專利名稱：：一種溫敏雄性育性基因及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種溫敏雄性育性基因及其應用，屬于基因工程領域。技術背景植物通過不同品種間的雜交產生雜種。雜種在生長勢、適應性、產量等方面具有優(yōu)勢，稱為雜種優(yōu)勢。利用雜種優(yōu)勢可以提高農作物的產量、品質和抗性。水稻育種利用雜種優(yōu)勢的途徑主要是通過雜交水稻育種，而雜交水稻育種的方式主要有兩系法和三系法。三系法育種需要不育系、保持系和恢復系，而兩系法只需要不育系和恢復系。兩系法中的不育系具有育性轉換的特點，其雄性的不育或可育受控于外界的光周期和溫度條件，不育系在不同光溫條件下可以作為保持系。與三系法相比，兩系法具有三大優(yōu)越性:一是不育系一系兩用，不需要保持系，簡化了種子生產程序，減少了生產環(huán)節(jié)和不育系繁殖面積，降低了種子成本；二是配組自由，絕大多數常規(guī)品種都可成為恢復系，擴大了雜種優(yōu)勢利用的種質范圍，大大提高了選到優(yōu)良組合的概率；三是不育系的不育性遺傳行為簡單，較容易轉育到其他性狀優(yōu)良的水稻品種(系)中，有利于改良品質、抗性等性狀，同時其不育性受細胞核控制，從而避免了細胞質不育對雜種優(yōu)勢的負效應，以及因細胞質單一化而導致某種毀滅性病蟲害爆發(fā)的潛在威脅(袁隆平，1987)。目前，在水稻兩系法中應用的不育系主要有光敏不育系和溫敏不育系。光敏不育系的花粉育性主要受日照長度的控制，在長日照的條件下，水稻花粉表現為不育，而在短日照條件下，花粉可育；溫敏不育系的花粉育性主要受環(huán)境溫度控制。當環(huán)境溫度高于某一溫度時，水稻花粉表現為不育，而當環(huán)境溫度低于某一溫度時，表現為可育。已發(fā)現并定位的光敏不育基因有3個，分別是pmsl(Zhang等1994，ProcNatlAcadSciUSA.91:8675-9)、pms2(Zhang等1994，ProcNatlAcadSciUSA.91:8675-9;Liu等2001，MolGenetGenomics266:271-5)和pms3(Mei等1999，SciChina(SerC)42:316—322;Li等2001，Euphytica119:343—348;Li等2002，ActaAgronSin28:310~314;Lu等2005，MolGenetGenomics273:507-11)。已發(fā)現并定位的溫敏不育基因共有8個，分別是tmsl(Wang等1995，TheorApplGenet91:1111—1114)，tms2(Yamaguchi等1997，BreedSci47:371—373)，tms3(Subudhi等1997，Genome40:188-194)，tms4(Dong等2000，TheorApplGenet100:727—734)，tms5(Wang等2003，TheorApplGenet107:917—921;Jiang等2006，ChineseScienceBulletin51:417-420;Yang等2007，Planta225:321-30)，tms6(Lee等2005，TheorApplGenet111:1271-1277),rtmsl(Jia等2001，TheorApplGenet103:607~612)和Ms-h(Koh等1999，Euphytica106:57-62)。溫敏不育系安農S-1是從安農中發(fā)現的自然突變體，其溫敏不育性是受一對隱性核基因所控制，其育性轉換主要受溫度控制，轉換溫度的起始點為25°C，即環(huán)境溫度高于25°C時，其花粉表現為不育，而環(huán)境溫度低于25。C時，表現為可育(鄧華鳳等，1999)。安農S-l是目前在兩系法育種中廣泛應用的兩個溫敏不育基因之一，以安農S-l為溫敏不育基因的供體，己培養(yǎng)多個溫敏不育系，廣泛應用于水稻育種中。安農S-l所攜帶的溫敏不育基因座為tms5，已定位于第二染色體(Wang等2003，TheorApplGenet107:917"921;Jiang等2006，ChineseScienceBulletin51:417-420;Jiang等2006，ChineseScienceBulletin51:417-420;Yang等2007，Planta225:321-30)。目前尚未有水稻溫敏不育基因tms5被分離克隆的報道，安農S-l溫敏不育的分子基礎還不清楚，已有技術還不能明確和分離克隆溫敏不育基因tms5，不能更好地選育水稻。
發(fā)明內容本發(fā)明通過圖位克隆(map-basedcloning)技術安農S-l溫敏不育基因座加s5獲得了溫敏育性基因TSSNR，通過轉基因實驗驗證了此基因的功能，并提出了RNAi(RNAinterference,RNAi)或反義RNA(anti-senseRNA)或過表達負顯性(dominantnegative,DN)原理的轉基因技術，可使正常水稻品種中的TSSRZ基因功能喪失，培育溫敏雄性不育系。本發(fā)明為克服已有技術的不足，目的在于提供一種溫敏雄性育性基因。本發(fā)明的另一個目的是提供上述溫敏雄性育性基因的遺傳標記。本發(fā)明的另一個目的是提供上述溫敏雄性育性基因所編碼的蛋白質。本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述溫敏雄性育性基因的載體。本發(fā)明的另一個目的在于提供含有溫敏雄性育性基因的重組微生物。本發(fā)明的另一個目的是提供上述溫敏雄性育性基因在培育溫敏雄性不育系中的應用。本發(fā)明的另一個目的是提供上述遺傳標記在水稻育種中的應用。本發(fā)明通過以下技術方案實現上述目的。一種溫敏雄性育性基因，其核苷酸序列如如SEQIDNo.l或SEQIDNo.4。上述溫敏雄性育性基因的遺傳標記，確定第71位的堿基C突變?yōu)锳。含有上述溫敏雄性育性基因所編碼的蛋白質，序列為SEQIDNo.2或SEQIDNo.5，或替換、減少或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。含有上述溫敏雄性育性基因的載體。所述的載體包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達載體。含有溫敏雄性育性基因的重組微生物。所述的重組微生物是含有所述載體的細菌細胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉化的植物細胞。上述溫敏雄性育性基因在培育植物溫敏不育系中的應用。所述溫敏不育系可以是溫敏雄性不育系。上述遺傳標記在水稻育種中的應用。本發(fā)明首先采用分子標記的方法完成安農S-l溫敏不育基因的精細定位，將安農S-l溫敏不育基因定位于8.4kb的區(qū)域，根據已測定的水稻基因組的序列，該區(qū)域只有3個編碼蛋白的基因。根據水稻基因組測序的結果，設計引物采用PCR的方法擴增正常品種安農和溫敏不育系安農S-l的這3個基因的基因組全序列(包括啟動子和編碼區(qū)的序列)，將擴增的序列進行測序。比較安農N和安農S-1的這3個基因的全基因組序列，發(fā)現只有一個編碼核酸酶Z(nuclearribonucleaseZ，簡稱為RNaseZ或RZ)的基因在安農N和安農S-l間有差異，即安農S-1中編碼區(qū)的第71位核苷酸由C突變?yōu)锳，導致第24位的密碼子由TCG突變?yōu)榻K止密碼子TAG。用PCR方法，從正常品種安農中擴增RZ基因的基因組全序列克隆到植物轉化載體，將該載體用農桿菌介導的方法轉化安農S-1轉育的溫敏不育系，To代時，被轉化的溫敏不育系即使在高溫條件其花粉育性恢復正常，在Ti代中不同單株的花粉育性在高溫條件下出現分離，即含有轉基因的單株花粉育性正常，而不含轉基因的單株花粉不育。同時，采用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)的方法降低正常品種中RZ基因的表達，在T。代中RZ基因的表達量下降，導致正常品種的花粉育性轉變?yōu)楦邷?28-35。C)不育和適溫(19-24°C)可育。在Ti代中不同單株在高溫下出現花粉育性分離，含有轉基因的單株，表現為溫敏雄性不育，而不含轉基因的單株表現雄性育性正常。為了檢驗這種機制的普遍性，同樣采用RNA干擾的方法降低擬南芥中RZ同源基因NUZ(核苷酸水平同源性為67%)的表達，導致擬南芥的花粉育性在高溫條件下不育，而在適溫條件下花粉可育，同樣表現為溫敏雄性不育。這些結果說明突變的RZ基因是溫敏不育基因，將該基因命名為temperature-sensitivesterileRZ，其野生型和突變型分別簡稱為TSSRZ(SEQIDNO:l)和tssrz(S￡QIDNO:3)。TSSRZ及其在其它植物的同源基因如雙子葉模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的同源基因序列NUZ(SEQIDNO:4)的表達抑制或其功能缺失突變型表達異常的蛋白，能導致植物溫敏雄性不育。與己有技術相比，本發(fā)明的具有以下有益效果(1)闡明了安農S-l的溫敏不育的分子機理，獲得了安農S-l溫敏不育基因tms5;(2)本發(fā)明提供的溫敏育性基因具有重要的應用價值，是根據所述基因序列信息產生特異性的分子標記或其緊密連鎖標記，包括但不限于SNP(單核苷酸多態(tài))、InDel(插入缺失多態(tài))、RFLP(限制性內切酶長度多態(tài))、CAP(切割擴增片段多態(tài))，用這些標記可鑒定水稻或野生稻或雜交后代植株的基因型，用于分子標記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率；同時利用己闡明的溫敏不育的分子機理培育植物溫敏雄性不育系，即利用RNAi或反義RNA(anti-senseRNA)或過表達負顯性(dominantnegative,DN)原理的轉基因技術使正常水稻品種中的75SiZ基因和其它植物的7^S/Z同源基因的功能喪失，實現培育溫敏雄性不育系的方法。圖1是實施例1水稻溫敏不育基因座tms5的染色體連鎖定位圖。圖2是實施例2正常水稻品種安農N的TSSRZ(RA-ANcDNA)和溫敏不育系安農S-1的tssrz(RA-AScDNA)編碼區(qū)的差異示意圖。圖3和圖4是實施例2用反轉錄PCR技術檢測溫敏不育基因TSSRZ在幼穗的表達，其中圖3為TSSRZRT-PCR擴增的結果圖；圖4為actinRT-PCR擴增的結果圖。兩圖中，l為花粉母細胞時期穗，2為減數分裂時期穗，3為小孢子早期穗，4為小孢子晚期穗。圖5和圖6是實施例3將正常水稻品種(中化ll)中的TSSRZ基因導入安農S-l，獲得的TO轉化體在高溫(28-35。C)下的花粉恢復可育的照片。其中圖5為未導入TSSRZ基因的安農S-l在高溫(28-35。C)下花粉的育性照片；圖6為導入TSSRZ基因的安農S-1在高溫(28-35。C)下花粉的育性照片。圖7為實施例4利用RNAi技術抑制水稻品種中化11的TSSRZ表達后，在高溫(28-35。C)條件下產生不育的照片。圖8為實施例4利用RNAi技術抑制水稻品種中化11的TSSRZ表達在適溫(19-24。C)下表現花粉可育的照片。圖9和圖10所示為實施例4利用RNAi技術抑制水稻品種中化11的TSSRZ表達。圖9為用TSSRZ作為探針Northern雜交的結果圖，顯示RNAi轉化系中TSSRZ表達水平明顯下降，圖10為總RNA電泳結果圖。圖中CK為未轉化的中花ll，l和2分別為RNAi轉化株系，圖11和圖12所示是實施例5利用RNAi技術抑制擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)的同源基因NUZ的表達。其中，圖11為用擬南芥TSSRZ作為探針Northern雜交的結果圖，圖12為總RNA電泳結果圖。圖中CK為未轉化的擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)，l為RNAi轉化株系。圖13和圖14為實施例5利用RNAi技術抑制擬南芥的同源基因NUZ的表達后，不同溫度條件下花粉萌發(fā)的結果。其中，圖ll為適溫(25°C)下花粉可以萌發(fā)的照片；圖12為高溫(30。C)條件下的花粉不能萌發(fā)的照片。圖15所示為實施例6用SNP標記RA1鑒定正常水稻品種安農N(AN)和溫敏不育系安農S-l(AS)的溫敏育性基因的基因型，圖中RANR和RASR分別為TSSRZ和tssrz的特異引物。具體實施方式實施例1tms5的精細定位(多態(tài)性分子標記的篩選和tms5基因的連鎖定位)根據公開的水稻基因組序列數據庫的資料(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，在該區(qū)域發(fā)展了多個分子標記，如表1所示表1與tms5緊密連鎖或共分離的多態(tài)性分子標記分子標記引物名稱引物序列AN1AN1FAN1RPL1PL1FPL1RNAC1NAC1FNAC1RRA1RA1FRA1RRASRRANR5'-CGAGGCCTTGGCAAGGTAG-3'5'-TACTGAATCAATCTCCGTCTG-3'5'-GTTCATGCATTGAAGGAAGG-3'5'-GAGTTCTTGGTACATGAGTG-3'5'-AGCGCACATAGGACAGATAG-3，5'-GGTCTTCGTTGGTAACCTCCG-3'5'-CAACCTCTTACAGGCTAGATG畫3'5'-AAGATGACGCAGGTCTCCTG-3'5'-TGAGGGGCGGCGCCTTCT-3'5'-TGAGGGGCGGCGCCTTCG-3'表1中的AN1、PL1和NAC1為插入/缺失(InDel)標記；RA1為單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記。SNP標記的檢測方法為第1次PCR用引物"RA1F"與"RA1R"擴增33個循環(huán)，然后取0.5MlPCR產物為第2次PCR的模板，每個樣品配制2個反應，即用引物"RA1F"與"RASR"為溫敏不育基因型的特異反應，用引物"RA1F'與"RANR"為野生基因型的特異反應，擴增8—10個循環(huán)，用6%聚丙烯酰胺凝膠檢測PCR產物，見13和圖14。分子標記與目標恢復基因的重組事件越多，表示兩者的遺傳距離越遠，反之其遺傳距離越近。利用這種遺傳作圖的方法和安農S-l與粳秈89雜交的6000多株F2植株構建了一個tms5基因的遺傳連鎖圖，見圖1。圖中2個標記ANIDL76和DLNAC1與tms5之間分別只有1個重組事件和3個重組事件，而標記IDLPL與tms5基因是零重組即共分離。ANIDL76和DLNAC1之間的物理距離約為8.4kb。所述的定位區(qū)域位于已公開的水稻細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)OJ1006_D05(http:〃www.ncbi.nlm-nih.gov)的約36-45kb處。實施例2tms5的克隆與序列分析根據GenBank公開的水稻(粳稻)基因組DNA序列和RiceGAAS軟件(http:〃ricegaas.dn&affrc.go.jp)分析，在定位的8.4kb區(qū)域內只存在2個預測的基因，這2個基因分別是果膠裂解酶(Pectatelyase,簡稱為PL)和核酸酶Z(RNaseZ，簡稱為RZ)。其中果膠裂解酶基因編碼1個446氨基酸的蛋白質，而核酸酶Z基因編碼1個302氨基酸的蛋白質。使用弓l物PLf(5，-CTCCTCTCGATGCACTCATG-3，)與PLr(5，-GATAGCATGACATGGCATTG-3，)和RZf(5，-CACGTCGTCAACAACGACTAC-3，)與RZr(5'-CCTGTTAACCGGTTGAGGTG-3')從正常品種安農N和溫敏不育系安農S-1用PCR技術擴增出PL和RZ基因組全序列(包括啟動子與編碼區(qū))，克隆到質粒載體pUC18。經測序分析，發(fā)現PL的DNA序列在安農N和安農S-1之間沒有差異，而RZ的DNA序列在安農N和安農S-1之間只有1個核苷酸的差異。并通過測定安農S-l和正常品種間RZ基因的cDNA序列，發(fā)現此核苷酸的變異發(fā)生在安農S-1的編碼區(qū)的第71位，即由C突變?yōu)锳，結果導致密碼子由TCG(Ser)突變?yōu)榻K止密碼TAG，產生一個只編碼23個氨基酸的截斷短肽，見圖2。用反轉錄PCR技術檢測到RZ基因在花粉母細胞時期的幼穗表達，其它時期的幼穗不表達，見圖3和圖4。因此，此突變的RZ基因可能是產生溫敏不育的基因。實施例3遺傳轉化鑒定目標基因的功能用弓|物RZf(5'-GTTCGGTGTGTGAAGGGGTG-3，)與RZr(5'-CCTGTTAACCGGTTGAGGTG-3')將從安農N擴增的4kb的RZ基因片段(包含啟動子區(qū)、編碼區(qū)、及其下游區(qū)序列)克隆到雙元轉化載體pCAMBIA1300。用電激法將該表達載體導入常用的土壤根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105。通過根癌農桿菌介導法(Hiei等，PlantJ.6:271-282)轉化由安農S-l轉育的溫敏不育系，獲得T。代轉基因植株。經分子檢測，獲得含有外源基因的轉化體，這些轉化體在高溫條件下(28-35。C)花粉育性正常，見圖5和圖6。收獲T。代種子，種植Ti代，在高溫條件下(28-35。C)T1代花粉育性出現分離，即含有轉基因的植株花粉可育，而不含轉基因的植株花粉敗育。這些結果證明了突變的RZ是溫敏不育基因。本薦明將此基因的野生型和突變型分別命名為TSSRZ禾卩tssrz(temperature-sensitivesterileRZ)。實施例4用RNAi技術抑制TSSRZ基因的表達產生溫敏不育轉化體植物轉化RNAi載體的構建按公開的載體和方法(胡旭霞和劉耀光，植物分子育種，4:1-6)進行，此RNAi載體由組成型的玉米泛素基因啟動子控制目的雙鏈RNA的產生。用引物RAZif(5，-aaaaAAGCTTcatggaccagtccgagctc-3，)禾卩RAZir(5，-aaaaGAATTCgteacactgatteagtatctc-3')對花粉母細胞時期的幼穗cDNA進行擴增。將擴增得到的TSSRZ的cDNA片段用BamHI和Hindin進行雙酶切，連接到pRNAi-ubi載體(胡旭霞和劉耀光，植物分子育種，4:1-6)的第一克隆位點。用電激法轉化大腸桿菌ToplOF'，再用pRNAi-ubi載體通用引物RNAi-Mlu(5，-CACCCTGACGCGTGGTGTTACTTCTGAAGAGG-3，)和RNAi-Pst(5，-ACTAGAACTGCAGCCTCAGATCTACCATGGTTCG-3，)對克隆的目的片段進行PCR擴增，獲得末端含有MluI和PstI酶切位點的目的片段。將目的片段用MluI和PstI酶切，克隆到第一輪陽性載體(也用同樣的酶切好)的第二克隆位點，然后將其轉化大腸桿菌DHIOB。將構建好的RNAi載體電擊轉化到農桿菌EHA105，用根癌農桿菌介導法(Hiei等，PlantJ.6:271-282)轉化正?？捎酒贩N中花11，經篩選獲得了含有轉基因的24株To代體。將每個To轉化體的分蘗分開種植，在生殖發(fā)育對溫度敏感的花粉母細胞時期進行高溫處理(28-35。C)和適溫(19-24°C)處理7天。結果高溫處理的產生敗育花粉且花粉量很少，而經適溫處理的可育花粉量達50%以上，結果見圖7和圖8。適溫處理的T。轉化體能結實獲得1\植株。再次對T\植株進行花粉母細胞發(fā)育時期的高溫處理(28-35。C)7天。結果Ti植株的花粉育性出現分離，即含有RNAi轉基因的單株花粉敗育，而不含RNAi轉基因的單株花粉可育。RT-PCR檢測結果表明，攜帶RNAi轉基因的Tt轉化體的TSSRZ表達受到抑制，見圖9和圖10。這些結果說明抑制TSSRZ基因的表達產生溫敏不育。實施例5擬南芥TMS5同源基因RNAi載體構建及轉化后代分析用TSSRZ基因序列對生物數據庫進行同源性搜索(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，獲得雙子葉豐莫式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的同源基因序列NUZ(SEQIDNO:3)。利用NUZ特異引物NUZif(5，-aaaaAAGCTTcacatggatcatatcggtgg-3，)和NUZir(5'aaaaGGATCCtcctteactgtataccgagc3，)PCR擴增擬南芥花的cDNA。將擴增得到的目的片段用BamHI和HindIII進行雙酶切。按實施例4相同的方法步驟構建RNAi載體。將構建好的RNAi載體電擊轉化到農桿菌EHA105，用花器官浸泡法(CloughandBen11998，PlantJ.16,735-743)轉化擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)，收獲的To代擬南芥種子均勻播種在含有潮霉素的培養(yǎng)基上，在篩選培養(yǎng)基上萌發(fā)并存活的植株即為1代陽性植株。在1植株生長到到抽苔后的花粉母細胞發(fā)育時期，部分植株進行高溫(28-35。C)處理7天，部分植株進行適溫(19-24。C)處理。結果高溫處理的植株產生花粉敗育，適溫處理的植株花粉可育，見圖11和圖12。經適溫處理的l植株獲得丁2代種子。再次在T2植株抽苔后的花粉母細胞發(fā)育時期進行高溫條件處理，結果T2植株得花粉育性出現分離，含有RNAi轉基因的植株花粉敗育，而不含轉基因的植株花粉可育。RT-PCR檢測結果表明，攜帶RNAi轉基因的T2轉化體的NUZ表達受到抑制，見圖13和圖14。這些結果說明，采用基因工程方法抑制TSSRZ或其同源基因得表達，或篩選這些基因的自然突變或人工誘變突變體，可以在單子葉植物和雙子葉植物培育溫敏雄性不育系，用于雜交種子生產。實施例6溫敏不育基因序列在分子標記輔助選擇育種中的應用利用本發(fā)明提供的序列信息可以產生水稻溫敏不育基因tssrz及其緊密連鎖的分子標記，用于鑒定水稻tms5位點的基因型，可在分子標記輔助選擇育種中應用。例如，表1所示的標記RA1可用于鑒定水稻正?？捎旰蜏孛舨挥甑幕蛐?，結果見圖15,即某個品種用"RA1F"與"RASR"引物組合可以擴增出特異的條帶，而用"RA1F'與"RANR"引物組合不能擴增出特異的條帶，該品種為溫敏不育系；相反即某個品種用"RA1F"與"RASR"引物組合不能擴增出特異的條帶，而用"RA1F"與"RANR"引物組合可以擴增出特異的條帶，該品種不是溫敏不育系。序列表<110>華南農業(yè)大學<120>一種溫敏雄性育性基因及其應用〈130〉〈160〉5〈170〉PatentIn!version3.1〈210>1〈211>4070〈212〉■〈213〉正常水稻品種安農N(OryzaSativa)〈220〉〈221〉CDS〈222>(2006)..(2485)〈223〉〈220〉〈221〉CDS〈222>(2591).(2686)〈223〉〈220〉〈221〉CDS〈222〉(2797)..(2910)〈223>〈220><221〉CDS〈222〉(3288)..(3356)<223〉〈220>〈221〉CDS<222〉(3455)..(3529)〈223〉<220〉<221>CDS<222>(3826)..(3900)〈223〉<400〉1cctgttaaccggttgaggtg鄉(xiāng)ccttggcaaggtaggcacggagattgattcagtaatc3tgtg3tt幼tt3CgC3g3taacagacagaggagtaacatccccttccttttcctgagcttgatcaggatgagc鄉(xiāng)cctgcgatcaagtttttggggagcactgctacatcttcgccaa3SLgCCtC33Ct￡Lgt￡LCa_tg￡Ltgctgctagaagatttttctaatgttatacttattttatgtcattgca幼tgtcatgtttaagag幼cgaggtagcggagtgaggattgtgtccgatattttgtgattctattttgaacactttttaaaataattcgaacatttcgggaattccgaacgagggaatttatcctcatgactatcttcacttaaaatctaataaacttcteaactgcctaaggtggtgggacggcggctgctaatttggttttgaatccaagctctctatgtgcttctggctccggaactcccgctcttgggcatgtcgacggcgttctcaggttaatgcttattatcttgt郷tttgaggtcacttcgcatttgtgttgttaattttagcaattatgacgccctgcctttttccttctatatatctgtccattaattctcagccacgcgcctctctctcttaacgagagctgttatccttcctagcggactccccggttcgtccagttgccgcgactgctggtatatgtcatcgcaatgttcatgctgagtggtggaccttgatgttgtgccggatgctccaaatctaaaaaatattttgcattgtgcatcaatacgctg3Ct3Cgta>￡Lggcgcgcgccgcgttttcattgaattcattcgcgctacaattgtctacttctgttcacttggtacctgcatcctgttcgac^cactcgcaccattcccttatacaattgcgcaccatcactgcagccaatttggtggagaagatctgaagctttccgagatcaaatttggagtgtccggtggggagttteagggg犯ttggactatxggatatwattagetacatgeatgggctgggccgttgtaacagagatgttaatctcctcccagcctcctcgattcgcgcacggggggtaggeggaacggttctatggcactggaccgttaattattactatgtgttgggtcaagatgcgtg卿attttegga/tccaaattcaattaeggggatgaggaaattctgaatccaataacaccatacgacagtgcag60120180240300360420■5406006607207808409009601020108011401200126013201380<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>505560ArgAlsValSerGinGluPheLeuPhelieSerHisAlaHisLeuAsp65707580HislieGlyGlyLeu85ProMetTyrValAla90ThrArgGlyLeuTyr95ArgGinArgProPro100ThrliePheliePro105AlaCysLeuArgAsp110ProValGluArgLeuPheGluLeuHisArgSerMet.AspGinSerGluLeuSer115120125HisAsnLeuValProLeuGlulieGlyGinGluHisGluCeuArgArg130135140AspLeuLysValLysAlaPheLysThrTyrHisAlalieProSerGin145150155160LeuGinPheLysAla165AlaLeuGluArgGlu170GinGinValHisAsn175ValAsnHisGlulie180AlalieSerLeuAsp185LysTyrThrAsnCys190ProLeuSerGlyThr195GlulieAlaGluLeu200ThrGinProLeuArg205SerMetThrCysGly210HisliePheAspArg215GinHislieMetAsn220TyrMetGlySerSerLeuLysGlyCysProVallieGlyCysProGlyAlaValSerAsn225230235240AspLeuValPheGlu245AspAlaGluLeuArg250HisAsplieLysTyr255CysGinCysAspLys260LeuGluAsnLysAla265lieLeuLeulieHis270PheSerAlaArgTyr275ThrAlaGluGlulie280AsplieAlalieAsn285LysLeuProProSerPheArgSerArgValHisAlaLeuLysGluGlyPhe290295300〈210〉3〈211〉4070<212〉腿〈213〉水稻溫敏不育系安農S-l(OryzaSativa)〈220>〈221〉CDS〈222〉(2006)..(2485)〈223〉<220><221>CDS<222>(2591).(2686)<223>〈220><221>CDS〈222>(2797).(2910)〈223〉<220>〈221〉CDS〈222〉(3288)..(3356)〈223〉〈220>〈221〉CDS〈222〉(3455)..(3529)〈223〉〈220>〈221>CDS〈222〉(3826)..〈223〉〈400〉3cctgttaaccaggccttggcCgg卿ttgELccccttcctttgatcaggatgcgatcaagtcactgctacaaagcctcaactgctgctagaaatgttatactcattgcaaa朋gag33cgatg鄉(xiāng)attgtttgtgattxtctttttaaaaatttcgggaagggaatttatatcttcacttaaacttctaac犯caaccgggcactgcaactgcatttgtgagctgccattccgatgcaacc幼tgttgatacgtgcaattaagctcccacggccgttggagtgcccggccccacggcggcCtCC3CC3CCgggctaccccgctgagcgcccttcatctccgggcctctacggagcgcctcccccctcgaggacctaccacgtgattgtagcctccctgggttuttttttgatgttgttggagattgcttgttttgaaggttgttgtcaacttcaagcaccagcctttgcattttttcaacctgaagcataattatctxc(3900)ggttg郷tg鄉(xiāng)gt郷CSLttcagtaatcttacgcagatggagtaacatttcctgagctgagcaggcctttttggggagtcttcgccaatagtacatgaagatttttctttattttatgtgtcatgtttggtagcggaggtccgatattattttgaacataattcgaacttccgaacgacctcatgactaaaatctaatactgcctaagcatccatgaattcttgcg犯gct.ttgacactcccgatgggctcttgcaccgttattccaacttttacgtcgtgttcaccctatcaatccacggcccatcgggcggcggcggcgccgccacgtgg鄉(xiāng)gcagccttcgacaca>cgccc3cccggcagcgccttcgagctccattggtcagggccattcccagattgattgagggtatgtga3gCg3g￡ltC3tttgatattgatgctgtgcgttaccggagattgtcattgtggatatcagtttttcaggaggtttcagtttaaa111aactgtggtgggacggcggctgctaatttggttttgaatcc犯gctctctatgtgcttctggctccggaactcccgctcttgggcatgtcgacggcgttctcaggtta>atgcttattatcttgt鄉(xiāng)tttgaggtcacttcgcatttgtgUgttaattttagcaattatgacgccctgcctttttccttctatatatctgtccattaa11ctctccataaacctccttaacccgeicgacgstgggcagcaagctacactcctattcgcgaaaattccaacctcacgccagcagtgcttcgtgcgcgccatggccgggtcggcctctccatcggtcggccggtgtcgaccacatcgcccaccataccgctccatagcacg已gctgccaggtgaatttggtcggatatacacggtagcagctgaatggatgtctgtggttctgtttacgatggcatgtagtggagtgctattcagagattgattcttgcggaaccccattctgaatagtgaactgagccacgcgcctctctctctt犯cgagagctgttatxcttcctagcggactccccggttcgtccagttgccgcgactgctg￡LC^LC3CC3ggtatatgtcatcgcaatgttcatgctgagtggtggaccttgatgttgtgccggatgctcggtactgaaacaaatctaaaaaatattttgcattgtgcatcaatacgctgactacgtaagg卿gtggcctctgaatctgacgaacaccgtattcgaccgtggttatcggt6L￡LtCg3t￡ia_accggtaatgttacaggctatagtcgaccgcaaaacgggcgaacagcggcgaagt卿agcgggc鄉(xiāng)agcccgcagcgccggcggcctccttcatccccggaccagtccc鄉(xiāng)郷gacgggttcatca幼tgtgtggtgctgtc鄉(xiāng)tgatg犯atggtttcagattagatttcattcgtattgcttccctgagaaaacaactccataaattggcagctatttattgttgttctggaagcgcgcgccgcgttttcattgaattcattcgcgctacaattgtctacttctgttcacttggtacctgcatcctgttcgacacactcgcaccattcccttatacaattgcgcaccatcactgcagccaatttggtgg卿6Lgatctgaagctttccgagatc3aatttgg3gtgtccggtggggagttt33ggggaattggactatcggatat^att解ctacatgcatgaaacagctgcataggttgtccctgattctgaggaatctcttgccg鄉(xiāng)agtcgtaaggaagatgttgaagagtagacattcgtgccgg犯aagtxatcgcgcgccgccccacctgcgtcagccgtctcgccccatgtacggcctgcctcagagctcagccctcaa3gtg3gttcttggttgaatttggttctcaagccaggtggaggtctaatacaattccgaatacattttgatcctgattatcgtcteatcaacagaatt33Ctg￡Lt￡L犯ttagtgggccttctcctgattgcagagtggctgggccgttgtaacagagatgttaeLtctcctcccagcctcctcgattcgcgcacggggggtaggcggaacggttctatggcactggaccgttaattattactatgtgagatcaattcttgggtc鄉(xiāng)atgcgtg卿attttcggatccaaattcaaagggtccgaatt3Cgggg3tgeiggaaattctgaatccaatgacagtgcagtacttcacctaagataatct3tggatgcagtiaccttcgctgaagcccttctt肪tatattgatgcccccaaaagcatcctggacttgggccC33CCCCCC3cggcggcgactcaccgtcgatcttcccgacaggagttccttcgccacccggggaccccgtacaacctcgtaggccttcaacttctggatgg卿tgtgatagtatcttgggttgttgtttacaatttagtgacggtgccttaatgcggattatggttaatgaaactgtttactgagtaccaactatgttgacgaaattttacttttgttg60120180240300360420480540600660720780840■9601020108011401200126013201380144015001560162016801740l謂1860192019802040210021602220228023402400246025202581264027002760282028802940300030603120318032403300〈210〉〈211>〈212〉〈213〉〈220〉〈221〉〈222〉〈223〉〈400〉atgactctgtttcccaaattaattttgcccctgttgtaattttgtttcaattttaatgcctcctcttaaaatttttttctcaaagatgaacatgtaccaacttgagtcct41009DNAtacaatttgagttgcttatttttatctttttattctgctaaccaattttacctctgtggatatcattatgacaccatcatttgccaccctcgtgatcaatcgaactcttttgaaacatttccsitgcaagagcatatttctgttttatgtattccacttttcttatatcattttattttttggc3ggca^a_tttgtgtttctttcagaagtttttttttggtgtagcacccaatatgggcagcagatactgtgctcgttatttatcctgattttcaagcaatgtgcccactattctttacatcacatccttagagttca/Lgcattcaacctggggg郷ggcttcacacaccacccatctgacatttcaccaatcagtgtgaccgc卿ggtC3att3gt￡Lgtttcacc犯tttcttgtagaataaatacacattgaaggatactctcctcgggggstcgacgaac3tt^tttgaggttatagcattgcttgagctatctatctgtatgctattgttattcatcctcctttttatcttcatgatatagcaaggtttctgatcgatgcactatccttaact擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)(ArabidopsisThaliana)ORF(80)..(922)4atttcatcgaaaccctaaggcg鄉(xiāng)gattgtttcgacattctctcacatgaatgiagcctcgaagttcaccatccaaagctggcctatctaactaatgctttcggtatcgtcatgctgaatgcact犯catttgtattccacacttggtgaacagtgagatcgattggtgggtcgttgccgatcatatcgccaacgatta11tattataacagggttatgcctg犯gttggatgctctcagt卿gcatgatcgaaga/tgcaaggattctacatgtaaactgg卿agaaggcacg卿ccacatcgcgcgtggattacctagtacccgcattcttcagaggaaagatcttagtgtattxcttttaicgggaggcaa鄉(xiāng)tcgagagattaaca^agcaatcggtttctgcattgtattctgaa^cg犯gg3aagc3titggtgcatcataaatttctcaaaatgtatgttgctaaagcacc犯3gtca^aactaaatatgaaggtttxsagatacaacgtctcgtcatgtggeicatatccctgctaatcattgcctccaacactcttatgttgttaatt6LgC3C3gCC3tttccatctcgacttcctctgctactagagaatcttgttggcctttaagaggtgttg聊tcggattttggagagcacatcacttttcggcctttagaggttaagatttgttacccgatttcggatagctcatxtctcagcttgtacaaagagtttattgcttggacatcattccatgtaggaatatatttecagacagttcttgatgactcggtatacgacgtgtgtttacttttgtt336034203480354036003660372037803840390039604020407060120180240300360420480540600660720780840■9601009〈210>5〈211〉280〈212〉PRT〈213〉擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)(ArabidopsisThaliana)〈400〉5MetGluLysLysLysAlsMetGinlieGluGlyTyrProlieGluGly151015LeuSerlieGlyGlyHisGluThrCyslieliePheProSerLeuArg202530lieAlaPheAsplieGlyArgCysProHisArgAlalieSerGinAsp354045PheLeuPhelieSerHisSerHisMetAspHislieGlyGlyLeuPro505560MetTyrValAlaThrArgGlyLeuTyrLysMetLysProProThrlie65707580lieValProAlaSerlieLysGluThrValGluSerLeuPheGluVal85HisArgLysLeu100AspSerSerGluAsplieGly115GluGluPhelielie120PheLys130ThrPheHisVallie135GinThrLysTyrLysLeuLysLysGlu145150lieLysAsnLeuLys165ValSerGlyThrProGluVal180AlaPheThrGlyAspGluThr195AsnAlaAspAlaLeu200SerThr210PheLeuAspAspSer215ValGlyHislieHislieSerGlulie225230AsnLysAlalieLeu245LeulieHisGlulieGluAsp260AlaValSerAlaValPheAla275LeuThrGinGlyPhe2809095LeuLysHisAsnLeuValGlyLeu105110ArgLysAspLeuLysValLysAla125SerGinGlyTyrValValTyrSer140TyrlieGlyLeuSerGlyAsnGlu155160ValGlulieThrAspSerlielie170175AspThrThrSerAspPheValVal185190LysAlaLysValLeuValMetGlu205SerValGluHisAlaArgAspTyr220ValAsnHisAlaGluLysPheGlu235240PheSerAlaArgTyrThrValLys250255LeuProProProLeuGluGlyArg265270權利要求1.一種溫敏雄性育性基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1或SEQIDNO4。2.含有權利要求1所述溫敏雄性育性基因的遺傳標記，其特征在于第71位的堿基C突變?yōu)锳。3.權利要求1所述溫敏雄性育性基因所編碼的蛋白質，其特征在于編碼蛋白質的氨基酸序列如SEQIDNO:2或SEQIDNO:5。4.含有權利要求l所述溫敏雄性育性基因的載體。5.含有權利要求l所述溫敏雄性育性基因的重組微生物。6.權利要求1所述溫敏雄性育性基因在培育植物溫敏不育系中的應用。7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述的溫敏不育系是溫敏雄性不育系。8.權利要求2所述遺傳標記在水稻育種中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種溫敏雄性育性基因及其應用，還公開了上述溫敏雄性育性基因的遺傳標記，提供了上述溫敏雄性育性基因所編碼的蛋白質和含有上述溫敏雄性育性基因的載體及重組微生物。本發(fā)明還公開了上述溫敏雄性育性基因在培育溫敏雄性不育系中的應用和上述遺傳標記在水稻育種中的應用。本發(fā)明通過圖位克隆技術安農S-1溫敏不育基因座tms5獲得了溫敏育性基因TSSNR，通過轉基因實驗驗證了此基因的功能，并提出了RNAi或反義RNA或過表達負顯性原理的轉基因技術，可使正常水稻品種中的TSSRZ基因功能喪失，培育溫敏雄性不育系，具有重要的應用價值。文檔編號C12Q1/68GK101333533SQ200810029748公開日2008年12月31日申請日期2008年7月25日優(yōu)先權日2008年7月25日發(fā)明者劉勤堅,劉耀光,森盧,平吳,海周,唐佩君,姜大剛,莊楚雄,朱麗雅,靜李,梅曼彤申請人:華南農業(yè)大學