小核糖核酸病毒樣顆粒在植物中的產(chǎn)生的制作方法
【專利說明】小核糖核酸病毒樣顆粒在植物中的產(chǎn)生 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及在植物中產(chǎn)生小核糖核酸病毒結(jié)構(gòu)蛋白。更具體地，本發(fā)明也涉及在 植物中產(chǎn)生包含小核糖核酸病毒結(jié)構(gòu)蛋白的病毒樣顆粒。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 小核糖核酸病毒是小的無包膜的正鏈RNA病毒，其可以引起人和動(dòng)物中多種臨床 表現(xiàn)?；诎ㄐ蛄型葱院退崦舾行缘亩喾N性質(zhì)，小核糖核酸病毒被分為多個(gè)屬，其中包 括多種人和動(dòng)物的重要病原體。
[0004] 小核糖核酸病毒具有裸露的核衣殼。衣殼為排列為緊密包裝的二十面體結(jié)構(gòu)的60 個(gè)原體。每一原體由4個(gè)多肽組成，稱為VP(病毒蛋白）1、2、3和4。VP2和VP4多肽起源 于被稱為VP0的前體，VP0在病毒基因組RNA內(nèi)化到細(xì)胞后被切割。VP4位于衣殼的內(nèi)側(cè)。 根據(jù)脫水類型和程度，病毒顆粒直徑為約27-30nm。
[0005] 小核糖核酸病毒具有7.1-8.9kb的單組分、線性、多聚腺苷酸化的ssRNA(+)基因 組，其由編碼多蛋白的單個(gè)0RF構(gòu)成。病毒基因組RNA在5'端具有病毒蛋白（VPg)，代替 甲基化核苷酸帽結(jié)構(gòu)。5'端長(zhǎng)的UTR包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)。P1區(qū)編碼結(jié)構(gòu)多 肽。P2和P3區(qū)編碼與復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白。較短的3' UTR在（-)鏈合成中是重要的。 L為存在于一些屬中的額外的N末端前導(dǎo)蛋白，其可以為蛋白酶（口蹄疫病毒，馬鼻病毒） 或具有其他的功能（嵴病毒，心臟病毒）。
[0006] 病毒粒子RNA為感染性的，并且作為基因組和病毒信使RNA。IRES允多種蛋白的 直接翻譯。由病毒蛋白酶將多蛋白最初加工為各種前體和成熟蛋白，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白、復(fù) 制酶、VPg和多種修飾宿主細(xì)胞、最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解的蛋白。
[0007] 腸病毒71 (EV71)為單鏈RNA病毒的小核糖核酸病毒科的成員。它是無包膜病毒， 并且它的衣殼由多個(gè)作為單個(gè)病毒翻譯產(chǎn)物的片段產(chǎn)生的外殼蛋白組成。圖1(現(xiàn)有技術(shù)） 中呈現(xiàn)了病毒多蛋白到結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)組分的加工。多蛋白基因的P1區(qū)編碼結(jié)構(gòu)蛋白，而P2 和P3區(qū)編碼病毒的非結(jié)構(gòu)組分。通過病毒蛋白酶2A將結(jié)構(gòu)蛋白前體P1(圖1中的1ABCD) 從多蛋白上切割之后，P1前體被加工為衣殼蛋白VP0、VP1 (圖1中的1D片段）和VP3(圖1 中的1C片段）。3C組分和它的前體3CD(P3區(qū)所編碼）為負(fù)責(zé)將P1前體加工為衣殼蛋白 的病毒蛋白酶。VP0、VP1和VP3原體同時(shí)地組裝為空的衣殼，并且據(jù)信，在空的顆粒組裝后， 病毒RNA被包裝到顆粒中?？盏囊職づc基因組RNA的結(jié)合導(dǎo)致結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、RNA的內(nèi)化、VP0 自動(dòng)催化切割為VP2(圖1中1B片段）和VP4(圖1中1A片段），并成熟為穩(wěn)定的150S病 毒粒子。通常在小核糖核酸病毒感染期間發(fā)現(xiàn)包含未切割的VP0前體的空的衣殼。
[0008] 已從P1前體蛋白與3⑶蛋白酶的共表達(dá)實(shí)現(xiàn)昆蟲細(xì)胞中EV71VLP的產(chǎn)生（Hu et al.，2003, Biotechnology Letters 25:919-925)。Chung et al?描述了使用單個(gè)桿狀病毒 載體產(chǎn)生P1和3⑶(2008, Vaccine 26:1855-1862)。小鼠中的免疫原性研宄顯示，純化的 EV71VLP為致死劑量的病毒處理提供了保護(hù)。
[0009] 來自于EV71的VP1蛋白產(chǎn)生于轉(zhuǎn)基因番茄的果實(shí)中，并且用含有VP1 的轉(zhuǎn)基因果實(shí)飼養(yǎng)小鼠導(dǎo)致VP1特異性糞便IgA和血清IgG的發(fā)展（Chen et al.，2006, Vaccine24:2944-2951)。
[0010] 口蹄疫病毒（FMDV)的PI前體蛋白和蛋白酶3C共表達(dá)在轉(zhuǎn)基因苜蓿中（Dus Santos et al.，2005, Vaccine 23:1838-1843)。用包含 FMDV P1(1A、1B、1C、ID)的基因組 區(qū)、2A、2B的N末端的前16個(gè)氨基酸殘基、3B1、3B2、3B3、3C的全序列和3D的N末端的前 16個(gè)氨基酸殘基的單個(gè)載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化苜蓿。通過Balb/c小鼠中腹腔內(nèi)給藥證明了來自 于轉(zhuǎn)基因植物的粗蛋白提取物的免疫原性。免疫小鼠也得到抵抗致死的FMDV處理的保護(hù)。 用于實(shí)踐目的的抗原表達(dá)的水平是低的。
[0011] 阿根廷申請(qǐng)AR078257公開了表達(dá)空的衣殼病毒的轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物 在它的基因組中包含編碼與自動(dòng)催化型2A蛋白酶連接的P1前體多肽的DNA構(gòu)建體。該DNA 構(gòu)建體還可包含連接于編碼3C蛋白酶的序列的蛋白片段2B，3C蛋白酶與編碼蛋白片段3D 的序列片段連接。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本發(fā)明涉及在植物中產(chǎn)生小核糖核酸病毒結(jié)構(gòu)蛋白。更具體地，本發(fā)明也涉及在 植物中產(chǎn)生包含小核糖核酸病毒結(jié)構(gòu)蛋白的病毒樣顆粒。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，提供了在植物中產(chǎn)生包含小核糖核酸病毒樣顆粒（PVLP)的方法，其 包括：
[0015] a)將第一核酸引入植物或植物的部分，第一核酸包含在植物中有活性的第一調(diào)節(jié) 區(qū)，第一調(diào)節(jié)區(qū)與編碼一種或多種小核糖核酸病毒多蛋白的核苷酸序列可操作地連接；
[0016] b)引入第二核酸植物，第二核酸包含在植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)，第二調(diào)節(jié)區(qū) 與編碼一種或多種蛋白酶的第二核苷酸序列可操作地連接；
[0017] c)在允許第一和第二核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)植物、植物的部分，從而產(chǎn)生PVLP。
[0018]本發(fā)明還提供了產(chǎn)生小核糖核酸病毒樣顆粒（PVLP)的方法（B)，其包括：
[0019] a)提供植物、植物的部分或植物細(xì)胞，所述植物、植物的部分或植物細(xì)胞包含第一 核酸和第二核酸，第一核酸包含在植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)，第一調(diào)節(jié)區(qū)與編碼一種或 多種小核糖核酸病毒多蛋白的第一核苷酸序列可操作地連接，第二核酸包含在植物中有活 性的第二調(diào)節(jié)區(qū)，第二調(diào)節(jié)區(qū)與編碼一種或多種蛋白酶的第二核苷酸序列可操作地連接；
[0020] b)在允許核酸表達(dá)的條件下，培養(yǎng)植物、植物的部分或植物細(xì)胞，從而產(chǎn)生PVLP。
[0021] 在植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)和在植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)可以是相同的或 不同的。
[0022] 此外，在方法（A)或（B)中，引入植物、植物的部分或植物細(xì)胞的第一核酸與第二 核酸的百分比率可以為95% :5%至50% :50%，或約20:1至約0.5:1。
[0023] 本發(fā)明還包括上述的方法（A)或（B)，其中第一核酸序列包含與一種或多種 豇豆花葉病毒（comovirus)增強(qiáng)子、編碼多蛋白的核苷酸序列和一種或多種雙生病毒 (geminivirus)擴(kuò)增元件可操作地連接的第一調(diào)節(jié)區(qū)，并且編碼雙生病毒復(fù)制酶的第三核 酸被引入植物或植物的部分。一種或多種豇豆花葉病毒增強(qiáng)子可為豇豆花葉病毒UTR，例 如，豇豆花葉病毒高度翻譯（CPMV-HT)UTR，諸如CPMV-HT 5'、3'UTR或其組合。一種或多種 雙生病毒擴(kuò)增元件可以選自大豆黃萎病病毒長(zhǎng)基因間隔區(qū)（BeYDV LIR)和BeYDV短基因間 隔區(qū)（BeYDV SIR)。
[0024] 上文所述方法（方法A)也可涉及引入編碼沉默阻抑蛋白（例如HcPro或pl9)的 另一核酸序列。
[0025] 上文所述方法（方法B)也可涉及還提供包含編碼沉默阻抑蛋白（例如HcPro或 P19)的另一核酸序列的植物、植物的部分或植物細(xì)胞。
[0026]本發(fā)明也包括上文所述方法（A)，其中在引入步驟（步驟a)中，核酸在植物中瞬時(shí) 表達(dá)?？蛇x地，在引入步驟（步驟a)中，核酸在植物中穩(wěn)定地表達(dá)。
[0027] 上文所述方法（A)和（B)還可以包括收獲植物和純化PVLP的步驟。
[0028] 本發(fā)明包括組合物，其包含用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有效劑量的上文所述的PVLP和 藥學(xué)上可接受的載體。
[0029] 本發(fā)明也包括誘導(dǎo)個(gè)體中對(duì)小核糖核酸病毒感染的免疫力的方法，包括向個(gè)體給 予上文所述的PVLP。PVLP可通過口服、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下的方式給予 個(gè)體。
[0030] 本發(fā)明也提供了包含通過上文所述的方法（A)和/或（B)產(chǎn)生的PVLP的植物物 質(zhì)。植物物質(zhì)可用于誘導(dǎo)個(gè)體中對(duì)小核糖核酸病毒感染的免疫力。植物物質(zhì)也可混合為食 品補(bǔ)充劑。
[0031] 發(fā)明概述部分未必描述了本發(fā)明的所有特征。
[0032] 附圖簡(jiǎn)述
[0033] 本發(fā)明的這些和其他特征從參考附圖中的以下描述會(huì)變得更清楚，其中：
[0034] 圖1為小核糖核酸病毒基因組（腸病毒71)和多蛋白加工中間體的現(xiàn)有技術(shù)展示 (來自于ViralZone網(wǎng)頁）。
[0035] 圖2顯示了 P1表達(dá)和由3⑶加工的Western印跡分析。將來自用上文鑒定的表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物的10微克蛋白提取物上樣，并在非還原條件下電泳。小鼠抗抗VP1單克 隆抗體用于免疫檢測(cè)。比率指示用于轉(zhuǎn)化的細(xì)菌懸浮液中P1 (構(gòu)建體1300或1301，見表 1)與3Q)(構(gòu)建體13KK1311或1315,見表1)農(nóng)桿菌株（Agrobacterium)的比例。顯示了 P1和VP1的預(yù)期位置。
[0036] 圖3顯示了針對(duì)VP1的最大化累積進(jìn)行的3CD表達(dá)策略的篩選。將來自用上文 鑒定的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物的5微克蛋白提取物上樣，并在非還原條件下電泳。小鼠抗抗 VP1單克隆抗體用于免疫檢測(cè)。比率指示用于轉(zhuǎn)化的細(xì)菌懸浮液中P1 (1301)與3CD (1310、 131U1312和1313)農(nóng)桿菌株的比例。
[0037] 圖4顯示了 EV71衣殼組裝的評(píng)估。（A)對(duì)來自共表達(dá)P1和3⑶（構(gòu)建體 1301+1310(4:0.5))的植物的蛋白提取物進(jìn)行的尺寸排阻色譜（SEC)分離中得到的洗脫部 分的考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE和Western印跡分析。指示了考馬斯亮藍(lán)染色凝膠中推定 對(duì)應(yīng)于VP1的條帶。（B) SEC洗脫部分12的負(fù)染色透射電子顯微鏡檢測(cè)。標(biāo)尺代表100nm。
[0038] 圖5顯示了純化的EV71PVLP的表征。（A)純化的EV71PVLP的考馬斯亮藍(lán)染色的 SDS-PAGE和Western印跡分析。指示了考馬斯亮藍(lán)染色凝膠中推定對(duì)應(yīng)于VP1的條帶。另 外，也鑒定了分子量與其他EV71衣殼蛋白相對(duì)應(yīng)的其他條帶。（B)純化的EV71的負(fù)染色透 射電子顯微鏡檢測(cè)。在檢測(cè)之前將樣品以1/100稀釋。標(biāo)尺代表lOOnm。
[0039] 圖6顯不了通過電子顯微鏡進(jìn)行的批號(hào)479-23-018的表征。
[0040] 圖7顯示了通過酶輔助的方法提取的、加工的并通過HIC選擇的EV71 PVLP的冷 凍電子顯微鏡分析（批號(hào)479-31-020)。
[0041] 圖8顯示了通過機(jī)械提取方法（pH 8. 0)和熱處理提取的EV71 PVLP的冷凍電子 顯微鏡分析（批號(hào)479-32-020)。
[0042] 圖9A顯示了來自于EV71株HK08的3CD，其包含如GenBank登錄號(hào)ADG57603所 示的氨基酸1549-2193(SEQ ID N0:1)。圖9B顯示了來自于EV71株HK08的3CD，其包含如 GenBank登錄號(hào)GQ279369所示的核苷酸5387-7321 (SEQ ID N0:2)。圖9C顯示了來自于 EV71株⑶FS08的3CD，其包含如GenBank登錄號(hào)ACI25378所示的氨基酸1549-2193 (SEQ ID N0:3)。圖9D顯示了來自于EV71株⑶FS08的3CD，其包含如GenBank登錄號(hào)FJ194964 所示的核苷酸5387-7321 (SEQ ID N0:4)。圖9E顯示了 P1氨基酸序列GenBank登錄號(hào) ADG57603(氨基酸1-862)(SEQ ID N0:5)。圖9F顯示了 P1核苷酸序列GenBank登錄號(hào) GQ279369(核苷酸743-3328)(SEQ ID N0:6)。圖9G顯示了來自于人腸病毒C血清型PV-1 的PVgpl多蛋白核苷酸序列（對(duì)基因組而言為GenBank登錄號(hào)NC_002058,對(duì)多蛋白而言 為NP_041277:nt 5438-7369)(SEQ ID N0:7)。圖9H顯示了來自于脊髓灰質(zhì)炎病毒的多蛋 白的氨基酸序列（氨基酸1566-2209,來自GenBank登錄號(hào)NP_041277)(SEQ ID N0:8)。圖 91顯示了 PVgpl多蛋白的核苷酸序列[人腸病毒C](nt 743-3385,來自GenBank登錄號(hào) NC_002058)(SEQ ID N0:9)。圖9J顯示了多蛋白的氨基酸序列[人腸病毒C]GenBank登錄 號(hào) NP_041277(氨基酸 1-881，來自 GenBank 登錄號(hào) NP_041277)(SEQ ID N0:10)。
[0043] 發(fā)明詳述
[0044] 以下描述優(yōu)選實(shí)施方案。
[0045] 本發(fā)明涉及包含一種或多種小核糖核酸病毒結(jié)構(gòu)蛋白的病毒樣顆粒（VLP)(即小 核糖核酸病毒樣蛋白或PVLP)，和在植