專利名稱：轉(zhuǎn)基因鹽藻制備口服型禽流感疫苗的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微藻(鹽藻)基因工程，尤其是一種轉(zhuǎn)基因鹽藻制備口服型禽流感疫苗 的方法，具體是將鹽藻自身的調(diào)控元件引入并構建高效表達載體，建立高效的禽流感病毒 基因表達系統(tǒng)，為口服型疫苗的生產(chǎn)提供了技術平臺。
背景技術：
禽流感(Avian influenza, Al)是由流感病毒引起的一種以侵害呼吸系統(tǒng)為主 的疾病，自1878年在意大利發(fā)現(xiàn)至今已有一百多年的歷史，由于候鳥的遷徙，該病毒在全 球范圍內(nèi)擴散，給人類健康和畜禽業(yè)生產(chǎn)帶來了極大的危害。中國是第一養(yǎng)禽大國，養(yǎng)禽總 量達130億羽，同時我國具有禽類較多，水禽分布廣泛，飼養(yǎng)粗放、開放，能與野生鳥類密切 接觸的特點，是禽流感多發(fā)、受到嚴重危害和威脅的國家之一。國內(nèi)外的禽流感防治實踐表明，疫苗免疫是防止禽流感暴發(fā)和造成巨大損失的主 要措施和關鍵環(huán)節(jié)。20世紀生物技術的飛躍發(fā)展，促進了疫苗學的形成與發(fā)展，以疫苗等 生物制品為中心的生物技術研究已經(jīng)成為全球發(fā)展最快的領域之一，而疫苗學在預防禽流 感中所起到的作用也是世人所矚目的。目前，應用的禽流感常規(guī)疫苗主要是滅活疫苗。近 20年來，滅活疫苗的制備技術不斷改進，并已經(jīng)廣泛應用于禽的免疫，大量的臨床試驗已 證實其可以有效地阻止臨床發(fā)病和死亡。業(yè)已證明，疫苗免疫預防是控制禽流感最經(jīng)濟和 有效的途徑。據(jù)報道通過禽流感疫苗免疫接種預防，每年至少可減少經(jīng)濟損失300億元以 上。傳統(tǒng)疫苗預防控制禽流感雖然經(jīng)濟、有效，但其制造方法、免疫程序及免疫效果的 可靠性，大面積應用的可行性及動物安全性，均存在不少缺陷，而且其制造成本高，需要用 耗時長的注射方式接種。據(jù)報道目前所采用的肌肉注射疫苗的方式必須對每只禽類進行注 射，每次注射要花半分鐘時間，一個規(guī)模2萬只的養(yǎng)雞場每次疫苗接種就需要用7天。而使 用可摻和在飼料中禽流感口服疫苗，能同時為上千只禽類進行接種，用20分鐘時間就能為 整個養(yǎng)雞場接種疫苗。最近，俄羅斯圣彼得堡全俄家養(yǎng)禽獸醫(yī)科研所和俄羅斯醫(yī)學科學院 圣彼得堡流感研究所的科學家，曾經(jīng)研究可摻和在飼料中的口服禽流感(H5N1)疫苗。國內(nèi) 學者通過農(nóng)桿菌介導的方法將禽流感病毒H5W的HA基因轉(zhuǎn)化煙草，檢測到HA基因在轉(zhuǎn)基 因煙草中得到表達，獲得了能夠表達HA基因的植物口服疫苗候選植株。為發(fā)展轉(zhuǎn)基因植物 生產(chǎn)禽流感口服疫苗開辟了新途徑。與微生物發(fā)酵、動物細胞和轉(zhuǎn)基因動物等生產(chǎn)系統(tǒng)相比，轉(zhuǎn)基因植物制備的口服 疫苗具有許多潛在的優(yōu)勢，特別是利用可食性植物如蔬菜、水果等生產(chǎn)口服型疫苗，由于可 大規(guī)模種植、生產(chǎn)成本低廉，又不涉及有關轉(zhuǎn)基因動物的倫理道德問題，受到廣泛重視和研 究。但是，這些植物生長受季節(jié)性限制，而且即使是可直接食用的水果、蔬菜也不可能經(jīng)常 生食，加之食用不方便，因此不可能在人群尤其兒童中廣泛推廣。此外，植物源疫苗還存在 生物安全性問題，如轉(zhuǎn)基因植物中外源基因有可能漂移到環(huán)境中使生態(tài)環(huán)境受到破壞以及 近緣植物之間交叉授粉是否會導致野生種的雜草化、攜帶抗生素或除草劑類選擇性標記基因的轉(zhuǎn)基因植物是否安全等。可見尋找環(huán)保、安全和便于食用的植物作為轉(zhuǎn)基因制備口服 疫苗的宿主是非常必要的。杜氏鹽藻(以下簡稱鹽藻)屬綠藻門團藻目，是一種原生質(zhì)裸露的嗜鹽性浮游單細 胞真核綠藻，長約6 15 μ m，呈橢圓形或梨形，無細胞壁只有細胞膜，且有雙鞭毛，能在水 中游動，有一個大型杯狀葉綠體約占細胞體積的48%左右，兼具動植物細胞的生物學特點。 該藻的突出優(yōu)點在于培養(yǎng)條件極其簡單，光合自養(yǎng)，抗逆性極佳，可在0. 05 5M的鹽水中 生長?；邴}藻的這些生物學特點，轉(zhuǎn)基因鹽藻生物反應器比傳統(tǒng)的生物反應器更具有優(yōu) 越性
①鹽藻為單細胞生物，繁殖快，無季節(jié)性生長限制，便于遺傳突變體的篩選。②遺傳操作比較容易鹽藻屬于低等的真核綠藻，結(jié)構簡單，無細胞壁，而且基因 組相對較小。③成本低鹽藻屬自養(yǎng)生物，不需要昂貴的培養(yǎng)基，只需適宜的光照，溫度和無機 鹽，培養(yǎng)成本低廉。鹽藻可在高滲鹽培液中生長，這是許多其它生物難以生存的環(huán)境，故其 大規(guī)模培養(yǎng)不需昂貴的發(fā)酵罐等設備，可直接采用開放式培養(yǎng)，因此生產(chǎn)成本低。④保證產(chǎn)品的活性和質(zhì)量鹽藻為真核生物，其表達產(chǎn)物可自行完成翻譯后加工， 如二硫鍵形成，蛋白質(zhì)糖基化等，因此簡化了基因工程技術下游工藝并能保證產(chǎn)品的活性 和質(zhì)量。⑤鹽藻的培養(yǎng)可采用易于控制的培養(yǎng)方法，可避免轉(zhuǎn)基因植物因近緣物種間交叉 授粉可能導致的野生種的雜草化或因外源基因漂移使生態(tài)環(huán)境受到破壞等生物安全性問 題。⑥鹽藻本身無毒，而且富含多種天然維生素和多不飽和脂肪酸，食用價值高。如果 用鹽藻生產(chǎn)口服型疫苗，甚至無須純化即可直接服用，大大降低生產(chǎn)成本。因此，利用轉(zhuǎn)基 因鹽藻大規(guī)模生產(chǎn)供人/禽用的口服型疫苗，具有明顯優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種克服上述缺陷的動物用的口服型禽流感疫苗。本發(fā)明所 提供的一種基因工程疫苗制備方法，主要是利用鹽藻固有的生物學特點，將鹽藻自身的調(diào) 控元件引入并構建高效表達載體，建立禽流感病毒基因表達系統(tǒng)，為更加經(jīng)濟地制備口服 型疫苗提供了平臺。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因鹽藻制備口服型禽流感疫苗的方法，是將鹽藻自身的調(diào)控元件引 入并構建含有禽流感病毒HA、NA重組基因的雙元表達載體，然后轉(zhuǎn)化鹽藻，經(jīng)篩選和鑒定， 確定高表達重組C3d-H5m融合蛋白的鹽藻轉(zhuǎn)化藻株。再通過穩(wěn)定表達C3d-H5m融合蛋白 轉(zhuǎn)化藻株的放大培養(yǎng)，制備成口服用禽流感疫苗。將鹽藻自身的調(diào)控元件引入并構建含有禽流感病毒HA重組基因的雙元表達載體 的具體方法包括
①中間載體p7-Pnr-nr-Tnr的構建利用鹽藻硝酸鹽還原酶(NR)基因5，上游序列 (Pnr)和3’端序列(Tnr)分別作為啟動子和終止子，以鹽藻NR基因為選擇標記基因，構建 含Pnr-nr-Tnr篩選標記表達盒的中間載體；
②中間載體pACtin-C3d-H5m的構建將小鼠補體C3d基因片段和禽流感病毒H5N1血凝素(HA)基因、神經(jīng)氨酸酶(NA)基因順序連接成C3d-H5m融合基因；以鹽藻actin 基因啟動子(Pat)和終止子(Tat)為表達調(diào)控元件，構建含Pat-C3d-H5N1-Tat表達盒的中 間載體 pActin-C3d-H5m ；
③鹽藻雙元表達載體PMNCH的構建利用鹽藻DSMl序列，構建含兩個同向的MAR序列 的中間載體PDMM。將Pnr-nr-Tnr表達盒和Pat-C3d-H5Nl_Tat表達盒順序連接、插入到兩 個同向MAR序列之間，構建高效的禽流感疫苗基因鹽藻雙元表達載體pMNCH。該制備方法還包括檢測由這種轉(zhuǎn)化藻株制備的口服疫苗對禽類的免疫效力及免 疫保護維持時間。本發(fā)明的優(yōu)點在于通過基因工程技術，建立了能夠高表達重組C3d_ H5N1融合 蛋白的鹽藻轉(zhuǎn)化藻株，這種轉(zhuǎn)化藻株適用于開放式培養(yǎng)，因此產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低，從而實 現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鹽藻制備口服型動物禽流感疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)，滿足市場需求。


圖1禽流感疫苗HA和NA基因鹽藻雙元表達載體pMNCH的構建模式圖 Pnr-nr-Tnr 氮源可控性篩選標記表達盒
C-HN 分子免疫佐劑C3d基因和HA和NA基因的融合基因 MAR序列利于定點整合，提高表達效率和降低轉(zhuǎn)基因沉默 圖2.禽流感疫苗HA和NA基因鹽藻雙元表達載體pMNCH的構建流程圖
具體實施例方式本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因鹽藻制備口服型禽流感疫苗方法，是采用基因工程等方法獲 得的禽流感病毒HA、NA基因的重組基因構建鹽藻雙元表達載體，然后轉(zhuǎn)化鹽藻，再通過篩 選和鑒定，確定高表達重組C3d-H5m融合蛋白的鹽藻轉(zhuǎn)化藻株。繼之大規(guī)模培養(yǎng)轉(zhuǎn)化藻 株，離心收集藻細胞，冷凍干燥，無菌條件下分裝、制備成口服用禽流感疫苗膠囊。下面通過結(jié)合實施例詳細敘述本發(fā)明的具體內(nèi)容 實施例1、禽流感病毒HA基因鹽藻表達載體的構建
(1)鹽藻硝酸鹽還原酶(NR)基因cDNA的克隆與鑒定取10 ml生長至對數(shù)生長期 的杜氏鹽藻細胞，按Trizol說明書提取總RNA，電泳分析其完整性，測純度，定量。按逆轉(zhuǎn) 錄酶試劑操作說明合成cDNA。根據(jù)GenBank登錄的鹽藻NR cDNA序列(GenBank登錄號 AY312143. 1)，設計引物如下
nrl5‘ -atgcccgcactcgccaacaacaca-3‘； nr25‘ -tcagaagctcaccgtgcgctcttt-3‘ 以cDNA為模板，擴增鹽藻NR基因，PCR反應體系為94 °C預變性2. 5 min, 94 °C變性 45 s, 50 °C退火1 min，72 °C延伸1.5 min，共30個循環(huán)，72 °C延伸5 min，4°C終止反應。 產(chǎn)物克隆到PMD18-T載體上，挑選酶切鑒定正確的克隆進行測序。(2)鹽藻基因組DNA的提取取對數(shù)生長期的鹽藻10 ml，5000 r/min離心15 min，棄上清，利用修飾的SDS法提取鹽藻基因組DNA 加SDS裂解緩沖液(Tris-HCl 10 mmol/L, EDTA 100 mmol/L SDS 0. 5%) 3 mL，37°C 1 h ；加蛋白酶 K 至終濃度 100 μ g/ml，用寬口徑移液管上下移取溶液5次，當樣品呈透明狀時，才能進行下一步，否則，顆粒碎片在 隨后的提取分離中得到捕獲，50°C水浴3 h。室溫冷卻，加等體積的酚/氯仿異戊醇(體積 比25 :24 :1)混勻，12000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至另一離心管，重復抽提兩次。加 Λ 1/12體積的5 mol/L NaCl，加入2. 5倍冷無水乙醇，4°C放置10 min, 12000 r/min離心 10 min, 70%乙醇洗去沉淀鹽類，12000 r/min離心10 min，吹干沉淀，加60 μ 1無菌超純水 溶解，最后經(jīng)RNase A消化去除RNA。各取3 μ 1基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳并測其OD 260/280，檢查其純度及含量。(3)PCR擴增鹽藻NR基因5'及3'側(cè)翼區(qū)根據(jù)GenBank登錄的鹽藻NR基因 5'及 3'側(cè)翼區(qū)序列(GenBank 登錄號DQ217416. 1、EF156403. 1 和 EF535104. 1)，合
成如下引物
Pnrl5‘ -agccttcagcttagacagcatcatctcg-3‘； Pnr25‘ -gtgttgttggcgagtgcgggcat-3‘； Tnrl5‘ -atctctttcatttcagtatcagga-3‘； Tnr25‘ -tcgatcagcctttgcaatccctc-3‘ 以上述鹽藻基因組DNA為模板，分別以Pnrl和Pnr2為引物進行PCR擴增鹽藻NR基因 5'側(cè)翼區(qū)；以Tnrl和Tnr2為引物進行PCR擴增鹽藻NR基因3'側(cè)翼區(qū)。PCR反應條件為94°C 30 s，55°C 2 min，72°C 1 min，29個循環(huán)；將產(chǎn)物克隆到 PMD18-T載體上，挑選酶切鑒定正確的克隆進行測序。(4)中間載體p7-Pnr-nr-Tnr的構建利用上述已克隆并鑒定的鹽藻NR基因5， 上游序列(Pnr)和3’端序列(Tnr)分別作為啟動子和終止子，以鹽藻硝酸鹽還原酶(NR) 基因為選擇標記基因，將Pnr、NR基因和Tnr切下、補平，順序連接成Pnr-nr-Tnr表達盒，并 在表達盒的上下游均引入損ο I位點，連接入質(zhì)粒pGEM-7zf(+) (Promega公司)的損ο I 位點，構建中間載體p7-Pnr-nr-Tnr。(5)小鼠補體C3d基因片段和禽流感病毒H5W血凝素(HA)基因、神經(jīng)氨酸酶 (NA)基因的克隆及C3d-HANA融合基因的連接取BALB/c小鼠新鮮肝臟5g，勻漿后抽提 mRNA,電泳分析其完整性，測純度，定量。按逆轉(zhuǎn)錄酶試劑操作說明合成cDNA。根據(jù)GenBank 登錄的小鼠補體C3d基因片段的序列(GenBank登錄號DQ408205. 1)，設計引物如下
cdl5‘ -acccccgcaggctgtggggaacagca-3‘； cd2:5' -gctacggctggggaggtggaagga-3, 以小鼠肝臟cDNA為模板，擴增補體C3d基因片段(897 bp)，PCR反應體系為94 ！預 變性 2.5 min, 94 °C 變性 45 s，50 °C 退火 1 min，72 °C 延伸 1. 5 min，共 30 個循環(huán)，72 V 延伸5 min, 4 °C終止反應。產(chǎn)物克隆到pMD18_T載體上，挑選酶切鑒定正確的克隆進行測 序。根據(jù)GenBank登錄的禽流感病毒H5M血凝素(HA)基因、神經(jīng)氨酸酶(NA)基因的 序列(GenBank登錄號HQ200450. 1和HQ200451. 1)，設計引物如下
hal5‘ -atagtgcttctttttgcgatag-3‘； ha25‘ -aatgcaaattctgcattgtaacg-3 ‘； nal5‘ -ccaaatcagaagataataaccat-3‘； na25‘ -cttgtcaatggtgaatggcaactc-3‘以禽流感病毒H5m標準株，抽提RNA，按逆轉(zhuǎn)錄酶試劑操作說明合成cDNA。以cDNA為 模板，分別擴增擴增禽流感病毒H5W HA基因和NA基因，PCR反應體系為94 °C預變性2. 5 min，94 °C變性45 s，50 °C退火 1 min，72 °C延伸 1. 5 min，共 30個循環(huán)，72 °C延伸 5 min, 4 °C終止反應。產(chǎn)物克隆到PMD18-T載體上，挑選酶切鑒定正確的克隆進行測序。將上述已克隆并鑒定的小鼠補體C3d基因片段和禽流感病毒H5W血凝素(HA)基 因、神經(jīng)氨酸酶(NA)基因從克隆載體上切下、補平，順序連接成C3d-H5m融合基因。(6)PCR擴增鹽藻肌動蛋白(actin)基因5'及3'側(cè)翼區(qū)根據(jù)本發(fā)明人從前 的研究(Acta Genetica Sinica，2005，32 424 — 433)和 GenBank 登錄的鹽藻 actin 基因 5'及3'側(cè)翼區(qū)序列(GenBank登錄號AF539623. 1和AF163669. 2)，合成如下引物
Patl:5' -tcaccatcttgtttcccgagctag-3‘； Pat25‘ -tctgtcaccccttccctacgcgt-3‘； Tatl:5' -catccaatttcaagtaactccaatc-3‘； Tat25‘ -gaatccaactcctccctgggagc-3‘ 以上述鹽藻基因組DNA為模板，分別以Patl和Pat2為引物進行PCR擴增鹽藻actin 基因5'側(cè)翼區(qū)；以Tatl和Tat2為引物進行PCR擴增鹽藻actin基因3'側(cè)翼區(qū)。PCR 反應體系為 94 °C預變性 2. 5 min, 94 °C變性 45 s，50 °C退火 1 min，72 "C 延伸1.5 min，共同30個循環(huán)，72 °C延伸5 min, 4 °C終止反應。產(chǎn)物克隆到pMD18_T載體 上，挑選酶切鑒定正確的克隆進行測序。(7 )中間載體pActin-C3d-H5Nl的構建利用上述已克隆并鑒定的鹽藻 actin基因5'側(cè)翼區(qū)(Pat)和actin基因3'側(cè)翼區(qū)(Tat)分別作為啟動子和終止子，以 C3d-H5N1融合基因為外源基因，將Pat序列、C3d-H5N1融合基因、Tat序列切下、補平，順 序連接成Pat-C3d-H5N1-Tat表達盒，并在表達盒的上下游均引入損a I位點，連接入質(zhì)粒 PUC18的Xba I位點，構成中間載體pActin-C3d_H5m。(8)鹽藻核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)片段DSMl序列的克隆根據(jù)GenBank登錄的鹽 藻核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)片段DSMl序列(GenBank登錄號AY583586. 1)，設計引物如下
MARl :5' -aaggttattgttaaagcggg-3‘； MAR2 :5' -aaggtttttttcgtaaagag-3‘ 以鹽藻基因組DNA為模板，PCR擴增鹽藻核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)片段DSMl序列。PCR反應條件為94°C 30 s，55°C 2 min，72°C 1 min，29個循環(huán)；將產(chǎn)物克隆到 PMD18-T載體上，挑選酶切鑒定正確的克隆進行測序。(9)中間載體pDMM的構建利用上述已克隆并鑒定的鹽藻DSMl序列，分別切 下、補平，同向連接到載體PUC18的Ι/Η η III位點，并在兩個序列間添加損a I和 Xho I位點，構建成含兩個同向的鹽藻DSMl序列的中間載體pDMM。(10)鹽藻雙元表達載體pMNCH的構建
將上述構建的中間載體p7-Pnr-nr-Tnr和pActin-C3d_H5m分別用Xho I切下 Pnr-nr-Tnr表達盒，用損a I切下Pat-C3d-H5Nl_Tat表達盒，再依次插入中間載體pDMM的 Xho I位點和損a I位點，酶切鑒定其方向，挑選片段方向與鹽藻DSMl序列相同的克隆，構 建成高效的禽流感基因鹽藻雙元表達載體PMNCH (圖1，2)。實施例2、轉(zhuǎn)化藻株的篩選和鑒定
(1)篩選將鹽藻高效表達載體PMNCH通過基因槍法轉(zhuǎn)化鹽藻硝酸鹽營養(yǎng)缺陷型藻株， 用接種環(huán)劃線于以硝酸鹽為唯一氮源的固體鹽藻培養(yǎng)基上，7天后觀察轉(zhuǎn)化細胞的生長情 況并計算轉(zhuǎn)化率。挑取在硝酸鹽為唯一氮源的鹽藻固體培養(yǎng)基上能夠恢復生長的單藻落細 胞，分別用液體鹽藻培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，進一步檢測和鑒定。(2)氯酸鹽毒性鑒定具有NR活性的鹽藻細胞因?qū)β人猁}毒性敏感而死亡，將轉(zhuǎn) 化的鹽藻細胞劃線于含有氯酸鹽的固體培養(yǎng)基上，觀察氯酸鹽對鹽藻轉(zhuǎn)化細胞的毒性。(3) Southern blots 利用修飾的SDS法提取鹽藻野生型和轉(zhuǎn)化株基因組DNA，將 轉(zhuǎn)化株和野生型基因組DNA分別用損a Ι,Η η III和I過夜酶切，鑒定酶切完全后， 配制無EB的0. 8%瓊脂糖凝膠，將酶切過的基因組點樣后電泳，分別與H5W基因探針和C3d 基因探針雜交，確定外源基因是否已整合入鹽藻基因組中。(4)實時熒光定量RT-PCR 根據(jù)表達載體上H5W和C3d基因序列設計引物，提取 各轉(zhuǎn)化株及對照藻株總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，應用實時熒光定量PCR法檢測 轉(zhuǎn)化鹽藻細胞H5m基因、C3d基因和C3d-H5m融合基因的mRNA表達，從而在轉(zhuǎn)錄水平分 析已轉(zhuǎn)化的鹽藻細胞外源基因的表達量。(5) Western blots 用蛋白裂解液提取生長至對數(shù)期的pMNCH載體轉(zhuǎn)化株細胞和 野生型的細胞總蛋白，用考馬斯亮藍標準曲線法測蛋白濃度，-20°C保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE 電泳及Western blots分析C3d_H5m融合蛋白的表達量。，并且將各轉(zhuǎn)化株用不同濃度的 NaCl誘導，分析重組C3d-H5m融合蛋白的誘導表達情況。(6) ELISA試驗在ELISA板的小孔中加入50 μ 1的蛋白提取液，按“禽流感病毒 H5m診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)”使用說明進行檢測。用酶標儀于450 nm處測量吸收值。
實施例3、鹽藻禽流感疫苗的免疫學實驗
(1)抗體產(chǎn)生試驗將80只35日齡試驗雞隨機分為4組，每組20只。I組拌料轉(zhuǎn)基 因鹽藻量為10g/KG ； II組拌料轉(zhuǎn)基因鹽藻量為5g/KG ；III組拌料轉(zhuǎn)基因鹽藻量為lg/KG ；IV 組(對照組)拌料野生型鹽藻量為10g/KG。免疫后分別在7、14、21、28、35、42和49天心臟 采血分離血清，測其血清HI抗體水平。①.血凝試驗采用96孔V型反應板，測定抗原效價
a.首先用微量移液器向反應板的每孔加生理鹽水25 μ 。b.用微量移液器吸取待測抗原25 μ 1于第一 1孔中并擠壓6次混合，后吸出25 μ 1至第2孔，依次倍比稀釋到第11孔，棄去25 μ 1。c.微量移液器再吸取1%紅細胞懸液依次加入各孔，每孔25 μ 1。d.置于微量振蕩器上振蕩1 min。e.室溫靜置30 min后觀察結(jié)果。f.結(jié)果觀察將反應板傾斜成45°，沉于孔底的紅細胞沿著傾斜面向下呈線狀流 動者為沉淀，表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻 薄層，傾斜后紅細胞不流動，說明紅細胞被病毒所凝集。能使雞紅細胞完全凝集的抗原的最 高稀釋倍數(shù)，稱為該抗原滴度紅細胞凝集效
4 U抗原校正
a.首先用微量移液器向反應板的第二孔至第六孔加生理鹽水25 μ 1。第1孔不加。b.用微量移液器吸取4 u抗原25μ1分別加入第1孔、第2孔中，從第2孔開始擠 壓6次混合，后吸出25 μ 1至第3孔，依次倍比稀釋到第5孔，棄去25 μ 1。c.用微量移液器再吸取1%紅細胞懸液依次加入1-6孔，每孔25 μ 1。d.于微量振蕩器上振蕩1 min。e.室溫靜置30 min后觀察結(jié)果。f.結(jié)果觀察第1、2、3孔為完全凝集，第4孔紅細胞為50%沉淀，第5孔為對照完 全沉淀，如果出現(xiàn)以上結(jié)果，表明所配4 u抗原準確，校正成立。@血凝抑制(HI)試驗每排孔檢查1份血清。步驟如下
a.用微量移液器先加25 μ 1生理鹽水于各孔中。b.用微量移液器吸取待檢血清25μ 1置于第1孔中，然后倍比稀釋至第11孔，棄 去25μ1。最后一孔不稀釋，作為對照。c.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25 μ 1。d.置于微量振蕩器上振蕩1 min，混合均勻。e.室溫下靜置20 min。f.每孔各加25 μ 1的1%紅細胞懸液。g.置于微量振蕩器上振蕩1 min，混合均勻。h.室溫靜置40 min后觀察結(jié)果。(2)攻毒保護試驗免疫后21天，4組雞同時用4-10倍稀釋的H5W尿囊液攻擊 (口服、滴鼻、點眼或肌注)，每只0.2 ml，隔離飼養(yǎng)，觀察14天，記錄發(fā)病及死亡雞數(shù)， 并剖檢病死雞的病理變化，觀察疫苗的保護效果。①免疫保護力產(chǎn)生時間的檢測
取80只35日齡試驗雞拌料轉(zhuǎn)基因鹽藻量為5g/KG;在免疫后的3、5、7、9、11、13和15 天各取出8只，同時用1 一 10倍稀釋的H5W尿囊液攻擊(口服、滴鼻、點眼、肌注)，每只 0. 2 ml,隔離飼養(yǎng)，觀察14天，記錄發(fā)病死亡情況，并剖檢病死雞的病理變化，觀察疫 苗的保護效果。@不同抗原含量的疫苗的免疫效力及免疫保護維持時間檢測
將240只180日齡試驗雞隨機分為四組，每組60只。I組拌料轉(zhuǎn)基因鹽藻量為IOg/ KG; II組拌料轉(zhuǎn)基因鹽藻量為5g/KG; III組拌料轉(zhuǎn)基因鹽藻量為lg/KG; IV組拌料野生型鹽 藻量為10g/KG。四組試驗雞在免疫后的21天、42天、84天、168天、252天和336天各取出 8只，同時用4 一 10倍稀釋的H5W尿囊液攻擊(口服、滴鼻、點眼、肌注)，每只0. 2 ml, 隔離飼養(yǎng)，觀察14天，記錄發(fā)病死亡情況，并剖檢病死雞的病理變化，觀察疫苗的保護 效果。
權利要求
一種轉(zhuǎn)基因鹽藻制備口服型禽流感疫苗的方法，其特征在于是將鹽藻自身的調(diào)控元件引入并構建含有禽流感病毒HA、NA重組基因的雙元表達載體，然后轉(zhuǎn)化鹽藻，經(jīng)篩選和鑒定，確定高表達重組C3d H5N1融合蛋白的鹽藻轉(zhuǎn)化藻株；再通過穩(wěn)定表達C3d H5N1融合蛋白轉(zhuǎn)化藻株的放大培養(yǎng)，制備成口服用禽流感疫苗。
2.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因鹽藻制備口服型禽流感疫苗方法，其特征在于鹽藻 自身的調(diào)控元件引入并構建含有禽流感病毒HA、NA重組基因的雙元表達載體的方法包括①中間載體p7-Pnr-nr-Tnr的構建利用鹽藻NR基因5，上游序列(Pnr)和3，端序 列(Tnr)分別作為啟動子和終止子，以鹽藻硝酸鹽還原酶(NR)基因為選擇標記基因，構建 含Pnr-nr-Tnr篩選標記表達盒的中間載體；②中間載體pActin-C3d-H5m的構建將小鼠補體C3d基因片段和禽流感病毒H5W血 凝素(HA)基因、神經(jīng)氨酸酶(NA)基因順序連接成C3d-H5m融合基因；以鹽藻actin基因 啟動子(Pat)和終止子(Tat)為表達調(diào)控元件，構建含Pat-C3d-H5N1-Tat表達盒的中間載 體pActin-C3d-H5Nl ；③鹽藻雙元表達載體PMNCH的構建利用鹽藻DSMl序列，構建含兩個同向的MAR序列 的中間載體PDMM ；將Pnr-nr-Tnr表達盒和Pat-C3d-H5Nl_Tat表達盒順序連接、插入到兩 個同向MAR序列之間，構建高效的禽流感疫苗基因鹽藻雙元表達載體pMNCH。
3.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因鹽藻制備口服型禽流感疫苗的方法，其特征在于該 制備方法還包括檢測由這種轉(zhuǎn)化藻株制備的口服疫苗對禽類的免疫效力及免疫保護維持 時間。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因鹽藻制備口服型禽流感疫苗的方法，尤其是將鹽藻自身的調(diào)控元件引入并構建含有禽流感病毒HA、NA重組基因的雙元表達載體，然后轉(zhuǎn)化鹽藻，經(jīng)篩選和鑒定，確定高表達重組C3d-H5N1融合蛋白的鹽藻轉(zhuǎn)化藻株。再通過穩(wěn)定表達C3d-H5N1融合蛋白轉(zhuǎn)化藻株的放大和大規(guī)模開放培養(yǎng)，離心收集藻細胞，冷凍干燥，無菌條件下分裝、制備成口服型禽流感疫苗膠囊。本方法制備的鹽藻轉(zhuǎn)化藻株，可供開放培養(yǎng)，因此產(chǎn)量高、成本低，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鹽藻制備口服型動物禽流感疫苗的規(guī)?；a(chǎn)，滿足市場需求。
文檔編號A61P31/16GK101954075SQ20101050508
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月13日 優(yōu)先權日2010年10月13日
發(fā)明者侯桂琴, 呂玉民, 李 杰, 潘衛(wèi)東, 薛樂勛 申請人:鄭州大學