專利名稱：核糖核酸酶活性抑制用化合物及含有其的核酸保存用容器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于有效地抑制核糖核酸酶的活性的核糖核酸酶活性抑制用化合物以及含有該化合物的試樣保存用容器，所述核糖核酸酶促進(jìn)提取的核糖核酸的分解，更具體而言，涉及能夠用于從生物體提取核糖核酸的過程以及提取的核糖核酸試樣保存中的核糖核酸酶活性抑制用化合物以及含有該化合物的核糖核酸試樣保存用容器。
背景技術(shù)：
核糖核酸屬于核酸的一種，結(jié)構(gòu)上與脫氧核糖核酸相比代替脫氧核糖而具有核糖，且堿基以尿嘧啶代替了胸腺嘧啶。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能可分為構(gòu)成核糖體的核糖體核糖核酸(rRNA)、具有從脫氧核糖核酸(DNA)傳遞的用于合成蛋白質(zhì)的遺傳信息的信使核糖核酸(mRNA)以及轉(zhuǎn)運與信使核糖核酸的密碼子對應(yīng)的氨基酸的轉(zhuǎn)運核糖核酸(tRNA)。這些核糖核酸根據(jù)使用用途和時機(jī)而被分解并重新合成，在該過程中有核糖核酸酶進(jìn)行參與。 核糖核酸酶不同于脫氧核糖核酸酶，其活性不易被抑制，且存在從收集試樣的過程到從試樣中提取核糖核酸的過程等任何過程中皆易于被污染的問題，這些核糖核酸酶是從生物試樣中分離純核糖核酸的過程中收率降低以及純度降低的主要原因，因此必須抑制其活性。一般，由于核糖核酸是單鏈，因此與脫氧核糖核酸相比具有易于被分解的特性。如進(jìn)行丙型肝炎病毒的診斷之類的情況下，需要在收集到的血液樣品中丙型肝炎病毒的核糖核酸被核糖核酸酶分解之前提取丙型肝炎病毒的核糖核酸，并進(jìn)行確認(rèn)其存在與否的實驗。這時，如果丙型肝炎病毒的核糖核酸已經(jīng)被血液中的核糖核酸酶所分解，則有可能導(dǎo)致將丙型肝炎病毒感染者判定為非感染者的嚴(yán)重的后果。結(jié)果，雖然抑制從生物試樣提取核糖核酸的過程中顯示的核糖核酸酶的活性也很重要，但是從保存生物試樣開始有效地阻斷核糖核酸暴露在核糖核酸酶中比什么都重要。另一方面，從血液或動物、植物的組織或培養(yǎng)細(xì)胞等中提取純核糖核酸大體上有兩種方法，即，使用苯酚的方法和使用離液鹽的方法。眾所周知，苯酚為強(qiáng)力的有機(jī)溶劑，具有溶解蛋白質(zhì)以及細(xì)胞構(gòu)成成分的性質(zhì)，因此在細(xì)胞被溶解(普司)的瞬間在顯示核糖核酸酶的活性之前分解掉核糖核酸酶，從而具有能夠從根源上阻斷核糖核酸的分解的優(yōu)點。但是，苯酚具有對人體有害的缺陷，且沒有完全除去有機(jī)溶劑時會對后續(xù)的操作造成嚴(yán)重的影響。胍鹽等離液鹽具有以強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性作用來使核糖核酸酶變性而抑制其活性的性質(zhì)。另外，離液鹽還能起到向二氧化硅的表面附著核糖核酸的作用，因此具有即使不使用有機(jī)溶劑也能夠很容易地分離/純化核糖核酸的優(yōu)點。但是，這些方法皆為抑制從生物試樣中分離核糖核酸的過程中顯示的核糖核酸酶的活性的方法，因此若在保存生物試樣的期間內(nèi)已經(jīng)暴露在核糖核酸酶中，無論在分離核糖核酸的過程中如何抑制核糖核酸酶的活性也完全無法起到效果。眾所周知，從人胎盤中提取的核糖核酸酶抑制酶與核糖核酸形成I : I復(fù)合體而可用于非競爭性抑制作用中，這已經(jīng)被廣為使用(Peter Blackburn et. al. , JBC,252 :5904-5910(1977))。從人胎盤提取的該核糖核酸酶抑制酶在酶特性上具有以作為巰基試劑的對(羥基汞)苯甲酸酯或N-乙基馬來酰亞胺進(jìn)行處理時，核糖核酸酶和核糖核酸酶抑制酶混合物被分解而失活的缺陷，而為了克服此缺陷必須一同使用過量的DTT (dithiothreitol)。還報導(dǎo)了保存動物組織試片等時，在50%以上的醇溶液中進(jìn)行保存或在PEG(PolyEthylene Glycol)等溶液中進(jìn)行保存，從而使組織切片無法接觸到水分而阻止被核糖核酸酶分解的方法，但這僅局限于用染色法觀察組織試片等試驗中使用，不適合廣泛使用(USP7, 250，270)。氯化氧f凡(Vanadyl chloride)由于與核糖核酸酶形成混合物而起到抑制分解酶活性的效果，但還存在對核糖核酸聚合酶等的作用也進(jìn)行抑制的影響，因此具有在核糖核酸提取過程中必須完全進(jìn)行清除的缺陷(Sambrook et al. , 1989)。 現(xiàn)在，被商品化的核糖核酸酶活性抑制用化合物有以上述的資料為基礎(chǔ)的、以從人胎盤中分離的核糖核酸酶抑制酶為主要材料來使用的制品組；利用含有50%以上的醇而使試樣暴露在非水的醇中來防止核糖核酸分解的方法的制品組；以及利用使用高濃度的鹽而抑制核糖核酸酶活性的方法的制品組等，但是存在不僅可分別有效地抑制其活性的核糖核酸酶的種類受限制，而且為了維持核糖核酸酶活性的抑制力需要持續(xù)添加助劑以及穩(wěn)定劑的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對分解核糖核酸的核糖核酸酶具有很強(qiáng)的活性抑制力的核糖核酸酶活性抑制用化合物，以及提供一種含有本發(fā)明的核糖核酸酶活性抑制用化合物的核糖核酸保存用容器，用于穩(wěn)定地對試樣保存中暴露在核糖核酸酶中而容易分解的核糖核酸進(jìn)行保存。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供用于有效地抑制核糖核酸酶的活性的核糖核酸酶活性抑制用化合物，所述核糖核酸酶促進(jìn)提取的核糖核酸的分解，所述化合物含有下述化學(xué)式I和化學(xué)式2的結(jié)構(gòu)的化合物。[化學(xué)式I]
權(quán)利要求
1.一種由下述化學(xué)式I或化學(xué)式2表示的核糖核酸酶活性抑制用化合物， 化學(xué)式I
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核糖核酸酶活性抑制用化合物，其選自下述化學(xué)式3 化學(xué)式6中，
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核糖核酸酶活性抑制用化合物，其選自下述結(jié)構(gòu)的化合物
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核糖核酸酶活性抑制用化合物，其中，所述核糖核酸酶為核糖核酸內(nèi)切酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核糖核酸酶活性抑制用化合物，其中，所述核糖核酸內(nèi)切酶為選自 RNase A>RNAse H>RNAse I>RNase III>RNase L>RNase P>RNase PhyM>RNase Tl、RNase T2、RNase U2、RNase Vl以及RNase V中的核糖核酸內(nèi)切酶或它們的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核糖核酸酶活性抑制用化合物，其中，所述核糖核酸酶活性抑制用化合物溶解于選自水、DMF、DMS0、(Cl C5)的低級醇或它們的混合溶劑中的一種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核糖核酸試樣保存用容器，其中，所述核糖核酸選自動物組織、植物組織、微生物、血液、血漿、血清、培養(yǎng)細(xì)胞以及將這些試樣轉(zhuǎn)化為重組基因的試樣。
8.—種核糖核酸試樣保存用容器，其含有權(quán)利要求I 7中任一項所述的核糖核酸酶活性抑制用化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核糖核酸試樣保存用容器，其中，所述核糖核酸酶活性抑制用化合物涂覆于容器內(nèi)壁。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于將促進(jìn)提取的核糖核酸的分解的核糖核酸酶的活性有效地進(jìn)行抑制的核糖核酸酶活性抑制用化合物以及含有該化合物的試樣保存用容器。本發(fā)明的核糖核酸酶活性抑制用化合物以及試樣保存用容器可有效地用于核糖核酸提取過程之中，或提取的核糖核酸的保存中。
文檔編號C07D403/08GK102803251SQ200980159836
公開日2012年11月28日 申請日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
發(fā)明者金鐘勛, 樸晃緒, 樸翰浯 申請人:株式會社百奧尼