專(zhuān)利名稱(chēng)：：由茶堿調(diào)控其靶特異性核糖核酸的取代活性的變構(gòu)反式剪接i型核酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由茶堿調(diào)控其靶特異性核糖核酸的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶。
背景技術(shù)：
：已做出了熱切的嘗試來(lái)開(kāi)發(fā)基因治療技術(shù)作為新的治療技術(shù)來(lái)治療無(wú)法治愈的人類(lèi)疾病，它通過(guò)對(duì)分子遺傳原因以及由于基因突變導(dǎo)致的不可治愈的人類(lèi)疾病的因素進(jìn)行研究。然而，在目前的基因治療技術(shù)中存在許多待解決的問(wèn)題。正?；蜣D(zhuǎn)移到患者的適當(dāng)?shù)募?xì)胞而做出的(摩根，R.A.與安德森，W.F.1993，人類(lèi)基因治療.生物化學(xué)年評(píng).62:191-217(Morgan,R.A.andAnderson,W.F.1993,Humangenetherapy.所oc/em.62:191-217))。理論上來(lái)說(shuō)為了通過(guò)這種基因治療獲得治療效果，應(yīng)該在適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)調(diào)控機(jī)制下產(chǎn)生所期望的基因產(chǎn)物。然而，由于在病毒顆粒中的轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的大小的限制，幾乎所有的基因治療都是通過(guò)將所期望的基因以cDNA(互補(bǔ)脫氧核糖核酸)的形式進(jìn)4亍轉(zhuǎn)移而做出的，這種轉(zhuǎn)移在各種不同的啟動(dòng)子或者在基因片段中基因自身的啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行。因此，病毒顆粒不包括各種遺傳成分，這種遺傳成分可以調(diào)控在病毒顆粒中的和它們自身的轉(zhuǎn)運(yùn)基因，并且不會(huì)使疾病的治療所期望的效果最大化。此外，用于基因表達(dá)的啟動(dòng)子等可能不符合人們期望地激活其它類(lèi)型的啟動(dòng)子，并且也可能通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)而增加基因所轉(zhuǎn)移到的細(xì)胞的不同基因的表達(dá)(例如，原癌基因(protooncogene))。而且，正?；虻霓D(zhuǎn)移根本不會(huì)影響患者細(xì)胞內(nèi)突變基因產(chǎn)物的減少。當(dāng)突變基因產(chǎn)物確實(shí)具有占主導(dǎo)的負(fù)面效果時(shí)，通過(guò)傳統(tǒng)的方法的治療效果可能不會(huì)得到最大化。因此，需要一種新穎的治療，該治療誘導(dǎo)正?；虻牧己谜{(diào)控的表達(dá)，并同時(shí)抑制突變基因的表4達(dá)(蘭，N.、赫瑞，R.P.、李，S.W.、史密斯，C.A.和薩倫格，B.A.1998，紅細(xì)胞前體中的鐮刀狀b-珠蛋白mRNA的核酶介導(dǎo)的修復(fù).科學(xué)280:1593(Lan,N.,Howrey，R.R,Lee，S.W"Smith,C.A.，andSullenger,B.A.1998,Ribozyme-MediatedRepairofSickleb-GlobinmRNAsinErythrocytePrecursors.5We"ce280:1593);皮拉克托，L.A.、達(dá)拉，C.和伍德，M丄1998,三核苷酸重復(fù)的核酶介導(dǎo)的反式剪接.自然遺傳學(xué)18:378-381(Phylactou,L.A.,Darrah,C.,andWood,M丄1998,Ribozyme-mediatedtrans-splicingofatrinucleotiderepeat.NatGenet.18:378-381);羅杰斯，C.S.、瓦努瓦，C.G.、薩倫格，B.A.和喬治，A丄.Jr.2002,使用反式剪接核酶對(duì)突變氯通道的功能性修復(fù)，臨床研究期刊.110:1783-1789(Rogers,C.S.,Vanoye,C,G"Sullenger,B.A.，andGeorge,A丄.Jr.2002，F(xiàn)unctionalrepairofamutantchloridechannelusingatrans-splicingribozyme，J.C7/"./"組110:1783-1789);信，K.S.、薩倫格，B.A.和李,S.W.2004，在人類(lèi)癌細(xì)胞中由于對(duì)突變p53RNA的靶向修復(fù)造成的并由核酶調(diào)控誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡.分子治療學(xué).10:365-372(Shin，K.S"Sullenger,B.A.，andLee,S.W.2004，Ribozyme-mediatedinductionofapoptosisinhumancancercellsbytargetedrepairofmutantp53RNA.Mo/TTzer10:365-372);宇，K丄、金姆，J.H.和李，S.W.2003,在丙型肝炎病毒內(nèi)部核糖進(jìn)入位點(diǎn)表達(dá)細(xì)胞中核酶介導(dǎo)的通過(guò)靶向反式剪接的選擇性誘導(dǎo).分子治療學(xué).7;386-395(Ryu,K丄，Kim,J.H.,andLee,S.W.2003，Ribozyme-mediatedselectiveinductionofnewgeneactivityinhepatitisCvirusinternalribosomeentrysite-expressingcellsbytargetedtrans-splicing.^M/.7Tze廣7;386-395))。已報(bào)導(dǎo)來(lái)自嗜熱四膜蟲(chóng)的I型內(nèi)含子核酶通過(guò)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞和人類(lèi)細(xì)胞內(nèi)以及在活體外條件下的獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行反式剪接來(lái)將兩種獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄物彼此連接(冰，M.和切赫，T.1986，一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)決定了四膜蟲(chóng)rRNA前體自我剪接、反式剪接以及RNA酶活性的序列特異性.細(xì)胞47:207-216(Been,M.andCech，T.1986，OnebindingsitedeterminessequencespecificityofTetrahymenapre-rRNAself-splicing,trans-splicing,andRNAenzymeactivity.Cell47:207-216);薩倫格，B.A.和切赫，T.R.1994，核酶介導(dǎo)的通過(guò)靶向反式剪接對(duì)缺陷mRNA的修復(fù).自然371:619-622(Sullenger,B.A.andCech,T.R.1994，Ribozyme-mediatedrepairofdefectivemRNAbytargeted,trans-splicing.Nature371:619-622);瓊斯，J,T.、李，S.W.和薩倫才各，B.A.1996，對(duì)核酶反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記以追蹤哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的反式剪接.自然.醫(yī)學(xué).2:643-648(Jones,J.T.，Lee，S.W"andSullenger，B.A.1996,Taggingribozymereactionsitestofollowtrans-splicinginmammaliancells.iVW^fed.2:643-648))。戶斤以，以I型內(nèi)含子為基礎(chǔ)的反式剪接核酶以疾病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本或者某些不在正常細(xì)胞中表達(dá)、只在感染細(xì)胞中特異地表達(dá)的某些RNA為靶；并隨后通過(guò)將不正常的RNA更正為正常RNA或者將與疾病有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄本取代為新的治療性基因轉(zhuǎn)錄本來(lái)誘發(fā)細(xì)胞重組。因此，反式剪接的核酶對(duì)疾病有非常的特異性并且可以用作穩(wěn)定的基因治療技術(shù)。也就是說(shuō)，由于RNA的取代僅在靶基因轉(zhuǎn)錄本存在情況下進(jìn)行的，所以期望的基因產(chǎn)物可能只在適當(dāng)?shù)目臻g和時(shí)間才產(chǎn)生。特別地，由于用RNA取代來(lái)靶向細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的RNA，并隨后用期望的基因產(chǎn)物來(lái)取代該目標(biāo)RNA，所以調(diào)控待表達(dá)基因的量是可能的。而且，由于反式剪接的核酶起到除去疾病特異性RNA的功能并同時(shí)誘導(dǎo)所期望的治療性基因產(chǎn)物的表達(dá)，因此反式剪接的核酶能使療效加倍。RNA具有合適的化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)特性以起到人為開(kāi)關(guān)或自然開(kāi)關(guān)的作用(曼達(dá)爾，M.、伯澤，B.、巴瑞克，J.E.、溫克勒，\￥.(:.以及布瑞克，11.11.2003,核開(kāi)關(guān)調(diào)控枯草芽孢桿菌和其他細(xì)菌內(nèi)基礎(chǔ)生化途徑.細(xì)胞113:577-586(Mandal,M.,Boese，B.，Barrick，J.E.,Winkler,W.C.，andBreaker,R.R.2003,RiboswitchescontrolfundamentalbiochemicalpathwaysinBacillussubtilisandotherbacteria.Ce〃113:577-586))。通過(guò)利用這些特性，通過(guò)對(duì)特異性地靶RNA適體結(jié)合到核酶上的小分子或者蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)活序列進(jìn)行識(shí)別而得到的酶被稱(chēng)為適體酶(aptazyme)，所述核酶為具有酶活性的RNA(布瑞克，R.R.2002,改造過(guò)的變構(gòu)核酶作為生物傳感器的組成.生物技術(shù)新見(jiàn)13:31-39(Breaker,R.R.2002,Engineeredallostericribozymesasbiosensorcomponents.Cwr.Qp/".13:31-39))。對(duì)于適體酶，核酶和適體通過(guò)il/f言才莫塊而連接。所述通信模塊具有這樣的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)起到中間體的作用來(lái)將在適體中產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)移到核酶中。(科特斯堡，夂和紹庫(kù)普，0.八.2002，一種用于RNA折疊和催化的多功能通信模塊.核酸研究.30:4599-4606(Kertsburg,A.and6Soukup,G.A.2002，AversatilecommunicationmoduleforcontrollingRNAfoldingandcatalysis.iVwc/e/d'<isi^s.30:4599-4606))。當(dāng)適體感應(yīng)到配體時(shí)，這些信號(hào)通過(guò)通信模塊轉(zhuǎn)移到核酶以對(duì)無(wú)活性的核酶進(jìn)行變構(gòu)修飾，從而誘發(fā)活抑制核酶的活性。也就是說(shuō)，核酶的活性可以通過(guò)某些內(nèi)源性配體活外源性配體進(jìn)行調(diào)控。對(duì)于目前的用于治療癌癥的方法而言，需要發(fā)展一種方法，其中僅能將癌細(xì)胞特異性地清楚。通過(guò)將RNA適體連接到核酶上來(lái)制備變構(gòu)核酶(適體酶)，這種制備利用了這樣的事實(shí)，RNA到其它的配體等的連接改變了核酶的結(jié)構(gòu)。變構(gòu)核酶利用小分子作為配體的確切的機(jī)理還未被知曉，但是人們認(rèn)為變構(gòu)核酶的機(jī)理是通過(guò)連接到配體上而進(jìn)行的，以在結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定核酶或破壞核酶的穩(wěn)定(科特斯堡，A.和紹庫(kù)普，G.A.2002,—種用于RNA折疊和催化的多功能通信模塊.核酸研究.30:4599-4606.(Kertsburg，A.andSoukup，G.A.2002,AversatilecommunicationmoduleforcontrollingRNAfoldingandcatalysis.泡c/e/c^c/A30:4599-4606);荷西，A.M.、紹庫(kù)普，G.A.和布瑞克，R.R.2001,效應(yīng)子通過(guò)變構(gòu)核酶的協(xié)同連接.核酸研究.29:1631.1637(Jose,A.M.,Soukup，G.A.，andBreaker,R.R.2001,Cooperativebindingofeffectorsbyanallostericribozyme.7Vwc/ez'cJc/A29:1631.1637);小泉，M.、紹庫(kù)普，G.A.、科爾，J.N.和布瑞克，R.R.1999，對(duì)第二信使cGMP和cAMP應(yīng)答的核酶的變構(gòu)選擇.自然結(jié)構(gòu)生物學(xué).6:1062.1071(Koizumi,M.,Soukup，G.A.，Kerr,J.N.，andBreaker,R.R.1999,AllostericselectionofribozymesthatrespondtothesecondmessengerscGMPandcAMRA^we所o/.6:1062.1071)。在較早階段就研究了適體酶使用小分子作為配體，但是目前對(duì)適體酶與蛋白質(zhì)或寡聚核苷酸的互相作用進(jìn)行了研究。人端斗立酶反4爭(zhēng)錄酶(Humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)是用來(lái)調(diào)控癌細(xì)胞的永生和增殖的因素之一。在無(wú)限繁殖的生殖細(xì)胞、造血細(xì)胞和癌細(xì)胞中，端粒酶具有80-90%的端粒酶活性，而在癌細(xì)胞周?chē)恼＜?xì)胞不具有這種活性J布萊恩，T.M.和切赫，T.R.1999，端粒酶和它對(duì)染色體末端的維持.細(xì)胞生物學(xué)新觀點(diǎn).11;318-324(Bryan，T.M.andCech，T.R.1999，Telomeraseandthemaintenanceofchromosomeends.Cw/rC^/".Ce〃歷o/.11;318-324))。通過(guò)利用端粒酶的這些特性，已有熱切的研究還開(kāi)發(fā)一種與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的端粒酶抑制劑，以抑制癌細(xì)胞的增殖(布萊恩，T.M.、恩格勒祖，A.,Gupta，J.、巴杰蒂，S.，和瑞德?tīng)枺琑.R.1995，在沒(méi)有可測(cè)到的端粒酶活性的情況下永生人類(lèi)細(xì)胞中端粒的延長(zhǎng).歐洲分子生物學(xué)學(xué)報(bào).14;4240-4248(Biyan，T.M.,Englezou,A.,Gupta,J.，Bacchetti，S.,andReddel，R.R.1995,Telomereelongationinimmortalhumancellswithoutdetectabletelomeraseactivity.14;4240-4248);阿坦堤，S.E.和狄平候，R.A.2000,沒(méi)有端粒酶的老鼠它們所能告訴我們的有關(guān)人類(lèi)癌癥.國(guó)家醫(yī)學(xué)雜質(zhì).6;852-855(Artandi，S.E.andDePinho,R.A.2000，Micewithouttelomerase:whatcantheyteachusabouthumancancer艦Met/.6;852-855))。酶通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞特異性的人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的特異性RNA識(shí)別并將hTERT耙向的反式剪接核酶通過(guò)商業(yè)化的通信模塊連接到適體上而進(jìn)行制備，其中，所述hTERT靶向的反式剪接核酶具有已經(jīng)證實(shí)的反式剪接能力，并且所述適體具有對(duì)茶堿的高度親和力。而且，使用體外反式剪接分析、熒光素酶報(bào)告分析、RT-PCR和MTT法，本發(fā)明已經(jīng)確認(rèn)這些核酶僅在茶堿存在于試管和細(xì)胞中的條件下選擇性地識(shí)別并切割hTERTRNA,并且核酶的3，端外顯子與靶位點(diǎn)下游區(qū)域進(jìn)行退火這些變構(gòu)反式剪接核酶可以用于開(kāi)發(fā)一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠以某些疾病特異性RNA為靶，并且通過(guò)使用外源性因子(例如小分子)激活核酶的功能來(lái)人為地調(diào)控向治療性基因RNA的取代。并且，可以通過(guò)針對(duì)已感染細(xì)胞特異性的方式人為地調(diào)控表達(dá)的治療性基因的表達(dá)來(lái)發(fā)展一種特異和可逆的基因治療技術(shù)的新概念(圖1)。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題而設(shè)計(jì)了本發(fā)明，并且因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種方法來(lái)選擇由茶堿調(diào)控其活性的變構(gòu)反式剪接I型核此外，本發(fā)明的另一個(gè)目的提供一種由茶堿調(diào)控其RNA的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶及其用途，并且該核酶特異性地把向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的RNA。進(jìn)一步地，本發(fā)明的另一目的是提供一種表達(dá)載體及其用途，該表達(dá)載體對(duì)所述變構(gòu)反式剪接I型核酶進(jìn)行表達(dá)。技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種方法來(lái)選擇由茶堿調(diào)控其活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種由茶石咸調(diào)控其RNA取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶及其用途，并且該核酶特異性地靶向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的RNA。根據(jù)本發(fā)明的再另一個(gè)方面，還提供了一種表達(dá)載體及其用途，該表達(dá)載體對(duì)所述變構(gòu)反式剪接I型核酶進(jìn)行表達(dá)。有益效果如以上所描述地，根據(jù)本發(fā)明的一種示例性實(shí)施方式的變構(gòu)反式剪接I型核酶可以用來(lái)選擇性地診斷僅表達(dá)了耙hTERTRNA的癌細(xì)胞，或者誘導(dǎo)這些癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，這是由于所述變構(gòu)反式剪接I型核酶的活性依賴(lài)于茶堿的調(diào)控以通過(guò)反式剪接反應(yīng)對(duì)靶hTERTRNA進(jìn)行更正。圖1為表示了通過(guò)變構(gòu)反式剪接核酶向RNA內(nèi)的取代的調(diào)控的示意圖。圖2表示了靶向hTERT的T/S核酶。圖3表示了依賴(lài)于茶堿的變構(gòu)T/S核酶。圖4表示了WTP9和Mu-P9的3'端序列。圖5表示了體外反式剪接反應(yīng)。圖6表示了對(duì)體外反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)時(shí)PCR分析。圖7表示了通過(guò)具有延長(zhǎng)的基因間區(qū)(intergenicspacer,IGS)的T/S核酶進(jìn)行的體外反式剪接反應(yīng)。圖8表示了通過(guò)變構(gòu)反式剪接核酶的體外反式剪接反應(yīng)的相容性。圖9表示了通過(guò)變構(gòu)反式剪接核酶誘導(dǎo)的依賴(lài)于茶堿的轉(zhuǎn)基因。圖IO表示了通過(guò)變構(gòu)反式剪接核酶誘導(dǎo)的依賴(lài)于茶堿的轉(zhuǎn)基因，所述變9構(gòu)反式剪接核酶包括lOOnt的對(duì)靶RNA的反義序列。圖ll表示了hTERT細(xì)胞內(nèi)的通過(guò)變構(gòu)反式剪接核酶抑制的轉(zhuǎn)基因。圖12表示了通過(guò)變構(gòu)反式剪接核酶誘導(dǎo)的依賴(lài)于茶堿的轉(zhuǎn)基因，所述變構(gòu)反式剪接核酶包括300nt的對(duì)靶RNA的反義序列。圖13表示了細(xì)胞內(nèi)的通過(guò)變構(gòu)核酶的依賴(lài)于茶堿的反式剪接反應(yīng)。圖14表示了表達(dá)載體(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK)和腺病毒載體(Ad-TheoRib-TK、Ad-Theo-CRT)的基本結(jié)構(gòu)，各個(gè)上述載體編碼依賴(lài)于茶堿的反式剪接核酶進(jìn)行編碼。圖15表示了在hTERT+HT-29細(xì)胞內(nèi)的由變構(gòu)反式剪接核酶引發(fā)的依賴(lài)于茶》咸的細(xì)胞凋亡。圖16表示了在hTERT+HepG2細(xì)胞內(nèi)的由變構(gòu)反式剪接核酶引發(fā)的依賴(lài)于茶堿的細(xì)胞凋亡。圖17表示了在hTERT+Capan-l細(xì)胞內(nèi)的由變構(gòu)反式剪接核酶引發(fā)的依賴(lài)于茶^f咸的細(xì)胞凋亡。圖18表示了在hTERT-IMR90細(xì)胞內(nèi)的變構(gòu)反式剪接核酶沒(méi)有引發(fā)細(xì)胞凋亡。圖19表示了由變構(gòu)反式剪接核酶引發(fā)的HT-29細(xì)胞的反式剪接反應(yīng)。圖20表示了使用實(shí)時(shí)PCR分析的由變構(gòu)反式剪接核酶引發(fā)的HT-29細(xì)胞的反式剪接反應(yīng)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種方法來(lái)選擇由茶堿調(diào)控其活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，該方法包4舌制備其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中的任一者或者兩者上的適體酶、其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到P9區(qū)被部分地除去的反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中的任一者或者兩者的適體酶，或者其中茶堿配體和通信模塊結(jié)合到P9區(qū)被部分地修飾的反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中的任一者或兩者的適體酶；通過(guò)茶堿和咖啡因來(lái)確認(rèn)是否發(fā)生依賴(lài)于茶堿的反式剪接反應(yīng)以比較體外制備的適體酶的變構(gòu)調(diào)控；以及通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶活性來(lái)確定在0.1-1mM的茶堿存在下依賴(lài)于茶堿的轉(zhuǎn)基因是否得到表達(dá)。在這種情況下，用來(lái)選擇根據(jù)本發(fā)明一種示例性實(shí)施方式的變構(gòu)反式剪接I型核酶的方法可以還包括在所述制備適體酶的步驟中，制備含有對(duì)hTERTRNA的100-300nt的反義片段的適體酶。此外，本發(fā)明的方法提供了一種由茶堿調(diào)控RNA的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其特征在于，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶特異性地靶向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)RNA，并具在3'外顯子處具有得自螢火蟲(chóng)(firefly-derived)的熒光素酶受體基因。在此情況下，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶可以具有選自由SEQIDNO:1中描述的AS300AP98T、SEQIDNO:2中描述的AS100Mu-P96T8T以及在SEQIDNO:3中描述的AS300W-P96T8T所組成的組中的RNA序列。而且，本發(fā)明提供編碼變構(gòu)反式剪接I型核酶的表達(dá)載體。在這種情況下，所述表達(dá)載體可以包括選自由SEQIDNO:4中描述的pSEAPAS300△P98T畫(huà)Luci、SEQIDNO:5中描述的pSEAPAS100Mu-P96T8T-Luci和SEQIDNO:6中描述的pSEAPAS300W-P96T8T-Luci所組成的組中的載體。此外，本發(fā)明提供了一種由茶堿調(diào)控其RNA的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其特征在于，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶特異性地靶向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)RNA，并在3'外顯子上具有單純皰滲病毒胸苷激酶(HSV-TK)細(xì)胞凋亡基因。在這種情況下，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶可以具有SEQIDNO:7中描述的AS300W-P96T8T-TK的RNA序列。此外，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，該表達(dá)栽體表達(dá)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的變構(gòu)反式剪接I型核酶。在此情況下，所述表達(dá)載體可以包括在SEQIDNO:8中描述的pAvQ畫(huà)Theo國(guó)Rib21AS國(guó)TK(KCCM10935P)。此外，本發(fā)明提供了基因表達(dá)誘導(dǎo)物、癌癥診斷劑、或包括變構(gòu)反式剪接的I型核酶和茶堿的基因治療劑。進(jìn)一步地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種包括所述表達(dá)載體和茶堿的基因表達(dá)誘導(dǎo)物、癌癥診斷劑或基因治療劑。，在下文中，將更詳細(xì)地對(duì)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式進(jìn)行描述。在下文中，根據(jù)本發(fā)明的一種示例性實(shí)施方式的變構(gòu)反式剪接I型核酶是指適體酶或依賴(lài)于茶堿的適體酶。本說(shuō)明書(shū)中通篇所使用"茶堿適體酶"的表述表示特異性地與茶堿結(jié)合的適體酶。根據(jù)本發(fā)明一種示例性實(shí)施方式的變構(gòu)反式剪接I型核酶是一種由于核酶中結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變可以變構(gòu)地增強(qiáng)或抑制核酶的反式剪接活性的分子。在此，由于結(jié)合到某些配體(例如適體)的區(qū)被退火到核酶的底物結(jié)合部位和催化核心部位，當(dāng)適體結(jié)合到所述某些配體上并且該配體被感應(yīng)到以將這些信號(hào)通過(guò)通信模塊轉(zhuǎn)移到核酶時(shí)，核酶結(jié)構(gòu)可以被誘導(dǎo)而改變。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)通信模塊將茶堿適體結(jié)合到hTERT靶向的反式剪接核酶上而發(fā)現(xiàn)了一種適體酶。在此，hTERT靶向的反式剪接核酶在先已基于I型內(nèi)含子建立，并且由茶堿調(diào)控反式剪接核酶的活性，并且該適體酶還能夠僅誘導(dǎo)具有hTERT的癌細(xì)胞的反式剪接。在這種情況下，所制備的為適體酶，其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中的任一者或兩者上，或者茶堿適體和通信模塊結(jié)合到P9區(qū)被部分地除去的反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中的任一者或兩者的適體酶(參見(jiàn)圖3)。在此，使用商業(yè)程度最高的通信模塊作為適體和核酶彼此退火的位點(diǎn)。而且，在PCR克隆過(guò)程中獲得其中部分的P9于的DNA序列被不同的序列所取代的Mu-P96t8t，并且該結(jié)構(gòu)還用于實(shí)驗(yàn)中(參見(jiàn)圖4)。所有是實(shí)驗(yàn)都是通過(guò)比較茶堿、咖啡因以及相當(dāng)量的溶劑(dH20或PBS)的結(jié)果而進(jìn)行的。在此，與茶堿相比擁有一個(gè)不同殘基的咖啡因被用來(lái)確認(rèn)對(duì)茶堿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而溶劑則被用來(lái)作為對(duì)照。從適體酶的變構(gòu)調(diào)控的對(duì)照和確認(rèn)的體外結(jié)果可以證實(shí)，Mu-P96t8t和AP96t通過(guò)依賴(lài)于茶堿地進(jìn)行了反式剪接(參見(jiàn)圖5)。而且，當(dāng)Mu-P96t8t和AP9進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，相比于AP96t的產(chǎn)量，Mu-P96t8t的反式剪接產(chǎn)物以40%或更多的大量而被表達(dá)。通過(guò)使用實(shí)時(shí)PCR,已確定當(dāng)茶堿存在時(shí)，在12MuP96t8t產(chǎn)生的反式剪接產(chǎn)物是dH20存在的情況下的12倍(參見(jiàn)圖6)。從具有延長(zhǎng)的IGS的適體酶的變構(gòu)調(diào)控的對(duì)照和確認(rèn)的體外結(jié)果還證實(shí)了，雖然核酶具有相同的基本骨架，核酶的活性根據(jù)反義序列的存在被不同地表達(dá)(參見(jiàn)圖7)。還在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中確認(rèn)了適體酶的變構(gòu)調(diào)控。考慮到適體酶的體外和細(xì)胞內(nèi)的變構(gòu)調(diào)控彼此不同，將適體酶的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果在體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。在進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)之前，將細(xì)胞以依賴(lài)于濃度的方式進(jìn)行處理從而確定細(xì)胞中最佳的茶堿濃度。因此，確定的茶堿的最佳濃度優(yōu)選為O.l-l.OmM的范圍內(nèi)，并且更優(yōu)選為0.7mM(參見(jiàn)圖9)。隨后，進(jìn)行熒光素酶分析從而確定反式剪接產(chǎn)物是否在細(xì)胞中表達(dá)并且所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因發(fā)揮了作用。在細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，甚至在存在相當(dāng)量的PBS(溶劑)而不是茶堿或咖啡因時(shí)，熒光素酶就能得到全面的表達(dá)。這表示存在于反式剪接適體3，外顯子的熒光素酶基因在沒(méi)有反式剪接的情況下很可能被表達(dá)。因此，當(dāng)核酶被轉(zhuǎn)染并在已知沒(méi)有靶的細(xì)胞((SK-LUI)中確認(rèn)時(shí)熒光素酶很可能在不存在靶的情況下的表達(dá)被如所期望地確認(rèn)了。(參見(jiàn)圖11)。增加劑量反義RNA來(lái)補(bǔ)充該背景。在反義RNA的增加減少非特異性表達(dá)并進(jìn)一步提高效率的期望下，核酶的反義RNA的用量范圍增加100-300，并且熒光素酶的表達(dá)在細(xì)胞中得到確認(rèn)。結(jié)果這反映了熒光素酶的表達(dá)速率得到了全面的增加。結(jié)果，在AS-100Mu-P96t8t、AS-300W-P96t8t和AS-300△P98t的例子中，可以觀察到在hTERT陽(yáng)性細(xì)胞中熒光素酶活性以依賴(lài)于茶堿的形式被有效地誘導(dǎo)(參見(jiàn)圖10和圖12)。將細(xì)胞的全部RNA進(jìn)行分離以核實(shí)細(xì)胞中的反式剪接，并且證實(shí)了RNA水平的反式剪接產(chǎn)物。如此一來(lái)，證實(shí)了在模擬條件下在AS300WT中觀察到反式剪接產(chǎn)物帶，并在存在茶;威時(shí)觀察到了AS300W-P96T8T(參見(jiàn)圖13)。通過(guò)用單純皰滲病毒胸苦激酶(HSV-TK)來(lái)取代熒光素類(lèi)而改變3，外顯子。也就是說(shuō),制備了特異性地靶向hTERTRNA并在3'外顯子處具有HSV-TK凋亡基因的變構(gòu)反式剪接I型核酶，并制備了編碼核酶的表達(dá)載體(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK)。然后，將制備的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到隨后將在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行使用的腺病毒中。將hTERTP日性細(xì)月包系(HT畫(huà)29、HepG2和Capan-l)和hTERT陰性細(xì)胞系(IMR90)用各種腺病毒進(jìn)行處理，然后還用更昔洛韋(ganciclovir,GCV)、茶堿和咖啡因分別處理五天，以使用MTT分析觀察細(xì)胞凋亡。在這種情況下，使用Ad-TK(在CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)HSVtk基因的腺病毒栽體)作為hTERT+細(xì)胞中的陽(yáng)性對(duì)照，并使用Ad-Rib-TK(對(duì)hTERT特異并且以HSVtk標(biāo)記的腺病毒載體)作為hTERT+細(xì)胞中的陽(yáng)性對(duì)照。并且，使用Ad-LacZ(在CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下對(duì)LacZ基因進(jìn)行表達(dá)的腺病毒載體)作為陰性對(duì)照。作為結(jié)果地，顯示了當(dāng)用GCV處理hTERT+細(xì)胞系時(shí)，無(wú)論是否存在調(diào)節(jié)復(fù)合體時(shí)(regulatorcompound),hTERT+細(xì)胞系中的腺病毒載體Ad-TK和Ad-Rib-TK死亡，而Ad-TheoRib-TK僅在茶堿存在時(shí)才發(fā)生特異性地細(xì)胞凋亡(參見(jiàn)圖15-17)。還確認(rèn)了陰性對(duì)照Ad-LacZ在每一種情況下都不發(fā)生細(xì)胞凋亡。對(duì)hTERT-細(xì)胞系IMR90進(jìn)行試-瞼以確定上述特異性的細(xì)胞凋亡是否由靶RNA調(diào)控。作為結(jié)果地，當(dāng)用GCV處理hTERT-細(xì)胞系時(shí)，Ad-TK發(fā)生細(xì)胞凋亡而Ad-Rib-TK、Ad-TheoRib-TK和Ad-LacZ沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞凋亡。因此，確認(rèn)了細(xì)胞凋亡是由hTERT靶向RNA調(diào)控的(參見(jiàn)圖18)。將含有100M.O.I的腺病毒的hTERT+細(xì)胞用100pM的化學(xué)制品處理以獲得全部RNA，并且將少量的得到的全部RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析，所述腺病毒的凋亡在MTT分析中被高度誘導(dǎo)。結(jié)果，與用Ad-Rib-TK轉(zhuǎn)染的hTERT十細(xì)胞時(shí)相比，僅在Ad-Theo-CRT-移入的HT-29細(xì)胞中并且在茶堿的存在的情況下確認(rèn)了反式剪接產(chǎn)物，并且該反式剪接產(chǎn)物以基本相似的濃度進(jìn)行表達(dá)。這反映了當(dāng)用咖啡因處理hTERT+細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)生了顯著的濃度的反式剪接產(chǎn)物，但是與用茶堿處理hTERT+細(xì)胞時(shí)相比，它的濃度降^氐了約78%(參見(jiàn)圖20)。這說(shuō)明了咖啡因?qū)Σ鑹A適體的親和力比茶堿低1000倍，但是對(duì)茶堿適體還具有一定程度上的顯著的親和力。從這些結(jié)果可以看出，由才艮據(jù)本發(fā)明一種示例性實(shí)施方式的變構(gòu)核酶導(dǎo)致的靶特異性細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)是依賴(lài)于細(xì)胞中的茶堿的，并且是通過(guò)靶RNA特異的反式剪接反應(yīng)而啟動(dòng)的。實(shí)施例下面，將參考附圖對(duì)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式進(jìn)行描述，但本發(fā)明不特別地局限于此。參考實(shí)施例1:底物(hTERT)RNA的制備為了制備靶RNA,用SEQIDNO:9中描述的引物(5，-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGGCAGCGCTGCGTCCT-3，)和SEQIDNO:10中描述的引物(5'畫(huà)CGGGATCCCTGGCGGAAGGAGGGGGCGGCGGG-3，)對(duì)含有hTERT的第-1到第+218的DNA序列的pCl-neo載體(外顯子1-2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而制得編碼hTERTRNA的DNA片段。將按此制備的DNA片段體外轉(zhuǎn)錄到RNA中。加入DNA模板(3嗎)、10x的轉(zhuǎn)錄緩沖液、10mM的DTT(西格瑪公司(sigma))、0.5mM的ATP、GTP、CTP和UTP(羅氏(Roche))，80U的RNA酶抑制劑(可斯克(Kosco))、200U的T7RNA聚合酶(安爺(Ambion)),并加入焦碳酸二乙酯水(DEPC-H20)至終體積為100pi,然后進(jìn)行混合。然后將得到的混合物在37。C下反應(yīng)3小時(shí)，并進(jìn)一步地用5U的DNA酶I(普洛麥格(Promega))在37°C下處理30分鐘，以完全除去DNA模板。通過(guò)苯酚提取(phenolextraction)(pH7.0)和乙醇沉淀來(lái)提純RNA，并在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上分離以洗提RNA帶。然后，將RNA帶提純并溶解在TE緩沖液中(10mM的三羥甲基氨基曱烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，pH7.5以及1mM的EDTA)。參考實(shí)施例2:依賴(lài)于茶堿的hTERT靶向反式剪接(T/S)適體酶的克隆作為用于發(fā)展變構(gòu)核酶的&出反式剪接核酶骨架,使用了I型內(nèi)含子核酶，所述I型內(nèi)含子核酶特異性地識(shí)別hTERT的+21核苷酸(nt)位點(diǎn)并具有對(duì)靶RNA的300nt的反義序列在該處進(jìn)行退火的PI、P10和延長(zhǎng)的IGS,(權(quán)，B.S.、榮格，H.S.、宋，M.S.、曹，K.S.、金，S.C.、基姆，K.、鄭，J.S.、金，I.H.和李，S.W.2005,通過(guò)核酶介導(dǎo)的腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄物的靶向取代對(duì)人類(lèi)癌細(xì)胞的特異性衰退.分子治療學(xué).12:824-834(Kwon，B.S.,Jung，H.S.，Song,M.S.,Cho，K.S.,Kim,S.C.,Kimm，K.,Jeong,J.S.,Kim，LH,，andLee，S.W.2005,Specificregressionofhumancancercellsbyribozyme-mediatedtargetedreplacementoftumor-specifictranscript.Mo/.77^r12:824-834);洪，S.H.、鄭，J.S.、李，Y丄、榮格,H.I.、曹，K.S,、金，C.M.、權(quán)，B.S.、薩倫格，B.A.、李，S.W，和金,I.H.*2008，15hTERT通過(guò)反式剪接核酶來(lái)靶向肺瘤細(xì)胞而在活體內(nèi)的重組.分子治療學(xué).16:74-80(Hong，S.H.，Jeong，J.S.，Lee，Y丄，Jung，H丄，Cho,K.S.，Kim，C.M.,Kwon，B.S.，Sullenger，B.A.,Lee，S.W.*，andKim，I.H,*2008，InvivoreprogrammingofhTERTbytrans-splicingribozymetotargettumorcells.Mo/7Tzer.16:74-80))。在耙向hTERT的核酶的P6和P8區(qū)中的之一或者二者上通過(guò)通信模塊的方式克隆茶堿適體。還在AP9核酶的例子中，其中P9區(qū)從該核酶中缺失，靶向hTERT的核酶的P6和P8區(qū)按照上述相同的方式進(jìn)行<多飾。通過(guò)使用含有IGS的在SEQIDNO:11中描述的引物(5，-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3，)和在SEQIDNO:12中描述的引物(5，-CGAGTACTCCAAAACTAATCAA-3，)，靶向hTERT的反式剪接核酶的基因被擴(kuò)增、用限制性內(nèi)切酶HindIII和NruI進(jìn)行斷裂，并隨后克隆到SEAP啟動(dòng)子載體上，所述SEQIDNO:11中描述的引物能從自我剪接核酶中對(duì)hTERT進(jìn)行靶向，所述自我剪接核酶上茶^咸適體通過(guò)通信模塊進(jìn)行退火，所述SEQIDNO:12中描述的引物能對(duì)核酶的3'外顯子的上游基因進(jìn)行擴(kuò)增，所述茶堿適體在所述靶向hTERT的反式剪接核酶進(jìn)行退火。用在SEQIDNO:13中描述的引物(5，-CGATGATCACGAAGACGC-3，)和在SEQIDNO:14中描述的引物(5，-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATTACAATTTGGACTTT-3，)對(duì)熒光素酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用限制性內(nèi)切酶NruI和XbaI進(jìn)行斷裂，并隨后克隆到核酶的3，末端中。然而，在使用PCR的克隆過(guò)程中得到了其P9區(qū)被修飾為不期望的序列的結(jié)構(gòu)。除了所述結(jié)構(gòu)之外，兩種野生型結(jié)構(gòu)(即，野生型P96t和野生型P98t)、3種刪除的結(jié)構(gòu)(即，AP96t、AP98t和AP96t8t)和突變結(jié)構(gòu)(MuP96t8t)也被制備，并且制備含有AP9的無(wú)適體的野生型P9和8結(jié)構(gòu)作為對(duì)照。所制備的依賴(lài)于茶堿的靶向hTERT的T/S適體酶的DNA序列在全部為10|il的反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增，該反應(yīng)混合物包括3^的終止子預(yù)備(ready)反應(yīng)混合物(PE應(yīng)用的生物系統(tǒng)(PEappliedBiosystems))、100ng的量化的DNA、和3.2pmol的經(jīng)過(guò)25個(gè)循環(huán)(96°C-10秒，50°C-5秒和60°C-4秒)后的在SEQIDNO:15中描述的引物(5，-CGGGATCCCTGGCGGAAGGAGGGGGCGGCGGG-3，)。為了對(duì)這種依賴(lài)于茶堿的靶向hTERT的T>S適體酶的擴(kuò)增的基因進(jìn)行純化，隨后加入40pi的dH20，并向擴(kuò)增的反應(yīng)混合物中加入3M的NaoAC(1/10體積)和100%的EtOH(2體積)。將得到的反應(yīng)混合物攪拌，在4°C下離心分離30分鐘，轉(zhuǎn)速為13,000rpm以獲得DNA小球(DNApellet)。將該DNA小球用70%的乙醇(EtOH)(400^)進(jìn)行洗滌，并在高速真空干燥器中進(jìn)行干燥以除去EtOH。將干燥的DNA小球溶解在15pi的模板抑制劑(templatesuppressionreagent)中。接著，將得到的DNA溶液進(jìn)行攪拌并慢慢減速，并轉(zhuǎn)移到測(cè)序管(sequencingtube),在自動(dòng)序列分析儀(ABI310遺傳分析儀(ABI310GeneticAnalyzer))上進(jìn)行測(cè)序。參考實(shí)施例3:依賴(lài)于茶堿的靶向hTERT的T/S適體酶的制備用含有T7聚合酶啟動(dòng)子的SEQIDNO:16中描述的引物(5'-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3，)和用核酶的3'外顯子的中間位點(diǎn)進(jìn)行退火的在SEQIDNO:17中描述的引物(5'-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGATAA誦3，)對(duì)參考實(shí)施例2在這種情況下，DNA模板(3嗎)和NTP(1.5mM)的增加的量用于盡可能地防止自我剪接反應(yīng)。然后，加入lx的剪接緩沖液(40mM的Tris-HCl，pH7.5、5mM的MgCl2,10mM的二疏蘇糖醇(DTT)和4mM的亞精胺)、0.5mM的ATP、GTP、CTP、UTP(Roche))、80U的RNA酶抑制劑(Kosco))、200U的T7RNA聚合酶(安拜昂(Ambion)),并加入DEPC-H20至終體積為100pl，然后進(jìn)行混合。然后將得到的混合物在37。C下轉(zhuǎn)錄3小時(shí)，并進(jìn)一步地用5U的DNA酶I(普洛麥格(Promega))在37°C下處理30分鐘以完全除去DNA模板。通過(guò)苯酚提取(pH7.0)和乙醇沉淀來(lái)提純RNA，并在4%的變性聚丙烯酰胺凝膠上分離以洗提RNA帶。然后，將RNA帶提純并溶解在TE緩沖液中(10mM的三羥曱基氨基曱烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，pH7.5以及1mM的EDTA)。參考實(shí)施例4:體外反式剪接反應(yīng)存在茶堿(500|iM)或者具有不同的來(lái)自茶堿的殘基的咖啡因(500),或者相當(dāng)量的dH20時(shí)，在剪接條件下(50mM的羥乙基旅、秦乙磺酸(HEPES)，pH7.0/150mM的NaCl/5mM的MgCl2/100piM的鳥(niǎo)嘌呤),將核酶(50nM)反應(yīng)產(chǎn)物在RT-PCR反應(yīng)中進(jìn)行分析。在這種情況下，用焚光素酶識(shí)別位點(diǎn)(5'國(guó)CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGATAA-3'，SEQIDNO:18)作為反轉(zhuǎn)錄(reversetranscription,RT)的引物，并4吏用識(shí)別hTERTRNA的5，末端的位點(diǎn)(5，-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT-3，，SEQIDNO:19)和識(shí)別熒光素酶基因的位點(diǎn)(5，-CCCAAGCTTTCACTGCATACGACGATT-3，，SEQIDNO:20)分別作為聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)的5，和3，端引物。參考實(shí)施例5:半定量PCR在體外反式剪接反應(yīng)之后，將反式剪接產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCT,然后進(jìn)行半定量PCR。將各個(gè)DNA樣品測(cè)試三次以計(jì)算平均值并確定其熔點(diǎn)，然后在瓊脂糖膠中觀察DNA樣品。在這種情況下，用綠色熒光染料(SYBRGreen)來(lái)檢測(cè)DNA樣品，并將由RT反應(yīng)量化的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照用于半定量地與DNA樣品進(jìn)行比較。為了校準(zhǔn)的目的，在RT反應(yīng)中向各個(gè)樣品中加入相等量的任何RNA(rasRNA)，并將RT引物設(shè)計(jì)成使得反式剪接產(chǎn)物和內(nèi)對(duì)照rasRNA能夠被一種引物反轉(zhuǎn)錄。在此，將SEQIDNO:21中描述的引物(5，-GCCCAACACCGGCATAAAGTTACATAATTACACACTT-3，)制備為RT引物。因此，用來(lái)定量比較反轉(zhuǎn)錄樣品的rascDNA的濃度來(lái)校準(zhǔn)反轉(zhuǎn)錄樣品的濃度。'PCR反應(yīng)在PCR條件下進(jìn)行在96。C下預(yù)熱10分鐘，在96。C下變性5分鐘，在60。C下退火15秒，并且在72。C下延伸30秒。在這種情況下，使用hTERT識(shí)別位點(diǎn)(5，-CCCGAATTCTGCGTCCTGCTCGA,SEQIDNO:22)作為5'引物，并使用熒光素酶識(shí)別位點(diǎn)(5，-CCCAAGCTTTCACTGCATACACGATT，SEQIDNO:23)作為3'引物。作為內(nèi)對(duì)照，使用mscNDA的PCR引物如下5，引物(5'-ATGACTGAATATAAACTT，SEQIDNO:24)和3，引物(5，-CCCAAGCTTTACATAATTACACACTT，SEQIDNO:25)。參考實(shí)施例6:具有提高的特異性的特異性T/S適體酶的制備用SEQIDNO:26中描述的引物(5，-AATTCAAGCTTCGTTTTGCGGCAGCAGGAAAAGTTATCAGGCATG-3，)和SEQIDNO:27中描述的引物(5，誦CCTGATAACTTTTCCTGCCGCAAAACGAAGCTTG國(guó)3，)來(lái)對(duì)朝向被基因間區(qū)(IGS)在hTRET上識(shí)別的hTRET序列的3，末端的互補(bǔ)的100nt反義鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用SEQIDNO:28中描述的引物(5，-GGGAAGCTTGGGAAGCCCTGGCCC-3，)和SEQIDNO:29中描述的引物(5，-GGGAAGCTTAAGGCCAGCACGTTCTT-3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增300nt反義鏈。隨后，將擴(kuò)增的反義鏈克隆到預(yù)先制備的核酶結(jié)構(gòu)上游的HindIII限制酶切位點(diǎn)。參考實(shí)施例7:細(xì)胞培養(yǎng)將hTERT陽(yáng)性細(xì)胞系在5。/。C02的恒溫箱中在37。C下進(jìn)行培養(yǎng)，以293(人腎臟/正常)、HT-29(結(jié)腸/結(jié)腸腺癌)、Capan-1(胰腺/腺癌)和HepG2(肝/肝細(xì)胞癌)作為參考，并將hTERT陰性細(xì)胞系在5。/。C02的培養(yǎng)箱中在37。C下進(jìn)行培養(yǎng)，以IMR-90(肺/成纖維細(xì)胞/正常)和SK-LU1(肺/腺癌)美國(guó)典型物保藏中心(ATCC)作為參考。參考實(shí)施例8:對(duì)細(xì)胞系中反式剪接適體酶的特異性和效率的證實(shí)1)茶堿最佳濃度的試驗(yàn)在35mm的皿中將293細(xì)胞以3xl05的濃度進(jìn)行接種，并生長(zhǎng)到大約80%的匯合。在這種情況下，用脂質(zhì)體LipofectAMINE(英杰(Invitrogen))使生長(zhǎng)的293細(xì)胞轉(zhuǎn)染1|ig的MuP96t8t。將轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞分別置于遞增濃度的茶堿或咖啡因中(0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和1mM)培養(yǎng)18小時(shí)，然后進(jìn)行熒光素酶分析。使用相同量的PBS作為對(duì)照。2)雙熒光素酶分析將轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基從35mm的皿中除去，并用lxPBS進(jìn)行洗滌。然后，向各個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中加入200^的lx被動(dòng)裂解緩沖液，并使轉(zhuǎn)染細(xì)胞在室溫下裂解15分鐘以獲得細(xì)胞裂解液。將細(xì)胞裂解液以13,000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離1分鐘，并將得到的上清液分別轉(zhuǎn)移到新管中。向光度計(jì)管中放入100^的LARII(焚光素酶檢測(cè)試劑II),還加入20]al的細(xì)胞裂解液并混合。然后，將得到的混合物用光度計(jì)進(jìn)行讀數(shù)。再向光度計(jì)試管中加入100pil的斯達(dá)普和格婁(Stop&Glo)混合試劑(Stop&Glo20+Stop&Glo緩沖液1ml)，并進(jìn)行混合。隨后，在將得到的混合物用光度計(jì)(TD+20/20)進(jìn)行讀數(shù)。將延遲時(shí)間設(shè)定為3秒，將積分時(shí)間設(shè)定為12秒，并且將靈敏度設(shè)定為45%以適用于各個(gè)待測(cè)細(xì)胞。對(duì)于轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞用溶解于PBS的茶堿和咖啡因進(jìn)行處理。此外，當(dāng)所使用的MEM培養(yǎng)基在細(xì)胞感染后用新的MEM培養(yǎng)基更換時(shí)，用各種化學(xué)制品處理細(xì)胞培養(yǎng)物，培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)并隨后進(jìn)行焚光素酶分析。3)細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)使用4pl的lipofectamine使293細(xì)胞短暫地轉(zhuǎn)染1fig的核酶載體。轉(zhuǎn)染之后5個(gè)小時(shí)，用添加有0.7mM的茶vf成或咖啡因的新鮮培養(yǎng)基更換所使用過(guò)的培養(yǎng)基，并保持18小時(shí)以獲得細(xì)胞裂解液。然后，從細(xì)胞裂解液中提純?nèi)縍NA。在這種情況下，使用補(bǔ)充有20mM的乙二胺四乙酸(EDTA)的鳥(niǎo)噪呤異氰酸鹽細(xì)胞裂解溶液來(lái)提取RNA，從而最小化體外反式剪接反應(yīng)的可能。用識(shí)別熒光素酶的引物(5，-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGATAA,SEQIDNO:30)對(duì)所提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而獲得cDNA。用作為3，引物的巢氏熒光素酶引物(5'-CCCAAGCTTGCCCAACACCGGCATAAAG，SEQIDNO:31)，和作為5，引物的識(shí)別hTERT的5'末端的識(shí)別位點(diǎn)(5，-AGCGCTGCGTCCTGCT,SEQIDNO:32)對(duì)所述cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR條件下進(jìn)行40循環(huán)的PCR反應(yīng)在96°C下預(yù)熱10分鐘、在96°C下變性5分鐘、在58。C下退火30秒，在72。C下延伸20秒。在這種情況下，所提取的作為對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)對(duì)照的RNA用寡聚脫氧胸苷酸(oligodT)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并將得到的cDNA用磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)5，引物(5'誦TGACATCAAGAAGGTGGTGA，SEQIDNO:33)和GAPDH3'引物(5，-TCCACCACCCTGTTGCTGTA,SEQIDNO:34)進(jìn)行擴(kuò)增，以觀察到用作內(nèi)部對(duì)照的GAPDHRNA的表達(dá)水平。4)腺病毒的制備，該腺病毒表達(dá)依賴(lài)于茶堿的靶向hTERT的T/S適體酶將pAvQ穿梭載體用限制性內(nèi)切酶BamHI和BstBI斷裂，并將DNA片段WTP9-TK和AS300W-P96T8T-TK克隆到該pAvQ穿梭載體內(nèi)以制備載體，該載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)在CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下對(duì)核酶進(jìn)行表達(dá)。用限制性內(nèi)切酶PmeI對(duì)所制備的載體進(jìn)行線性化，并使用電穿孔法與5型腺病毒基因組DNA質(zhì)粒、AE1/E3pAdeno載體(pAdenovector)(求必精(Qbiogene))—起共轉(zhuǎn)染到BJ5183細(xì)菌內(nèi)。對(duì)通過(guò)同源重組在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獲得的重組腺病毒載體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離、提純并通過(guò)小量制備進(jìn)行檢查。然后，用限制性內(nèi)切酶Pacl將重組腺病毒載體結(jié)構(gòu)進(jìn)行線性化，并轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系(packagingcellline)293細(xì)胞中。得到通過(guò)病毒增殖(viralproliferation)形成的蝕斑克隆(plaqueclones),并除去細(xì)胞殘?jiān)垣@得病毒上清液。用該病毒上清液對(duì)感染的293細(xì)胞進(jìn)行感染，以證實(shí)是否發(fā)生細(xì)胞溶解。在CMV啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)AS300WTP9-TK(原始T/S核酶)和AS300W-P96T8T-TK(變構(gòu)T/S核酶)的腺病毒載體襪分別命名為Ad-Rib-TK和Ad-TheoRib國(guó)TK。為了確定重組腺病毒(Ad-Rib-TK和Ad-TheoRib-TK)已經(jīng)被順利的制備，用獲得自重組病毒基因組DNA轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的上清液感染293細(xì)胞，并且通過(guò)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)證實(shí)重組的腺病毒。此外，通過(guò)從病毒上清液獲得DNA并在DNA上進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)(TK和病毒ITR位點(diǎn))來(lái)證實(shí)重組的腺病毒，所述病毒上清液獲自誘導(dǎo)細(xì)胞裂解的蝕斑克隆。從感染了病毒的細(xì)胞的裂解液中提取RNA，并且在該RNA(TKRNA)上進(jìn)行RT-PCR以證實(shí)是否重組病毒構(gòu)建體被成功地制備，以及來(lái)自該病毒的轉(zhuǎn)基因是否被表達(dá)。用獲得自用各種重組腺病毒克隆感染的293細(xì)胞的上清液的重組病毒對(duì)293細(xì)胞進(jìn)行數(shù)次感染，從而對(duì)重組病毒進(jìn)行擴(kuò)增。然后，使用(維瓦純⑧愛(ài)迪樂(lè)派克TM(VivapureAdenoPACKTM))將重組腺病毒載體分離并提純。將得到的重組病毒連續(xù)稀釋?zhuān)㈦S后進(jìn)行半數(shù)組織培養(yǎng)感染量分析(TCID50assay)以確定提純的病毒栽體的蝕斑形成單位滴度(PFUtiter)。5)MTT分析將細(xì)胞種在96孔板(TPP)內(nèi)一天，并隨后分別用Ad-TK(在CMV啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)TK基因的腺病毒載體)、Ad-Rib-TK、Ad-TheoRib-TK和Ad-LacZ(在CMV啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)LacZ基因的腺病毒載體)病毒進(jìn)行感染。從病毒感染那天起，每?jī)商斓轿逄炀陀孟嗤男碌呐囵B(yǎng)基來(lái)更換使用過(guò)的添力口有GCV和化學(xué)制品(茶堿或咖啡因)的培養(yǎng)基。將HT-29抹系以細(xì)胞數(shù)為3xl03/孔進(jìn)行接種，將HepG2抹系以細(xì)胞數(shù)為3xl0V孔進(jìn)行接種，將Capan-l抹系以細(xì)胞數(shù)為5xl0"孔進(jìn)行接種，并將IMR90抹系以細(xì)胞數(shù)為5xl0"孔進(jìn)行接種。在這些抹系接種的5天后，向各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入細(xì)胞滴度96⑧液相唯一溶液型細(xì)胞繁殖測(cè)定(CellTiter96AQueousONESolutionCellProliferationAssay)(Promega)從而使其達(dá)到全部培養(yǎng)基的20°/。，對(duì)96孔用100pi的得到的細(xì)胞培養(yǎng)基每孔進(jìn)行培養(yǎng)，并使用微板讀數(shù)模型550(Microplatereadermodel550)(伯樂(lè)(BioRad))在490nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)量，以觀察細(xì)胞的細(xì)胞存活率。6)半定量PCR用腺病毒感染35mm的皿，并在感染后的24小時(shí)用同樣的新的培養(yǎng)基替換補(bǔ)充有化學(xué)制品(茶堿或咖啡因)的使用的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基更換24小時(shí)候后，使用TriZol反應(yīng)劑(Invitrogen)從培養(yǎng)的細(xì)胞中提純RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并使用實(shí)時(shí)PCR將其在反式剪接產(chǎn)物上進(jìn)行半定量PCR。用GAPDHPCR產(chǎn)物的濃度對(duì)T/SPCR產(chǎn)品的濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。用寡居核苷酸(dT)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)4吏用實(shí)時(shí)PCR將得到的cDNA用作為3，引物的TK引物(5，-CCCATGCACGTCTTTATCCTGGAT-3，，SEQIDNO:35)和作為5，引物的識(shí)另'JhTERT5，末端的位點(diǎn)(5，-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT-3，，SEQIDNO:36)進(jìn)行擴(kuò)增。所提取的作為對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)對(duì)照的RNA用寡聚脫氧胸苷酸(oligodT)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并將得到的cDNA用磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)5，引物(5,-TGACATCAAGAAGGTGGTGA，SEQIDNO:37)和GAPDH3,引物(5，-TCCACCACCCTGTTGCTGTA，SEQIDNO:38)進(jìn)行擴(kuò)增，以觀察到用作內(nèi)部對(duì)照的GAPDHRNA的表達(dá)水平。實(shí)施例1:反式剪接核酶的制備，該核酶具有附著其上的茶堿適體并特異性地靶向hTERTRNA作為用于發(fā)展變構(gòu)核酶的1^出反式剪接核酶骨架,使用了I型內(nèi)含子核酶，所述I型內(nèi)含子核酶特異性地識(shí)別hTERT的+21nt位點(diǎn)并具有對(duì)靶RNA的300nt的反義序列在該處進(jìn)行退火的Pl、P10和延長(zhǎng)的IGS(圖2)。觀察到這種核酶通過(guò)在細(xì)胞和動(dòng)物模型(animalmodel)中特異性地表達(dá)hTERTRNA來(lái)誘導(dǎo)了表達(dá)hTERT的癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡(Mo/.772^.2005;12:824,Mo/2008;16:74)為了制備依賴(lài)于茶堿的變構(gòu)核酶，用作為茶堿的受體區(qū)的茶堿RNA適體22(Science1994;263:1425)被同時(shí)附著到P6或/和P8區(qū)中的任一者或二者上，這在用于由本申請(qǐng)的研究小組所研發(fā)的hTERT特異性T/S核酶的催化功能的RNA折疊中扮演著重要的角色。而且，通過(guò)將茶堿適體連接到P9區(qū)被最小化的AP9區(qū)所取代或被修飾的核酶的P6、P8或P6+P8區(qū)而制備了T/S核酶。圖3表示了I型內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)和RNA序列，該I型內(nèi)含子與反式剪接核酶、茶堿適體、和其中茶堿適體與核酶退火的通信模塊結(jié)構(gòu)等同源(核酸研究方法.2002;30:4599(NucleicAcisRes.2002;30:4599))。所制備的反式剪接核酶結(jié)構(gòu)列出如下國(guó)hTERT特異性反式剪接核酶(WT)_其中適體附著到野生型(WT)的P6或P8區(qū)的核酶(W-P96t，WT-P98t)誦其中適體附著到突變P9的P6和P8區(qū)的核酶(Mu-P96t8t)-其中WT核酶的P9區(qū)被AP9取代的核酶(AP9)_其中適體附著到AP9核酶的P6、P8、P6+P8區(qū)的核酶(AP96t、AP98t、△P96t8t)其中附著有對(duì)hTERT的反義的300nt序列的WT核酶(AS-300WT)-具有Pl和P10螺旋結(jié)構(gòu)并含有附著到P6+P8區(qū)的適體的WT核瞰I(xiàn)GSW畫(huà)P96t8t)-使反義的300nt序列附著其上的并含有附著到P6+P8區(qū)的適體的WT核酶(AS-300W-P96t8t)畫(huà)使反義的300nt序列附著其上的并含有附著到P6+P8區(qū)的適體的MU-P9核酶(AS-300Mu-P96t8t)在制備核酶載體的PCR程序中通知制備了突變P9的結(jié)構(gòu)，并且這反映了在用靶RNA(hTERTRNA)進(jìn)行體外反式剪接反應(yīng)時(shí)，突變P9的結(jié)構(gòu)不影響核酶的活性。因此，作為一種制備根據(jù)本發(fā)明的變構(gòu)核酶的參與者，還制備了基于突變P9的核酶結(jié)構(gòu)，并確定了其功能。圖4表示了野生型P9序列和突變P9(Mu-P9)。另一個(gè)序列區(qū)域用粗體和下劃線的字母示出。實(shí)施例2:對(duì)具有取代依賴(lài)于茶堿的RNA的能力的核酶的定量分析按此制備的核酶和作為底物RNA的hTERTRNA在37'C的剪接條件下反應(yīng)3小時(shí)，并將得到的剪接產(chǎn)物通過(guò)RT-PCR反應(yīng)進(jìn)行分析。在剪接反應(yīng)中，水或0.5mM的咖啡因(茶>威結(jié)構(gòu)類(lèi)似物、用于變構(gòu)效應(yīng)的特異性的陰性對(duì)照)或0.5mM的茶堿一起反應(yīng)以觀察反式剪接反應(yīng)是否以茶堿特異性的方式變構(gòu)地發(fā)生。圖5表示了RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。參見(jiàn)圖5，它反映了WT和AP9核酶如所預(yù)期的總是無(wú)關(guān)于咖啡因、茶堿和水地誘導(dǎo)反式剪接反應(yīng)，并且W-P96t也無(wú)關(guān)于這些化合物地誘導(dǎo)反式剪接反應(yīng)。而且，這還反映了W-P98t以茶堿特異性的方式誘導(dǎo)反式剪接反應(yīng)，并且，在AP98t和AP96t8t的情況下反式剪4妄反應(yīng)可能#:無(wú)效地誘導(dǎo)。同時(shí)，它還反映了在Mu-P96t8t和AP96t核酶的情況下具有319bp大小的反式剪接產(chǎn)物以茶堿特異性的方式在體外被制備。因此，它反映了根據(jù)核酶的P9序列或結(jié)構(gòu)特性，I型內(nèi)含子的P6或P8區(qū)是能夠以依賴(lài)于茶堿的方式變構(gòu)地調(diào)控核酶活性的主要區(qū)。為了比較并分析由變構(gòu)核酶產(chǎn)生的依賴(lài)于茶堿的反式剪接反應(yīng)的誘導(dǎo)的調(diào)控程度，進(jìn)行了對(duì)反式剪接產(chǎn)物的實(shí)時(shí)PCR分析(分析設(shè)備擴(kuò)貝特研究RG6(CorbettResearchRG6))。用hTERTRNA對(duì)Mu-P96t8t核酶或WT核酶進(jìn)行剪接，然后進(jìn)行RT反應(yīng)，所述Mu-P96t8t核酶的酶活性通過(guò)茶堿依賴(lài)方式的反式剪接反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，所述WT核酶具有無(wú)關(guān)于小分子化合物的結(jié)構(gòu)酶活性。對(duì)于反轉(zhuǎn)錄樣品的定量分析，使用rascDNA的濃度來(lái)校準(zhǔn)反轉(zhuǎn)錄樣品的濃度。結(jié)果示于圖6。參見(jiàn)圖6,它反映了在WT核酶的情況下無(wú)論是否存在水、茶堿和咖啡因，相同濃度的反式剪接產(chǎn)品在剪接緩沖液中產(chǎn)生。從反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)時(shí)定量分析來(lái)看，還反映了依賴(lài)于茶堿的反式剪接反應(yīng)不會(huì)在AP96t核酶中發(fā)生。然而，在Mu-P96t8t核酶的情況中，反映了當(dāng)用內(nèi)部調(diào)控來(lái)對(duì)分別的RT樣品中的反式剪接產(chǎn)物的濃度進(jìn)行校準(zhǔn)時(shí)，在茶堿的存在下產(chǎn)生的反式剪接產(chǎn)物的濃度比存在咖啡因的情況要高4.3倍，并且比存在相同體積的dH20時(shí)濃度要高12.16倍，所述Mu-P96t8t的活性如以上的實(shí)驗(yàn)所描述地以依賴(lài)于茶堿的形式在體外被調(diào)控。因此，這表示了Mu-P96t8t核酶為變構(gòu)核酶，其反式剪接活性可以以依賴(lài)于茶堿的方式在體外進(jìn)行調(diào)控。由于被分析的核酶的基因間區(qū)(IGS)僅具有6nt序列，應(yīng)該將具有延長(zhǎng)的IGS組的核酶用于進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的靶RNA特異性的反式剪接反應(yīng)(Ato.所otec/2"o/.1996;15:902,/Mo/.所o/.1999;185:1935，Mo/.772eK2003;7:386，Mo/.772en2004;10:365;Mo/.77^.2005;12:824)。具有延長(zhǎng)的IGS的核酶通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄而被制備，并隨后用hTERTRNA進(jìn)行體外反式剪接反應(yīng)。在這種情況下，無(wú)論反式剪接是否以依賴(lài)于茶堿的形式進(jìn)行，都可以觀察到上述現(xiàn)象。所制備的核酶對(duì)其上附著有對(duì)hTERT的反義300nt序列的WT核酶(AS-300WT);具有Pl和P10螺旋結(jié)構(gòu)并含有附著到P6+P8區(qū)上的適體的WT核酶(IGSW-P96t8t);其上附著有翻譯300nt序列的并含有附著到P6+P8區(qū)的適體的WT核酶(AS-300W-P96t8t);以及其上附著有反義30nt序列并含有附著到P6+P8區(qū)上的適體的Mu-P9核酶(AS-300Mu-P96t8t)進(jìn)行誘導(dǎo)，并且它們的反式剪接反應(yīng)結(jié)果(反式剪接產(chǎn)物的RT-PCR產(chǎn)物)示于圖7。在圖7中，反映了AS-300WT誘導(dǎo)的剪接反應(yīng)如所預(yù)期地與茶堿無(wú)關(guān)。同時(shí)，還反映了AS300W-P96t8t誘導(dǎo)的體外剪接反應(yīng)與茶堿無(wú)關(guān)，但是與不含AS-300核酶不同地，AS300Mu-P96t8t不能輕易地誘導(dǎo)剪接反應(yīng)。同時(shí)，還反映了不含有反義序列并具有Pl和P10螺旋結(jié)構(gòu)的IGSW-P96t8t僅在茶堿的存在下才誘導(dǎo)反式剪接反應(yīng)。這些結(jié)果說(shuō)明了，雖然具有6ntlGS序列的核酶和具有延長(zhǎng)的IGS序列的核酶據(jù)喲相同的勤出骨架結(jié)構(gòu)，它們可能具有結(jié)構(gòu)上的差別，其中，它們根據(jù)反義序列的存在而表現(xiàn)出不同的活性。因此，這反應(yīng)了具有延長(zhǎng)的IGS序列的核酶的剪接活性應(yīng)該在體外和/或體內(nèi)被觀察到。從以上的結(jié)果可以看出，在一些附著有茶堿適體的核酶中，反式剪接活性在體外以依賴(lài)于茶堿的方式被變構(gòu)地調(diào)控。為了證實(shí)是否反式剪接產(chǎn)物在嚴(yán)格的反式剪接反應(yīng)中產(chǎn)生，將制備的反式剪接RT-PCR產(chǎn)物克隆到pUC19載體中并進(jìn)行測(cè)序。如圖8所示地，從反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物的測(cè)序數(shù)據(jù)可以確定，附著到核酶的3'外顯子的螢火蟲(chóng)焚光素酶RNA被嚴(yán)格地退火到作為靶RNA的第+21個(gè)nt位點(diǎn)的下游位點(diǎn)。該結(jié)果意味著非常精確地發(fā)生了變構(gòu)反式剪接核酶的反式剪接反應(yīng)。實(shí)施例3:使報(bào)告基因附著到3，外顯子的變構(gòu)反式剪接核酶的制備為了制備農(nóng)賴(lài)于茶堿的變構(gòu)核酶的表達(dá)載體，用作為茶堿的受體區(qū)的茶堿RNA適體(Science1994;263:1425)被同時(shí)附著到P6或/和P8區(qū)中的任一者或二者上，這在用于由本發(fā)明的研究小組所研發(fā)的hTERT特異性T/S核酶的催化功能的RNA折疊中扮演著重要的角色(NucleicAcisRes.2002;30:4599)。而且，通過(guò)將茶堿適體連接到P9區(qū)被最小化的AP9取代所取代或被修飾的核酶的P6、P8或P6+P8區(qū)而制備了反式剪接核酶。作為用來(lái)誘導(dǎo)核酶表達(dá)的轉(zhuǎn)基因，螢火蟲(chóng)熒光素酶基因被嵌入到核酶的3，外顯子中，并且使用SV40啟動(dòng)子系統(tǒng)以促進(jìn)核酶的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。所制備的反式剪接核酶結(jié)構(gòu)列舉如下。通過(guò)從為了體外剪接反應(yīng)而制備的變構(gòu)核酶結(jié)構(gòu)的核酶區(qū)域到熒光素酶基因的3'末端的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、將擴(kuò)增的DNA嵌入到含有SV40啟動(dòng)子的pSEAP載體(克隆科技(Clontech))的HindIII和XbaI限制酶切位點(diǎn)，并將對(duì)hTERTRNA的反義序列嵌入到HindIII限制酶切位點(diǎn)而進(jìn)行載體的構(gòu)建。在這種情況下，用于擴(kuò)增核酶的5'引物含有PI和PIO螺旋結(jié)構(gòu)和識(shí)別hTERTRNA(5，-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3，，SEQIDNO:39)的IGS序列。①含有對(duì)hTERTRNA的100nt反義序列的載體；-hTERT特異性核酶(AS-100WT)的表達(dá)載體-其中適體附著到WT核酶的P6和P8區(qū)的核敏AS-100W-P96t,AS-100WT-P98t)的表達(dá)載體_其中適體附著到突變P9的P6+P8區(qū)上的核酶(AS-100Mu-P96t8t)的表達(dá)載體(pSEAPAS100Mu-P96T8T-Luci，SEQIDNO:5)-其中適體附著到AP9核酶的P6、P9和P6+P8區(qū)上的核酶(AS-100AP96t，AS-100AP98t，AS-100AP96t8t)的表達(dá)載體②含有對(duì)hTERTRNA的300nt反義序列的載體-hTERT特異性核酶(AS-300WT)的表達(dá)載體一其中適體附著到WT核酶的P6+P8區(qū)上的核酶(AS-300W-P96t8t)的表達(dá)載體(pSEAPAS300W-P96T8T-Luci，SEQIDNO:6)-其中適體附著到突變P9的P6+P8區(qū)上的核酶(AS-300Mu-P96t8t)的表達(dá)載體-其中適體附著到AP9核酶的P6區(qū)上的核酶(AS-300AP96t)的表達(dá)載體-其中適體附著到AP9核酶的P8區(qū)上的核酶(AS-300AP98t)的表達(dá)載體(pSEAPAS300DeltaP98T-Luci,SEQIDNO:4)實(shí)施例4:對(duì)細(xì)胞內(nèi)核酶的依賴(lài)于化合物的hTERTRNA的特異性取代的觀察1)依賴(lài)于茶堿的反式剪接轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)條件的建立首先，按以上所制備的使熒光素酶基因附著到3'外顯子的變構(gòu)核酶的誘導(dǎo)條件通過(guò)確定在什么樣的細(xì)胞內(nèi)茶堿濃度下轉(zhuǎn)基因得到最變構(gòu)化的誘導(dǎo)而建立。293細(xì)胞用Mu-P96t8t核酶表達(dá)載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所述Mu-P96t8t核酶表達(dá)載體以依賴(lài)于茶堿的方式誘導(dǎo)了反式剪接反應(yīng)，伴隨著脂質(zhì)體lipofectamine穿過(guò)體外反式剪接反應(yīng)。在這種情況下，為了測(cè)量轉(zhuǎn)染效率并對(duì)被表達(dá)的產(chǎn)物的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，293細(xì)胞與在CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下能夠表達(dá)海腎熒光素酶(renillarluciferase)的載體被共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4個(gè)小時(shí)，用新鮮培養(yǎng)基更換使用過(guò)的培養(yǎng)基。在這種情況下，向新鮮的培養(yǎng)基中加入0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和1mM的咖啡因或茶石威，以i正實(shí)咖啡因或茶堿的濃度能最大地誘導(dǎo)依賴(lài)于茶堿的形式的焚光素酶的活性。更換培養(yǎng)基后18個(gè)小時(shí)，得到細(xì)胞裂解液，并隨后用光度計(jì)TD-20/20(特納設(shè)計(jì)儀器(TurnerDesignsInstrument))測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)化到海腎熒光素酶活性的螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。在此情況下，作為載體(SV40-Luci)轉(zhuǎn)染后而制備的熒光素酶濃度的相對(duì)值(%)的所測(cè)量的熒光素酶活性如圖9所示地，被表示為能夠在SV40啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)熒光素酶基因。參考圖9,它反映了在存在0.7mM的茶堿時(shí)，相比于存在0.7mM的咖啡因的情況，茶堿特異性熒光素酶活性在細(xì)胞中被最大地誘導(dǎo)。因此，以誘導(dǎo)依賴(lài)于茶堿的基因從各種核酶表達(dá)載體中被表達(dá)的最佳的茶堿濃度條件設(shè)定為0.7mM，并在該濃度下進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)。2)對(duì)來(lái)自含有100nt的翻譯序列的核酶表達(dá)載體的依賴(lài)于茶堿的基因的表達(dá)的誘導(dǎo)通過(guò)熒光素酶分析還觀察到通過(guò)含有100nt的對(duì)hTERTRNA的反義序列并使茶堿適體附著其上的核酶的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因活性的誘導(dǎo)。在這種情況下，所測(cè)量的焚光素酶活性通過(guò)從PBS處理過(guò)的細(xì)胞裂解液中觀察到的熒光素酶的濃度的相對(duì)值(％)來(lái)表示。該結(jié)果示于圖10。參見(jiàn)圖10,它反映了與體外數(shù)據(jù)一致，AS-100Mu-P96t8t核酶最大地誘導(dǎo)了依賴(lài)于茶堿形式的熒光素酶活性。然而，反映了AS-lOOAP98t核酶以比AS-lOOAP96t核酶更具有茶堿特異性的方式誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，這與體外數(shù)據(jù)是不同的。在這種情況下，考慮將上述的結(jié)果本身歸因于可能由于進(jìn)一步向IGS上游區(qū)域加入100nt的反義序列而導(dǎo)致的核酶中結(jié)構(gòu)的改變，并且還歸因于細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境確實(shí)與體外環(huán)境不同這一因素。同時(shí)，可以考慮到WT核酶、W-P96t核酶、W-P98t核酶和AP9核酶，以及AP96t8t核酶在細(xì)胞中以茶堿特異性的方式誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因的活性。3)hTERT陰性細(xì)胞中的變構(gòu)酶活性為了從上述結(jié)果中測(cè)定被觀察到以依賴(lài)于茶堿的方式在細(xì)胞中變構(gòu)地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因活性的AS-100Mu-P96t8t核酶和在細(xì)胞中沒(méi)有表現(xiàn)出變構(gòu)活性的AS-100AP96t是否以hTERT靶RNA特異性的方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因活性，用德牧依-C(DMRIE-C)將hTERT陰性細(xì)胞SK-Lu-l細(xì)胞用各種核酶載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4小時(shí)，用新鮮的添加有茶堿的培養(yǎng)基替換使用過(guò)的培養(yǎng)基。在用新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行替換后的18個(gè)小時(shí)，獲得細(xì)胞裂解液，并且隨后測(cè)量熒光素酶活性。在這種情況下，所測(cè)得的作為來(lái)自SV40-Luci載體的熒光素酶的表達(dá)水平的相對(duì)值(％)的熒光素酶活性示于圖11中。參見(jiàn)圖11,可以看出，與AS-100WT相似地，當(dāng)靶RNA不存在于核酶中時(shí)，無(wú)論是否存在茶堿，AS-100Mu-P96t8t核酶和AS-100AP96t核酶抑制了轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)。也就是說(shuō)，這反映了依賴(lài)于茶堿的變構(gòu)反式剪接核酶可能以輩巴RNA特異性的方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。4)來(lái)自含有300nt的反義序列的核酶表達(dá)載體的依賴(lài)于茶堿的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)為了觀察到反式剪接核酶的變構(gòu)轉(zhuǎn)基因表達(dá)是否可能隨著反義序列的長(zhǎng)度的增加而被增強(qiáng)，制備含有300nt的對(duì)hTERTRNA的反義序列核酶載體，并比較并觀察依賴(lài)于核酶的熒光素酶活性的誘導(dǎo)。在該實(shí)驗(yàn)中，使用AS-300WT核酶作為依賴(lài)于茶堿對(duì)照，并將hTERT陽(yáng)性細(xì)胞、293細(xì)胞與核酶(AS-300Mu-P96t8t)、核酶(AS-300AP96t)、核酶(AS-300AP98t)和核酶(AS-300W-P96t8t)中的每一種的表達(dá)載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，所述核酶(AS-300Mu-P96t8t)的Mu-P96t8tbasic基礎(chǔ)骨架含有300nt的反義序列的核酶(AS-300Mu-P96t8t)，當(dāng)核酶含有AS-100序列時(shí)，它以依賴(lài)于茶堿的方式誘導(dǎo)了體外的反式剪接反應(yīng)，并還誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)的依賴(lài)于茶堿的轉(zhuǎn)基因活性；所述核酶(AS-300AP96t)的AP96tJ^5出骨架含有300nt的翻譯序列，它以依賴(lài)于茶堿的方式誘導(dǎo)了體外反式剪接反應(yīng)；所述核酶(AS-300AP98t)的AP98t基礎(chǔ)骨架含有300nt的翻譯序列，當(dāng)核酶含有AS-100序列時(shí)，它誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)的依賴(lài)于茶堿的轉(zhuǎn)基因活性；所述核酶有延長(zhǎng)的IGS序列(P1+P10螺旋結(jié)構(gòu))，它以依賴(lài)于核酶的方式誘導(dǎo)了體外反式剪接反應(yīng)。然后，對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行測(cè)量，并且還比較和觀察了依賴(lài)于茶堿的基因活性的誘導(dǎo)。在這種情況下，所測(cè)量的萸光素酶活性作為能在SV40啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)熒光素酶基因的載體(SV40-Luci)的轉(zhuǎn)染后所制得的熒光素酶的濃度的相對(duì)值而示于圖12。參見(jiàn)圖12，它反映了如所預(yù)期地?zé)o論是否存在茶堿，AS-300WT核酶有效地誘導(dǎo)了焚光素酶表達(dá)。在含有300nt的反義序列的核酶中，可以看出AS-300Mu-P96t8t和AS-300AP96t核酶不誘導(dǎo)依賴(lài)于茶堿的轉(zhuǎn)基因活性。同時(shí)，可以看出AS-300W-P96t8t和AS-300AP98t核酶以依賴(lài)于茶堿的方式有效地誘導(dǎo)了熒光素酶活性，還觀察到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)在其中嵌入了300nt的反義序列的核酶中比在其中嵌入了100nt的反義序列的核酶中被更有效地誘導(dǎo)。5)通過(guò)變構(gòu)核酶的細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)在上述實(shí)驗(yàn)中對(duì)能夠在細(xì)胞內(nèi)以依賴(lài)于茶堿方式來(lái)誘導(dǎo)并增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因活性的核酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。為了證實(shí)依賴(lài)于茶堿的轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)是否被細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)的變構(gòu)效應(yīng)所誘導(dǎo)，用其上附著有茶堿適體的核酶的表達(dá)載體對(duì)293細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)轉(zhuǎn)染，并且在細(xì)胞中觀察到細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物。觀察到GAPDHRNA的表達(dá)水平，并且用作內(nèi)部對(duì)照。在瓊脂糖凝膠上對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。并且結(jié)果示于圖13中。參見(jiàn)圖13,反應(yīng)了如所預(yù)期地(泳道3)，在陽(yáng)性對(duì)照WT核酶(AS-300WT)中產(chǎn)生了hTERT特異性反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物。對(duì)于附著有茶堿適體的核酶，觀察到無(wú)論是否存在茶石威、咖啡因和PBS的存在從AS-300Mu-P96t8t核酶載體產(chǎn)生了反式剪接產(chǎn)物，這符合熒光素酶活性誘導(dǎo)結(jié)果(泳道7-9)，但是僅在用茶堿處理過(guò)的細(xì)胞中產(chǎn)生了311bp的反式剪接產(chǎn)物，這符合熒光素酶活性誘導(dǎo)結(jié)果(泳道4)。這些結(jié)果與AS-300W-P96t8t核酶的體外反式剪接結(jié)果不同，但是考慮到這種差異是源于體外和細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的不同。為了證實(shí)反式剪接產(chǎn)物在RNA抽提過(guò)程中是由細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)而不是由誘導(dǎo)的體外反式剪接反應(yīng)而產(chǎn)生的，將用AS-300W-P96t8t核酶轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞和SK-Lu-l細(xì)胞(hTERT陰性)混合，并且將RNA從細(xì)胞中抽提出來(lái)，并進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。結(jié)果，如圖13所示地，由于沒(méi)有觀察到反式剪接產(chǎn)物(泳道10)，轉(zhuǎn)染有AS-300W-P96t8t核酶的293細(xì)胞中存在茶堿下所測(cè)量的反式剪制備。如以上所描述地，AS-300W-P96t8t和AS-300AP98核酶被研發(fā)為用于能夠在表達(dá)hTERTRNA的細(xì)胞中特異性地以依賴(lài)于核酶的方式調(diào)控變構(gòu)核酶的參與者，也就是說(shuō)，能夠在細(xì)胞中以依賴(lài)于茶堿的方式人為地調(diào)控RNA取代反應(yīng)。此外，IGSW-P96t8t被開(kāi)發(fā)為能夠最有效地在體外產(chǎn)生反式剪接產(chǎn)物變構(gòu)核酶。實(shí)施例5:對(duì)由腺病毒載體來(lái)調(diào)控表達(dá)hTERT癌癥細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡的功能的觀察1)在HT-29細(xì)胞(hTERT+)中依賴(lài)于茶堿的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)通過(guò)向所制備的變構(gòu)核酶(AS300W-P96T8T-TK)的3'外顯子和重組的腺病毒載體嵌入細(xì)胞凋亡基因、HSV胸腺激酶來(lái)制備能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)核酶的載體(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK，SEQIDNO:8)(圖14)。用2008年3月21日在韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms，KCCM)的登記號(hào)KCCM10935P來(lái)保藏pAvQ-Theo-Rib21AS-TK。為了觀察到是否腺病毒載體(Ad-TheoRib-TK)含有HSVtk基因作為3，式的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞用該腺病毒載體進(jìn)行處理，用GCV和調(diào)節(jié)復(fù)合體進(jìn)行處理，并隨后進(jìn)行MTT分析以觀察HT-29細(xì)胞的細(xì)胞存活率。在這種情況下，使用Ad-TK(在CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下對(duì)HSVtk基因近習(xí)慣表達(dá)的腺病毒載體)作為hTERT+細(xì)胞中的陽(yáng)性對(duì)照，并使用Ad-Rib-TK(對(duì)hTERT特異并且以HSVtk標(biāo)記的腺病毒載體)作為hTERT+細(xì)胞中的陽(yáng)性對(duì)照。使用Ad-LacZ(在CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下對(duì)LacZ基因進(jìn)行表達(dá)的腺病毒載體)作為陰性對(duì)照。當(dāng)用Ad-TheoRib-TK處理HT-29細(xì)胞時(shí)，將用茶堿或咖啡因處理后的HT-29細(xì)胞的細(xì)胞存活率與用Ad-TheoRib-TK處理的HT-29細(xì)胞的細(xì)胞存活率進(jìn)^f亍比較。結(jié)果示于圖15中。參見(jiàn)圖15,觀察到當(dāng)用Ad-TK和Ad-Rib-TK處理HT-29細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率隨著GCV濃度和腺病毒濃度的增加而降低，但是，細(xì)胞存活率不受到化學(xué)物質(zhì)濃度的影響。同時(shí)，觀察到Ad-LacZ完全不影響細(xì)胞存活率。注意到，在HT-29感染有變構(gòu)核酶Ad-TheoRib-TK的情況下，當(dāng)用咖啡因處理HT-29細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率不受到GCV、病毒和化學(xué)物的濃度則增加的影響，但是當(dāng)該HT-29細(xì)胞用茶堿處理時(shí)，如在陽(yáng)性對(duì)照中地，細(xì)胞存活率與病毒和GCV濃度成比例地降低。而且，觀察到當(dāng)茶堿的濃度增加時(shí)，細(xì)胞存活率也隨著茶堿濃度的增加而降低。這說(shuō)明了由于核酶活性被茶堿變構(gòu)地調(diào)控，并且轉(zhuǎn)基因表達(dá)僅當(dāng)用茶堿處理時(shí)才被誘導(dǎo)，Ad-TheoRib-TK誘導(dǎo)了癌癥細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。其中基因表達(dá)被變構(gòu)地誘導(dǎo)的最佳條件為將HT-29細(xì)胞用100moi的腺病毒、100pM的茶堿和100pM的GCV處理。2)在HepG2細(xì)胞中依賴(lài)于茶堿的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)(hTERT十)為了觀察是否Ad-TheoRib-TK以靶特異性和依賴(lài)于茶堿的方式誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因表達(dá)，將肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞用腺病毒載體進(jìn)行處理，用GCV和調(diào)節(jié)復(fù)合體進(jìn)行處理，隨后進(jìn)行MTT分析以觀察在HepG2細(xì)胞中的細(xì)胞存活率。在這種情況下，使用Ad-TK作為陽(yáng)性對(duì)照，并使用Ad-Rib-TK作為hTERT+細(xì)胞中的陽(yáng)性對(duì)照。并將Ad-LacZ用作陰性對(duì)照。當(dāng)用Ad-TheoRib-TK處理HepG2細(xì)胞時(shí)，將用茶堿或咖啡因處理后的HepG2細(xì)胞的細(xì)胞存活率與用Ad-TheoRib-TK處理的HepG2細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果示于圖16中。參見(jiàn)圖16,觀察到當(dāng)用Ad-TK和Ad-Rib-TK處理HepG2細(xì)胞時(shí)，如在HT-29細(xì)胞中所觀察到地，細(xì)胞存活率隨著GCV和腺病毒濃度的增加而降低，但是化學(xué)制品的濃度不會(huì)影響細(xì)胞存活率。同時(shí)，觀察到Ad-LacZ完全不影響細(xì)胞存活率。注意到，在HepG2細(xì)胞感染有變構(gòu)核酶Ad-TheoRib-TK的情況下，當(dāng)用咖啡因處理HepG2細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率不會(huì)由于GCV、病毒和化學(xué)品的濃度的增加而受到影響，但是如在陽(yáng)性對(duì)照中當(dāng)用茶^f威處理HepG2細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞存活率會(huì)與病毒和GCV的濃度成比例的降低。還觀察到，當(dāng)茶堿的濃度增加，細(xì)胞存活率也會(huì)隨著茶堿的濃度增加而降低。這說(shuō)明了除hTERT+HT-29細(xì)胞之外，Ad-TheoRib-TK誘導(dǎo)了HepG2細(xì)胞中的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，這是因?yàn)楹嗣富钚员徊鑹A變構(gòu)地調(diào)控，并且轉(zhuǎn)基因僅當(dāng)用茶堿進(jìn)行處理時(shí)被誘導(dǎo)。其中基因表達(dá)被變構(gòu)地誘導(dǎo)的最佳條件為將HepG2細(xì)胞用10moi的腺病毒、10pM的茶堿和100|iM的GCV處理。3)在Capan-l細(xì)胞(hTERT+)中依賴(lài)于茶堿的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)為了觀察是否Ad-TheoRib-TK以靶特異性和依賴(lài)于茶堿的方式誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因表達(dá)，將結(jié)腸癌細(xì)胞(Capan-1細(xì)胞)用腺病毒載體進(jìn)行處理，用GCV和調(diào)節(jié)復(fù)合體進(jìn)行處理，隨后進(jìn)行MTT分析以觀察在Capan-l細(xì)胞中的細(xì)胞存活率。結(jié)果示于圖17中。參見(jiàn)圖17，觀察到當(dāng)用Ad-TK和Ad-Rib-TK處理Capan-l細(xì)胞時(shí)，如在HT-29和HepG2細(xì)胞中所觀察到，細(xì)胞存活率隨著GCV和腺病毒濃度的增加而降低，但是化學(xué)制品的濃度不會(huì)影響細(xì)胞存活率。同時(shí)，觀察到Ad-LacZ完全不影響細(xì)胞存活率。注意到，在Capan-l細(xì)胞感染有變構(gòu)核酶Ad-TheoRib-TK的情況下，當(dāng)用咖啡因處理Capan-l細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率不會(huì)由于GCV、病毒和化學(xué)品的濃度的增加而受到影響，但是如在陽(yáng)性對(duì)照中當(dāng)用茶堿處理Capan-l細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞存活率會(huì)與病毒和GCV的濃度成比例的P爭(zhēng)低。還觀察到，當(dāng)茶堿的濃度增加，細(xì)胞存活率也會(huì)隨著茶堿的濃度增加而降低。這說(shuō)明了除hTERT+HT-29和H印G2細(xì)胞之外，Ad-TheoRib-TK誘導(dǎo)了Capan-l細(xì)胞中的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，這是因?yàn)楹嗣富钚员徊鑹A變構(gòu)地調(diào)控，并且轉(zhuǎn)基因僅當(dāng)用茶堿進(jìn)行處理時(shí)被誘導(dǎo)。其中基因表達(dá)被變構(gòu)地誘導(dǎo)的最佳條件為將Capan-l細(xì)胞用100moi的腺病毒、500的茶堿和50的GCV處理4)對(duì)在IMR90細(xì)胞(hTERT-)中依賴(lài)于茶堿的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)的觀察為了觀察在hTERT+細(xì)胞中的Ad-TheoRib-TK活性的依賴(lài)于茶堿的調(diào)控是否對(duì)靶RNA特異，將hTERT-的IMR90細(xì)胞用腺病毒載體感染，然后觀察hTERT-的IMR90細(xì)胞中的細(xì)胞存活率。結(jié)果示于圖18中。參見(jiàn)圖18，觀察到當(dāng)用Ad-TK處理hTERT-的IMR90細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率無(wú)關(guān)于腺病毒和GCV的濃度而降低。這說(shuō)明了該結(jié)果與化學(xué)物濃度無(wú)關(guān)。然而，甚至在Ad-Rib-TK和變構(gòu)Ad-TheoRib-TK的濃度增加時(shí)，對(duì)核酶進(jìn)行表達(dá)的Ad-Rib-TK和變構(gòu)Ad-TheoRib-TK可以無(wú)關(guān)于病毒、GCV和化學(xué)品的濃度而不影響細(xì)胞存活率。這說(shuō)明了Ad-TheoRib-TK可以在存在外源性化合物的情況下人為地調(diào)控核酶的活性，并且也以高度的靶特異性的方式誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因。實(shí)施例6:對(duì)通過(guò)表達(dá)變構(gòu)核酶的腺病毒載體的依賴(lài)于茶堿的細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)的調(diào)控為了證實(shí)依賴(lài)于茶堿的轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)是否被細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)的變構(gòu)效應(yīng)所誘導(dǎo)，將HT-29細(xì)胞用對(duì)附著茶堿適體的核酶進(jìn)行表達(dá)的腺病毒載體(100moi)感染，并然后用O.lmM的茶堿或相同濃度的咖啡因進(jìn)行處理，這是在該實(shí)驗(yàn)中所建立的用來(lái)觀察是否細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)廠商的最佳條件。觀察到GAPDHRNA的表達(dá)水平，并且用作內(nèi)部對(duì)照。在瓊脂糖凝膠上對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。并且結(jié)果示于圖19中參見(jiàn)圖19，觀察到如所預(yù)期地，在陰性對(duì)照Ad-LacZ的情況中無(wú)論用小分子化合物進(jìn)行處理，不產(chǎn)生任何反式剪接產(chǎn)物。同時(shí)，當(dāng)將Ad-TheoRib-TK(Ad-Theo-Rib2AS-TK)S1入表達(dá)hTERT的癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞中時(shí)，并用咖啡因進(jìn)行處理，基本上不產(chǎn)生反式剪接產(chǎn)物，但是當(dāng)用0.1mM的茶堿處理HT-29細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)生預(yù)期的429nt反式剪接產(chǎn)物，這與在MTT分析中觀察到的結(jié)果一致。當(dāng)將對(duì)反式剪接產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序時(shí)，觀察到hTER的第+21個(gè)位點(diǎn)在反式剪接產(chǎn)物中被剪接。同時(shí)，在如上描述的相同條件下不表達(dá)hTERT的IMR90細(xì)胞中不產(chǎn)生反式剪接產(chǎn)物，這說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明的核酶僅在靶RNA的存在下才表現(xiàn)出其反式剪接的功能。為了證實(shí)依賴(lài)于茶堿的反式胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)，將模擬感染的HT-29細(xì)胞和用Ad-TheoRib-TK轉(zhuǎn)染并用茶堿進(jìn)行處理的IMR90細(xì)胞(hTERT陰性)進(jìn)行混合，并且隨后從細(xì)胞混合物中抽提RNA，并進(jìn)行RTOPCR反應(yīng)(混合)。結(jié)果，在細(xì)胞混合物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)預(yù)期的反式剪接產(chǎn)品，這說(shuō)明了反式剪接產(chǎn)物和測(cè)量的僅茶堿存在下在Ad-TheoRib-TK誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞中細(xì)胞凋亡是由依賴(lài)于茶堿和耙RNA特異性反式剪接反應(yīng)所誘導(dǎo)的。為了比較在HT-29細(xì)胞中的反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物的相對(duì)濃度，將變構(gòu)反式剪接核酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。用GAPDHPCR產(chǎn)物的濃度對(duì)T/SPCR產(chǎn)物的濃度進(jìn)^^史準(zhǔn)，并在描繪于圖中(圖20)。參見(jiàn)圖20，觀察到，在陰性對(duì)照Ad-LacZ的情況中無(wú)論用小分子化合物進(jìn)行處理，不產(chǎn)生任何反式剪接產(chǎn)物。同時(shí)，當(dāng)將Ad-TheoRib-TK引入細(xì)胞中時(shí)，并隨后用PBS進(jìn)行處理，基本上不產(chǎn)生反式剪接產(chǎn)物，并且，當(dāng)用咖啡因處理Ad-TheoRib-TK時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的濃度比當(dāng)用PBS處理Ad-TheoRib-TK時(shí)的濃度要稍微地增加，但是比當(dāng)用茶堿處理Ad-TheoRib-TK時(shí)的濃度要顯著地降低了78%。同時(shí)，當(dāng)將Ad-TheoRib-TK引入細(xì)胞中時(shí)，并隨后用茶堿進(jìn)行處理，反式剪接反應(yīng)被有效地誘導(dǎo)至與由Ad-Rib-TK所產(chǎn)生的反式剪接產(chǎn)物一樣多的濃度。該結(jié)果說(shuō)明了由變構(gòu)核酶誘導(dǎo)的依賴(lài)于茶堿且靶特異性的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)是由于茶堿造成的靶特異性反式剪接反應(yīng)的激活所產(chǎn)生的。工業(yè)實(shí)用性如以上所描述地，本發(fā)明基于在非常特異的基因治療與反式剪接核酶的結(jié)合，所述反式剪接核酶能以疾病特異性RNA為靶，并通過(guò)建立、作為模型系統(tǒng)的其活性能由茶堿進(jìn)行調(diào)控的反式剪接核酶和可以由反式剪接核酶和外源性因素來(lái)調(diào)控基因表達(dá)的可逆基因技術(shù)來(lái)誘導(dǎo)基因表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一種示例性實(shí)施方式的別構(gòu)反式剪接I型核酶可以用作普通的基因治療治劑來(lái)治療各種不可治愈的疾病，還可以用作開(kāi)發(fā)診斷劑的工具，或者作為探尋核酶活性機(jī)理的機(jī)制。權(quán)利要求1.一種選擇由茶堿調(diào)控其活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶的方法，該方法包括制備其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中任一者或兩者上的適體酶、其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到P9區(qū)被部分地除去的反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中任一者或兩者上的適體酶、或者其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到P9區(qū)被部分地修飾的反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中任一者或兩者上的適體酶；通過(guò)使用茶堿和咖啡因來(lái)確定是否發(fā)生依賴(lài)于茶堿的反式剪接反應(yīng)以比較體外制備的適體酶的變構(gòu)調(diào)控；以及通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶活性來(lái)確定依賴(lài)于茶堿的轉(zhuǎn)基因在0.1-1mM的茶堿存在下是否被表達(dá)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選擇變構(gòu)反式剪接I型酶的方法，該方法還包括在所述制備適體酶的步驟中，制備含有對(duì)人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶RNA反義的100-300核苷酸片^R的適體酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選擇變構(gòu)反式剪接I型酶的方法，其中，所述反式剪接核酶的被修飾的P9區(qū)具有'CGAAAGGGAG'的DNA序列。4.一種由茶堿調(diào)控其RNA的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其特征在于，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶特異性地靶向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的RNA,并在3'外顯子處具有得自螢火蟲(chóng)的熒光素酶受體基因。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其中，所述核酶具有選自由在SEQIDNO:1中描述的AS300AP98T、在SEQIDNO:2中描述的AS100Mu-P96T8T和在SEQIDNO:3描述中的AS300W-P96T8T所組成的組中的RNA序列。6.—種編碼權(quán)利要求4所限定的變構(gòu)反式剪接I型核酶的表達(dá)載體。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其中，所述表達(dá)載體包括選自由在SEQIDNO:4中描述的pSEAPAS300AP98T國(guó)Luci、在SEQIDNO:5中描述的pSEAPAS100Mu-P96T8T-Luci和在SEQIDNO:6中描述的pSEAPAS300W-P96T8T-Luci所組成的組中的載體。8.—種由茶堿調(diào)控其RNA的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其特征在于，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶特異性地靶向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的RNA,并在3，外顯子上具有單純皰滲病毒胸苷激酶(HSV-TK)細(xì)胞凋亡基因。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其中，所述核酶具有在SEQIDNO:7中描述的AS300W-P96T8T-TK的RNA序列。10.—種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)權(quán)利要求8所限定的變構(gòu)反式剪接I型核酶的表達(dá)載體。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的表達(dá)載體，其中，所述表達(dá)載體包括在SEQIDNO:8中描述的pAvQ-Theo-Rib21AS-TK(KCCM10935P)。12.—種基因表達(dá)誘導(dǎo)物，該基因表達(dá)誘導(dǎo)物包括茶堿和權(quán)利要求4或8中所限定的變構(gòu)反式剪接I型核酶。13.—種基因表達(dá)誘導(dǎo)物，該基因表達(dá)誘導(dǎo)物包括茶堿和權(quán)利要求6或10中所限定的表達(dá)載體。14.一種癌癥診斷劑，該癌癥診斷劑包括茶堿和權(quán)利要求4或8中所限定的變構(gòu)反式剪接I型核酶。15.—種癌癥診斷劑，該癌癥診斷劑包括茶堿和權(quán)利要求6或10中所限定的表達(dá)載體。16.—種基因治療劑，該基因治療劑包括茶堿和權(quán)利要求4或8中所限定的變構(gòu)反式剪接I型核酶。17.—種基因治療劑，該基因治療劑包括茶4^和權(quán)利要求6或10中所限定的表達(dá)載體。全文摘要提供了由茶堿調(diào)控靶特異性核糖核酸的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其中靶向hTERT的反式剪接核酶識(shí)別人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的mRNA作為癌癥特異性RNA轉(zhuǎn)錄物以通過(guò)通信模塊將茶堿適體連接到hTERT靶反式剪接核酶上，所述hTERT靶反式剪接核酶具有被證實(shí)的反式剪接的能力。變構(gòu)反式剪接I型核酶可以有利地選擇性僅診斷表達(dá)靶hTERTRNA的細(xì)胞，或者誘導(dǎo)它們的細(xì)胞凋亡，這是由于變構(gòu)反式剪接I型核酶的活性依賴(lài)性地受到茶堿的調(diào)控以通過(guò)反式剪接來(lái)更正靶hTERTRNA。文檔編號(hào)C12Q1/00GK101688231SQ200880000802公開(kāi)日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年12月16日優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日發(fā)明者張善英,李城旭,金朱玄申請(qǐng)人:檀國(guó)大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)