專利名稱：：抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(VEGFR1)mRNA表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：RNA干擾(RNAinterference,RNAi)，又叫基因沉默，是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。它是一種在動(dòng)植物中廣泛存在的序列特異性轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默過(guò)程，是生物基因組抵抗病毒之類的外來(lái)遺傳元件入侵的一種生物保護(hù)機(jī)制。生物體內(nèi)的雙鏈RNA可來(lái)自于RNA病毒感染、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、外源導(dǎo)入的基因。這些來(lái)源的雙鏈RNA誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的RNAi機(jī)制，結(jié)果是病毒被清除，轉(zhuǎn)座子的表達(dá)被阻斷，外源導(dǎo)入基因表達(dá)被阻斷，同時(shí)，與其內(nèi)源的細(xì)胞基因組中的基因也被阻斷。RNAi還具有很高的特異性。19個(gè)核苷酸的雙鏈RNA幾乎可以完全抑制基因的表達(dá)，而將其中的一個(gè)核苷酸突變掉后，它對(duì)基因的抑制作用就消失了(Brumme1kamp.T.R，Bernads.R，Agami.R.AsystemforstableexpressionofshortintereringRNAsinMammaliancells-Science.2002;296:550-553)，這對(duì)雙鏈RNA的應(yīng)用是非常重要的，這可以避免雙鏈RNA降解與靶mRNA同家族的其他的mRNA。最有效的小分子干擾RNA(smallinterferenceRNA，以下簡(jiǎn)稱siRNA)是19個(gè)堿基大小、且3'端有兩個(gè)堿基突出(懸掛堿基)的雙鏈RNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)格，與靶mRNA之間的一個(gè)堿基錯(cuò)配都會(huì)顯著消弱基因沉默的效果(BrownD，JarvisR,PallottaVandetal.，RNAinterferenceinmammaliancellculture:design,executionandanalysisofthesiRNAeffect.Technotes,9(1):3-5;MiyagishiMandTairaK.,U-6promoter-drivensiRNAswithfoururidine3'-overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatureBiotechnology,20:497-500)。快速發(fā)展的RNAi技術(shù)為惡性腫瘤機(jī)制的研究提供了有力工具，同時(shí)也推動(dòng)了以該技術(shù)為基礎(chǔ)的腫瘤治療策略的研發(fā)進(jìn)程。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移需要生成新的血管。在腫瘤形成的早期，腫瘤細(xì)胞主要通過(guò)擴(kuò)散作用獲得營(yíng)養(yǎng)和氧氣，但這樣腫瘤僅能長(zhǎng)至23mm3。為了進(jìn)一步的生長(zhǎng)和遷移，必須有新的血管的生成，新生成的血管把還在生長(zhǎng)的腫瘤和循環(huán)系統(tǒng)直接連接起來(lái)，使其供腫瘤生長(zhǎng)的物質(zhì)得以交換。除此之外，腫瘤還利用新生血管通過(guò)血液循環(huán)將原發(fā)癌細(xì)胞輸送至轉(zhuǎn)移靶器官。因此，血管新生與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。血管的生成是復(fù)雜的過(guò)程。它是由內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及正負(fù)調(diào)控因子相互作用的多步驟過(guò)程。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)作為血管生成的正性調(diào)控因子在血管生成過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。VEGF具有增加微血管的通透性、促進(jìn)不同來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖和血管構(gòu)建、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移等多種作用，是已知的最強(qiáng)的血管生成因子。而VEGF的生物學(xué)效應(yīng)均是通過(guò)其特異性受體VEGFR介導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。VEGFR可導(dǎo)致由配體介導(dǎo)的二聚體化。受體的二聚體化促使相鄰受體亞基自身磷酸化和去磷酸化從而觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終造成內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生，血管內(nèi)皮通透性增加等。所以VEGF及其受體家族被認(rèn)為是抗腫瘤治療理想的分子靶點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供能在m脂A水平上抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)VEGFR1基因表達(dá)的si腿.實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種抑制VEGFRl基因表達(dá)的si脂A，其核苷酸序列為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5'-CUAGCUGUACCUACUUCAAAGAAGA-3'，反義鏈5'-UCUUCUUUGAAGUAGGUACAGCUAG-3，；正義鏈5'-CAAUCUUGCUGAGCAUAAAACAGUC-3'，反義鏈5'-GACUGUUUUAUGCUCAGCAAGAUUG-3';正義鏈5'-GCAGCACGCUGUUUAUUGAAAGAGU-3',反義鏈5'-ACUCUUUCAAUAAACAGCGUGCUGC-3'，或上述三對(duì)核苷酸序列的任一對(duì)正義鏈3'末端、反義鏈中5'末端對(duì)應(yīng)缺失l一6個(gè)堿基的雙鏈RNA分子。優(yōu)選地，所述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5'-CUAGCUGUACCUACUUCAA-3'，反義鏈5'-UUGAAGUAGGUACAGCUAG-3';正義鏈5'-CAAUCUUGCUGAGCAUAAA-3'，反義鏈5'-UUUAUGCUCAGCAAGAUUG-3';正義鏈5'-GCAGCACGCUGUUUAUUGA-3',反義鏈5'-UCAAUAAACAGCGUGCUGC-3'。所述雙鏈RNA分子的3'末端還可設(shè)有兩個(gè)脫氧核苷組成的懸掛堿基(Over-hang)，所述懸掛堿基例如可為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的dTdT或dTdC或dUdU等，以增加siRNA的活性。更優(yōu)選地，所述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA為正義鏈5'-CAAUCUUGCUGAGCAUAAAdTdT-3'，反義鏈5'-UUUAUGCUCAGCAAGAUUGdTdT-3'。優(yōu)選地，上述抑制VEGFR1基因表達(dá)的siRNA為任意部分經(jīng)化學(xué)修飾的雙鏈RNA分子；所述化學(xué)修飾包括對(duì)連接核苷酸的磷酸二酯鍵的部分修飾或用其它任何化學(xué)建取代；化學(xué)修飾包括對(duì)這些siRNA分子核酸戊糖的2位上的0H作任何化學(xué)的修飾和改變，例如，所述2'位上的0H^^七學(xué)的l彥f布為CH30-，F(xiàn)—，CH30CH2CH20—，CH3NHCH2CH20—。本發(fā)明的另一目的是提供上述siRNA在制藥中的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下上述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA在制備預(yù)防或治療人類血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)的疾病的藥物或制劑中的應(yīng)用。所述疾病為肺癌、肝癌、食管癌、白血病、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、頭頸癌、腦瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤的任一種或多種。本發(fā)明所述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA序列的長(zhǎng)度為19一25bp，這些siRNAs既足夠長(zhǎng)誘導(dǎo)基因特異性抑制，又足夠短，逃避宿主干擾素反應(yīng)。因此，本發(fā)明所述的siRNA能有效抑制VEGFR1基因的表達(dá)，為制備預(yù)防或治療血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)疾病的藥物或制劑提供了新的，較好的選擇。圖1是各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別作用于HUVEC細(xì)胞后Rea1-1imeRT-PCR法檢測(cè)各處理組細(xì)胞中VEGFR1mRNA的表達(dá)量；圖2是RealtimeRT-PCR法檢測(cè)50nMlnM濃度梯度的VEGFRlsiRNA2轉(zhuǎn)染后VEGFRlmRNA表達(dá)量；圖3是RealtimeRT-PCR法檢測(cè)500pM50pM濃度梯度VEGFRlsiRNA2轉(zhuǎn)染后VEGFRlmRNA表達(dá)量；圖4是RT-PCR檢測(cè)不同處理組VEGFR1mRNA的表達(dá)量。具體實(shí)施例方式發(fā)明人采用siRNA設(shè)計(jì)法則，并結(jié)合發(fā)明人自主開發(fā)的設(shè)計(jì)軟件輔助設(shè)計(jì)抑制VEGFR1基因表達(dá)的siRNA序列，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選多條高效VEGFR1siRNA序列其核苷酸序列為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5'-CUAGCUGUACCUACUUCAAAGAAGA-3'，反義鏈5'-UCUUCUL:UGAAGUAGGUACAGCUAG-3';正義鏈5'-CAAUCUUGCUGAGCAUAAAACAGUC-3',反義鏈5'-GACUGUUUUAUGCUCAGCAAGAUUG-3';正義鏈5'-GCAGCACGCUG而UAUUGAAAGAGU-3'，反義鏈5'-ACUCUUUCAAUAAACAGCGUGCUGC-3'。其中，任一對(duì)正義鏈3'末端、反義鏈中5'末端對(duì)應(yīng)缺失l一6個(gè)堿基是指正義鏈和相應(yīng)的反義鏈互補(bǔ)配對(duì)，當(dāng)選擇的正義鏈為具有20個(gè)核苷酸時(shí)，則其互補(bǔ)配對(duì)的反義鏈也具有20個(gè)核苷酸。上述任一條抑制VEGFR1基因表達(dá)siRNA可用于制備預(yù)防或治療人類血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體l相關(guān)的任何疾病的藥物或制劑。表lVEGFR1siRNA—27bp<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>AGAGUGCUGC實(shí)施例一VEGFR1siRNA的設(shè)計(jì)與合成。首先在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取人VEGFR1mRNA的序列全長(zhǎng)(序列號(hào)NM—002019)，使用本實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)的siRNA設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)三條VEGFR1siRNA和一條陰性對(duì)照s1RNA(NotargetsiRNA)。此外，設(shè)計(jì)了dTdT懸掛末端，以增加siRNA的穩(wěn)定性。設(shè)計(jì)的siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司合成。(本發(fā)明中，其它VEGFR1siRNA的設(shè)計(jì)與此相同)表2設(shè)計(jì)的VEGFR1siRNA及陰性對(duì)照NotargetsiRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例二RealtimeRT-PCR法檢測(cè)3條VEGFR1siKNA對(duì)VEGFRlmRM表達(dá)的抑制效果人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)于含2X胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)液中，置于5MC02、37'C飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，用O.25%的胰蛋0酶消化傳代。取第2-8代的HUVEC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為1X10V孔，使得次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30%50%。根據(jù)LipofectamineTM2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(NotargetsiRNA)、VEGFR1siRNAl轉(zhuǎn)染組、VEGFR1siRNA2轉(zhuǎn)染組、VEGFR1siRNA3轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染方案為在250yL0PTI-MEM中加入5nL20uM的siRNA，室溫孵育5min。在250nLOPTI-MEM中加入5uLLipofectamine2000，室溫孵育5min。將上述兩種稀釋液混勻，室溫孵育20min后加入細(xì)胞板孔中，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染后24-48h的細(xì)胞，6孔板每孔加入lmLTrizo1，加入氯仿和異丙醇按常規(guī)方法抽提細(xì)胞總副A，所提RNA溶于40iiL無(wú)RNA酶水中，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各處理組RNA的含量和純度，并進(jìn)行凝膠電泳，觀察RNA完整性。以oligo(dT)w為引物，lygRNA為模板，按Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作生成cDNA。各取逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物l.6uL做模板，利用SYBRGreenI染料實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的VEGFR1mRNA表達(dá)，并以無(wú)RNA酶水作為陰性模板對(duì)照，以P-Actin作為內(nèi)參。引物序列根據(jù)GenBank公布的cDNA序列設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性10s;94。C變性5s;退火30s;72。C延伸ls;45個(gè)循環(huán)。用2—AACT法計(jì)算和分析VEGFR1基因的相對(duì)表達(dá)量，確定VEGFRl基因的mRNA被siRNA沉默的程度。①VEGFRl基因PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為262bp，退火溫度為55.5°C。上游引物5'_GGTATCCCTCAACCTACA_3'下游引物5'-CCACAGTCCCAACTTTATT-3'②Actin基因PC財(cái)廣增長(zhǎng)度為452bp，退火溫度為6(TC。上游引物5'-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3'下游引物5'-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'10結(jié)果見圖l。圖1顯示，在50nM的轉(zhuǎn)染濃度下，與NotargetsiRNA轉(zhuǎn)染組比較，VEGFRlsiRNAl對(duì)VEGFRlmRNA的抑制率達(dá)到66%，VEGFRlsiRNA2對(duì)VEGFRlmRNA的抑制率達(dá)到96%。實(shí)施例三RealtimeRT-PCR法檢測(cè)50nMlnM濃度梯度的VEGFRlsiRNA2對(duì)VEGFRlmRNA表達(dá)的抑制效果人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)于含2X胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)液中，置于5%0)2、37'C飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，用O.25%的胰蛋白酶消化傳代。取第2-8代的HUVEC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為1XIO'V孔，使得次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30%50%。根據(jù)Lipofectamine2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(NotargetsiRNA)、VEGFRlsiRNA250nM轉(zhuǎn)染組、VEGFRlsiRNA220nM轉(zhuǎn)染組、VEGFRlsiRNA210nM轉(zhuǎn)染組、VEGFRlsiRNA2lnM轉(zhuǎn)染組。根據(jù)Lipofectamine2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集轉(zhuǎn)染后24-48h的細(xì)胞，6孔板每孔加入lmLTrizol，加入氯仿和異丙醇按常規(guī)方法抽提細(xì)胞總RNA，所提RNA溶于40pL無(wú)RNA酶水中，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各處理組RNA的含量和純度，并進(jìn)行凝膠電泳，觀察RNA完整性。以oligo(dT)w為引物，lugRNA為模板，按P簡(jiǎn)ega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作生成cDNA。各取逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物l.6pL做模板，利用SYBRGreenI染料實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的VEGFR1mRNA表達(dá)，并以無(wú)RNA酶水作為陰性模板對(duì)照，以f5-Actin作為內(nèi)參。引物序列根據(jù)GenBank公布的cDNA序列設(shè)計(jì)(同實(shí)施例2)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為同實(shí)施例二。結(jié)果見圖2。圖2顯示了50nM、20nM、10nM、1nM四個(gè)濃度梯度的RealtimeRT-PCR結(jié)果，與轉(zhuǎn)染濃度為50nM的Notargets濯A比較，VEGFRlsi腿2轉(zhuǎn)染濃度為1nM日寸，對(duì)VEGFRlmRNA表達(dá)的抑制率仍能達(dá)到94%左右。實(shí)施例四RealtimeRT-PCR法檢測(cè)50nMlnM濃度梯度的VEGFRlsiRNA2對(duì)VEGFRlmRNA表達(dá)的抑制效果人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)于含2X胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)液中，置于5%032、37。C飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，用O.25%的胰蛋白酶消化傳代。取第2-8代的HUVEC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為1XIOV'孔，使得次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30%50%。根據(jù)Lipofectamine2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(NotargetsiRNA)、VEGFRlsiRNA2500pM轉(zhuǎn)染組、VEGFRlsiRNA2250pM轉(zhuǎn)染組、VEGFRlsiRNA2100nM轉(zhuǎn)染組、VEGFRlsi隱250pM轉(zhuǎn)染組。根據(jù)Lipofectamine2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集轉(zhuǎn)染后24-48h的細(xì)胞，6孔板每孔加入lmLTrizol，加入氯仿和異丙醇按常規(guī)方法抽提細(xì)胞總RNA，所提RNA溶于40nL無(wú)RNA酶水中，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各處理組RNA的含量和純度，并進(jìn)行凝膠電泳，觀察RNA完整性。以oligo(dT)w為引物，lngRNA為模板，按Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作生成cDM。各取逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物l.6yL做模板，利用SYBRGreenI染料實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的VEGFR1mKNA表達(dá)，并以無(wú)RNA酶水作為陰性模板對(duì)照，以J3-Actin作為內(nèi)參。引物序列根據(jù)GenBank公布的cDNA序列設(shè)計(jì)(同實(shí)施例2)，并由匕海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為同實(shí)施例二。結(jié)果見圖3。圖3顯示了500pM、250pM、100pM、50pM四個(gè)濃度梯度的RealtimeRT-PCR結(jié)果，與轉(zhuǎn)染濃度為50nM的NotargetsiRNA比較，VEGFR1siRNA2轉(zhuǎn)染濃度為50pM時(shí)，對(duì)VEGFR1mRNA表達(dá)的抑制率仍能達(dá)到50X左右。這些結(jié)果表明，我們篩選出的針對(duì)VEGFR1基因特異的siRNA2在極低的轉(zhuǎn)染濃度下能夠達(dá)到很好的干擾效果。上述實(shí)施例1一4中，將所述針對(duì)VEGFR1mRNA編碼區(qū)不同位置的3條VEGFRlsiRNA序列和一條陰性對(duì)照siRNA(NotargetsiRNA)分別轉(zhuǎn)入人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)入陰性對(duì)照siRNA相比，VEGFK1siRNA轉(zhuǎn)入組即VEC細(xì)胞中VEGFRl的mRNA的表達(dá)量均有不同程度的降低，其中VEGFR1siRNA2的降低效果最明顯。雖然針對(duì)同一靶基因，但位置不同，效果不同。隨后，發(fā)明人對(duì)效果最好的VEGFK1siRNA2進(jìn)行了siRNA的濃度梯度效果檢測(cè)。結(jié)果表明，VEGFR1siRNA2轉(zhuǎn)染濃度為50pM時(shí)，對(duì)VEGFR1基因的沉默效果還能達(dá)到50X左右。實(shí)施例五27個(gè)堿基的siRNA和化學(xué)修飾的siRNA對(duì)VEGFR1mRNA沉默效果的監(jiān)測(cè)。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)于含2X胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)液中，置于5%0)2、37'C飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，用O.25%的胰蛋白酶消化傳代。取第2-8代的HUVEC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為1Xi05/孔，使得次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30%50%。根據(jù)Lipofectamine"2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(NotargetsiRNA)、VEGFRlsiRNA250nM轉(zhuǎn)染組、VEGFRlsiRNA220nM轉(zhuǎn)染組、VEGFRlsiRNA2iOnM轉(zhuǎn)染組、VEGFRlsiRNA2lnM轉(zhuǎn)染組。根據(jù)Lipofectamine2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集轉(zhuǎn)染后24-48h的細(xì)胞，6孔板每孔加入lmLTrizo1，加入氯仿和異丙醇按常規(guī)方法抽提細(xì)胞總RNA，所提RNA溶于40uL無(wú)RNA酶水中，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各處理組RNA的含量和純度，并進(jìn)行凝膠電泳，觀察RNA完整性。以oligo(dT)化為引物，lligRNA為模板，按Pro鵬ga逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作生成cDNA。各取逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物l.L做模板，利用PCR試劑盒檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的VEGFR1mRM表達(dá)，并以無(wú)RIVA酶水作為陰性模板對(duì)照，以P-Actin作為內(nèi)參。引物序列根據(jù)GenBank公布的cDNA序列設(shè)計(jì)(同實(shí)施例2)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為同實(shí)施例二。結(jié)果見圖4。參見圖4:其中，1為VEGFRlsi隨221bp(SEQ7、8，有dTdT懸垂)未修飾組;2為VEGFRlsiRNA221bp(有dTdT懸垂堿基，正反義鏈3'、5'末端的二個(gè)堿基甲基化，反義鏈的5'木端磷酸化)修飾組；3為VEGFRlsiRNA527bp(SEQ3、4，有dTdT懸垂)未修飾組；4為VEGFRlsiRNA219bp(無(wú)懸垂堿基，正義鏈所有堿基2'甲基化，反義鏈5'端磷酸化)修飾組5為NotargetsiRNA組；6:空白對(duì)照組。結(jié)果分析結(jié)果顯示，與NotargetsiRNA組相比，VEGFRlsiRNA221bp(有dWT懸垂)未修飾組對(duì)VEGFR1mRNA的沉默效果最好。VEGFRlsiRNA221bp(有dTdT懸垂，正反義鏈3'、5'末端的三個(gè)堿基甲基化，反義鏈的5，末端磷酸化)修飾組和VEGFR1siRNA527bp未修飾組也有很好的沉默效果，NotargetsiRNA組和空白對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。系列表<110>中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〈120〉抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用〈160〉14<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉25212〉腿〈213>人工序列<400>1cuagcuguaccuacuucaaagaaga25〈210>2〈211〉25<212>腿<213〉人工序列<400>2ucuucuuugaaguagguacagcuag25〈210>3<211>25<212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉3caaucuugcugagcauaaaacaguc25〈210〉4<211〉25<212〉RNA〈213〉人工序列<400>4gacugu皿uaugcucagcaagauug25〈210〉5<211>25〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉5gcagcacgcuguuuauugaaagagu<210>6〈211〉25〈212〉腿<213>人工序列<400〉6acucuuucaauaaacagcgugcugc〈210〉7〈211〉19〈212〉畫〈213〉人工序列〈400〉7cuagcuguaccu3cuuca3<210>8〈211>19〈212〉腿〈213〉人工序列〈400>8uugaaguagguacagcuag〈210〉9<211〉19〈212>RNA〈213〉人工序列〈400〉9caaucuugcugagcauaaa19〈210〉10〈211〉19〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉10uuuaugcucagcaagauug〈210〉11〈211〉19〈212〉腿〈213>人工序列<■〉11gcagcacgcuguuuauuga〈210〉12〈211〉19〈212〉腿<213>人工序列〈400〉12ucaauaaacagcgugcugc<210〉13〈211>19<212>腿〈213〉人工序列<400>13uucuccgaacgugucacgu〈210〉14〈211〉19〈212〉腿<213〉人工序列〈400〉14acgugacacguucggagaa20權(quán)利要求1.一種抑制VEGFR1基因表達(dá)的siRNA，其特征是，其核苷酸序列為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5’-CUAGCUGUACCUACUUCAAAGAAGA-3’，反義鏈5’-UCUUCUUUGAAGUAGGUACAGCUAG-3’；正義鏈5’-CAAUCUUGCUGAGCAUAAAACAGUC-3’，反義鏈5’-GACUGUUUUAUGCUCAGCAAGAUUG-3’；正義鏈5’-GCAGCACGCUGUUUAUUGAAAGAGU-3’，反義鏈5’-ACUCUUUCAAUAAACAGCGUGCUGC-3’；或上述三對(duì)核苷酸序列的任一對(duì)正義鏈的3’末端、反義鏈中5’末端對(duì)應(yīng)缺失1-6個(gè)堿基的雙鏈RNA分子。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA，其特征是，其為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5'-CUAGCUGUACCUACUUCAA-3'，反義鏈5'-UUGAAGUAGGUACAGCUAG-3';正義鏈5'-CAAUCUUGCUGAGCAUAAA-3'，反義鏈5'-UUUAUGCUCAGCAAGAUUG-3';正義鏈5'-GCAGCACGCUGUUUAUUGA--3'，反義鏈5'-UCAAUAAACAGCGUGCUGC-3'。3.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA，其特征是，所述雙鏈RNA分子的3'末端還設(shè)有以兩個(gè)脫氧核苷組合的懸掛堿基。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA，其特征是，其為正義鏈5'-CAAUCUUGCUGAGCAUAAAdTdT-3'，反義鏈5'-UUUAUGCUCAGCAAGAUUGdTdT-3'的雙鏈RNA分子。5.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA，其特征是，所述的siRNA為任意部分經(jīng)化學(xué)修飾的雙鏈RNA分子。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA，其特征是，所述化學(xué)修飾為對(duì)連接核苷酸的磷酸二酯鍵的部分修飾或用其它任何化學(xué)鍵取代。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA，其特征是，所述化學(xué)修飾為在siRNA分子核酸戊糖的2'位上的OH作化學(xué)的修飾和改變。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA,其特征是，所述核酸戊糖的2'位上的0H的修飾基團(tuán)為CH3CT，F(xiàn)-，CH30CH2CH20—，CH3NHCH2CH20—。9.如權(quán)利要求l一8任一項(xiàng)所述抑制VEGFRl基因表達(dá)的siRNA在制備預(yù)防或治療人類血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受休相關(guān)的疾病的藥物或制劑中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征是，所述疾病為肺癌、肝癌、食管癌、白血病、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、頭頸癌、腦瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤的任一種或多種。全文摘要本發(fā)明公開了一種抑制VEGFR1基因表達(dá)的siRNA，其特征是，其核苷酸序列為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5’-CUAGCUGUACCUACUUCAAAGAAGA-3’，反義鏈5’-UCUUCUUUGAAGUAGGUACAGCUAG-3’；正義鏈5’-CAAUCUUGCUGAGCAUAAAACAGUC-3’，反義鏈5’-GACUGUUUUAUGCUCAGCAAGAUUG-3’；正義鏈5’-GCAGCACGCUGUUUAUUGAAAGAGU-3’，反義鏈5’-ACUCUUUCAAUAAACAGCGUGCUGC-3’；或上述三對(duì)核苷酸序列的任一對(duì)正義鏈的3’末端、反義鏈中5’末端對(duì)應(yīng)缺失1-6個(gè)堿基的雙鏈RNA分子。因此，本發(fā)明所述的siRNA能有效抑制VVEGFR11基因的表達(dá)，為制備預(yù)防或治療血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)疾病的藥物或制劑提供了新的，較好的選擇。文檔編號(hào)C12N15/11GK101353655SQ20081002971公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2008年7月24日優(yōu)先權(quán)日2008年7月24日發(fā)明者張必良,艷李申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院