專利名稱：分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法及其所使用的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離篩選菌株的方法及其所使用的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
利用現(xiàn)有工程菌株處理含油污水或含油污泥時，通常需要具有破乳功能的 工程菌株和具有絮凝功能的工程菌株分兩階段完成進行處理，因此存在工藝時 間長、能耗高、費用大、設(shè)備多等問題。如果將兩類工程菌株放在同一環(huán)境中 處理含油污水或含油污泥，雖然可以解決上述問題；但是由于兩類工程菌株的 生存條件勢必存在差異，因此將兩類工程菌株放在同一環(huán)境中必然無法同時滿 足兩類工程菌株的生存需要，導(dǎo)致工程菌株功能的降低，影響破乳或絮凝的效 果，影響含油污水或含油污泥的處理效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有處理含油污水或含油污泥方法中需要工程菌 株分破乳和絮凝兩階段處理，工藝時間長、能耗高、費用大、設(shè)備多的問題及 兩類工程菌株無法在同一環(huán)境中同時高效地處理含油污水或含油污泥的問題， 而提供的一種分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法及其所使用的培養(yǎng)基。通過 本發(fā)明的方法和培養(yǎng)基可以分離篩選出具備絮凝及破乳雙功能的工程菌株解 決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題。
分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法按以下步驟實現(xiàn) 一、將采集樣品在 好氧條件下進行倍比稀釋，得到不同濃度的倍比稀釋液；二、將固體培養(yǎng)基在 沸水浴中融化，然后冷卻至溫度為45 55°C，隨即將不同濃度的倍比稀釋液 分別涂布在固體培養(yǎng)基表面，而后在溫度為30 32'C的條件下恒溫培養(yǎng)至管 中有菌落出現(xiàn)；三、挑取單菌落放在液體培養(yǎng)基上，然后在30 32。C的條件 下恒溫培養(yǎng)2 3天；四、分離純化至有純菌株出現(xiàn)，即可分離篩選出絮凝破. 乳雙功能菌株；其中步驟二中固體培養(yǎng)基由3.0g的牛肉膏、10.0g的蛋白胨、 l.Og的酵母膏、5.0g的氯化鈉、20.0g的瓊脂粉、50mL的綿羊鮮血和1000mL 的蒸餾水制成；步驟三中液體培養(yǎng)基由3.0 4.0g的NH4N03、 3.0 4.0g的K2HP04、 4.0 6.0g的KH2P04、 0.1 0.2g的MgS04.H20、 0.5 lmL的微量 元素溶液、40mL的液體石蠟、0.5 1.0g的酵母膏、8.0 10.0g的葡萄糖溶于 lOOOmL的蒸餾水組成。
分離篩選絮凝破乳雙功能菌株使用的培養(yǎng)基分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng) 基；其中固體培養(yǎng)基由3.0g的牛肉膏、10.0g的蛋白胨、l.Og的酵母膏、5.0g 的氯化鈉、20.0g的瓊脂粉、50mL的綿羊鮮血和lOOOmL的蒸餾水制成；液伴 培養(yǎng)基由3.0 4.0g的NH4N03、 3.0 4.0g的K2HP04、 4.0 6.0g的KH2P04、 0.1 0.2g的MgSO4'H2O、0.5 lmL的微量元素溶液、40mL的液體石蠟、0.5 l.Og的酵母膏、8.0 10.0g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸餾水組成。
本發(fā)明在含有油污的水和含有油污的土壤中分離篩選絮凝破乳雙功能菌 株能同時產(chǎn)生破乳活性成分和絮凝活性成分，具有破乳率高和絮凝率高的特 點，篩選用培養(yǎng)基的針對性強。本發(fā)明的方法具有工藝時間短、節(jié)約能源、費 用小、設(shè)備簡單的優(yōu)點。


圖1為具體實施方式
十二分離篩選出絮凝破乳雙功能菌株的電鏡掃描圖， 圖2為具體實施方式
十二分離篩選出絮凝破乳雙功能菌株的破乳率隨破乳時 間變化曲線圖，圖3為具體實施方式
十二分離篩選出絮凝破乳雙功能菌株對高 嶺土懸濁液絮凝率曲線圖。
具體實施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方 式間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法按以下 步驟實現(xiàn) 一、將采集樣品在好氧條件下進行倍比稀釋，得到不同濃度的倍比 稀釋液；二、將固體培養(yǎng)基在沸水浴中融化，然后冷卻至溫度為45 55°C， 隨即將不同濃度的倍比稀釋液分別涂布在固體培養(yǎng)基表面，而后在溫度為 30 32。C的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有菌落出現(xiàn)；三、挑取單菌落放在液體培養(yǎng) 基上，然后在30 32"的條件下恒溫培養(yǎng)2 3天；四、分離純化至有純菌株 出現(xiàn)，即可分離篩選出絮凝破乳雙功能菌株；其中步驟二中固體培養(yǎng)基由3.0g 的牛肉膏、10.0g的蛋白胨、l.Og的酵母膏、5.0g的氯化鈉、20.0g的瓊脂粉、50mL的綿羊鮮血和lOOOmL的蒸餾水制成；步驟三中液體培養(yǎng)基由3.0 4.0g 的NH4N03、 3.0 4.0g的K2HP04、 4.0 6.0g的KH2P04、 0.1 0.2g的 MgS04'H20、 0.5 lmL的微量元素溶液、40mL的液體石蠟、0.5 1.0g的酵 母膏、8.0 10.0g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸餾水組成。
本實施方式步驟二中固體培養(yǎng)基與步驟三中液體培養(yǎng)基均處于好氧狀態(tài)。 本實施方式步驟二中固體培養(yǎng)基(除綿羊鮮血外其它成分)采用蒸煮方法 配制，配制參數(shù)滅菌溫度為12rC，滅菌時間為20min;綿羊鮮血在滅菌后 加入。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中采集樣 品為含有油污的水或含有油污的土壤。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相 同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中冷卻至 溫度為48 52。C。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中冷卻至
溫度為49 51。C。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中冷卻至
溫度為50。C。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中在溫度
為3rc的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有菌落出現(xiàn)。其它步驟及參數(shù)與具體實施方 式一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中液體培
養(yǎng)基由3.2 3.8g的NH4N03、 3.2 3.8g的K2HP04、 4.2 5.8g的KH2P04、 0.12 0.18g的MgSCVH20、 0.6 0.9mL的微量元素溶液、40mL的液體石蠟、 0.6 0.9g的酵母膏、8.4 9.6g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸餾水組成。其它步 驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中液體培 養(yǎng)基由3.4 3.6g的NH4N03、 3.4 3.6g的K2HP04、 4.6 5.2g的KH2P04、 0.14 0.16g的MgSCVH20、 0.7 0.9mL的微量元素溶液、40mL的液體石蠟、 0.7 0.9g的酵母膏、8.8 9.4g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸餾水組成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中液體培
養(yǎng)基由3.5g的NH4N03、 3.5g的K2HP04、 5.0g的KH2P04、 0.15g的 MgSCVH20、 0.8mL的微量元素溶液、40mL的液體石蠟、0.8g的酵母膏、9.0g 的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸餾水組成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相 同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中微量元 素溶液由lOOOmg WCaCl2.H20、 1000 mg的FeS04'7H20、 1400mgEDTA溶 于lOOOmL的蒸餾水制成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十一本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中在 3rc的條件下恒溫培養(yǎng)2天。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十二本實施方式分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法按以
下步驟實現(xiàn) 一、將含有油污的土壤在好氧條件下進行倍比稀釋，得到不同濃
度的倍比稀釋液；二、將固體培養(yǎng)基在沸水浴中融化，然后冷卻至溫度為48°C， 隨即將不同濃度的倍比稀釋液分別涂布在固體培養(yǎng)基表面，而后在溫度為
3rc的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有菌落出現(xiàn);三、挑取單菌落放在液體培養(yǎng)基上，
然后在3rc的條件下恒溫培養(yǎng)3天；四、分離純化至有純菌株出現(xiàn)，即可分
離篩選出絮凝破乳雙功能菌株；其中步驟二中固體培養(yǎng)基由3.0g的牛肉膏、 10.0 g的蛋白胨、l.Og的酵母膏、5.0g的氯化鈉、20.0g的瓊脂粉、50mL的 綿羊鮮血和1000mL的蒸餾水制成；步驟三中液體培養(yǎng)基由3.5g的NH4N03、 3.5g的K2HP04、 4.5g的KH2P04、 0. 2g的MgS04'H20、 0.75mL的微量元素 溶液、40mL的液體石蠟、0.8g的酵母膏、9.0g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸餾 水組成。
本實施方式分離篩選出絮凝破乳雙功能菌株(用XH-1表示)通過電鏡掃 描(圖1)表述菌體形態(tài)。從圖1中可以清楚看出菌株XH-1長短多變、有莢 膜、無鞭毛、表面光滑、圓整突起、邊緣規(guī)則、有芽孢并蘭氏染色呈陽性，此 菌株的形態(tài)特征與莫海威芽孢桿菌(B。"7/"smq/"ve"w、)相同；經(jīng)測試此菌 株適宜在溫度為20 30°C、 pH為6.0 8.0的條件下生長且好氧，在培養(yǎng)基上 生長時呈淡黃色，易挑取。本實施方式分離篩選出絮凝破乳雙功能菌株XH-1和相近菌株16S rDNA 序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)測定XH-1菌為革蘭氏陽性桿菌、菌株長短多 變、需氧、產(chǎn)生芽孢、XH-1菌株16SrDNA序列與S"c/〃m m07'avera/s (DQ993678)相似性為99%，可確定此菌株為芽孢桿菌屬莫海烕芽孢桿菌
挑取一環(huán)本實施方式得到純菌株轉(zhuǎn)接于250mL裝有100mL已滅菌的液體 培養(yǎng)基(本實施方式所使用)的三角瓶中，制得細胞全培養(yǎng)液，然后向5mL 模擬0/W型乳狀液的比色管中加入2mL細胞全培養(yǎng)液，振蕩搖勻，靜置，開 始計時。經(jīng)測得，該純菌株15小時以內(nèi)破乳率在85%以上，24小時以內(nèi)可達 100%。測試結(jié)果如圖2所示，從圖2可以看出本實施方式分離出的純菌株破 乳率隨時間的變化近似為一級反應(yīng)，開始時破乳速度較快，隨時間的延長，乳 化液體積的減少，破乳速率變慢；而隨著破乳過程的進行乳狀液含油量下降， 菌液濃度也下降，當乳化液中油量降到一定程度后，小油滴聚集速度下降，導(dǎo) 致破乳速度減慢。
挑取本實施方式得到純菌株轉(zhuǎn)接裝有250mL裝有l(wèi)OOmL種子培養(yǎng)基的三 角瓶中，在溫度為3(TC、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下培養(yǎng)24搖瓶培養(yǎng)方 法在500 mL三角瓶中裝入250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后按10%的接種量將 種子培養(yǎng)基中接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，制備生物絮凝劑。向1000mL待測水樣(采 用自來水按照5g/L的比例加入高嶺土——250目，山東濟寧泰豐研究所出品 的懸濁液)中依次投加生物絮凝劑和助凝劑CaCl2。以相同條聯(lián)混凝攪拌儀攪 拌后靜置20min，對沉后水濁度與絮凝率的測定，進行5次重復(fù)對比試驗，使 用濁度儀測定上清液的濁度，經(jīng)測得，該菌株的絮凝率均在90%以上，最高可 達99.4%測試結(jié)果如圖3所示。
具體實施方式
十三本實施方式分離篩選絮凝破乳雙功能菌株所使用的培 養(yǎng)基分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；其中固體培養(yǎng)基由3.0g的牛肉膏、lO.Og 的蛋白胨、l.Og的酵母膏、5.0g的氯化鈉、20.0g的瓊脂粉、50mL的綿羊鮮 血和1000mL的蒸餾水制成；液體培養(yǎng)基由3.0 4.0g的NH4NO3、3.0 4.0g的 K2HP04、 4.0 6.0g的KH2P04、 0.1 0.2g的MgS04.H20、 0.5 lmL的微量 元素溶液、40mL的液體石蠟、0.5 1.0g的酵母膏、8.0 10.0g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸餾水組成。
本實施方式中固體培養(yǎng)基(除綿羊鮮血外其它成分)采用蒸煮方法配制， 配制參數(shù)滅菌溫度為12rC，滅菌時間為20min;綿羊鮮血在滅菌后加入。
具體實施方式
十四本實施方式與具體實施方式
十三不同的是液體培養(yǎng)基
由3.2 3.8g的NH4N03、 3.2 3.8g的K2HP04、 4.2 5.8g的KH2P04、 0.12 0.18g的MgS(VH20、 0.6 0.9mL的微量元素溶液、40mL的液體石蠟、0.6 0.9g的酵母膏、S.4 9.6g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸餾水組成。其它步驟及 參數(shù)與具體實施方式
十三相同。
具體實施方式
十五本實施方式與具體實施方式
十三不同的是液體培養(yǎng)基 由3.5g的NH4N03、 3.5g&K2HP04、 4.8g的KH2P04、 0.16g的MgS04'H20、 0.8mL的微量元素溶液、40mL的液體石蠟、0.7g的酵母膏、9.0g的葡萄糖溶 于lOOOmL的蒸餾水組成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
十三相同。
具體實施方式
十六本實施方式與具體實施方式
十三不同的是微量元素溶 液由lOOOmg的CaCl2'H20、 1000 mg的FeS04.7H20、 1400 mg EDTA溶于 lOOOmL的蒸餾水制成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
十三相同。
權(quán)利要求
1、分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法，其特征在于分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法按以下步驟實現(xiàn)一、將采集樣品在好氧條件下進行倍比稀釋，得到不同濃度的倍比稀釋液；二、將固體培養(yǎng)基在沸水浴中融化，然后冷卻至溫度為45～55℃，隨即將不同濃度的倍比稀釋液分別涂布在固體培養(yǎng)基表面，而后在溫度為30～32℃的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有菌落出現(xiàn)；三、挑取單菌落放在液體培養(yǎng)基上，然后在30～32℃的條件下恒溫培養(yǎng)2～3天；四、分離純化至有純菌株出現(xiàn)，即可分離篩選出絮凝破乳雙功能菌株；其中步驟二中固體培養(yǎng)基由3.0g的牛肉膏、10.0g的蛋白胨、1.0g的酵母膏、5.0g的氯化鈉、20.0g的瓊脂粉、50mL的綿羊鮮血和1000mL的蒸餾水制成；步驟三中液體培養(yǎng)基由3.0～4.0g的NH4NO3、3.0～4.0g的K2HPO4、4.0～6.0g的KH2PO4、0.1～0.2g的MgSO4·H2O、0.5～1mL的微量元素溶液、40mL的液體石蠟、0.5～1.0g的酵母膏、8.0～10.0g的葡萄糖溶于1000mL的蒸餾水組成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法，其特征 在于步驟二中冷卻至溫度為48 52°C。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法，其特征在于步驟二中在溫度為3rc的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有菌落出現(xiàn)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法，其特征 在于步驟三中液體培養(yǎng)基由3.2 3.8g的NH4N03、3.2 3.8g的K2HP04、 2 8g的KH2P04、 0.12 0.18g的MgS04vH20、 0.6 0.9mL的微量元素溶液、 40mL的液體石蠟、0.6 0.9g的酵母膏、8.4 9.6g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸 餾水組成。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或4所述的分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法， 其特征在于步驟三中微量元素溶液由lOOOmg的CaCl2'H20、 1000 mg的 FeS04 7H20、 1400 mg EDTA溶于lOOOmL的蒸餾水制成。
6、 分離篩選絮凝破乳雙功能菌株所使用的培養(yǎng)基，其特征在于分離篩選 絮凝破乳雙功能菌株所使用的培養(yǎng)基分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；其中固體 培養(yǎng)基由3.0g的牛肉膏、10.0g的蛋白胨、l.Og的酵母膏、5.0g的氯化鈉、 20.0g的瓊脂粉、50mL的綿羊鮮血和lOOOmL的蒸餾水制成；液體培養(yǎng)基由(3.0 4.0g的NH4N03、 3.0 4.0g的K2HP04、 4.0 6.0g的KH2P04、 0.1 0.2g 的MgSCVH20、 0.5 lmL的微量元素溶液、40mL的液體石蠟、0.5 (1.0g的 酵母膏、8.0 10.0g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸餾水組成。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離篩選絮凝破乳雙功能菌株所使用的培養(yǎng)基， 其特征在于液體培養(yǎng)基由3.2 3.8g的NH4N03、 3.2 3.8g的K2HP04、 (4.2 5.8g的KH2P04、 0.12 0.18g的MgS04'H20、 0.6 0.9mL的微量元素溶液、 40mL的液體石蠟、0.6 0.9g的酵母膏、8.4 9.6g的葡萄糖溶于(lOOOmL的蒸 餾水組成。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的分離篩選絮凝破乳雙功能菌株所使用的培 養(yǎng)基，其特征在于微量元素溶液由lOOOmg的CaCl2'H20、 1000 mg的 FeS04-(7H20、 1400 mg EDTA溶于lOOOmL的蒸餾水制成。
全文摘要
分離篩選絮凝破乳雙功能菌株的方法及其所使用的培養(yǎng)基，它涉及一種分離篩選菌株的方法及其所使用的培養(yǎng)基。它解決現(xiàn)有處理含油污水或含油污泥方法中需要工程菌株分破乳和絮凝兩階段處理，工藝時間長、能耗高、費用大、設(shè)備多的問題及兩類工程菌株無法在同一環(huán)境中同時高效地處理含油污水或含油污泥的問題。分離方法一、制備不同濃度的倍比稀釋液；二、使管中有菌落出現(xiàn)；三、挑取單菌落恒溫培養(yǎng)；四、分離純化至有純菌株出現(xiàn)，即可分離。本發(fā)明分離篩選絮凝破乳雙功能菌株能同時產(chǎn)生破乳活性成分和絮凝活性成分，具有破乳率高和絮凝率高的特點。篩選用培養(yǎng)基的針對性強。本發(fā)明的方法具有工藝時間短、節(jié)約能源、費用小、設(shè)備簡單的優(yōu)點。
文檔編號C12R1/07GK101434925SQ20081020975
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者寧 侯, 旸 徐, 絮 李, 李大鵬, 放 馬, 利 魏 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)