疾病a)使來(lái)自宿主的樣品接觸至少一種選自下述的試劑i)肽，其包含至少一個(gè)表位，所述表位包含選自SEQ IDNO1-1927的序列，和其等價(jià)物；和ii)i)的類(lèi)似物，其能被識(shí)別i)的T細(xì)胞受體識(shí)別，且其長(zhǎng)度不超過(guò)50個(gè)氨基酸；和體外測(cè)定樣品中的T細(xì)胞是否識(shí)別該試劑；T細(xì)胞的識(shí)別指示著個(gè)體患有或易感腹部疾病；或b)施用如權(quán)利要求1所定義的試劑，和體內(nèi)測(cè)定個(gè)體中的T細(xì)胞是否識(shí)別該試劑，其中試劑的識(shí)別指示著個(gè)體患有或易感腹部疾??；和給診斷為患有或易感腹部疾病的個(gè)體，施用用于預(yù)防或治療腹部疾病的治療劑。
12.試劑在制備用于治療或預(yù)防腹部疾病的藥物中的用途，其中所述試劑包含(a)肽，其包含至少一個(gè)表位，所述表位包含選自SEQ ID NO1-1927的序列，和其等價(jià)物；和(b)(a)的類(lèi)似物，其能被識(shí)別(a)的肽的T細(xì)胞受體識(shí)別，且其長(zhǎng)度不超過(guò)50個(gè)氨基酸。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑是HLA-DQ2-限制的。
14.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑是HLA-DQ8-限制的。
15.權(quán)利要求12的用途，其中一種試劑是HLA-DQ2-限制的，且第二種試劑是HLA-DQ8-限制的。
16.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑包含小麥表位。
17.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑包含燕麥表位。
18.權(quán)利要求12的用途，其中一種試劑包含小麥表位，且一種試劑包含燕麥表位。
19.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑存在于藥物組合物中，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
20.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑存在于藥物組合物中，所述組合物包含具有如權(quán)利要求12定義的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的拮抗劑，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
21.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑存在于組合物中，所述組合物用于使個(gè)體耐受谷蛋白，以抑制生成對(duì)如權(quán)利要求1所定義的試劑的T細(xì)胞或抗體反應(yīng)。
22.如權(quán)利要求1所定義的試劑，其任選地與載體相結(jié)合，以用于通過(guò)使識(shí)別試劑的T細(xì)胞耐受來(lái)治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。
23.具有如權(quán)利要求1所定義的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的拮抗劑，其任選地與載體相結(jié)合，以用于通過(guò)拮抗這樣的T細(xì)胞來(lái)治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。
24.如權(quán)利要求1所定義的試劑或結(jié)合抗體的類(lèi)似物，所述抗體結(jié)合如權(quán)利要求1定義的試劑的表位，其用于通過(guò)使個(gè)體耐受以預(yù)防這樣的抗體的生產(chǎn)，來(lái)治療或預(yù)防個(gè)體的腹部疾病的方法中。
25.蛋白，其包含能結(jié)合T細(xì)胞受體的序列，該T細(xì)胞受體識(shí)別能如權(quán)利要求1所定義的試劑，且該序列能造成攜帶這樣的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的拮抗作用。
26.如權(quán)利要求1所定義的試劑或如權(quán)利要求9所定義的拮抗劑。
27.藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1所定義的試劑或如權(quán)利要求9所定義的拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
28.組合物，其用于使個(gè)體耐受谷蛋白，以抑制生成對(duì)如權(quán)利要求1所定義的試劑的T細(xì)胞或抗體反應(yīng)，所述組合物包含如權(quán)利要求1所定義的試劑。
29.組合物，其用于拮抗對(duì)如權(quán)利要求1所定義的試劑的T細(xì)胞反應(yīng)，所述組合物包含如權(quán)利要求9所定義的拮抗劑。
30.突變的谷蛋白，其野生型序列可以被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成作為如權(quán)利要求1所定義的試劑的序列，該突變的谷蛋白包含突變，所述突變可以預(yù)防它被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成作為如權(quán)利要求1所定義的試劑的序列；或這樣的突變的谷蛋白的片段，其長(zhǎng)度是至少7個(gè)氨基酸，且其包含該突變。
31.多核苷酸，其包含編碼如權(quán)利要求25或30定義的蛋白或片段的編碼序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的多核苷酸，其另外包含一個(gè)或多個(gè)可操作地連接到編碼序列上的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列能確保編碼序列在細(xì)胞中的表達(dá)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的多核苷酸，其中調(diào)節(jié)序列允許編碼序列在原核或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
34.根據(jù)權(quán)利要求31-33中的任一項(xiàng)的多核苷酸，它是載體，或它是載體的形式。
35.細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求31-34中的任一項(xiàng)定義的多核苷酸，或其已經(jīng)被這樣的多核苷酸轉(zhuǎn)化。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的細(xì)胞，它是原核細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
37.哺乳動(dòng)物，其表達(dá)如權(quán)利要求1所定義的T細(xì)胞受體。
38.診斷個(gè)體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包?a)使來(lái)自宿主的樣品接觸至少一種選自下述的試劑i)肽，其包含至少一個(gè)表位，所述表位包含選自SEQ IDNO1-1927的序列，和其等價(jià)物；和ii)(i)的類(lèi)似物，其能被識(shí)別(i)的T細(xì)胞受體識(shí)別，且其長(zhǎng)度不超過(guò)50個(gè)氨基酸；和(b)體外測(cè)定樣品中的T細(xì)胞是否識(shí)別該試劑；T細(xì)胞的識(shí)別指示著該個(gè)體患有或易感腹部疾病。
39.如權(quán)利要求38所定義的試劑在制備用于診斷個(gè)體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒ㄖ械脑\斷工具中的用途，所述方法包含，測(cè)定個(gè)體的T細(xì)胞是否識(shí)別該試劑，其中T細(xì)胞的識(shí)別指示著該個(gè)體患有或易感腹部疾病。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或39的方法或用途，其中所述試劑是類(lèi)似物(iii)，其包含結(jié)合到(a)HLA分子或(b)能結(jié)合(i)或(ii)的HLA分子的片段上的(i)或(ii)。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法或用途，其中所述HLA分子或片段是在復(fù)合物中，所述復(fù)合物包含4個(gè)HLA分子或HLA分子的片段。
42.根據(jù)權(quán)利要求39-41中的任一項(xiàng)的用途，其中所述方法包含，給個(gè)體的皮膚施用試劑，和檢測(cè)炎癥在施用部位的存在，其中炎癥的檢測(cè)指示著個(gè)體的T細(xì)胞識(shí)別該試劑。
43.根據(jù)權(quán)利要求39、41或42的方法，其中所述樣品是血液樣品。
44.根據(jù)權(quán)利要求38、40、41或43的方法，其中在所述測(cè)定之前，未以抗原特異性的方式體外地再次刺激T細(xì)胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求38-44中的任一項(xiàng)的方法或用途，其中通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的分泌，來(lái)確定T細(xì)胞對(duì)試劑的識(shí)別。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法或用途，其中所述細(xì)胞因子是IFN-γ。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的方法或用途，其中通過(guò)允許細(xì)胞因子結(jié)合固定化的對(duì)該細(xì)胞因子特異性的抗體，且然后檢測(cè)抗體/細(xì)胞因子復(fù)合物的存在，來(lái)檢測(cè)細(xì)胞因子。
48.根據(jù)權(quán)利要求38-44中的任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量試劑是否結(jié)合T細(xì)胞受體來(lái)完成的。
49.鑒別如權(quán)利要求38、40或41中所定義的類(lèi)似物的方法，其包含測(cè)定候選物質(zhì)是否能被T細(xì)胞受體識(shí)別，所述T細(xì)胞受體識(shí)別包含如權(quán)利要求38所定義的序列的表位，其中該物質(zhì)的識(shí)別指示著該物質(zhì)是類(lèi)似物。
50.診斷個(gè)體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包含測(cè)定來(lái)自個(gè)體的樣品中結(jié)合包含如權(quán)利要求38所定義的序列的表位的抗體的存在，其中抗體的存在指示著該個(gè)體患有或易感腹部疾病。
51.測(cè)定組合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含測(cè)定組合物中是否存在能被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成如權(quán)利要求38所定義的寡肽序列的蛋白，其中該蛋白的存在指示著該組合物能造成腹部疾病。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中如下完成所述測(cè)定使組合物接觸對(duì)能被修飾成寡肽序列的序列特異性的抗體，其中抗體與組合物中蛋白的結(jié)合，指示著該組合物能造成腹部疾病。
53.鑒別T細(xì)胞的拮抗劑的方法，所述T細(xì)胞識(shí)別如權(quán)利要求1所定義的試劑，所述方法包含使候選物質(zhì)接觸T細(xì)胞，和檢測(cè)該物質(zhì)是否造成T細(xì)胞經(jīng)歷抗原特異性的反應(yīng)的能力的降低，其中所述能力的任何這樣的降低的檢測(cè)，指示著物質(zhì)是拮抗劑。
54.試劑盒，其用于實(shí)現(xiàn)根據(jù)權(quán)利要求38-48中的任一項(xiàng)的方法或用途，其包含如權(quán)利要求38、40或41所定義的試劑和用于檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)肽的識(shí)別的工具。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的試劑盒，其中用于檢測(cè)識(shí)別的工具包含IFN-γ的抗體。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的試劑盒，其中所述抗體固定化在固體支持物上，且任選地該試劑盒也包含用于檢測(cè)抗體/IFN-γ復(fù)合物的工具。
57.如權(quán)利要求56所定義的試劑或拮抗劑或如權(quán)利要求30所定義的野生型序列在生產(chǎn)對(duì)試劑、拮抗劑或野生型序列特異性的抗體中的用途。
58.谷蛋白的表位中的突變?cè)诮档凸鹊鞍自斐筛共考膊〉哪芰χ械挠猛?，所述表位如?quán)利要求38所定義。
59.鑒別作為腹部疾病的治療劑的產(chǎn)物的方法，其包含給患有或易感腹部疾病的如權(quán)利要求37所定義的哺乳動(dòng)物施用候選物質(zhì)，并測(cè)定該物質(zhì)是否預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中的腹部疾病，其中腹部疾病的預(yù)防或治療指示著該物質(zhì)是治療產(chǎn)物。
60.如權(quán)利要求59的方法所鑒別的治療產(chǎn)物，其用于預(yù)防或治療腹部疾病的方法中。
61.診斷個(gè)體的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包含施用如?quán)利要求38所定義的試劑，和體內(nèi)測(cè)定個(gè)體中的T細(xì)胞是否識(shí)別該試劑，其中試劑的識(shí)別指示著個(gè)體患有或易感腹部疾病。
62.根據(jù)權(quán)利要求35的細(xì)胞，它是禾本科單子葉植物物種的細(xì)胞。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的細(xì)胞，它是小麥、玉米、燕麥、黑麥、稻、大麥、黑小麥、高梁或甘蔗的細(xì)胞。
64.生產(chǎn)由如權(quán)利要求31所定義的編碼序列編碼的蛋白的方法，該方法包含(a)在允許表達(dá)蛋白的條件下，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求35、36、62或63中的任一項(xiàng)的細(xì)胞；和任選地(b)回收表達(dá)的蛋白。
65.得到轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞的方法，其包含(a)用根據(jù)權(quán)利要求34的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞。
66.得到第一代轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包含(b)再生用根據(jù)權(quán)利要求34的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞，以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。
67.得到轉(zhuǎn)基因植物種子的方法，其包含(c)從可從權(quán)利要求66的步驟(b)得到的轉(zhuǎn)基因植物得到轉(zhuǎn)基因種子。
68.得到轉(zhuǎn)基因后代植物的方法，其包含從可通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求66的方法得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，得到第二代轉(zhuǎn)基因后代植物，和任選地從由此得到的第二代后代植物，得到再后一代或多代的轉(zhuǎn)基因植物。
69.根據(jù)權(quán)利要求68的方法，其包含(d)從可通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求67的方法得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，得到轉(zhuǎn)基因種子，然后從轉(zhuǎn)基因種子得到第二代轉(zhuǎn)基因后代植物；和/或(e)克隆繁殖可通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求66的方法得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，以生產(chǎn)第二代后代植物；和/或(f)使可通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求66的方法得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物與另一種植物雜交，以生產(chǎn)第二代后代植物；和任選地(g)從這樣得到的第二代后代植物，得到再后一代或多代的轉(zhuǎn)基因后代植物。
70.可通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求65-69中的任一項(xiàng)的方法得到的轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞、植物、植物種子或后代植物。
71.轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，其包含根據(jù)權(quán)利要求62或63的植物細(xì)胞。
72.轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞愈傷組織，其包含可從權(quán)利要求62、63或65-69中的任一項(xiàng)所定義的轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞、第一代植物、植物種子或后代得到的根據(jù)權(quán)利要求62或63的植物細(xì)胞。
73.根據(jù)權(quán)利要求70-72中的任一項(xiàng)的植物或愈傷組織，它是如權(quán)利要求62或63所定義的物種。
74.得到作物產(chǎn)物的方法，其包含從根據(jù)權(quán)利要求70-73中的任一項(xiàng)的植物收獲作物產(chǎn)物，和任選地進(jìn)一步加工收獲的產(chǎn)物。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中所述植物是小麥植物，且所述收獲的作物產(chǎn)物是谷物；任選地進(jìn)一步加工成面粉或另一種谷物產(chǎn)物。
76.可通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求74或75的方法得到的作物產(chǎn)物。
77.食物，其包含如權(quán)利要求25或30所定義的蛋白。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的食物，其中使用如權(quán)利要求25或30所定義的蛋白代替野生型谷蛋白。
全文摘要
此處公開(kāi)的本發(fā)明涉及在診斷、治療和預(yù)防腹部疾病的方法中使用的表位。提供了包含至少一種表位的治療組合物。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1976715SQ200580021704
公開(kāi)日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2005年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月28日
發(fā)明者R·安德森, T·貝斯巴思, J·T·丁 申請(qǐng)人:英國(guó)技術(shù)集團(tuán)國(guó)際有限公司