專利名稱：：一種馬流感檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種馬流感檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，尤指采用快速的單重和雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的核苷酸序列、檢測(cè)試劑盒和方法，不僅適用于對(duì)動(dòng)物組織樣本中H3N8亞型馬流感病毒的準(zhǔn)確檢測(cè)，還可適用于動(dòng)物活體樣本(主要為鼻拭子)的檢測(cè)，可用于國(guó)內(nèi)馬科動(dòng)物H3N8亞型馬流感病毒的篩査，出入境馬匹檢疫等，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：馬流行性感冒(簡(jiǎn)稱馬流感)的病原為馬流行性感冒病毒(Equineinfluenza,EI)可引起馬的急性上呼吸道感染，特征性臨床癥狀為發(fā)燒、呼吸困難，厭食和持續(xù)性咳嗽；并可導(dǎo)致母馬流產(chǎn)；病理學(xué)表現(xiàn)為急性支氣管炎、細(xì)支氣管炎、間質(zhì)性肺炎，繼發(fā)感染可表現(xiàn)支氣管肺炎。根據(jù)HA和NA的不同，存在2個(gè)亞型的馬流感病毒可感染馬，即H7N7亞型(馬甲1型)和H3N8(馬甲2型)，但近20多年以來(lái)，世界范圍內(nèi)沒(méi)有再分離到馬甲1型病毒。馬甲1型原型毒株為A/Equine/Prague/1/56(H7N7)，為1956年從捷克斯洛伐克的馬體中分離；馬甲2型原型毒株為A/Equine/Miami/1/63(H3N8)，最早分自美國(guó)邁阿密州。自然條件下，只有馬屬動(dòng)物對(duì)馬流感病毒具有易感性，一般來(lái)講，沒(méi)有年齡、性別和品種的差別。本病傳染方式包括呼吸道(吸入含有病毒的飛沫)、消化道(病毒污染的飼料和飲水)與本交(康復(fù)公馬的精液長(zhǎng)期帶毒)，其中經(jīng)呼吸道傳染是本病主要的傳染方式。本病傳播極為迅速，呈暴發(fā)性流行，病毒傳入易感馬群，易感馬7天左右都可以感染發(fā)病。本病一年四季均可發(fā)生，我國(guó)北方地區(qū)春夏之交多發(fā)，有些地區(qū)則多發(fā)生于冬末春初，而另外一些地區(qū)流行和發(fā)生于夏季。病馬主要表現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽和流漿液性鼻液。馬流感主要有H7N7(馬1)和H3N8(馬2)兩個(gè)亞型，馬1于1956年在捷克首都布拉格馬群中暴發(fā)，馬2于1963年在美國(guó)邁阿密馬群中暴發(fā)，馬2型在多個(gè)國(guó)家暴發(fā)和流行。建國(guó)后，我國(guó)共有4次馬流感的大流行。第一次發(fā)生于1974年6月，新疆伊犁、博爾塔拉和塔城等地區(qū)暴發(fā)和蔓延到青海、內(nèi)蒙古、河北、福建等17個(gè)省、市和自治區(qū)，此次疫情為馬1型，這次疫情分離的毒株以A/馬/京防74-1為代表，該毒株與1956年國(guó)外首次發(fā)現(xiàn)并分離的代表株A/馬/l/布拉格/1/56(馬甲1型)抗原性相似，多年來(lái)未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外該亞型流感發(fā)病的報(bào)道；第二次疫情發(fā)生于1989年和1990年，發(fā)病率為81%，個(gè)別馬群的死亡率為20%，某縣病馬的死亡率高達(dá)35%。此次疫情中分離出的毒株為H3N8亞型的馬流感毒株(A/馬/吉林/1/89),該毒株的6個(gè)片段的基因與禽流感病毒有密切關(guān)系，文獻(xiàn)報(bào)道禽源流感病毒在馬群中傳播至少5年，發(fā)展趨勢(shì)難以預(yù)測(cè)(Binns等，1995);第三次大流行暴發(fā)于1993年，我國(guó)西北、華北和西南地區(qū)突然暴發(fā)了馬流感，從發(fā)病馬體內(nèi)分離出H3N8亞型馬流感病毒(A/馬/青海/1/94)。北京市10個(gè)區(qū)縣的18個(gè)鄉(xiāng)也發(fā)生92個(gè)疫點(diǎn)，發(fā)病馬7630匹，死亡28匹。1994年，北京市又有6個(gè)區(qū)縣的8個(gè)鄉(xiāng)發(fā)生30個(gè)疫點(diǎn)，發(fā)病馬1510匹，，死亡160匹(?？〗?、曹平，2005)。時(shí)隔13年，在馬匹的數(shù)量急劇減少的情況下，蒙古和我國(guó)再次暴發(fā)了H3N8亞型馬流感(馬2)。2007年11月中旬，華北某地區(qū)突然暴發(fā)H3N8亞型馬流感。歷史上，馬流感對(duì)比賽馬的影響主要有(1)1992年年底，香港賽馬盡管用疫苗進(jìn)行了免疫接種，但是仍暴發(fā)了H3N8亞型馬流感，對(duì)賽馬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Powell等，1992;Lai等，1992);(2)1986年，南非由于暴發(fā)馬流感，賽馬會(huì)被取消2個(gè)多月(Kawaoka等，1989)。由于國(guó)際間馬匹的流動(dòng)，容易將馬流感病毒引入到易感馬群而暴發(fā)馬流感，國(guó)際獸疫局(OfficeInternationaldesEpizootis,OIE)建議，沒(méi)有馬流感的國(guó)家在引入馬匹時(shí)，應(yīng)要求對(duì)馬流感流行地區(qū)的馬進(jìn)行疫苗免疫，并且在運(yùn)輸前28周進(jìn)行追加免疫一次(0xburgh等，1998)。鑒于目前世界范圍內(nèi)發(fā)生的馬流感均為H3N8亞型(馬甲2型)病毒引起，因此開展H3N8亞型(馬甲2型)馬流感病毒快速檢測(cè)技術(shù)研究。對(duì)于馬流感病原檢測(cè)，目前常用方法為病毒分離鑒定、抗原捕獲檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。病毒分離鑒定周期長(zhǎng)且存在生物安全問(wèn)題，抗原捕獲檢測(cè)方法的靈敏度較差。盡管普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的RT-PCR方法可以檢測(cè)病毒核酸，且樣本來(lái)源廣泛，適用性好。但是這種方法操作相對(duì)繁瑣而且容易污染。而且測(cè)定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA或RNA的拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物的量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA或RNA的拷貝數(shù)，無(wú)法做到準(zhǔn)確定量。Taqman熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)病原的技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速診斷、高通量、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高、易標(biāo)準(zhǔn)化操作和試驗(yàn)的生物安全性高等突出優(yōu)點(diǎn)，靈敏度比普通PCR靈敏度高100倍以上，是國(guó)際上公認(rèn)的快速準(zhǔn)確技術(shù)之一。可檢測(cè)到很微量的病毒核酸。我們已經(jīng)將其應(yīng)用到了禽流感病毒、新城疫病毒、豬鏈球菌以及口蹄疫病毒亞洲l型的檢測(cè)領(lǐng)域，取得了很好的技術(shù)效果。T叫Man技術(shù)的要點(diǎn)是在普通PCR原有一對(duì)特異性引物基礎(chǔ)上增加特異性的熒光雙標(biāo)記探針。該探針結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域的中間。探針的5'端和3'端分別標(biāo)記不同的熒光素，如5'端標(biāo)記的熒光素，它發(fā)出的熒光能夠被檢測(cè)儀器接收，稱為報(bào)告熒光基團(tuán)(用R表示)，3'端標(biāo)記的熒光素，在近距離內(nèi)能吸收5'端報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)，稱為淬滅熒光基團(tuán)(用Q表示)。當(dāng)PCR反應(yīng)在退火階段時(shí)，引物和探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，此時(shí)探針上R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)所吸收，儀器檢測(cè)不到R所發(fā)出的熒光信號(hào)；PCR反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，沿著模板鏈合成新鏈；當(dāng)鏈的延伸進(jìn)行到探針結(jié)合部位時(shí)，此時(shí)的Taq酶發(fā)揮它的5'—3'外切核酸酶的功能，將探針切成單核苷酸，與此同時(shí)標(biāo)記在探針上的R基團(tuán)游離出來(lái)，R所發(fā)出的熒光再不為Q所吸收而被檢測(cè)儀所接收。PCR進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，合成了N條新鏈的同時(shí)，就水解了N條探針，亦釋放了相應(yīng)數(shù)量的熒光基團(tuán)。儀器所接收到熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR反應(yīng)產(chǎn)物的量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)往復(fù)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)形式增長(zhǎng)，熒光信號(hào)也相應(yīng)增長(zhǎng)。如果以每一個(gè)PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)所測(cè)得的熒光值為縱坐標(biāo)，以PCR循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，即可得到一條連接每一個(gè)循環(huán)后熒光值的曲線一稱為擴(kuò)增曲線。當(dāng)檢測(cè)標(biāo)本中含有所要檢測(cè)病原體的核酸序列時(shí)，所得到的曲線呈"S"型；而當(dāng)標(biāo)本中不含病原體，則PCR過(guò)程不發(fā)生，探針不被水解，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，其擴(kuò)增曲線為一水平線。PCR擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的最下限，通常設(shè)定在S型擴(kuò)增曲線的增長(zhǎng)拐點(diǎn)處附近，稱為閾值線(Threshold);而擴(kuò)增曲線與閾值線交叉點(diǎn)的循環(huán)數(shù)稱為Ct值。樣本中病原體的濃度越高，Ct值就越小。以此方法測(cè)定未知標(biāo)本中的病原體核酸，不僅能快速定性，還因?yàn)闊晒釶CR本身先進(jìn)的熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和強(qiáng)大的信息處理能力，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體核酸的定量。本發(fā)明首次將單重和雙重?zé)晒釸T-PCR技術(shù)應(yīng)用于H3N8亞型馬流感病毒檢測(cè)領(lǐng)域，提供了針對(duì)H3N8亞型馬流感病毒的特異性引物序列、探針序列、試劑盒和檢測(cè)方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的核苷酸序列，包括引物序列和探針序列。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的單重和雙重檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速、準(zhǔn)確、可定量檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的單重和雙重檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案選擇H3N8亞型馬流感病毒HA和NA基因編碼區(qū)特定序列作為耙區(qū)域，在多重序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。引物長(zhǎng)度為20個(gè)堿基左右，GC含量為50%—60%，引物內(nèi)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5°C。探針的長(zhǎng)度在25個(gè)堿基左右，Tm值比引物Tm值高5'C左右。1組檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的核苷酸序列，如下1)5'-AACCRGTGGCAACAACACAG-3'(SEQIDNO:1)2)5'-TCAGTAGCATTTGTCACCTCAAT-3，(SEQIDNO:2)3)5'-[FAM]CTGGGACACCATGCAGTAGCAAATGG[TAMRA]-3，(SEQIDNO:3)4)5'_CAGCTCCATTGTGATGTGTG-3'(SEQIDNO:4)5)5'-TCGTAAAYTACATCTTRTCGATGTC-3，(SEQIDNO:5)6)5'-[VIC或HEX]AAGRATAGCTCCATCGTGCCATGACC[TAMRA]-3'(SEQIDNO:6)其中序列l(wèi))和2)分別為HA檢測(cè)的正義引物和反義引物，序列3)為HA檢測(cè)熒光探針，探針的5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM(6—羧基熒光素)，3'端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA;序列4)和5)分別為NA檢測(cè)的正義引物和反義引物，序列6)為NA檢測(cè)熒光探針，探針的5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)VIC或HEX(六氯-6-甲基熒光素)，3'端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA。我們采用TaqMan熒光PCR檢測(cè)技術(shù)建立了H3N8亞型馬流感病毒單重和雙重檢測(cè)方法，對(duì)反應(yīng)的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，其中包括引物探針的篩選，Mg2+使用濃度的優(yōu)化，引物探針濃度的優(yōu)化，得到以下試劑盒。檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒單重和雙重檢測(cè)試劑盒，由以下組分組成1)裂解液購(gòu)自INVITROGEN公司，按5ml/管進(jìn)行分裝，6管/盒。2)RT-PCR反應(yīng)液，表1為HA或NA單重反應(yīng)液配方；表2為檢測(cè)HA和NA的雙重反應(yīng)液配方。表1HA或NA單重反應(yīng)液配方<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2檢測(cè)HA和NA的雙重反應(yīng)液配方<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>IOXPCR緩沖液、25mMMgCl2、2.OmMdNTP均購(gòu)于Promega公司；引物和探針均委托大連寶生物生物工程有限公司合成，其中IOXPCR緩沖液的組成為500mMKCl、lOOmMTris—HCl(pH9.025°C)、1.0%TritonX-100。3)RT-PCR酶顆粒，購(gòu)自AMERCIA公司，12管/盒。4)TaqDNA聚合酶5U/pL，購(gòu)自Promega公司。5)DEPC水，用自來(lái)水兩次蒸餾，經(jīng)過(guò)MilliporeMILLI-QPFPLUS純水儀純化，收取電阻率》18.OMQ.cm的水，Millipore-Q純化水加入DEPC至終濃度為0.1%，37。C攪拌處理12hr，151bf/in2(1.034X105Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘。6)陰性對(duì)照馬流感病毒陰性組織樣品，用O.Olmol/LpH7.2PBS緩沖鹽水制成20%懸液，70'C作用1小時(shí)。7)陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段。回收H3N8亞型馬流感病毒HA和NA基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得高純度的含有H3N8亞型馬流感病毒HA和NA基因編碼區(qū)序列基因，長(zhǎng)度分別為1762bp和1413bp，與PGEM-Teasy載體(購(gòu)自Promega公司)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為PGEM-RAB。以純化的質(zhì)粒為模板，用Promega公司的RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionSystem-T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase除去其中的DNA模板后經(jīng)TRIZ0L提取后進(jìn)行測(cè)定后，即得到制備H3N8亞型馬流感病毒陽(yáng)性對(duì)照品所需的RNA陽(yáng)性對(duì)照品母液。1762bpHA目的片段基因序列如下1AGCAAAAGCAGGGGATATTTCTGATGAAGACAACCATTATTTTTATTTTTATACTACTGA61CCCATTGGGCCTACAGTCAAAACCCAATCAGTAACAACAACACAGCCACATTGTGTCTGG121GACACCATGCAGTAGCAAATGGAACATTAGTAAAAACAATAAGTGATGATCAAATTGAGG181TGACAAATGCTACAGAATTAGTTCAGAGCATTTCAATGGGGAAAATATGCAACAACTCAT241ATAGAATTCTAGATGGAAGAAATTGCACATTAATAGATGCAATGCTAGGAGACCCCCACT301GTGACGTCTTTCAGTATGAGAATTGGGACCTCTTTATAGAAAGAAGCAGCGCTTTCAGCA361ATTGCTACCCATATGACATCCCTGACTATGCATCGCTCCGATCAATTGTAGCATCCTCAG421GAACATTGGAATTCACAGCAGAGGGATTCACATGGACAGGTGTCACTCAAAACGGAAGAA481GTGGAGCCTGCAAAAGGGGATCAGCCGATAGTTTCTTTAGCCGACTGAATTGGCTAACAA541AATCTGGAAACTCTTATCCCACATTGAATGTGACAATGCCTAACAATAAAAATTTCGACA601AGCTATACATCTGGGGGATTCATCACCCGAGTTCAAATCAAGAGCAGACAAAATTGTATA661TCCAAGAATCAGGACGAGTAACAGTCTCAACAAAAAGAAGTCAACAAACAATAATCCCTA721ACATCGGATCTAGACCGTGGGTCAGAGGTCAATCAGGCAGGATAAGCATATACTGGACCA781TTGTAAAACCTGGAGATATCCTAATGATAAACAGTAATGGCAACTTAGTTGCACCGCGGG841GATATTTTAAATTGAAAACAGGGAAAAGCTCTGTAATGAGATCAGATGTACCCATAGACA901TTTGTGTGTCTGAATGTATTACACCAAATGGAAGCATCTCCAACGACAAGCCATTCCAAA961ATGTAAACAAAGTTACATATGGAAAATGCCCCAAATATATCAGGCAAAACACTTTAAAGT1021TAGCCACTGGAATGAGAAATGTACCAGAAAAGCAAATCAGAGGAATCTTTGGAGCAATAG1081CGGGATTCATCGAAAACGGCTGGGAAGGAATGGTTGATGGGTGGTATGGGTTCCGATACC1141AAAACTCTGAAGGAACAGGACAAGCTGCAGATCTAAAGAGCACTCAAACAGCCATCGACC1201AGATTAATGAAAAGTTAAACAGAGTGATTGAAAGAACCAATGAGAAATTCCATCAGATAG1261AGAAGGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAATTCAGGACTTGGAGAAATATGTGGAAGACA1321CCAAAATAGACCTATGGTCCTACAATGCAGAATTGCTGGTGGCTCTAGAAAATCAACATA1381CAATTGACTTAACAGATGCAGAAATGAATAAATTATTCGAGAAGACTAGACGCCAGTTAA1441GAGAAAACGCAGAAGACATGGGAGGTGGATGTTTCAAGATTTACCACAAATGTGATAATG1501CATGCATTGGATCAATAAGAAATGGGACATATGACCATTACATATACAGAGATGAAGCAT1561TAAACAACCGATTTCAAATCAAAGGTGTTGAGTTGAAATCAGGCTACAAAGATTGGATAC1621TGTGGATTTCATTCGCCATATCATGCTTCTTAATTTGCGTTGTTCTATTGGGTTTTATTA1681TGTGGGCTTGCCAAAAAGGCAACATCAGATGCAACATTTGCATTTGAGTAAACTGATAGT1741TAAAAACACCCTTGTTTCTACT1413bpNA目的片段基因序列如下1TATACATTGGATCTGCATCATTGGGGATATTAATCATTAACGTCATTCTCCATGTAGTCA61GCATTATAGTAACAGTACTGGTCCTCAATAACAATGAAACAGGTCTGAACTGCAAAGGGA121CGATCATAAGAGAGTACAATGAAACAGTAAGAGTAGAAAAAATTACTCAATGGCATAATA181CCAGTGCAATTAAGTACATAGAGAGACCTCCAAATGAATACTACATGAACAACACCGAAC241CACTTTGTGAGGCCCAAGGCTTTGCACCATTTTCCAAAGATAATGGAATACGAATTGGGT301CGAGAGGCCATGTTTTTGTGATAAGAGAACCTTTTGTATCATGTTCGCCCTCAGAATGTA361GAACCTTTTTCCTCACACAGGGCTCATTACTCAATGACAAACATTCTAACGGCACAGTAA421AGGATCGAAGTCCATATAGGACTTTGATGAGTGTCAAAATAGGGCAATCACCTAATGTGT481ATCAAGCTAGGTTTGAATCGGTGGCATGGTCAGCAACAGCATGCCATGATGGAAAAAAAT541GGATGACAATTGGAGTCACAGGGCCCGACAATCAAGCAATTGCAGTAGTGAACTATGGGG601GTATTCCGGTTGATATTATTAATTCATGGGAAGGGGACATCTTAAGAACCCAAGAATCAT661CATGCACCTGCATTAAAGGAAACTGTTATTGGGTAATGACTGATGGACCGGCAAATAGGC721AAGCTAAATATAGGATATTCAAAGCAAAAGATGGAAGAGTAATTGGACAGACTGATATAA781GTTTCAATGGGGGACACATAGAGGAGTGTTCTTGTTACCCCAACGAAGGGAAGGTGGAAT841GCATATGCAGGGACAATTGGACTGGAACAAATAGACCAATTCTGGTAATATCTTCTGATC901TATCGTACACAGTTGGATATTTGTGTGCTGGCATTCCCACTGACACTCCTAGGGGAGAGG961ATAGTCAATTCACAGGCTCATGTACAAGTCCTTTGGGAAATAAAGGATACGGTGTAAAAG1021GTTTCGGGTTTCGACAAGGAACTGACGTATGGGCCGGAAGGACAATTAGTAGGACTTCGA1081GATCAGGATTCGAAATAATAAAAATCAGGAATGGTTGGACACAGAACAGTAAAGACCAAA1141TCAGGAGGCAAGTGATTATCGATGACCCAAATTGGTCAGGATATAGCGGTTCTTTCACAT1201TGCCGGTTGAACTAACAAAAAAGGGATGTTTGGTCCCCTGTTTCTGGGTTGAAATGATTA1261GAGGTAAACCTGAAGAAACAACAATATGGACCTCTAGCAGCTCCATTGTGATGTGTGGAG1321TAGATCATAAAATTGCCAGTTGGTCATGGCACGATGGAGCTATTCTTCCC丁TTGACATCG1381ATAAGATGTAGTTTACGAAAAAAACTCCTTGTA對(duì)合成的引物和探針做HPLC分析，如得到單吸收峰圖譜、而且用紫外分光光度計(jì)測(cè)定0D260nm/0D280nm的比值在1.6—2.0之間，即視為合格引物。從1:104稀釋的H3N8亞型馬流感病毒雞胚培養(yǎng)物中提取的RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示本發(fā)明提供的引物對(duì)與探針配合使用，擴(kuò)增的Ct值相對(duì)較低，且升幅較高。將篩選好的引物濃度從0.lnM至O.8nM以0.lyM為間距遞增，探針濃度從0.025yM至0.2nM以0.025yM遞增。對(duì)引物和探針不同濃度的配比進(jìn)行了比較，從多次重復(fù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同濃度的引物、探針對(duì)于該陽(yáng)性模板，CT值基本穩(wěn)定在18.55左右，但引物濃度為0.2ixM，探針濃度為O.lyM時(shí)熒光增幅相對(duì)較高，所以選定引物濃度為0.2yM，探針濃度為0.luM作為H3N8亞型馬流感病毒單重和雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法的引物和探針濃度。我們針對(duì)RocheLightCycler以及ABI7900HT熒光PCR檢測(cè)儀，在42°C/30min，92'C/3min的逆轉(zhuǎn)錄后，對(duì)該實(shí)驗(yàn)中對(duì)變性溫度和時(shí)間、退火和延伸溫度及時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增時(shí)，采用循環(huán)次數(shù)分別為40、45和50，比較擴(kuò)增結(jié)果的Ct值，進(jìn)而確定擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)。最終確定采用擴(kuò)增效果較好，耗時(shí)較短的方案為PCR反應(yīng)參數(shù)92。C/10sec，6(TC/30sec40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光。研究表明，Mg2+濃度對(duì)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響較大，故應(yīng)用篩選好的引物探針，將Mg2+的濃度從1.5mM至6.0慮以0.5mM為間距遞增，對(duì)不同Mg2+濃度條件下的擴(kuò)增進(jìn)行了比較，結(jié)果表明Mg2+濃度對(duì)熒光增量和檢測(cè)的靈敏度相關(guān)，提高其使用濃度，可提高檢測(cè)探針的熒光增量，但隨著Mg2+濃度的提高，特別是超過(guò)5mM時(shí)，在檢測(cè)某些樣品時(shí)，可發(fā)現(xiàn)曲線上漂的現(xiàn)象。對(duì)于H3N8亞型馬流感病毒單重和雙重檢測(cè)方法，優(yōu)化后的Mg2+濃度為3.OmM。我們選擇Promega公司生產(chǎn)的T叫酶，一單位的定義74'C作用30分鐘，能將10nM的dNTPs摻入酸溶性物質(zhì)中所需要的酶量。活性要求具DNA聚合酶活性及5'—3'核酸外切酶活性，無(wú)3'—5'核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94°C1小時(shí)后仍保持50%活性。Taq酶用量(以單位U計(jì))的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)?zāi)０宀捎肏3N8亞型馬流感病毒雞胚培養(yǎng)物(1:104稀釋)提取RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行擴(kuò)增。從多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果中選定1.25UTaq酶作為使用的Taq酶量。1)樣品處理對(duì)于組織樣品，用無(wú)菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品1.0g于研缽中充分研磨，再加5mLPBS混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。對(duì)于液體樣本，用無(wú)菌注射器直接吸取至無(wú)菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。采集或處理的樣本在2°C8'C條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h;若需長(zhǎng)期保存，須放置-70。C冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(最多凍融2次)。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。2)RNA的提取在樣本處理區(qū)進(jìn)行。取n個(gè)1.5ml滅菌離心管(n=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，作好標(biāo)記。首先加入600ul裂解液(裂解液有很強(qiáng)的腐蝕性，切勿沾到皮膚或衣物，否則立即用大量清水沖洗并擦干)，然后分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各200ul(一份樣本換用一個(gè)吸頭)；再加入200ul氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec(不宜過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可用手顛倒混勻)。12,OOOg離心15min(如有條件，于4。C進(jìn)行離心)。取與上步中相同數(shù)量的1.5ml滅菌離心管，加入400ul異丙醇(一2CTC預(yù)冷)，作好標(biāo)記。吸取步驟1.3.各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻。12，000g離心15min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干)；加入600ul75%乙醇(一20'C預(yù)冷)，顛倒洗滌。12，000g離心10min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。4,OOOg離心10sec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干(一份樣本換用一個(gè)吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面)，室溫干燥3min(不宜過(guò)于干燥，以免RNA不溶)。加入llulDEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2，000g離心5sec，冰上保存?zhèn)溆?注意此時(shí)的RNA最易受RNA酶降解，請(qǐng)?jiān)?小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增)。3)RT-PCR擴(kuò)增從試劑盒中取出RT-PCR反應(yīng)液、Taq酶，在室溫下融化后，2,000g離心5sec。設(shè)所需PCR管數(shù)為n(n=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系需要15ulRT-PCR反應(yīng)液和0.25ulTaq酶。計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，向其中加入n/4顆RT-PCR酶顆粒，充分混合均勻，向每個(gè)PCR管中各分裝15ul，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。在各設(shè)定的PCR管中分別加入制備的RNA溶液各lOul，蓋緊管蓋，于400g離心5sec。將PCR管排好放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置——第一階段，預(yù)變性42'C/30min，92°C/3min;一一第二階段，92°C/10s，6(TC/30sec40個(gè)循環(huán)，熒光收集設(shè)置在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時(shí)進(jìn)行。4)結(jié)果的判定結(jié)果分析條件設(shè)定，讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陰性對(duì)照無(wú)a值并且無(wú)擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照的G值應(yīng)《30.0，并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線。如陰性對(duì)照和陽(yáng)性條件不滿足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。結(jié)果描述及判定，陰性，無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，表明樣品中無(wú)H3N8亞型馬流感病毒；陽(yáng)性，Ct值《30.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，表示樣本中存在H3N8亞型馬流感病毒。檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的單重和雙重方法，包括如下步驟1)提取樣品RNA;2)對(duì)提取的樣品RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增HA檢測(cè)引物序列為1)5，-AACCRGTGGCAACAACACAG-3'(SEQIDNO:1)2)5，_TCAGTAGCATTTGTCACCTCAAT-3'(SEQIDNO:2)HA檢測(cè)熒光探針為3)5'-[FAM]CTGGGACACCATGCAGTAGCAAATGG[TAMRA]-3，(SEQIDNO:3)NA檢測(cè)引物序列為4)5'-CAGCTCCATTGTGATGTGTG-3'(SEQIDNO:4)5)5'_TCGTAAAYTACATCTTRTCGATGTC_3，(SEQIDNO:5)NA檢測(cè)熒光探針為6)5'-[VIC或HEX]AAGRATAGCTCCATCGTGCCATGACC-3'(SEQIDNO:6)擴(kuò)增條件為42tV30min，92°C/3min;92°C/10sec，60°C/30sec40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光。3)測(cè)定RT-PCR反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度，判斷樣品中是否存在H3N8亞型馬流感病毒；陰性，無(wú)G值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，表明樣品中無(wú)H3N8亞型馬流感病毒；陽(yáng)性，Ct值《30.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，表示樣本中存在H3N8亞型馬流感病毒。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明選擇H3N8亞型馬流感病毒HA和NA基因編碼區(qū)作為耙區(qū)域，設(shè)計(jì)引物和探針建立并優(yōu)化了H3N8亞型馬流感病毒單重和雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，取得了優(yōu)異的技術(shù)效果l)快速該方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，RT-PCR結(jié)束即可獲得結(jié)果，將傳統(tǒng)檢測(cè)方法的21天檢測(cè)時(shí)間縮短為4個(gè)小時(shí)。2)靈敏由于采用了特異性的熒光探針和高靈敏度的熒光PCR儀，使該方法比傳統(tǒng)的PCR方法靈敏度高1001000倍；用所建立的方法對(duì)以10倍梯度稀釋的H3N8亞型馬流感病毒A/equine/xibei/1/2007株雞胚培養(yǎng)尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明稀釋到10—7倍單重方法仍為陽(yáng)性；稀釋到10—5倍雙重方法為陽(yáng)性。3)特異由于不僅采用了特異性的引物，而且采用了特異性的探針，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)RT-PCR方法；建立的H3N8亞型馬流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法在檢測(cè)所收集的馬動(dòng)脈炎病毒以及其他動(dòng)物流感病毒病原，結(jié)果為陰性，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。4)穩(wěn)定重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好；5)不易污染全封閉反應(yīng)，無(wú)需PCR后處理，操作安全。下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1為H3N8亞型馬流感病毒H3和N8單重檢測(cè)方法的檢測(cè)極限測(cè)定結(jié)果(a)為H3檢測(cè)結(jié)果，(b)為N8檢測(cè)結(jié)果。圖2為H3N8亞型馬流感病毒雙重檢測(cè)方法檢測(cè)極限測(cè)定結(jié)果a)為對(duì)稀釋病毒的檢測(cè)結(jié)果；(b)為對(duì)稀釋RNA的檢測(cè)結(jié)果。圖3為采用單重方法對(duì)病毒RNA進(jìn)行相對(duì)定量的結(jié)果。圖4為雙重方法與單重方法對(duì)不同濃度RNA的檢測(cè)結(jié)果。圖5為H3N8亞型馬流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果(a)為H3特異性試驗(yàn)結(jié)果；(b)為N8特異性試驗(yàn)結(jié)果。圖6為雙重方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。圖7采用熒光RT-PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:試劑盒的配制和使用1.試劑盒的配制組成，見(jiàn)表3。表3試劑盒配制組成<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.試劑盒的使用方法2.1RNA提取:取n個(gè)1.5ml滅菌離心管(n=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，作好標(biāo)記。首先加入600ul裂解液(裂解液有很強(qiáng)的腐蝕性，切勿沾到皮膚或衣物，否則立即用大量清水沖洗并擦干)，然后分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各200ul(一份樣本換用一個(gè)吸頭)；再加入200ul氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec(不宜過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可用手顛倒混勻)。12,000g離心15min(如有條件，于4。C進(jìn)行離心)。取與上步中相同數(shù)量的1.5ml滅菌離心管，加入400ul異丙醇(一2(TC預(yù)冷)，作好標(biāo)記。吸取步驟1.3.各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻。12，000g離心15min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干)；加入600ul75%乙醇(一20。C預(yù)冷)，顛倒洗滌。12,OOOg離心10min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。4，OOOg離心10sec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干(一份樣本換用一個(gè)吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面)，室溫干燥3min(不宜過(guò)于干燥，以免RNA不溶)。加入llulDEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2,OOOg離心5sec，冰上保存?zhèn)溆?注意此時(shí)的RNA最易受RNA酶降解，請(qǐng)?jiān)?小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增)。2.2擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備與配制從試劑盒中取出單重和雙重RT-PCR反應(yīng)液、Taq酶，在室溫下融化后，2,OOOg離心5sec。設(shè)所需PCR管數(shù)為n(n=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+l管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系需要15ulRT-PCR反應(yīng)液和0.25ulTaq酶。計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，向其中加入n/4顆RT-PCR酶顆粒，充分混合均勻，向每個(gè)PCR管中各分裝15ul，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。在各設(shè)定的PCR管中分別加入制備的RNA溶液各10ul，蓋緊管蓋，于400g離心5sec。將PCR管排好放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置——第一階段，預(yù)變性42°C/30min，92°C/3min;——第二階段，92°C/10s，6(TC/30sec40個(gè)循環(huán)，熒光收集設(shè)置在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時(shí)進(jìn)行。2.3結(jié)果判定結(jié)果分析條件設(shè)定，讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陰性對(duì)照無(wú)6Y值并且無(wú)擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)《30.0，并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線。如陰性對(duì)照和陽(yáng)性條件不滿足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。結(jié)果描述及判定，陰性，無(wú)CY值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，表明樣品中無(wú)H3N8亞型馬流感病毒；陽(yáng)性，6Y值《30.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，表示樣本中存在H3N8亞型馬流感病毒。實(shí)施例2:試劑盒的靈敏度試驗(yàn)及用于病毒RNA的相對(duì)定量1.材料方法研究過(guò)程中應(yīng)用到的病毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存的H3N8亞型馬流感病毒A/equine/xibei/1/2007(10—5EID50/0.lml)。2.方法1)將H3N8亞型馬流感病毒A/equine/xibei/1/2007雞胚培養(yǎng)的尿囊液作10—\10—2、10—3、10—4、10—5、10—6、10_7、10—8、10—9、10—"倍稀釋,分別進(jìn)行H3和N8單重和雙重H3N8亞型馬流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)，同時(shí)將各個(gè)稀釋度的病毒接種SPF雞胚，比較兩種方法的靈敏度。2)病毒RNA的相對(duì)定量為實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣品中病毒RNA量的相對(duì)定量，我們進(jìn)一步對(duì)連續(xù)10倍稀釋的病毒RNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)Ct值和樣品中病毒脂A的量進(jìn)行線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。3.結(jié)果1)見(jiàn)圖1_圖3所示，將H3N8亞型馬流感病毒A/equine/xibei/1/2007雞胚培養(yǎng)的尿囊液作10倍系列稀釋，運(yùn)用優(yōu)化后的條件分別用兩種檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，單重檢測(cè)方法的檢測(cè)極限可達(dá)10—7，雙重檢測(cè)方法可達(dá)10—5。圖l，圖2分別為H3N8亞型馬流感病毒單重和雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法的靈敏度檢測(cè)結(jié)果。而采用SPF雞胚分離培養(yǎng)鑒定，靈敏度僅能達(dá)到10—5，與雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法的靈敏度一致，但低于單重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法。2)病毒RM的相對(duì)定量為實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣品中病毒RNA量的相對(duì)定量，我們進(jìn)一步對(duì)連續(xù)10倍稀釋的病毒RNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)Ct值和樣品中病毒RNA的量進(jìn)行線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，病毒RNA的量與試驗(yàn)測(cè)得的Ct值呈線性相關(guān)，R2=0.9990(ABI7900)和0.995(R0CHE1.1)，表明建立的方、法可用于病毒RNA量的相對(duì)確定，如圖3所示。對(duì)于各個(gè)稀釋度的RNA，采用單重和雙重方法，所得Ct值基本一致，如圖4所示，表明RNA濃度在10_1—10—5稀釋度范圍內(nèi)，單重和雙重檢測(cè)方法檢測(cè)效率相近。實(shí)施例3:試劑盒的特異性試驗(yàn)1.材料表4方法研究過(guò)程中應(yīng)用到的病毒株病毒來(lái)源馬動(dòng)脈炎病毒本實(shí)驗(yàn)室保存Hl亞型流感病毒本實(shí)驗(yàn)室保存禽源H3，H5，H9亞型流感病毒本實(shí)驗(yàn)室保存馬甲l型病毒本實(shí)驗(yàn)室保存2.方法用所建立的單重和雙重?zé)晒釸T-PCR方法對(duì)多種流感病毒(包括Hl，禽源H3，H5，H9亞型病毒)以及馬動(dòng)脈炎病毒、馬甲1型流感病毒進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證方法的特異性。3.結(jié)果如圖5和圖6所示，結(jié)果表明所建立的方法與上述病毒無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。實(shí)施例4:H3N8亞型馬流感病毒熒光RT-PCR試劑盒的批間、批內(nèi)可重復(fù)性試驗(yàn)為對(duì)該試劑盒批間、批內(nèi)重復(fù)性進(jìn)行綜合考核，我們選擇三批合格試劑進(jìn)行了批間、批內(nèi)可重復(fù)性試驗(yàn)。1.實(shí)驗(yàn)材料試劑H3N8亞型馬流感病毒熒光RT-PCR試劑盒3批，批號(hào)200612001、200612002、200612003檢測(cè)儀器全自動(dòng)熒光PCR檢測(cè)儀ABI公司產(chǎn)品，型號(hào)，7900。檢測(cè)樣本將將H3N8亞型馬流感病毒A/equine/xibei/1/2007雞胚培養(yǎng)的尿囊液作10—3、104、105倍稀釋后，分別命名為D1、D2、1)3，連續(xù)三次分別用H3N8亞型馬流感病毒熒光RT-PCR試劑盒進(jìn)行批間、批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。2.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:每批試劑均對(duì)A/equine/xibei/1/2007雞胚培養(yǎng)的尿囊液的3個(gè)稀釋度進(jìn)行3次突光RT-PCR檢測(cè)，每次每一樣本檢測(cè)10份復(fù)管，然后根據(jù)以上數(shù)據(jù)計(jì)算試劑盒的批內(nèi)、批間誤差。檢測(cè)結(jié)果要求同一樣本的批內(nèi)、批間CV值《10X3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)表5結(jié)果可見(jiàn)200712001、200712002、200712003三個(gè)批號(hào)的"H3N8亞型馬流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒"對(duì)每一樣木各IO份復(fù)管的重復(fù)性檢測(cè)，同一批號(hào)、同一次檢測(cè)結(jié)果的CV值均小于5%，說(shuō)明該試劑盒同批試劑同時(shí)檢測(cè)具有很好的重復(fù)性。表5三批試劑盒批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>根據(jù)表6結(jié)果可見(jiàn)200712001、200712002、200712003三個(gè)批號(hào)的"H3N8亞型馬流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒"對(duì)三份樣本的重復(fù)性檢測(cè)，同一批號(hào)、各自三次檢測(cè)結(jié)果之間的CV值均小于5%，說(shuō)明該試劑盒同批試劑、不同時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果也具有很好的重復(fù)性。表6三批試劑盒各自批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>根據(jù)以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析，該試劑盒批內(nèi)、批間重復(fù)性結(jié)果的CV值均小于5%，說(shuō)明具有很好的批內(nèi)、批間重復(fù)性。實(shí)施例6:對(duì)臨床樣品檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.材料北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供的40份馬驢鼻拭子樣品。2.方法對(duì)于這40份臨床樣品，分成2份，1份采用熒光RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，另一份采用雞胚病毒分離鑒定進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。3.結(jié)果檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8、圖7。表8臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在本研究中，我們將建立的方法用于臨床樣品的檢測(cè)，樣品均為北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供的40份臨床樣品，結(jié)果顯示與雞胚病毒分離鑒定試驗(yàn)結(jié)果完全一致。序列表〈110〉中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局<120>—種馬流感檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法〈130〉<160〉8<170〉Patentlnversion3.5〈210〉1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉1aaccrgtggca^c犯cac3g〈210〉2<211〉23〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉2tcagtagcatttgtcacctcaat<210〉3<211>26<212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉3ctgggacaccatgcagtagc犯atgg<210〉4〈211〉20〈212〉■〈213〉人工合成<400〉4cagctccattgtgatgtgtg〈210>5<211>25〈212〉DNA<213〉人工合成〈400〉5tcgtaaaytacatcttrtcgatgtc〈210〉6〈211〉26〈212〉DNA<213〉人工合成<400〉6aagratagctccatcgtgccatgacc<210〉7〈211〉1762〈212〉DNA〈213〉人工合成HA片段<400〉73gca^犯gcagggg3tatttcaaccatt8tttttatttttettactactga60cccattgggcaacccaatcagtaacaacaacac3gccac3ttgtgtctgg120gacaccatgcagtagc犯atggaacattagtaaaaacaataagtgatgatcaaattgagg180tgac3犯tgcgttcagagcatttC33tggggaaaatatgcaacaactcat240atagaattctaattgcacatta^t￡Lg￡LtgCgacccccact300gtgacgtctttcagt3tgagaattgggacctctttatagaaagaagc已gcgctttcagca360attgctaccccctgactatgcatcgctccggcatcctcag420gaacattgga3ttcacagc已catgg已c已ggtgtcactcaa480gtggagcctgC^鄉(xiāng)ggg3tcagccgatagtttctttagccgactgaattggCt33C肌540犯tctgga犯ctcttatccctgacaatgccaatttcgaca600agctatacatctgggggsttcatcacccgaagagcagaca660tccaagaatc3ggacg3gtacaa^a^ga^gtcaacaaacaataatcccta720acatcggatct卿ccgtgggtc卿ggtcaatC3ggcaggataagcatatactggacca780tggagatatcac已gtaatggcaacttagttgC3CCgCggg840ctgtaatgagatcagatgtacccEiteigaca■Utgtgtgtcacacc已a(bǔ)atggaagcatctcca^cgac認(rèn)gccattccaaa960atgta^caaggaaaatgccacttta犯gt1020tagccactggaatgag幼atgt3ccag33aagcasEitcagaggaatctttgg;agc肌tag1080cgggattcatcg犯aacggctggg鄉(xiāng)g^tggttgstgggtggtatgggttccgatacc1140agg33C3gg3caagctgcagatctaaag3gcactcaaacagccatcgacc1200aaagttaaac卿gtgattgtgagaaattccatcagatag1260ctC3gaagtag3agga卿attcaggacttgtggaagaca1320ccaaaat3gacctatggtcctaca^tgcagaattgctggtggctctagaa1380caattgacttcgccagttaa1440gagaaaacgcgg鄉(xiāng)tggatgtttcaag已t1500catgcattgg3tcaataagaatgaccattacatatacagagatgaagcat1560ta_aacaaccgatttcaa^tc3犯ggtgttgagttgaaatcaggctacaa^gattggatac1620tgtggatttcattcgccatatcatgcttcttaatttgcgttgttctattgggttttatta1680tgtgggcttgcca^338ggcgcaacatttgcatttgagtaaactgatagt1740taaaaacacccttgtttctact1762〈210〉8〈211〉1413〈212〉DNA<213〉人工合成NA片段〈400〉8tatacattggatctgcatcattggggat已ttaatcattaacgtcattctccatgtagtca60gcattatagt認(rèn)cagtactggtcctcaataaca已tga^acaggtctg已a(bǔ)c120cgatcata^g180ccagtgcaattaagtscat3g3g3g3CCtCctacatgaac240cactttgtgaggccca鄉(xiāng)ctttgcaccattttCC3^g3taatggaatacg已a(bǔ)ttgggt300Cg卿ggCC3tgtUttgtg3taag3g3accttttgtatcatgttcgccctcagaatgta360gaacctttttcctcacacagggctcattactcaatgacaaacattct已a(bǔ)cggcacagtaa420aggatcg卿tccatatagg3Ctttgatgagtgtc已a(bǔ)aatagggcaatcacctaatgtgt■3tc肌gctaggtttg皿tcggtggcatggtcagcaacagcatgccatgat540gg已tgaca^ttggagtcscagggcccg3C已a(bǔ)tcs已gcaattgC3g"Ugtg3已C城gggg600gtattccggttgatattatt犯gggg3catCtt33g犯CCcaagaatcat660catgcacctgaactgttattgggt已a(bǔ)tgsctgatggaccggC3^t3ggC720犯gct^atataggatattcatgg已3g已gtaL3ttgga_ca_g780gtttcaatggg鄉(xiāng)agtgttcttgttacccC33Cg3aggg犯ggtggaat840gcatatgcagggacaattggactggaac已a(bǔ)atagaccaattcttctgatc900tatcgtacacttgtgtgctggcattcccactgacactcct鄉(xiāng)gg卿gg960cac3ggctc3tgtac犯gtcctttgggaaataaaggatacggtgta混3g1020gtttcgggttactgacgtatgggccgg鄉(xiāng)gacaattagt1080gatcagg已ttcgaaataataaaaatc已gga3tggttgg3C1140tcaggaggca3gtgatt3tcgatgacccaaattggtcagg3tatagcggttctttcacat1200tgccggttga犯ggg3tgtttggtcccctgtttctgggttgaaatgatta1260gaggtaaacc￡iC￡L3tatggacctctagcagctccattgtgstgtgtgg3g1320tagatcataaaattgccagttggtcatggc3Cg3tggagCtattcttccctttgacatcg1380ataagatgt已gta141權(quán)利要求1.一組檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的核苷酸序列，其特征在于為序列表SEQIDNO1至SEQIDNO6所示的核苷酸序列，其中SEQIDNO1和SEQIDNO2為HA檢測(cè)引物序列；SEQIDNO3為HA檢測(cè)熒光探針；SEQIDNO4和SEQIDNO5為NA檢測(cè)引物序列；SEQIDNO6為NA檢測(cè)熒光探針。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的核苷酸序列，其特征在于序列SEQIDNO:3的5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA;SEQIDNO:6的5，端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)VIC或HEX,3，端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA。3.—種檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的試劑盒，48tests/盒，由以下組分組成1)裂解液5ml/管，6管/盒；2)H3或N8單重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液，分別為750uLXl管，均包括10XPCR緩沖液、25mMMgCL2、2.OmMdNTP、引物1、引物2和探針；3)H3N8雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液，為750nLXl管，包括IOXPCR緩沖液、25mMMgCL2、2.OmMdNTP、檢測(cè)H3和N8的特異性引物和探針；4)RT-PCR酶顆粒，1粒X36管；5)TaqDNA聚合酶5U/yL，45uLX1管；6)DEPC水，lmLX3管；7)陰性對(duì)照l(shuí)mLX3管，馬流感病毒陰性組織樣品，用0.01mol/LpH7.2PBS緩沖鹽水制成20%懸液，7(TC作用l小時(shí)；8)陽(yáng)性對(duì)照l(shuí)mLX3管，為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的試劑盒，其特征在于所述8)陽(yáng)性對(duì)照的制法為回收H3N8亞型馬流感病毒HA和NA基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得高純度的含有H3N8亞型馬流感病毒HA和NA基因編碼區(qū)序列基因，長(zhǎng)度分別為1762bp和1413bp，與PGEM-Teasy載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為PGEM-RAB。以純化的質(zhì)粒為模板，用Promega公司的RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionSystem-T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase除去其中的DNA模板后經(jīng)TRIZOL提取后進(jìn)行測(cè)定后，即得到制備H3N8亞型馬流感病毒陽(yáng)性對(duì)照品所需的RNA陽(yáng)性對(duì)照品母液；其中HA目的片段基因序列為序列表SEQIDNO:7，NA目的片段基因序列為序列表SEQIDNO:8。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的H3N8亞型馬流感病毒的試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)HA基因引物序列為序列表SEQIDNO:1禾nSEQIDNO:2;HA檢測(cè)熒光探針為序列表SEQIDNO:3，其5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3，端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TA服A。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)NA基因引物序列為序列表SEQIDNO:4和SEQIDNO:5;NA檢測(cè)熒光探針為序列表SEQIDNO:6，其5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)VIC或HEX,3'端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA。7.檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的方法，包括如下步驟1)提取樣品RNA;2)對(duì)提取的樣品RNA進(jìn)行單重或雙重RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)HA引物序列為序列表SEQIDNO:1和SEQIDNO:2;熒光探針為序列表SEQIDNO:3;檢測(cè)NA引物序列為序列表SEQIDNO:4和SEQIDNO:5;熒光探針為序列表SEQIDNO:6;擴(kuò)增條件為擴(kuò)增條件為42°C/30min，92°C/3min;92°C/10sec，60°C/30sec40'循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光；3)測(cè)定RT-PCR反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度，判斷樣品中是否存在H3N8亞型馬流感病毒；陰性，無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，表明樣品中無(wú)H3N8亞型馬流感病毒；陽(yáng)性，Ct值《30.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，表示樣本中存在H3N8亞型馬流感病毒。全文摘要本發(fā)明涉及一種馬流感檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。一組檢測(cè)H3N8亞型馬流感病毒的核苷酸序列，為序列表SEQIDNO1至SEQIDNO6所示的核苷酸序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1)快速將傳統(tǒng)檢測(cè)方法的21天檢測(cè)時(shí)間縮短為4個(gè)小時(shí)；2)靈敏對(duì)以10倍梯度稀釋的H3N8亞型馬流感病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明單重方法稀釋到10^-7倍均檢出為陽(yáng)性；雙重方法稀釋到10^-5倍檢出為陽(yáng)性。3)特異建立的H3N8亞型馬流感病毒單重和雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法在檢測(cè)馬動(dòng)脈炎病毒，其他亞型的流感病毒，結(jié)果為陰性，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)；4)穩(wěn)定重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好；5)不易污染全封閉反應(yīng)，無(wú)需PCR后處理，操作安全。文檔編號(hào)C12N15/11GK101392299SQ20081011686公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年7月18日優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日發(fā)明者喬彩霞,劉月煥,丹吳,琦周,張向東,柏亞鐸,段生濤,琳汪,靜蒲,強(qiáng)谷,賴平安,高志強(qiáng)申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局