一株h9n2型禽流感毒株在疫苗開(kāi)發(fā)上的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一株雞源H9N2禽流感病毒毒株的分離與鑒定以及在疫苗開(kāi)發(fā)上的應(yīng)用。禽流感A型流感病毒H9N2亞型，已于2012年10月17日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)：CGMCC?No.6659。本發(fā)明提供的禽流感A型流感病毒H9N2亞型株經(jīng)過(guò)雞胚擴(kuò)增，利用甲醛滅活，與新型605佐劑混合制備成滅活疫苗后，經(jīng)過(guò)血清學(xué)方法和免疫攻毒法進(jìn)行免疫評(píng)估，并且比市場(chǎng)商品苗(禽流感病毒SS株，F(xiàn)株，HP株)產(chǎn)生抗體時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，在最高峰產(chǎn)生的抗體水平較高，對(duì)禽群具有很好的保護(hù)效果。本發(fā)明對(duì)于禽流感病毒的防治具有重要的價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一株H9N2型禽流感毒株在疫苗開(kāi)發(fā)上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株的分離與鑒定及利用該毒株制備用的預(yù)防禽流感的滅活疫苗。
技術(shù)背景[0002]禽流感病毒(AIV)屬于正粘病毒科流感病毒屬成員。根據(jù)流感病毒的核蛋白和基質(zhì)蛋白的不同，可分為A、B、C三種血清型。禽流感病毒屬于A型流感病毒。A型流感病毒粒子呈球形，直徑IOOnm左右。病毒具有囊膜，囊膜上有12~14nm的纖突，有兩種不同類(lèi)型即HA和NA。病毒的核衣殼呈螺旋對(duì)稱(chēng)，核酸為單股負(fù)鏈RNA，可分成8個(gè)片段，總長(zhǎng)約13.6kb。禽流感病毒的囊膜表面具有血凝素(HA)，能夠凝集多種動(dòng)物的紅細(xì)胞，并且能被特異的抗血清所抑制。AIV根據(jù)其致病性可分為高致病性AIV和低致病性AIV，感染家禽的高致病性和低致病性AIV分別以H5和H9為主。
[0003]H9N2亞型禽流感病毒在世界范圍內(nèi)廣泛存在，是當(dāng)前禽流感流行的主要型別之一。H9N2亞型禽流感最早在北美的火雞體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，1994年我國(guó)家禽中開(kāi)始出現(xiàn)。此型禽流感呈地方性流行、持續(xù)存在等特征，嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。H9N2屬于低致病性禽流感毒株，感染后并不一定造成禽群的大規(guī)模的死亡，但會(huì)使禽群的免疫力下降，對(duì)各種病原的抵抗力降低，常常易發(fā)生并發(fā)或繼發(fā)感染。H9N2的感染主要引起呼吸道感染或產(chǎn)蛋率下降等癥狀，當(dāng)伴有其他病原感染后，主要引起青年雞、產(chǎn)蛋雞的呼吸道、生殖道、腎或胰腺的嚴(yán)重?fù)p傷。所以低致病性的禽流感同樣對(duì)養(yǎng)禽業(yè)存在著嚴(yán)重的威脅。我國(guó)在禽流感的防控中采取了疫苗免疫和撲殺的政策，實(shí)踐表明該政策對(duì)控制禽流感的大規(guī)模流行起到了重要作用，所以選擇免疫保護(hù)力好的H9N2禽流感病毒疫苗株，才能使得疫苗的免疫效果得到保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株的分離與鑒定及利用該毒株制備用的預(yù)防禽流感的滅活疫苗，所制備的疫苗是針對(duì)禽H9N2亞型流感病毒的疫苗。
[0005]禽H9N2亞型流感病毒已于2012年I月9日由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定，命名為禽流感A型流感病毒H9N2亞型。該毒株于2012年10月17日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)06110:，地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC N0.6659。禽流感A型流感病毒H9N2亞型CGMCCN0.6659 簡(jiǎn)稱(chēng)為 AIV-JD 株。
[0006]本發(fā)明中制備禽流感病毒疫苗，其有效成分為滅活后的AIV-JD株病毒。所制備的疫苗是針對(duì)禽H9N2亞型流感病毒的疫苗。所述禽流感疫苗的制備方法包括AIV-JD株病毒液的滅活終濃度0.2%的甲醛，37°C滅活24h，滅活液與新型605佐劑4: 6的混合，得到禽流感病毒滅活苗。
[0007]本發(fā)明中制備禽流感疫苗，利用血清學(xué)方法和免疫攻毒法評(píng)估疫苗的免疫效果，結(jié)果顯示，本發(fā)明中制備的禽流感滅活疫苗疫苗對(duì)禽具有很好的保護(hù)力。
【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例1
[0009]AIV-JD株的分離與鑒定
[0010]1.病毒分離
[0011]將采集的喉頭、氣管和肺臟混合、剪碎、研磨，按W/V為1: 5比例用無(wú)菌PBS稀釋,4000rpm離心IOmin,取上清液過(guò)濾,經(jīng)尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚。雞胚接種后置37°C孵化器繼續(xù)孵化，孵育24h后觀察雞胚存活情況，24小時(shí)內(nèi)死亡雞胚視為非特異死亡，棄去不用，連續(xù)孵化96小時(shí)，收獲尿囊液。
[0012]2.病毒的鑒定
[0013]2.1 血凝試驗(yàn)(HA)
[0014]將收集的尿囊液作為被檢樣品，進(jìn)行HA試驗(yàn)，觀察凝集反應(yīng)，試驗(yàn)設(shè)PBS陰性對(duì)照。血凝價(jià)大于1: 16判定為陽(yáng)性。結(jié)果顯示，雞胚尿囊液對(duì)I %雞紅細(xì)胞的凝集效價(jià)為
I: 1024。
[0015]2.2血凝抑制試驗(yàn)(HI)
[0016]根據(jù)凝集試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果，用滅菌PBS配制4個(gè)工作單位的抗原。用PBS(pH7.0~
7.2)分別將禽流感Hl~H16亞型、新城疫陽(yáng)性血清及SPF雞陰性血清做連續(xù)倍比稀釋后，做HI試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離毒株禽流感Hl~H8和HlO~H16及新城疫陽(yáng)性血清、陰性血清均沒(méi)有交叉反應(yīng)，而與H9亞型禽流感抗血清有交叉反應(yīng)(I: 256)。
[0017]2.3病毒神經(jīng)氨酸酶活性測(cè)定(NA)
[0018]取1.5ml管9支，2~9#每管加入10ulPBS(pH5.9)，1#管加入20ul病毒，2~8#管依次進(jìn)行倍比稀釋1: 2、1: 4、1: 8直至1: 128，9#管為對(duì)照管；每管加入20ul胎蛋白工作液，充分振蕩，37°C水浴16~18小時(shí)；從水浴中取出試管，室溫冷卻，每管加入20ul過(guò)碘酸鈉，充分混合，室溫孵育30min ;每管加入200ul砷試劑，混勻；硫代巴比妥酸試劑加熱溶解，每管加入500ul，混勻；將試管置于水浴中煮沸10~15min，取出后觀察顏色變化，粉紅色代表具有神經(jīng)氨酸酶活性，淡粉色表示有部分活性，淺黃色或無(wú)色代表沒(méi)有活性，顏色改變的前一管的稀釋度為I個(gè)酶單位。結(jié)果顯示，底物對(duì)照組呈白色，其余各管隨樣品稀釋度升高，顏色逐漸從粉紅色向白色改變，試驗(yàn)結(jié)果成立。病毒在1: 64稀釋度顏色明顯改變?yōu)榈凵?，判定該毒株酶活性?: 32。
[0019]2.4病毒神經(jīng)氨酸酶活性抑制試驗(yàn)(NI)
[0020]血清滅活:56°C滅活30分鐘；取1.5ml管12支，I~9#管為陽(yáng)性血清管，每管分別加入IOulNl~N9陽(yáng)性分型血清，10#管加入IOul陰性血清，11#管加入30ulPBS, 12#管為病毒對(duì)照管；病毒配制成I個(gè)酶單位，向I~10#和12#管內(nèi)加入20ul病毒,37°C作用30~60min ;取出加入20ul胎蛋白，充分混合，37°C作用16~18小時(shí)；取出，室溫冷卻，每管加入20ul過(guò)碘酸鈉，混勻，室溫作用20min ;每管加入200ul砷試劑，混勻；每管加入500ul硫代巴比妥酸，混勻；置于沸水浴中10~15分鐘，取出后立即觀察顏色，判定病毒活性。粉紅色代表病毒神經(jīng)氨酸酶活性沒(méi)有受到抑制，判為陰性，淺黃色或無(wú)色代表病毒神經(jīng)氨酸酶活性受到抑制，判為陽(yáng)性。結(jié)果顯示，PBS對(duì)照管呈白色，陰性血清對(duì)照管、I個(gè)酶單位病毒管呈粉紅色，試驗(yàn)結(jié)果成立。N2亞型陽(yáng)性血清可以完全抑制I個(gè)酶單位病毒活性，而N1、N3~N9亞型陽(yáng)性血清均不能抑制病毒的酶活性。
[0021]2.5病毒回歸試驗(yàn)
[0022]用PBS將分離的病毒100倍稀釋?zhuān)?.5ml/只的劑量經(jīng)滴鼻途徑接種10只SPF雞，將試驗(yàn)雞置于SPF雞隔離器中飼養(yǎng)。攻毒后5天采集咽拭子，接種SPF雞胚，進(jìn)行病毒重分離。攻毒后14天采血分離血清，利用禽流感分型抗原進(jìn)行血清HI抗體效價(jià)測(cè)定。結(jié)果表明，病毒接種SPF雞后5天，10只SPF雞的病毒分離陽(yáng)性率為100% (10/10)。攻毒后14天，10只SPF雞的血清僅與H9N2亞型HI抗原發(fā)生特異性反應(yīng)。
[0023]結(jié)果顯示，分離到一株H9N2亞型禽流感病毒。
[0024]實(shí)施例2
[0025]AIV-JD株種毒的制備
[0026]禽流感病毒AIV-JD株毒種制備將種毒用生理鹽水作10_3稀釋?zhuān)蚰仪粌?nèi)接種9日齡SPF雞胚，每胚0.1ml0接種后持續(xù)觀察雞胚，棄去48h死亡的雞胚，選取48~96h內(nèi)死亡的雞胚，分別收獲雞胚液(尿囊液及羊水)，裝入滅菌處理的容器中。對(duì)收集的雞胚液進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)和血凝價(jià)檢測(cè)，對(duì)無(wú)菌檢測(cè)合格和血凝價(jià)不低于1: 256 (微量法)的雞胚液混合，分裝于鹽水瓶中，冷凍保存，注明收獲日期及毒種代次。
[0027]實(shí)施例3
[0028]AIV-JD株制苗用病毒液 的制備
[0029]取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作10_3稀釋?zhuān)臃N9日齡SPF雞胚，每胚尿囊腔內(nèi)接種0.1ml，接種后密封針孔，置37°C繼續(xù)孵育，不必翻蛋。雞胚接種后，每日照蛋I次，將48小時(shí)前死亡的雞胚奔去。此后每4~6小時(shí)照蛋I次,死亡的雞胚隨時(shí)取出，直至96小時(shí)，不論死亡與否，全部取出，氣室向上垂直，置于2~8°C冷卻24小時(shí)。將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無(wú)菌手術(shù)剝除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜，吸取胚液。對(duì)每個(gè)雞胚在吸取胚液前均應(yīng)注意檢查，凡胎兒腐敗，胚液混濁及有任何污染可疑者，棄去不用。死胚和活胚分別收獲，每若干個(gè)雞胚分為一組，吸取胚液放于同一滅菌容器內(nèi)，每組抽樣測(cè)定血凝價(jià)，血凝價(jià)低于1: 256(微量法)者應(yīng)奔去。同時(shí)作無(wú)菌檢查，應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。收獲的胚液滅活前在2~8 °C左右保存，應(yīng)不超過(guò)5日。
[0030]實(shí)施例4
[0031]AIV-JD病毒液的滅活及半成品檢驗(yàn)與疫苗的制備
[0032]1.將收獲的無(wú)菌胚液以4層紗布及一層細(xì)銅紗網(wǎng)濾過(guò)，混合于一個(gè)大玻璃瓶?jī)?nèi)，吸出數(shù)毫升樣品備測(cè)毒價(jià)。其余胚液和雞胚浸出液分別計(jì)量加入10%的甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0.2%。加甲醛溶液后最好傾倒另一瓶中，以避免瓶頸附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。然后37°C滅活24小時(shí)(以瓶?jī)?nèi)溫度達(dá)到37°C開(kāi)始計(jì)時(shí))。期間震搖3~4次。在2~8°C保存，應(yīng)不超過(guò)I個(gè)月。
[0033]2.取滅活胚液按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄方法進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0034]3.滅活檢驗(yàn)取10日齡無(wú)禽流感病毒抗體的雞胚10枚，每胚接種0.2ml，置37°C繼續(xù)孵育，剔除24h內(nèi)死亡雞胚，觀察5日，雞胚非特異性死亡不應(yīng)超過(guò)2枚。收獲所有雞胚的胚液，然后觀察雞胚的胎兒病變，應(yīng)全部為陰性。對(duì)所有胚液分別測(cè)定血凝價(jià)，應(yīng)均不出現(xiàn)血凝，認(rèn)為滅活完全。[0035]4.毒價(jià)測(cè)定將滅活前取出的胚液進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)?0(-6)、10(-7)、10(-8)3個(gè)稀釋度分別接種9日齡無(wú)雞禽流感病毒抗體的雞胚5個(gè)，每胚尿囊液內(nèi)0.1ml，每日照蛋2次，觀察5日，無(wú)論死胚、活胚均應(yīng)測(cè)定血凝價(jià)，血凝價(jià)≥ 1: 64(微量法)以上者判為感染，計(jì)算EID5tl，每0.1ml病毒含量應(yīng)≥107°EID5Q，方可用于制苗。
[0036]5.滅活疫苗制備將605佐劑按照各種物質(zhì)配比后，混勻，高壓滅菌4度保存?zhèn)溆谩缁钋萘鞲胁《疽号c佐劑按照4:6比例進(jìn)行混合。
[0037]表1:滅活疫苗的組份
[0038]
【權(quán)利要求】
1.禽流感H9N2亞型病毒AIV-JD株，保藏號(hào)為CGMCCN0.6659。
2.采用禽流感H9N2亞型病毒AIV-JD株制備禽流感滅活疫苗，用于預(yù)防H9亞型禽流感，有效成分為滅活后的AIV-JD株病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述禽流感滅活疫苗的制備方法，其特征在于采用所述AIV-JD株病毒接種雞胚培養(yǎng)，收獲感染的胚液，經(jīng)甲醛滅活后與新型無(wú)油佐劑按照4: 6的比例混合制備而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述禽流感滅活疫苗制備方法，其特征在于采用以下方法制備的新型無(wú)油佐劑作為禽流感滅活疫苗專(zhuān)用佐劑:取磷酸氫二鈉2~5g、磷酸二氫鉀0.2~lg、氯化鈉3~10g、海藻糖2~10g、黃苗多糖2~10g、谷氨酸鈉I~5g、明膠5~20g、聚乙二醇3000 3~IOg,葡聚糖I~5g溶解于1000ml注射用水中，采用均質(zhì)機(jī)處理后,經(jīng)121°C,高壓滅菌20min后備用。具 體實(shí)施方法參照本公司專(zhuān)利:新型無(wú)油佐劑制備方法及用途。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103497933SQ201310323864
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】江厚生, 王秀敏, 趙 卓, 尚川川, 張金龍, 王健, 鄧玉芹, 周瑞杰, 王力 申請(qǐng)人:北京華夏興洋生物科技有限公司