專利名稱：針對CDK2基因siRNA重組體187的構(gòu)建及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種RNAi重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在腫瘤基因治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference,簡稱RNAi)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種抑制耙基因表達(dá)的新方法，它被認(rèn)為從低等生物到高等生物都普遍存在的一種防御外源性核酸侵?jǐn)_的生理機(jī)制。RNAi是通過小分子雙鏈RNA特異性互補(bǔ)靶向基因轉(zhuǎn)錄本，從而誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種技術(shù)。人工合成或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成的小的雙鏈RNA(siRNA)或者發(fā)夾型RNA (short hairpin RNA， shRNA)進(jìn)入細(xì)胞后，能和與之互補(bǔ)的耙基因mRNA結(jié)合，從而介導(dǎo)特異性的切割酶將mRNA降解，達(dá)到降低目的基因表達(dá)的目的。 目前RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛用于基因功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方法以及腫瘤基因治療的研究領(lǐng)域。其在腫瘤基因治療上與基因替代、反義寡核苷酸治療、細(xì)胞因子基因治療等傳統(tǒng)的基因治療方法相比，具有特異、高效、毒性小的特點，因此可用來對一些腫瘤進(jìn)行治療。
腫瘤的產(chǎn)生是喪失細(xì)胞機(jī)能調(diào)控的結(jié)果。生長信號的異常和細(xì)胞周期調(diào)控的異常將導(dǎo)致細(xì)胞增殖的異常，最終產(chǎn)生惡性克隆。研究進(jìn)展表明腫瘤共性的生物學(xué)特征是失控性生長，其主要分子機(jī)制是細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致細(xì)胞增殖過多和凋亡過少。因此，可以說腫瘤是細(xì)胞失控性生長所致的一類細(xì)胞周期性疾病。CDK2是細(xì)胞周期調(diào)控的核心分子，正常情況下，CDK2在整個細(xì)胞周期中，保持非常恒定的水平，但是在細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)下，它的活性會發(fā)生變化。如果細(xì)胞周期蛋白持續(xù)過表達(dá)或CDK2的抑制蛋白表達(dá)下調(diào)，CDK2在細(xì)胞周期中始終處于高活性狀態(tài)，細(xì)胞周期處于失控狀態(tài)，則細(xì)胞就無限增殖發(fā)生癌變。
基因上述研究，我們針對CDK2基因設(shè)計相應(yīng)的序列，連接到質(zhì)粒載體上，構(gòu)建siRNA重組表達(dá)質(zhì)粒，將其導(dǎo)入肝癌細(xì)胞內(nèi)，在U6啟動子的作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shRNA，通過這些shRNA來誘導(dǎo)RNAi，從而特異地抑制CDK2基因的過度表達(dá)。因此，RNAi重組質(zhì)?？捎糜谥苽湫碌目鼓[瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供針對CDK2基因RNAi重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo_siRNA187及制備方法，為腫瘤基因治療提供新策略。 本發(fā)明的另一 目的是提供新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物。
本發(fā)明選定CDK2基因作用腫瘤治療靶點，根據(jù)人肝癌細(xì)胞CDK2基因(GenBankAccession Number :NM_001798)的序列，通過網(wǎng)絡(luò)在線工具(http://www. invitrogen.com/皿page)在線設(shè)計軟件設(shè)計siRNA187 (序列為5—AGTTGTACCTCCCCTGGAT 3—)。并構(gòu)建含干擾片段的dsDNA，送生物公司合成，退火后克隆入質(zhì)粒(pGPU6/GFP/Neo)，并用酶切鑒定與DNA測序技術(shù)進(jìn)行篩選鑒定重組質(zhì)粒；通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞，在U6啟動子的作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA， shRNA)，通過這些shRNA來誘導(dǎo)RNAi，經(jīng)實時定量PCR與Western blot檢測干擾重組質(zhì)粒對CDK2基因mRNA與蛋白水平的抑制程度，為開發(fā)成為新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物提供實驗依據(jù)。


圖lpGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒圖譜
圖2pGPU6/GFP/Neo-siRNA187測序結(jié)果
圖3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的熒光表達(dá)的檢測
圖4實時定量PCR擴(kuò)增曲線
具體實施例方式
以下通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，以下實例僅用于說明本發(fā)明，而
不用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例一 干擾序列的設(shè)計根據(jù)人肝癌細(xì)胞CDK2基因(GenBank Accession Number :NM_001798)的序列，通過網(wǎng)絡(luò)在線工具(http:〃www. invitrogen. com/,age)在線設(shè)計軟件設(shè)計siRNA187(序列為5—AGTTGTACCTCCCCTGGAT 3，；再設(shè)計一組無關(guān)序列作為陰性對照。
實施例二重組質(zhì)粒的構(gòu)建 構(gòu)建Oligo單鏈，在正義和反義鏈之間鏈接Loop環(huán)，然后在基本結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上添加Bam H I內(nèi)切酶與Bbs I內(nèi)切酶的酶切位點序列與轉(zhuǎn)錄終止序列，形成編碼特異地抑制CDK2基因表達(dá)的siRNA187的DNA片段 然后送上海生工公司人工合成后，將兩條鏈退火連成雙鏈。用Bam H I內(nèi)切酶與Bbs I內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo (質(zhì)粒圖譜如圖1)，然后將雙鏈DNA克隆至質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，抽提后用酶切法鑒定轉(zhuǎn)化菌，粗篩可能的陽性重組克隆并進(jìn)行DNA測序鑒定(測序圖譜如圖2)，具體為247位至305位(59個堿基)。
實施例三轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株SMMC7721 本實驗采用陽離子脂質(zhì)體試劑(Invitrogen公司Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑
盒)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株。經(jīng)多次轉(zhuǎn)染條件的摸索，找到最佳的條件。轉(zhuǎn)染后24h、48h后熒光
倒置顯微鏡拍片觀察，視野內(nèi)有較強(qiáng)的綠色熒光(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的熒光表達(dá)的檢測
如圖3)，即證明有綠色熒光蛋白的表達(dá)。隨機(jī)選擇5個細(xì)胞區(qū)視野(200X)，計數(shù)綠色熒光
細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，按下面公式計算綠色熒光細(xì)胞發(fā)生率(即轉(zhuǎn)染效率) 綠色熒光細(xì)胞發(fā)生率=(綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))X 100% 轉(zhuǎn)染S匪C7721后48h測得轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上。 實施例四定量PCR檢測重組質(zhì)粒對CDK2基因mRNA水平的影響 取肝癌細(xì)胞正常培養(yǎng)，分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA187與pGPU6/
GFP/Neo-NC (陰性對照)48h待細(xì)胞匯合率達(dá)到80-90 %時，總RNA用Trizol法提取，所得
RNA溶解于DEPC處理的ddH20中。所用引物根據(jù)CDK2mRNA和GAPDH mRNA全基因序列，應(yīng)
用Primer Premier 5. 0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，送上海生工合成。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到模板cDNA，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，采用相對定量法，分析轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體后的S匪C7721肝癌細(xì)胞內(nèi)CDK2基因相對于GAPDH內(nèi)參基因的表達(dá)變化(實時定量PCR擴(kuò)增曲線如圖4) 。 PCR擴(kuò)增后，設(shè)定閾值線(threshold)為0. 2，采集對應(yīng)的CT值(Thresholdcycle)，然后按照2—A ACT法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，所得數(shù)據(jù)對內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行均一化處理，然后得到樣品組相對于陰性對照組的基因表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA187可以顯著抑制肝癌細(xì)胞CDK2基因mRNA表達(dá)，抑制效率為41 % 。
權(quán)利要求
一種以CDK2為靶基因的siRNA187，其特征在于，其堿基序列為5`AGTTGTACCTCCCCTGGAT 3`。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述siRNA，其特征在于，其制備為構(gòu)建重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA187體內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，所用質(zhì)粒包括含III型RNA聚合酶與真核U6啟動子的載體pGPU6/GFP/Neo ;編碼特異地抑制CDK2基因表達(dá)的siRNA187的DNA片段。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼特異地抑制CDK2基因表達(dá)的siRNA187的DNA片段，其特征在于，其堿基序列為
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA187，其特征在于，其能顯著抑制肝癌細(xì)胞中CDK2基因的表達(dá)，可用于制備新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對CDK2基因siRNA重組體187的構(gòu)建及用途。本發(fā)明公開了一種針對CDK2基因的RNAi重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA187的構(gòu)建及其抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。利用RNAi技術(shù)原理，設(shè)計出以CDK2為靶基因的siRNA187，設(shè)計合成了能轉(zhuǎn)錄出shRNA的模板DNA，并將其定向克隆到真核表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo，并用酶切鑒定與DNA測序技術(shù)進(jìn)行篩選，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA187。該重組質(zhì)粒能顯著抑制肝癌細(xì)胞中CDK2基因的表達(dá)，用于制備新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物。
文檔編號C12N15/11GK101775391SQ200810209709
公開日2010年7月14日 申請日期2008年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月16日
發(fā)明者于水瀾, 于英君, 宋高臣, 李和偉, 李娜, 李玲, 趙陽 申請人:宋高臣;于英君;于水瀾