專(zhuān)利名稱(chēng)：：適合于大規(guī)模生產(chǎn)人用禽流感疫苗的裂解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本技術(shù)屬于生物制藥領(lǐng)域。涉及一種可滿(mǎn)足人用禽流感病毒裂解疫苗規(guī)?；a(chǎn)的禽流感病毒裂解方法。
背景技術(shù)：
：禽流感病毒是由正黏病毒科流感病毒屬的A型流感病毒引起的，是各種家禽和野鳥(niǎo)的一種急性傳染病。該病呈全球性分布，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1997年一抹禽流感H5N].病毒在香港直接從禽傳染給人造成18人感染，6人死亡，該事件說(shuō)明由禽流感可以造成人流感流行。近幾年禽流感在世界范圍內(nèi)有蔓延之勢(shì)。亞洲近幾年一直處于世界禽流感危機(jī)中心。據(jù)有關(guān)人員分析，禽流感的威脅將會(huì)持續(xù)很多年，衛(wèi)生專(zhuān)家擔(dān)心禽流感會(huì)和人流感病毒相結(jié)合，產(chǎn)生一種易于在人類(lèi)間傳播的疾病。2003年SARS奪走了近800人的生命，禽流感對(duì)人類(lèi)健康的威脅遠(yuǎn)要比SARS嚴(yán)重許多。目前接種疫苗是預(yù)防疾病最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段。本發(fā)明的目標(biāo)是研制一種安全有效的人用禽流感裂解疫苗，以預(yù)防可能造成的禽流感病毒在人群中的流行。該發(fā)明是利用禽流感病毒反向遺傳林NIBGR-14,建立主代種子及工作種子庫(kù)，規(guī)模化、工業(yè)化在雞胚細(xì)胞上進(jìn)行病毒擴(kuò)增，在此基礎(chǔ)上對(duì)病毒進(jìn)行純化、裂解、滅活等一系列的工藝過(guò)程，再進(jìn)行稀釋、除菌過(guò)濾制成疫苗。該發(fā)明技術(shù)主要是確認(rèn)禽流感病毒裂解方法及裂解條件，建立具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人用禽流感病毒裂解疫苗生產(chǎn)工藝。裂解劑大體可分為三類(lèi)，即陰離子型裂解劑、非離子型裂解劑和陽(yáng)離子型裂解劑。其中陽(yáng)離子型裂解劑，能使病毒變性，生產(chǎn)裂解流感病毒疫苗時(shí)多數(shù)釆用非離子型裂解劑TritonX-100。也有采用3-N-磷酸酯-Tween-80混合來(lái)裂解流感病毒。目前國(guó)內(nèi)外人用流感病毒疫苗裂解劑的使用情況國(guó)外巴斯德生產(chǎn)的凡爾靈使用TritonX-100、葛蘭素史克生產(chǎn)的福祿立適使用去氧膽酸鈉、凱龍公司生產(chǎn)的愛(ài)閣立保使用Tween-80和CTAB。國(guó)內(nèi)使用TritonX-100有5個(gè)廠家、TritonX-lOl的1個(gè)廠家、TritonX-lOl或去氧膽酸鈉1家。我公司采用乙醚進(jìn)行禽流感病毒的裂解。乙醚是有機(jī)溶劑，可溶解脂肪，易揮發(fā)微溶于水，使用乙醚可提取尿嚢液中的脂類(lèi)，減少卵清白蛋白的殘余，另外還有一定的去除熱原和滅活病毒的作用，乙醚的去除方法也簡(jiǎn)單快捷，由于禽流感病毒具有易聚集的特點(diǎn)，在乙醚裂解之前用Tween-80處理病毒液以減少病毒的聚集，獲得了良好的病毒裂解效果，使疫苗的安全性更好。該發(fā)明方法解決了規(guī)模化生產(chǎn)中禽流感病毒裂解技術(shù)，為大規(guī)模生產(chǎn)安全、有效的禽流感病毒裂解疫苗奠定了理論基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容該發(fā)明是要摸索禽流感病毒裂解方法及裂解條件，建立具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人用禽流感病毒裂解疫苗生產(chǎn)裂解方法。為滿(mǎn)足人用禽流感病毒裂解疫苗的生產(chǎn)需要，本發(fā)明選用符合疫苗生產(chǎn)的海蘭白種蛋賻化的9-11日齡雞胚，使用禽流感病毒工作種子，進(jìn)行病毒的生產(chǎn)規(guī)?；瘮U(kuò)增，收獲病毒液。在本發(fā)明方法中，我公司研究用的禽流感毒種為NIBRG-14(05/160)重配高產(chǎn)抹，是由A/Vietnaffl/1194/2Q04(H5Nl)毒抹經(jīng)重配獲得，來(lái)自英國(guó)的NIBSC。毒種傳代和制備用雞胚來(lái)源于無(wú)外源性禽白血病病毒、I型和III型禽腺病毒的SPF雞群；疫苗生產(chǎn)用雞胚來(lái)源于封閉式房舍內(nèi)飼養(yǎng)的、符合疫苗生產(chǎn)的海蘭白或來(lái)亨健康雞群。并選用9~11日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng)的健康雞胚。本發(fā)明涉及一種規(guī)模化生產(chǎn)人用禽流感病毒裂解疫苗的病毒裂解方法，其特征在于乙醚裂解禽流感病毒。本發(fā)明所述的乙醚裂解禽流感病毒的方法，其特征在于將純化后的禽流感全病毒置于在密閉的容器中，加入適宜濃度的乙醚，并采用磁力攪拌裝置進(jìn)行攪拌，其中包括禽流感病毒的接踵、病毒培養(yǎng)、病毒收獲、病毒純化、病毒裂解、病毒洗濾及除菌過(guò)濾。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是乙醚是有機(jī)溶劑，可溶解脂肪，易揮發(fā)微溶于水，使用乙醚可4是取尿囊液中的脂類(lèi)，減少卵清白蛋白的殘余，另外還有一定的去除熱原和滅活病毒的作用，乙醚的去除方法也簡(jiǎn)單快捷，由于禽流感病毒具有易聚集的特點(diǎn)，在乙醚裂解之前用Tween-80處理病毒液以減少病毒的聚集，獲得了良好的病毒裂解效果。減少疫苗的不良反應(yīng)，使疫苗的安全性更好。圖1禽流感病毒電鏡照片(全病毒)(放大3.5萬(wàn)倍)圖2禽流感病毒裂解后電鏡照片(放大3.5萬(wàn)倍)圖3禽流感病毒裂解疫苗生產(chǎn)流程圖具體實(shí)施方案1)雞胚準(zhǔn)備選用血管清晰、胚胎活動(dòng)的9~11日齡雞胚。2)病毒接種、培育及收獲取禽流感工作種子批毒種根據(jù)其感染病毒滴度將病毒稀釋成1000-10000個(gè)EID50毒種懸液，于雞胚尿囊腔接種，每胚0.ltnl;將雞胚置3335。C培育68~72小時(shí)，挑選活胚置2~8'C經(jīng)冷胚16~20小時(shí)，分組收獲尿嚢液。43)病毒液合并與澄清病毒的單次收獲物合并為病毒合并液，將收獲的病毒合并液用300目濾布過(guò)濾，再經(jīng)8000rpm連續(xù)流離心澄清。4)超濾濃縮選用100~3Q0KD超濾膜，將病毒合并液超濾濃縮30~50倍，血凝滴度應(yīng)不低于1:1600。5)純化將濃縮后的病毒液經(jīng)蔗糖密度梯度30000rpm離心3小時(shí)，根據(jù)紫外檢測(cè)儀收集純化后的病毒峰。6)裂解與再純化在純化病毒液中按1:4000加入聚山梨脂80，再按l:l加入乙醚，室溫裂解病毒30分鐘。裂解后進(jìn)行再純化，收集純化病毒裂解液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較的有益效果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實(shí)施例1.材料和設(shè)備1)乙醚2)PH7.2PBS3)純化后禽流感病毒液批號(hào)Q0601Q0602Q0603Q0604血凝滴度1:256001:256001:256001:256004)聚山梨酯80(Tween-80)低速大容量離心機(jī)型號(hào)J-26XP美國(guó)Beckman公司5)方法首先將純化后禽流感病毒液按終濃度1:4000加入Tween-80，再按體積比1:1加入乙醚并混勻，對(duì)照組不加裂解劑，置室溫并經(jīng)磁力攪拌器震蕩30分鐘進(jìn)行裂解。裂解后經(jīng)3000rpra低速離心20分鐘，收集病毒液層，真空排醚1-2小時(shí)，為病毒裂解液。在電鏡下觀察結(jié)果。從圖1可見(jiàn)禽流感全病毒，病毒多數(shù)呈球形或橢球形，鏡下可見(jiàn)完整的病毒胞膜，表面抗原位于最外層，清晰可見(jiàn)。少數(shù)病毒不規(guī)則如絲狀。從圖2可見(jiàn)禽流感流感病毒裂解均勻，裂解程度較好，完整病毒顆粒極少見(jiàn)。權(quán)利要求1.本發(fā)明涉及一種規(guī)?；a(chǎn)人用禽流感病毒裂解疫苗的病毒裂解方法，其特征在于，采用禽流感毒種NIBRG-14(05/160)重配高產(chǎn)株，以雞胚作為基質(zhì)細(xì)胞，規(guī)?；苽淙擞们萘鞲胁《玖呀庖呙?，其中包括病毒接踵、病毒培養(yǎng)、病毒收獲、粗濾尿囊液、連續(xù)流低速離心、超濾濃縮及蔗糖密度梯度離心、病毒裂解及再純化。2.權(quán)利要求1所述的在本發(fā)明方法中，采用的禽流感毒種為NIBRG-14(05/160)重配高產(chǎn)抹，是由A/Vietnam/1194/2004(H5Nl)毒抹經(jīng)重配獲得，來(lái)自英國(guó)的NIBSC。3.權(quán)利要求1所述的在本發(fā)明方法中使用雞胚，病毒種子庫(kù)為SPF雞胚，生產(chǎn)用雞胚為來(lái)源于封閉式房舍內(nèi)飼養(yǎng)的、符合疫苗生產(chǎn)的海蘭白或來(lái)亨健康雞群。并選用9~11日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng)的健康雞胚。4.權(quán)利要求1所述的本發(fā)明中病毒培養(yǎng)方法為1)將禽流感病毒工作種子制備成1000-10000個(gè)EID50毒種懸液，于雞胚尿嚢腔接種，每胚0.lml;2)將雞胚置33-35。C培育68-72小時(shí)；3)挑選活胚置2~rC經(jīng)冷胚16-20小時(shí)，分組收獲尿嚢液。5.權(quán)利要求1所述的本發(fā)明中病毒液合并與澄清方法其特征為1)將收獲的病毒合并液用300目濾布過(guò)濾；2)8000rpm連續(xù)流離心澄清。6.權(quán)利要求1所述的在本發(fā)明中病毒液超濾濃縮方法其特征為選用100~300KD超濾膜，將病毒合并液超濾濃縮30~50倍。7.權(quán)利要求1所述的在本發(fā)明中病毒液純化方法其特征為將濃縮后的病毒液經(jīng)蔗糖密度梯度30000rpm離心3小時(shí)。8.權(quán)利要求1所述的本發(fā)明中病毒裂解方法其特征為在純化病毒液中按1:4000加入聚山梨脂80，再按1:1加入乙醚，在室溫條件下磁力攪拌裂解病毒30分鐘。裂解后進(jìn)行再純化，收集純化病毒裂解液。9.權(quán)利要求1所迷的本發(fā)明中病毒純化方法，其中病毒純化液的收集采用紫外檢測(cè)儀，收集純化后的病毒。全文摘要本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及禽流感病毒的一種裂解方法，適合用于人用禽流感病毒裂解疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，其特征在于首先加入吐溫80分散病毒，以乙醚作為裂解劑，該方法作用緩和，裂解劑易于去除，所制備的疫苗具有卵清蛋白含量低、安全性高等優(yōu)勢(shì)。文檔編號(hào)C12N7/02GK101633912SQ20081013219公開(kāi)日2010年1月27日申請(qǐng)日期2008年7月22日優(yōu)先權(quán)日2008年7月22日發(fā)明者傅連弟,蕾周,李衛(wèi)東,屹楊,王敏文,王飛宇,飛聶,彬趙,郭文軍,閆昆明,楠陳,魏傳忠申請(qǐng)人:大連雅立峰生物制藥有限公司