一種瓊膠酶及其基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種瓊膠酶及其基因、含有該基因的重組載體和細(xì)胞，以及該瓊膠酶的表達(dá)和應(yīng)用。所述瓊膠酶的氨基酸序列如SEQNO.1所示。將所述瓊膠酶用于降解富含瓊膠的底物，主要產(chǎn)物為二糖、四糖類的寡聚糖，實(shí)現(xiàn)瓊膠酶的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明利用基因工程手段克隆表達(dá)了瓊膠酶，實(shí)現(xiàn)了瓊膠酶的規(guī)模制備，獲得了優(yōu)質(zhì)的瓊膠酶產(chǎn)品。本發(fā)明通過酶活測定和底物特異性的分析，證明本發(fā)明的瓊膠酶對瓊膠和龍須菜有很好的分解能力。
【專利說明】一種瓊膠酶及其基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種瓊膠酶及其基因、含有該基因的重組載體和細(xì)胞，以及該瓊膠酶的表達(dá)和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]海洋細(xì)菌中的瓊膠降解菌是目前產(chǎn)生瓊膠酶最多的一類微生物，目前研究者所研究的瓊膠酶大部分都是來自于海洋細(xì)菌。已知的瓊膠降解菌主要來自于幾個菌屬，包括:Vibr1 (弧菌屬)，(假單胞菌屬)，(假交替單胞菌屬)，Alteromonas (交替單胞菌屬)，Agarivorans (食瓊脂菌屬)，Saccharophagus (曬糖菌屬)，Microscilla (微顫菌屬)和(假佐貝爾氏菌屬)等。另外，從土壤和淡水中也發(fā)現(xiàn)了一些能夠產(chǎn)生瓊膠酶的細(xì)菌，如Cellvibr1 (纖維弧菌屬),Jcifle1Aacier (不動桿菌屬)，ifeci77w5.(芽孢桿菌屬)，Cytophaga (曬細(xì)胞菌屬)等。
[0003]根據(jù)瓊膠酶降解瓊脂糖作用方式的不同，可以把瓊膠酶分為兩大類:α -瓊膠酶和β -瓊膠酶。α -瓊膠酶裂解瓊脂糖的α -1, 3糖苷鍵，生成以β -D-半乳糖作為非還原性末端和以3，6-內(nèi)醚-a-L-半乳糖作為還原性末端的瓊寡糖系列；而β-瓊膠酶則裂解瓊脂糖的β -1, 4糖苷鍵，生成以β -D-半乳糖作為作還原性末端和以3，6-內(nèi)醚-a -L-半乳糖作為非還原性末端的新瓊寡糖系列。在文獻(xiàn)報(bào)道中，已確認(rèn)的β -瓊膠酶比α -瓊膠酶更為豐富。
[0004]已報(bào)道的β -瓊膠酶主要被劃分為幾類糖苷水解酶家族(Glycosidehydrolasefamily, GH),如 GH-16, GH-50 和 GH-86 等。Jam 等對來自于ZobelliagalactanivoransDsi j的兩個屬于GH-16的瓊膠酶A和B的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其具有“三明治”式的三維結(jié)構(gòu)以及由兩個酸性氨基酸67?構(gòu)成的活性中心。還有極少數(shù)的β -瓊膠酶是來自于一些新型的糖苷水解家族的，如馬翠萍等在假交替單胞菌CY24中克隆了一個β -瓊膠酶_Β，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，此瓊膠酶不屬于任何一個已經(jīng)報(bào)道過的糖苷水解家族。而已經(jīng)報(bào)道的α-瓊膠酶則都屬于GH-96家族。
[0005]在重組酶的研究中，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌通常被用于重組瓊膠酶的宿主。在大多數(shù)情況下，重組瓊膠酶產(chǎn)生于大腸桿菌的胞內(nèi)，然而一些瓊膠酶在自身信號肽的控制下能夠分泌到培養(yǎng)基中。據(jù)報(bào)道，從m_r1 577.V134和577.LQ48克隆的瓊膠酶存在于培養(yǎng)基和細(xì)胞沉淀中。目前，已有不少β -瓊膠酶進(jìn)行了克隆表達(dá)，克隆的β -瓊膠酶的分子量從30kDa到147kDa不等。通過比較SDS-PAGE結(jié)果和預(yù)測的蛋白分子量，發(fā)現(xiàn)二者是一致的，這證明這些重組的瓊膠酶都是單一的多肽。此外，這些瓊膠酶的酶的比活大小不一，其中從來自海水的假交替單胞菌Offlmas sp.CY24中克隆的rAgaB降解瓊脂糖的酶比活最大，為5，OOOU/mgo
[0006]瓊膠酶降解瓊脂生成瓊膠寡糖，而瓊膠寡糖又分為瓊寡糖和新瓊寡糖。大量的報(bào)道證明，瓊膠寡糖由于其特有的生理和生化特性而具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。寡糖的混合物能夠清除羥自由基、超氧化陰離子自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，從而表現(xiàn)出各種抗氧化特性。研究表明，具有硫酸基團(tuán)的或高分子量的寡糖比沒有硫酸基團(tuán)、低分子量的寡糖的抗氧化能力強(qiáng)。此外，新瓊寡糖還能抑制細(xì)菌的生長，減緩淀粉的降解，作為低能量的添加劑提高食品的品質(zhì)。低聚合度的產(chǎn)物，如新瓊二糖，對皮膚有保濕的作用，并且能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞的產(chǎn)生，具有美白功效。瓊膠酶能夠用于降解紅藻細(xì)胞壁，以便從海藻中提取易分解的生物活性物質(zhì)，例如不飽和脂肪酸、維生素和類胡蘿卜素等。因此，由于新瓊寡糖具有以上這些特性，使其在食品、制藥和化妝品行業(yè)具有潛在的應(yīng)用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的主要目的在于提供一種海洋微生物來源的瓊膠酶及其基因和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)瓊膠酶的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化。
[0008]本發(fā)明首先提供了一種瓊膠酶，其氨基酸序列如SEQ N0.1所示。
[0009]本發(fā)明還提供了編碼所述的瓊膠酶的瓊膠酶基因。
[0010]所述瓊膠酶基因的核苷酸序列如SEQ N0.2所示。
[0011]本發(fā)明保護(hù)一種包含所述瓊膠酶基因的重組載體。所述重組載體是大腸桿菌質(zhì)粒pET28a (+) -Agarase 或酵母質(zhì)粒 pPIC9k_Agarase。
[0012]本發(fā)明還保護(hù)一種細(xì)胞，所述細(xì)胞含有所述的瓊膠酶基因的核苷酸序列；或所述細(xì)胞由包含所述的瓊膠酶基因的重組載體經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得；所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
[0013]本發(fā)明還提供了所述的瓊膠酶基因的克隆方法，步驟包括:利用瓊膠酶氨基酸保守片段的簡并引物，通過PCR技術(shù)獲得微泡菌sp.) 一段瓊膠酶的編碼基因；再通過genome walking獲得其全長，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，得到瓊膠酶基因。
[0014]以及，一種所述的重組載體的制備方法:采用所述瓊膠酶基因的核苷酸序列經(jīng)和AfoiI雙酶切后與&oRI和Afoi I雙酶切的pET28a (+)載體連接，得到大腸重組表達(dá)載pET28a(+)-Agarase，或采用所述的瓊膠酶基因的核苷酸序列經(jīng)&0RI和Not I雙酶切后與沿ol和AfoiI雙酶切的pPIC9k載體連接，得到酵母重組表達(dá)載體pPIC9k-Agarase。
[0015]另外，本發(fā)明還保護(hù)一種所述的瓊膠酶的制備方法:培養(yǎng)含有瓊膠酶基因的細(xì)胞或培養(yǎng)包含瓊膠酶基因的重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)，收獲表達(dá)產(chǎn)物，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。
[0016]以及，所述瓊膠酶的應(yīng)用，利用本發(fā)明的瓊膠酶降解富含瓊膠的底物，主要產(chǎn)物為二糖、四糖類的寡聚糖。
[0017]詳述
本發(fā)明涉及從微泡菌577.)中克隆瓊膠酶基因。實(shí)施方式之一，本發(fā)明利用瓊膠酶氨基酸保守片段的簡并引物，獲取微泡菌#.)基因中一段瓊膠酶的編碼基因；再通過genome walking技術(shù)獲得全長,并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，得到瓊膠酶基因。實(shí)施方式之一中，所述編碼序列包含如SEQ N0.2所示的核酸序列，稱之為Agarase。實(shí)施方式之一中，所述編碼序列是SEQ N0.2中的核苷酸I至824所示的核苷酸序列。
[0018]本發(fā)明還涉及包含所述瓊膠酶編碼序列的重組載體，例如由各種本領(lǐng)域常用的表達(dá)載體制備的重組載體，其中，所述編碼序列不包含其來源微生物的內(nèi)源性信號肽序列。實(shí)施方式之一中，將不帶內(nèi)源性信號肽編碼序列的本發(fā)明瓊膠酶編碼基因經(jīng)RoRI和AfoiI雙酶切后與&oRI和AfoiI雙酶切的pET28a(+)載體連接，得到大腸重組表達(dá)載pET28a (+) -Agarase。另一實(shí)施方式中，將不帶內(nèi)源性信號肽編碼序列的本發(fā)明瓊膠酶編碼基因經(jīng)&oRI和AfoiJ雙酶切后與&oRI和Afoi I雙酶切的pPIC9k載體連接，得到酵母重組表達(dá)載體 pPIC9k_Agarase。
[0019]本發(fā)明還制備包含本發(fā)明瓊膠酶編碼基因的細(xì)胞。實(shí)施方式之一中，所述細(xì)胞是用上述本發(fā)明重組載體轉(zhuǎn)化來構(gòu)建的。所述細(xì)胞優(yōu)選各種利于基因產(chǎn)物表達(dá)或發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞，此類細(xì)胞已為本領(lǐng)域熟知并常用，例如各種大腸桿菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施方式之一中，選用大腸桿菌BL21(DE3)和的畢赤酵母GS115構(gòu)建表達(dá)瓊膠酶的重組細(xì)胞。
[0020]本發(fā)明還提供了制備和應(yīng)用瓊膠酶的方法，包括:培養(yǎng)前文所述本發(fā)明包含瓊膠酶編碼基因的細(xì)胞或所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)，收獲表達(dá)產(chǎn)物，還可以可行性地包括純化表達(dá)產(chǎn)物的步驟。實(shí)施方式之一中，本發(fā)明通過包含本發(fā)明瓊膠酶編碼基因的酵母(例如畢赤酵母GS115)發(fā)酵來生產(chǎn)瓊膠酶，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。實(shí)施方式之一中，本發(fā)明通過設(shè)計(jì)瓊膠酶降解瓊膠及龍須菜實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了本發(fā)明瓊膠酶在瓊膠寡糖制備中應(yīng)用的可行性。
[0021]本發(fā)明利用基因工程手段克隆表達(dá)了瓊膠酶，實(shí)現(xiàn)了瓊膠酶的規(guī)模制備，獲得了優(yōu)質(zhì)的瓊膠酶產(chǎn)品。本發(fā)明通過酶活測定和底物特異性的分析，證明本發(fā)明的瓊膠酶對瓊膠和龍須菜有很好的分解能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為微泡菌iMicrobulbifer寧)來源的瓊膠酶基因在質(zhì)粒pET28a (+)和pPIC9k上的結(jié)構(gòu)圖。
[0023]圖2為畢赤酵母表達(dá)微泡菌5/7.)來源瓊膠酶的發(fā)酵過程中的SDS-PAGE ;其中 1-發(fā)酵 60h ;2_ 發(fā)酵 84h ;3_ 發(fā)酵 98h ；4~ 發(fā)酵 122h ;5_ 發(fā)酵 146h ;6_ 發(fā)酵170h ；7~ 發(fā)酵 194h ;M_ marker0
[0024]圖3A為畢赤酵母表達(dá)微泡菌5/7.)來源瓊膠酶的純化，陰離子交換層析條件:平衡液:Tris-HCl pH 8.0, 0.05mM ;洗脫液=Tris-HCl pH 8.0.0, 05mM, IMNacl ;流速 2.5mL/min ；
圖3B為畢赤酵母表達(dá)微泡菌(i/ZcrotoJAi/er sp.)來源瓊膠酶的SDS-PAGE，檢驗(yàn)發(fā)酵液過DEAE所得到的洗脫峰。
[0025]圖4為畢赤酵母表達(dá)微泡菌5/7.)來源瓊膠酶對瓊膠的分解能力，其中1、2、3、4、5分別表示底物與酶反應(yīng)時間為15min、30min、lh、2h、20h，6、7、8、9、10、
11分別表示為糖標(biāo)準(zhǔn)品單糖、二糖、三糖、四糖、五糖以及混合糖。
[0026]圖5為畢赤酵母表達(dá)微泡菌(#icro/w76i/er sp.)來源瓊膠酶對龍須菜的分解能力，其中1、龍須菜懸濁液；2-4、瓊膠酶液降解龍須菜的產(chǎn)物分析；5、二糖；6、四糖。

【具體實(shí)施方式】
[0027]以下根據(jù)具體的實(shí)施例充分說明本發(fā)明。
實(shí)施例
[0028]實(shí)驗(yàn)材料和試劑
1.菌株和載體:
大腸桿菌BL21 (DE3)、JM109、DH5a及表達(dá)載體pET28a (+)購自Novagen公司，畢赤酵母 GS115 及表達(dá)載體 pPIC9k 均購自 Invitrogen 公司(Carlsbad, CA, USA)。
[0029]2.酶類及其他生化試劑:
限制性內(nèi)切酶、DNA Maker、Protein Maker 均購自 Fermentas (MBI), genome walkingkit購自TaKaRa公司，瓊膠購自上海生工，龍須菜:市售；其他常規(guī)試劑為上海生工或進(jìn)口。
[0030]3.培養(yǎng)基:
使用的培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基，YPD，YPAD, BMDY, BNNY, MM，MD培養(yǎng)基均參照Invitrogen畢赤酵母操作手冊。
[0031]4.本發(fā)明中所用到的生物化學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實(shí)施例中，除非特殊說明，所有實(shí)驗(yàn)操作均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分進(jìn)行，包括:[美]J.莎姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南；趙永芳等，生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用(第二版)；朱檢等，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]。
[0032]5.本發(fā)明中所有相關(guān)的酶活、酶活力、酶活性均是指瓊膠酶酶活性，均采用DNS法并按照所述的方法進(jìn)行測定及計(jì)算。
[0033]實(shí)施例1瓊膠酶基因的獲得
(I)微泡菌sp.)基因組DNA的分離提取:
取1.5mL微泡菌(#icro/w7Ai/kr sp.)(中國海洋微生物菌種保藏管理中心)菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心lmin，棄上清液，收集菌體；加入400 μ L裂解液(40mMTris-醋酸，20 mM醋酸鈉，ImM EDTA，1% SDS，pH 7.8)混勻，置于37°C水浴Ih ;然后加Λ 200 μ L 15mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000rpm離心15min ;取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提I次；加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M，pH8.0)，_20°C保存Ih后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50 μ LTE溶液中，置4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0034]( 2)瓊膠酶保守序列的獲取
對NCBI已有的瓊膠酶基因進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)簡并引物以擴(kuò)增瓊膠酶基因保守序列。
[0035]PCR程序?yàn)?94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 2min，循環(huán)擴(kuò)增30次；最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并回收凝膠中的目標(biāo)基因。
[0036](3) genome walking 獲取目的基因
以獲得的瓊膠酶保守序列為模板，根據(jù)genome walking kit進(jìn)行操作。擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并回收凝膠中的目標(biāo)基因，測序。
[0037](4) PCR獲取目的基因
以由genome walking擴(kuò)增得到的最終序列為模板,設(shè)計(jì)上下游引物Pl和P2。上、下游引物分別含有及^7? I和Afoi I酶切位點(diǎn)，由上海生工合成，引物序列如下: Pl:5’ gaattcGACTGGGATGGCACCCCGGTACCGG 3’
P2:5' gcggccgcTTAACCGCCGCCGGTCGCCACTGGC 3'
PCR程序?yàn)?94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸2min，循環(huán)擴(kuò)增30次；最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并回收凝膠中的目標(biāo)基因。
[0038](5)亞克隆:
制備好的雙鏈cDNA插入到載體系統(tǒng)pMD18-T上，得到重組質(zhì)粒pMD18-Agarase，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化受體菌DH5 α，在含有100mg/ml Amp的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜。挑取的單克隆菌落接種到2ml含有100mg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)6_10h，1000rpm離心1min收集菌體，提取質(zhì)粒，酶切回收目的基因備用(質(zhì)粒提取和膠回收分別用OMEGA公司的 E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I 和 E.Z.N.A.Gel Extract1n Kit 試劑盒)。將所得目的基因進(jìn)行DNA序列測定(Invitrogen公司)，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，表明所得基因及編碼的氨基酸序列為全新基因及氨基酸序列。
[0039]由此所得到的瓊膠酶的編碼序列共有834bp (SEQ ID NO:2)，其中第832-834位為終止密碼子TAA、第1-831位編碼不含信號肽的成熟蛋白，該成熟蛋白含有277個氨基酸(SEQ ID NO:1)。
[0040]實(shí)施例2瓊膠酶編碼基因在大腸桿菌中的表達(dá)
將實(shí)施例1-⑷中所得到的目的基因，與經(jīng)過及^ I和艙《雙酶切的pET28a(+)質(zhì)粒連接，得到重組質(zhì)粒pET28a(+)-Agarase (如圖1所示)。
[0041]取10 μ L構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，加入到100 μ L制備好的感受態(tài)細(xì)大腸桿菌BL21 (DE3)中，搖勻置于冰上，冰浴30min ;置于42°C水浴中熱擊90s ;將離心管快速移至冰水混合物中冰浴2min ;每管加入400 μ L SOC培養(yǎng)基(2%蛋白胨，0.5%酵母粉，1mM NaCl，2.5mM KCl, 1mM MgCl2, 1mM MgSO4, 20mM 葡萄糖，pH7.0 ?7.2)，用移液器輕吸打散后于37°C搖床上復(fù)蘇Ih (80rpm?200rpm);離心,4000rpmX 5min,除去400 μ L上清,剩余部分混勻；涂平板(LB-agar平板，含100 μ g/ml Amp)，37°C正置Ih后，倒置培養(yǎng)過夜，在抗性平板上生長的為含有重組質(zhì)粒的陽性克隆子。
[0042]取重組大腸桿菌菌株BL21 (DE3)，接種于50ml LB培養(yǎng)液中(250ml三角瓶，100 μ Lg/ml Amp), 37°C 250rpm 振蕩培養(yǎng) 1-1.5h，加入 IPTG 誘導(dǎo)(終濃度為 2 μ mol/ml )，37°C 250rpm再振蕩培養(yǎng)3_3.5h。取培養(yǎng)液1000rpm離心lOmin，收集菌體，再加入等體積的無菌水重新懸浮菌體，12000rpm離心1min,取沉淀用1/5體積pH6.0, 50mM的PBS懸浮菌體，進(jìn)行超聲波破碎，破碎條件為:60%功率，間隔5s破碎lOmin，停止lOmin，再破碎1min0 12000rpm離心，收集上清液分析瓊膠酶活力，并通過SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)量，結(jié)果表明該瓊膠酶可在大腸桿菌中表達(dá)，且酶活力約為50 U/mL.
[0043]實(shí)施例3酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
將實(shí)施例1-(4)中所得到的目的基因，與經(jīng)過及^7? I和艙(1雙酶切的pPIC9k質(zhì)粒連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9k_Agarase (如圖1所示)。
[0044]以所得pPIC9k重組質(zhì)粒為模板，以引物Pl和引物P2構(gòu)成的引物對進(jìn)行PCR，同時，以實(shí)施例2制備的pET28a(+)重組質(zhì)粒與引物Pl和引物P2所構(gòu)成的引物對做PCR，從DNA水平上驗(yàn)證外源基因插入是否正確。PCR所得到的2種產(chǎn)物序列長度均為894bp，與實(shí)施例I中從微泡菌(#icro/w76i/er sp.)中所得到的瓊膠酶原始基因的序列以及其他特征一致，由此可知目的基因的插入位點(diǎn)、方向和序列正確。
[0045]制備的重組質(zhì)粒經(jīng)SacI酶切,得到線性化質(zhì)粒pPIC9k_Agarase。取構(gòu)建好的線性重組質(zhì)粒DNA 50 μ g，直接加入到仍在0°C以下的感受態(tài)細(xì)胞中(畢赤酵母GS115);加入
1.0ml含5yg/ml的鮭魚精DNA的溶液II (40% (w/v)聚乙二醇1000，0.2M N, N-二羥乙基甘氨酸，PH8.35)，或先加入1.0ml的溶液II，然后加入5μ L lmg/ml的鮭魚精DNA并盡量的將兩者完全混勻；30°C水浴保溫Ih以上，每隔15min輕輕的混勻一次；42°C保溫1min ;室溫3000Xg離心5min，棄去上清，用1.0mL的溶液III(0.15M NaCl, 1mM N，N_ 二羥乙基甘氨酸，pH8.35)重新懸浮菌體；室溫3000Xg離心5min，移去800 μ L上清，用剩余的200ul上清重新懸浮菌體；將200 μ L菌液涂YPD平板(YP和20%D單獨(dú)滅菌，倒平板之前按1:9向YP中加入20%D ;篩選抗性為80ug/ml Amp)，30°C倒置培養(yǎng)3_4天，在抗性平板上生長的為含有重組質(zhì)粒的陽性克隆子。
[0046]取重組質(zhì)粒pPIC9k_Agarase轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GS115菌株陽性克隆子，接種于150mL YPD培養(yǎng)液中，30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.3?0.5 (約20hr)，然后接種于3L發(fā)酵基本培養(yǎng)基(26.2 ml/L磷酸，0.80 g/L硫酸鈣，18.7 g/L硫酸鉀，15.5 g/L硫酸鎂，4.17 g/L氫氧化鉀，Glucose 40 g/L葡萄糖)中，于5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。
[0047]在起始階段一菌體生長階段，發(fā)酵過程中用25%的氨水調(diào)節(jié)pH，使其維持在6.5，并且以4.0ml/hr的速度流加PTMl (30 mM硫酸銅，0.54 mM碘化鈉，17.6 mM硫酸錳，
0.80 mM鑰酸鈉，0.32 mM硼酸，2.4 mM氯化鈷，0.18 mM氯化鋅，0.24 mM硫酸亞鐵，1.6 mM生物素，0.19 M硫酸)，進(jìn)行連續(xù)流加補(bǔ)料。攪拌并通氣培養(yǎng)20-24hr，在菌體生長過程中溶氧逐漸下降至低于100 %，直至碳源耗盡，溶氧又逐漸上升至高于80 %，此時菌濕重可達(dá)到90g/L。
[0048]進(jìn)入碳源飼喂階段，以25mL/h的速度流加用蒸餾水配置的含有25% (w/v)葡萄糖和12ml/L PTMl的溶液，持續(xù)流加4_6hr，并調(diào)節(jié)通氣量，使溶氧維持在20%上下，到代該階段的末期，菌濕重可達(dá)到160g/L。
[0049]在誘導(dǎo)階段，以20-30ml/hr的速度流加含有12ml/L PTMl的甲醇，使培養(yǎng)基中甲醇的終濃度最高不要超過0.3% (v/v)，并調(diào)節(jié)通氣量，使溶氧維持在20%上下。在誘導(dǎo)階段的發(fā)酵過程中每隔24hr取樣10ml，1000rpm離心5min，收集上清液測定瓊膠酶活力并進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果分別如圖2所示。發(fā)酵達(dá)194h時，菌濕重可達(dá)到330g/L，重組瓊膠酶的表達(dá)水平(以發(fā)酵液上清的酶活力表示)可達(dá)到5020U/ml，這說明微泡菌(#icrobulbifer sp.)來源的瓊膠酶基因均在畢赤酵母中得到了高效表達(dá)。
[0050]實(shí)施例4重組瓊膠酶的純化
將實(shí)施例3所制備的發(fā)酵培養(yǎng)液1000rpm離心1min去除菌體，取上清液作為粗酶液，用截留分子量為6000Da的外壓式中空纖維超濾膜進(jìn)行超濾，以去除粗酶液中小分子的雜質(zhì)，并將其濃縮3-5倍。
[0051]將上面所得粗酶液的濃縮液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至55%，13000rpm離心15min,取沉淀,用緩沖液重新溶解,置于截留分子量為6000Da的透析袋中，以pH8.0,20mM Tris-HCl為透析外液，透析外液與內(nèi)液的體積比大于50，4°C透析12_16h，中間每隔4h更換透析外液一次，透析完后，取透析內(nèi)液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，再進(jìn)行冷凍干燥后，置于_20°C的低溫冰箱中保存待用。
[0052]取20mg上面所得到的凍干粉末于離心管中，加入2ml Tris-HCl (pH8.0,50mM)緩沖液，使其充分溶解后，上TOSOH Toyopearl EDAE-650C陰離子柱。先用pH8.0，50mMTris-HCl緩沖液平衡柱子，然后流加樣品，再用相同緩沖液配置的0-0.8mol/L NaCl梯度洗脫5個柱體積,流速為lml/min,用部分收集器收集,每管3ml。然后對收集管中的溶液測定瓊膠酶活力及蛋白電泳分析。(圖3A)
純化完成后，微泡菌sp.)來源的瓊膠酶比活性從粗酶液的1237U/mg提高到純酶的6447U/mg，純化倍數(shù)為5.21，得率為41.8。SDS-PAGE結(jié)果(圖3B)。
[0053]實(shí)施例5重組瓊膠酶酶解瓊膠和龍須菜的分析
瓊膠能夠用于制備瓊膠寡糖，瓊膠寡糖因在抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌、抑菌等眾多方面具有生理活性而備受關(guān)注。然而，作為一種天然多糖，瓊膠的分子量大、粘度高、溶解性低，因此難以被人體分解吸收，不能發(fā)揮瓊膠寡糖的生理活性。因此，通過降解瓊膠制備能夠被人體直接吸收的瓊膠寡糖，就成為一個極為有意義的研究。本專利中利用生產(chǎn)的重組瓊膠酶來探討其降解瓊膠和龍須菜的效果。
[0054]1、重組瓊膠酶酶解瓊膠的分析
(I)材料:實(shí)施例4發(fā)酵得到的瓊膠酶酶液，0.3%瓊膠底物，層析紙，層析液(正丁醇:乙醇:水=2:1:1)，染色液(苯胺-二苯胺)，糖標(biāo)準(zhǔn)品等。
[0055](2)實(shí)驗(yàn)過程:①將0.5mL的瓊膠酶液與4.5mL的底物在混合液50°C下保溫，分別保溫15min、30min、lh、2h、20h !②將保溫后的混合液在層析紙中上樣，各加50 u L ;糖標(biāo)準(zhǔn)品也依次在層析紙中上樣；③層析3-4h 將層析紙吹干，用染色液對層析紙染色。染完色后，放入70°C烘箱烘干，15min后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0056]結(jié)果由圖可知，瓊膠酶與底物的最終產(chǎn)物主要是二糖和四糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所
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[0057]2、重組瓊膠酶酶解龍須菜的分析
參照(實(shí)施例5:重組瓊膠酶酶解瓊膠的分析)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。染完色后，放入70°C烘箱烘干，15min后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示瓊膠酶對龍須菜有很強(qiáng)分解能力，且其產(chǎn)物主要是二糖和四糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。
【權(quán)利要求】
1.一種瓊膠酶，其特征在于:所述瓊膠酶的氨基酸序列如3即顯.1所示。
2.一種瓊膠酶基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的瓊膠酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的瓊膠酶基因，其特征在于:所述瓊膠酶基因的核苷酸序列如卿勵.2所示。
4.包含如權(quán)利要求2所述的瓊膠酶基因的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為大腸桿菌質(zhì)?！椤?28? (+) '&86 或酵母質(zhì)粒八職 1^86。
6.一種細(xì)胞，其特征在于:所述細(xì)胞含有權(quán)利要求2所述的瓊膠酶基因的核苷酸序列；或所述細(xì)胞由包含權(quán)利要求2所述的瓊膠酶基因的重組載體經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得；所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
7.—種如權(quán)利要求2所述的瓊膠酶基因的克隆方法，其特征在于:所述瓊膠酶的克隆方法包括以下步驟:利用瓊膠酶氨基酸保守片段的簡并引物，通過？⑶技術(shù)獲得微泡菌5/7.) —段瓊膠酶的編碼基因；再通過861101116獲得其全長，并在^081數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，得到瓊膠酶基因。
8.—種如權(quán)利要求5所述的重組載體的制備方法，其特征在于:所述重組載體的制備方法為:采用權(quán)利要求2所述瓊膠酶基因的核苷酸序列經(jīng)及和#乂1雙酶切后與及I和艙(I雙酶切的邱12? (+)載體連接，得到大腸重組表達(dá)載^128^1 (+)或采用所述的瓊膠酶基因的核苷酸序列經(jīng)及和耐I雙酶切后與沿01和#乂1雙酶切的匕載體連接，得到酵母重組表達(dá)載體？？1091^-八職1^86。
9.一種如權(quán)利要求1所述的瓊膠酶的制備方法，其特征在于:培養(yǎng)含有瓊膠酶基因的細(xì)胞或培養(yǎng)包含瓊膠酶基因的重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)，收獲表達(dá)產(chǎn)物，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。
10.一種如權(quán)利要求1所述的瓊膠酶的應(yīng)用，其特征在于:利用所述瓊膠酶降解富含瓊膠的底物。
【文檔編號】C12N15/66GK104388411SQ201410721829
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】葉秀云, 李仁寬, 陳增, 楊光, 林娟 申請人:福州大學(xué)