專利名稱：聚乙二醇化胰島素樣生長因子測定的制作方法
聚乙二醇化胰島素樣生長因子測定本發(fā)明屬于免疫測定領域，更精確而言，報道了檢測和定量聚乙二醇化胰島素樣 生長因子的免疫測定，該免疫測定通過形成和確定聚乙二醇化胰島素樣生長因子和胰島素 樣生長因子結(jié)合蛋白復合體來實現(xiàn)。
背景技術(shù)：
胰島素樣生長因子I和II(IGF I和IGF II)是胰島素激素、生長因子和神經(jīng)肽 超家族成員，其通過結(jié)合細胞表面受體(例如胰島素樣生長因子I受體或胰島素樣生長因 子II受體)發(fā)揮生物學作用。胰島素樣生長因子和生長激素(GH)軸在調(diào)節(jié)胎兒和兒童期 身體生長中發(fā)揮大部分作用。幾十年的基礎和臨床研究已經(jīng)證實其在維持贅生性生長中 也是關(guān)鍵性的(Khandwala, H. Μ.等，Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244)。胰島素樣生長因子 的作用受到胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)的調(diào)節(jié)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白作為 胰島素樣生長因子的轉(zhuǎn)運蛋白，保護它們不受降解，限制或抑制它們結(jié)合受體，并維持生物 學上無活性胰島素樣生長因子的“儲存庫” (Martin, J. L.，和Baxter, R. C.，IGF binding proteins as modulators of IGF actions,在 Rosenfeld,R. G.禾口 Roberts,C. Τ·編輯，The IGF system,Molecular Biology,Physiology,and Clinical Applications(1999),Humana Press, Totowa, 227-255 中 Jones, J. L.，禾口 Clemmons，D. R.，Endocr. Rev. 12 (1995) 10-21 ； Khandwala, H. Μ. Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244 ；Hwa, V. The IGF binding protein superfamily,在 Rosenfeld, R. G.,禾口 Roberts, C. T.編輯，The IGF system, Molecular Biology, Physiology, and Clinical Applications(1999), Humana Press, Totowa，第315-327頁中)。事實上胰島素樣生長因子系統(tǒng)在腫瘤組織上介導的各級水平 的反應(IGF、IGFBP、IGF受體)都可作為治療手段的靶標(Khandwala, H. Μ.等，Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244 ；Fanayan, S.等，J. Biol. Chem. 275 (2000) 39146-39151 ；Imai，Y.等， J. Biol. Chem. 275(2000) 18188-18194)。此處也應當提到胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3 具有不依賴于胰島素樣生長因子的抗增殖和促凋亡效應(Wetterau，L. Α.等，Mol. Gen. Metab. 68 (1999) 161-181 ；Butt, A. J.等，J. Biol. Chem. 275 (2000) 39174-39181)。人胰島素樣生長因子I是結(jié)構(gòu)上與胰島素相關(guān)的循環(huán)激素。傳統(tǒng)上 認為胰島素樣生長因子I是生長激素在外周組織上發(fā)揮作用的主要介質(zhì)。胰 島素樣生長因子I由70個氨基酸組成，也被稱為生長調(diào)節(jié)素C并由SwissProt No. P01343 定義。 在例如，Ie Bouc, Y.等，F(xiàn)EBS Lett. 196(1986) 108-112 ；de Pagter-Holthuizen, P. φ, FEBS Lett. 195 (1986) 179-184 ；Sandberg Nordqvist, Α. C. φ, Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277 ；Steenbergh, P. H.等， Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514 ； Tanner, J. M.等，Acta Endocrinol. (Copenhagen) 84 (1977) 681-696 ；Uthne, K.等，J. Clin. Endocrinol. Metab.39(1974)548-554;EP 0 123 228 ；EP 0 128 733 ；US 5, 861, 373 ；US 5, 714, 460 ；EP 0 597 033 ；WO 02/32449 ；WO 93/02695 中提到了用途、活性及制備。胰島素樣生長因子I的功能調(diào)控是相當復雜的。在循環(huán)中，僅0.2%至1.0%的 邊緣水平的胰島素樣生長因子I以游離形式存在，而大多數(shù)結(jié)合胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白，所述胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白對胰島素樣生長因子具有很高的親和力，并調(diào)節(jié)胰島 素樣生長因子I的功能。可通過釋放胰島素樣生長因子I的機制(如通過蛋白酶蛋白水解 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白)局部釋放所述因子。胰島素樣生長因子I在發(fā)育的及成熟的腦中起旁分泌作用(Werther，G. Α.等， Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778)。體外研究表明胰島素樣生長因子I對CNS中幾種類型 的神經(jīng)元而言是有力的非選擇性親和物質(zhì)(Knusel，B.等，J. Neurosci. 10(1990)558-570 ； Svrzic, D.，禾口 Schubert，D. ，Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990) 54—60)，所述神經(jīng) 元包括多巴胺能神經(jīng)元(Knusel，B.等，J. Neurosci. 10(1990)558-570)和少突膠質(zhì)細胞 (McMorris, F. A.，禾口 Dubois—Dalcq，Μ. ， J. Neurosci. Res. 21(1988) 199—209 ；McMorris, F. Α.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826 ;Mozell，R. L.，和 McMorris，F(xiàn). A.， J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390))。US 5，093，317提到膽堿能神經(jīng)元細胞的存活通過 施用胰島素樣生長因子I而提高。還已知胰島素樣生長因子I刺激外周神經(jīng)再生(Kanje， Μ.等，Brain Res. 486 (1989) 396-398)并提高鳥氨酸脫羧酶的活性(US 5，093，317)。US 5，861，373和W093/02695提到通過提高患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中胰島素樣生長因子I和/或其 類似物的有效濃度來治療主要影響神經(jīng)膠質(zhì)和/或非膽堿能神經(jīng)細胞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損 傷或疾病的方法。WO 02/32449涉及通過向哺乳動物鼻腔施用包含治療有效量的胰島素樣 生長因子I或其生物活性變體的藥物組合物來減少或預防哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中局部 缺血損傷的方法。胰島素樣生長因子I通過鼻腔吸收并以有效減少或預防與局部缺血事件 相關(guān)的局部缺血損傷的量轉(zhuǎn)運至哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。在EP 0 874 641中報道了 胰島素樣生長因子I或胰島素樣生長因子II用于制備治療或預防中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元 損傷的藥物的用途。已將降低游離胰島素樣生長因子I的腦水平和血清水平與阿爾茨海默氏病的散 發(fā)型和家族型的發(fā)病機理相關(guān)聯(lián)。此外，胰島素樣生長因子I保護神經(jīng)元免于Αβ誘導的 神經(jīng)毒性(Niikura,T.等，J. Neurosci. 21 (2001) 1902-1910 ；Dore, S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(1997)4772-4777 ；Dore,S.等，Ann. NY Acad. Sci. 890 (1999) 356-364)。近來，表 明外周施用胰島素樣生長因子I能夠降低大鼠和小鼠中的腦Αβ水平(CamE.等，Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397)。此外，研究證實在轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型中延長的胰島素樣生長因 子I治療顯著減輕腦的淀粉狀蛋白斑負擔。這些數(shù)據(jù)強烈支持胰島素樣生長因子I能夠通 過從腦中清除Αβ來降低腦的Αβ水平和減輕斑點相關(guān)腦癡呆的觀點。胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II是67%同一性的單鏈多肽，分別具有 70和67個氨基酸，與胰島素具有大約40%的序列同一性并且據(jù)推測是結(jié)構(gòu)同源的。胰島 素樣生長因子的前29個殘基與胰島素B鏈(B區(qū)，1-29)是同源的，隨后是與前胰島素的C 肽(C區(qū)，30-41)相似的12個殘基，以及與胰島素A鏈(Α區(qū)，42-62)同源的21個殘基區(qū)。 羧基末端的八肽(D區(qū)，63-70)在胰島素和前胰島素中沒有對應部分(Murray-Rust，J.等， BioEssays 14(1992)325-331 ；Baxter, R. C.等，J. Biol. Chem. 267 (1992) 60-65)。胰島素樣 生長因子是胰島素超家族中翻譯后未通過蛋白水解除去C區(qū)的僅有的成員。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1至6)是216至289 個殘基的蛋白質(zhì)，例如，成熟的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5由252個殘基組成(Wetterau， L. Α.等，Mol. Gen. Metab. 68 (1999) 161-181 ；綜述參見例如 Rajaram，S.等，Endocr.
5Rev. 18(1997)801-831)。所有胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白都有共同的結(jié)構(gòu)域組織。發(fā)現(xiàn)最 保守處位于N末端(殘基1至大約100)和C末端(從殘基170)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域中。 在N末端結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)12個保守的半胱氨酸，在C末端結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)6個。中部的低保 守部分(L結(jié)構(gòu)域)含有大部分特異性蛋白酶的切割位點(Chernausek，S. D.等，J.Biol. Chem. 270(1995) 11377-11382)。迄今為止已經(jīng)描述和生化表征了胰島素樣生長因子結(jié)合蛋 白的幾個不同片段(Mazerbourg, S.等，Endocrinology 140(1999)4175-4184)。誘變研究表 明高親和力胰島素樣生長因子結(jié)合位點位于N末端結(jié)構(gòu)域中(WetteraU，L.A.等，Mol. Gen. Metab. 68(1999) 161-181 ；Chernausek, S. D.等，J. Biol. Chem. 270 (1995) 11377-11382)，并 且至少胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2含有兩個結(jié)合決定 簇，一個在 N —個在 C 末端結(jié)構(gòu)域(Wetterau，L. Α.等，Mol. Gen. Metab. 68 (1999) 161-181)。 近來，已經(jīng)描述了一組比胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白具有更低親和力的結(jié)合胰島素樣生 長因子的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白(IGFBP-rP) (Hwa, V.等，The IGF binding protein superfamily,在 Rosenfeld, R. G.,禾口 Roberts, C. Τ.編輯，The IGF system, Molecular Biology, Physiology, and Clinical Applications (1999), Humana Press, Totowa，第315-327頁中)。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白和IGFBP-rP都有高度保守并且富 含半胱氨酸的N末端結(jié)構(gòu)域，這似乎對于幾種生物學作用(包括它們結(jié)合胰島素樣生長因 子以及高親和力結(jié)合胰島素)是重要的(Hwa等，1999)。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3的 N末端(例如通過消化血漿產(chǎn)生)也結(jié)合胰島素，因此在生理學上可能與胰島素作用相關(guān)。 除了 N末端結(jié)構(gòu)域外，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白和IGFBP-rP之間缺少序列相似性。發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面是檢測聚乙二醇化胰島素樣生長因子的免疫測定，包含捕獲抗 體和示蹤抗體，其中所述捕獲抗體是單克隆抗聚乙二醇抗體，所述示蹤抗體是單克隆抗洋 地黃毒苷(digoxygenin)抗體，所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子作為與洋地黃毒苷化胰 島素樣生長因子結(jié)合蛋白的復合體而得到檢測，其中所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子與 所述洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的孵育步驟為室溫下12至24小時，所述洋 地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的濃度為5. 0μ g/ml或更低。在一個實施方案中，所述抗聚乙二醇抗體綴合到固相，并且所述抗洋地黃毒苷抗 體綴合到可檢測標簽。在另一個實施方案中，所述綴合為化學綴合。在另一個實施方案中， 所述可檢測標簽選自酶、抗原、熒光基團、化學發(fā)光基團和金屬螯合物復合體。在又一個實 施方案中，所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子是SEQ ID NO :1的胰島素樣生長因子I或其 聚乙二醇化變體。在又一個實施方案中，所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子是單聚乙二醇 化的。在又一個實施方案中，所述胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋 白3、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4、或胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5。在另一個實施方案 中，本發(fā)明的免疫測定的特征在于所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子與所述洋地黃毒苷化 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的孵育步驟為18至22小時，優(yōu)選地為20小時。在又一個實施 方案中，本發(fā)明的免疫測定的特征在于所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子與所述洋地黃毒 苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的孵育步驟中所述洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合 蛋白的濃度為 0. 1 至 5. 0μ g/ml，或 0. 1 μ g/ml 至 1.0yg/ml。本發(fā)明的第二方面是確定樣品中聚乙二醇化胰島素樣生長因子的方法，包括下述步驟a)提供待分析的樣品，b)將綴合到固相的抗聚乙二醇抗體與所述樣品孵育以形成抗聚乙二醇抗體/聚 乙二醇化胰島素樣生長因子復合體，c)將b)中形成的所述復合體與洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4在室 溫下孵育12至24小時以形成第二復合體，其包含b)中形成的復合體，所述洋地黃毒苷化 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4的濃度為5. 0μ g/ml或更低，d)將C)中形成的所述復合體與辣根過氧化物酶綴合的抗洋地黃毒苷抗體孵育以 形成第三復合體，其包含c)中形成的復合體，e)通過將d)中形成的復合體與ABTS孵育并通過檢測有色產(chǎn)物的形成確定聚乙二 醇化胰島素樣生長因子。在所述方法的一個實施方案中，在步驟b)，和/或C)，和/或d)之后進行洗滌步 驟。在一個實施方案中，所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子是聚乙二醇化胰島素樣生長因 子I或其聚乙二醇化變體。在另一個實施方案中，所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子和所 述洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4的孵育步驟為18至22小時。在另一個實施 方案中，所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子和所述洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋 白4的孵育步驟中所述洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4的濃度為0. 1 μ g/ml至 5. 0 μ g/ml ο本發(fā)明的第三方面是定量確定樣品中聚乙二醇化胰島素樣生長因子I或其聚乙 二醇化變體的量的方法，包括下述步驟a)提供待分析樣品，b)提供至少兩種參比樣品，每種含有確定但不同量的聚乙二醇化胰島素樣生長因 子I，c)將綴合到固相的抗聚乙二醇抗體分別與所述樣品以及與所述至少兩種含有不 同量聚乙二醇化胰島素樣生長因子I的參比樣品孵育，從而形成抗聚乙二醇抗體/聚乙二 醇化胰島素樣生長因子復合體，d)將C)中各自與樣品和參比樣品形成的所述復合體分別與洋地黃毒苷化胰島素 樣生長因子結(jié)合蛋白4孵育，從而形成第二復合體，其包含c)中形成的復合體，其中與洋地 黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4的孵育為室溫下12至24小時，所述洋地黃毒苷化 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4的濃度為5. 0 μ g/ml或更低，e)將d)中各自與樣品和參比樣品形成的所述復合體分別與辣根過氧化物酶綴合 的抗洋地黃毒苷抗體孵育，從而形成第三復合體，其包含d)中形成的復合體，f)將e)中各自與樣品和參比樣品形成的復合體分別與ABTS孵育5至15分鐘，并 確定所形成的有色產(chǎn)物的量，g)通過標準曲線定量確定所述樣品中聚乙二醇化胰島素樣生長因子I或其聚乙 二醇化變體的量，該標準曲線基于參比樣品中所形成有色產(chǎn)物的量來計算。本發(fā)明第四方面是本發(fā)明的方法在患者隨訪中的用途，該患者已經(jīng)施用了聚乙二 醇化胰島素樣生長因子或其聚乙二醇化變體。本發(fā)明此方面的一個實施方案是所述捕獲抗體為所述抗聚乙二醇抗體的混合物，其包含至少兩種所述抗聚乙二醇抗體，該至少兩種抗體綴合到固相的抗體位點不同，并且 所述示蹤抗體是所述抗洋地黃毒苷抗體的混合物，其包含至少兩種所述抗洋地黃毒苷抗 體，該至少兩種抗體綴合到可檢測標簽的抗體位點不同。在另一個實施方案中，抗體通過 化學結(jié)合經(jīng)抗體氨基酸骨架的N末端和/或ε氨基(賴氨酸)、不同賴氨酸的ε氨基、羧 基、巰基、羥基、和/或酚功能基團、和/或通過抗體碳水化合物結(jié)構(gòu)的糖醇基團與其綴合配 偶體進行綴合。在本發(fā)明此方面的一個實施方案中，捕獲抗體混合物或示蹤抗體混合物包 含通過氨基和通過碳水化合物結(jié)構(gòu)綴合到它們綴合配偶體的相應抗體。在另一個實施方案 中，捕獲抗體通過被動吸附或通過特異性結(jié)合對綴合到固相。在本發(fā)明的一個實施方案中， 特異性結(jié)合對(第一成分/第二成分)選自鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、或抗 體/抗原、或凝集素/多糖、或類固醇/類固醇結(jié)合蛋白、或激素/激素受體、或酶/底物、 或IgG/蛋白質(zhì)A和/或G。在另一個實施方案中，捕獲抗體綴合到生物素并且通過固定的 抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素綴合到固相。在另一個實施方案中，捕獲抗體為IgM類型的 抗聚乙二醇抗體。在本發(fā)明此方面的又一個實施方案中，示蹤抗體通過特異性結(jié)合對綴合 到可檢測標簽。本發(fā)明此方面的另一個實施方案為捕獲抗體與示蹤抗體的比例是1 10 至50 1(比例的意思是抗體分子的比例，不考慮綴合物的分子量，其可能是不同的)。本發(fā)明的另一方面是確定樣品中聚乙二醇化胰島素樣生長因子I或其聚乙二醇 化變體的試劑盒，包括a)鏈霉抗生物素包被的微量滴定板，b)綴合到生物素的抗聚乙二醇抗體，c)綴合到辣根過氧化物酶的抗洋地黃毒苷抗體，d)洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4，e) ABTS ο在一個實施方案中，b)和C)中的抗體是單克隆抗體。在另一個實施方案中，b)中 的抗體為IgM類型，并且c)中的抗體為IgG類型。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及通過使用捕獲抗體和示蹤抗體來確定聚乙二醇化胰島素樣生長因子 或其聚乙二醇化變體的免疫測定，其中所述捕獲抗體為抗聚乙二醇抗體和所述示蹤抗體為 抗洋地黃毒苷抗體，其中所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子作為所述聚乙二醇化胰島素樣 生長因子與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白形成的復合體而被確定，其中所述聚乙二醇化胰島 素樣生長因子和所述洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的孵育步驟為室溫下12至 24小時，所述洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的濃度為5. 0μ g/ml或更低。免疫測定是本領域技術(shù)人員熟知的。相關(guān)教科書中總結(jié)了實施這樣測定的 方法以及實際應用和操作過程。相關(guān)教科書的例子為Tijssen，P.，Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates (在"Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990), 221-278, R. H. Burdon 禾口 v. P. H. Knippenberg 編輯，Elsevier，Amsterdam 中)，以及多卷的〃 Methods in Enzymology" (S. P. Colowick, N. 0. Caplan編輯，Academic Press)，其討論免疫學檢測方法，特別是第70、73、74、84、92和 121 卷。抗體作為蛋白質(zhì)包含許多反應部分，如，例如氨基(賴氨酸、α氨基)，巰基(胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)，羧基(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。這些可用于偶聯(lián)到結(jié)合配 偶體，如表面、蛋白質(zhì)、聚合物(如，例如PEG、纖維素或聚苯乙烯)、酶、或結(jié)合對的成員(參 見例如 Aslam M.，禾口 Dent，A.，Bioconjugation MacMillan Ref. Ltd. (1999)50—100)。蛋白質(zhì)最常見的反應基團之一是氨基酸賴氨酸的脂肪族胺。通常，幾乎所有 抗體都包含豐富的賴氨酸。賴氨酸胺是PH 8. O以上(pKa = 9. 18)相當好的親核物質(zhì)，因 此與多種試劑容易地、完全地反應形成穩(wěn)定的鍵。抗體中另一種常見的反應基團是來自于 含硫氨基酸胱氨酸及其還原產(chǎn)物半胱氨酸(或半個胱氨酸)的巰基殘基。半胱氨酸包含 比胺更加親核的游離巰基，通常是蛋白質(zhì)中最具有反應性的功能基團。巰基通常在中性PH 具有反應性，因此可在胺存在時選擇性地偶聯(lián)到其它分子。由于游離的巰基是相對具有 反應性的，帶有這些基團的蛋白質(zhì)常常以它們作為二硫基團或二硫鍵的氧化形式而存在。 除了胱氨酸和半胱氨酸，一些蛋白質(zhì)也含有氨基酸甲硫氨酸，其包含硫醚連接的硫。文獻 報道使用幾種硫醇交聯(lián)試劑如Traut' s試劑(2-亞氨硫雜環(huán)戊烷)、琥珀酰亞胺基(乙 酰硫基)乙酸酯(SATA)或磺基琥珀酰亞胺基6-[3-(2_吡啶基二硫基)丙酰氨基]己酸 酯(Sulfo-LC-SPDP)提供通過反應性氨基引入多個巰基的有效方式。反應性酯類，特別是 N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)酯類，是其中最常用的修飾胺基的試劑。水性環(huán)境中反應的最 適？!1為？!18.0至9.0。異硫氰酸酯是胺修飾試劑，與蛋白質(zhì)形成硫脲鍵。它們與蛋白質(zhì)胺 在水性溶液中反應(在PH9. O至9. 5最佳)。在溫和含水條件下醛與脂肪族和芳香族胺、 胼和酰胼反應形成亞胺中間體(希夫氏堿)。希夫氏堿可通過溫和或強力還原劑(如硼氫 化鈉或氰基硼氫鈉)被選擇性地還原從而獲得穩(wěn)定的烷胺鍵。用于修飾胺的其它試劑為酸 酐。例如，二亞乙基三胺五乙酸酐(DTPA)是雙功能螯合劑，包含兩個胺反應性酸酐基團。它 能與蛋白質(zhì)的N末端和ε-氨基反應形成酰胺鍵。酸酐環(huán)打開產(chǎn)生多元金屬螯合臂，其能 夠以配位化合物緊密結(jié)合金屬?？贵w中另一常見反應性基團為羧酸(天冬氨酸、谷氨酸)。蛋白質(zhì)在C末端位置和 天冬氨酸和谷氨酸側(cè)鏈內(nèi)包含羧酸基團。為了綴合羧酸基團通常通過使用水溶性碳二亞胺 轉(zhuǎn)化成反應性酯并與親核試劑(如胺、酰胼或胼)反應。為了在蛋白質(zhì)中其它胺存在下與 活化的羧酸選擇性反應，含胺試劑應當是弱堿性的。當PH提高到8. O以上時可發(fā)生蛋白交 聯(lián)。高碘鈉可用于將碳水化合物部分內(nèi)的糖的醇部分氧化成醛。每個醛基團都能與 胺、酰胼或胼反應，如對羧酸所述。由于碳水化合物部分主要在抗體的可結(jié)晶片段(Fe)區(qū) 發(fā)現(xiàn)，可通過對遠離抗原結(jié)合位點的碳水化合物進行定點修飾從而完成綴合。巰基反應試劑為將巰基偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上的那些試劑，形成硫醚偶聯(lián)產(chǎn)物。這些試 劑在弱酸至中性PH下迅速反應，因此可在胺基團存在時被選擇性地反應。鹵乙酰衍生物 (例如碘乙酰胺)形成硫醚鍵，是用于巰基修飾的試劑。在抗體中，反應發(fā)生在半胱氨酸基 團上，半胱氨酸基團或者是本身存在的，或者來自于對抗體不同位置的胱氨酸二硫化物的 還原。其他有用試劑是馬來酰亞胺。馬來酰亞胺與巰基反應性試劑的反應基本上與碘乙酰 胺的反應相同。馬來酰亞胺在弱酸至中性PH下迅速反應。胺、酰胼和胼是醛和羧酸反應性試劑(形成酰胺、腙或烷胺鍵)。在通過水溶性碳 二亞胺活化羧基后，胺、酰胼和胼可被偶聯(lián)到蛋白質(zhì)的羧基。含胺試劑必須為弱堿性，以便 在更強堿性的賴氨酸ε _胺存在時與碳二亞胺活化蛋白質(zhì)選擇性反應形成穩(wěn)定的酰胺鍵。在與醛基(可通過高碘酸鹽氧化抗體上的碳水化合物殘基在抗體上產(chǎn)生醛基)反應中形成 希夫氏堿中間體，可通過使用氰基硼氫鈉(溫和的并且選擇性的)或硼氫化鈉(強力的) 水溶性還原劑還原中間體而使其還原成烷胺。本發(fā)明中使用的術(shù)語“免疫測定”是指免疫學測定方法，即一種體外方法。通過免 疫測定可以直接確定樣品中聚乙二醇化胰島素樣生長因子或其聚乙二醇化變體的存在和 / 或數(shù)量(參見例如 The Immunoassay Handbook, David Wild 編輯，M Stockton Press, 1994)。一般而言免疫測定包含一種或更多種(在一個實施方案中為兩種不同的)特異性結(jié) 合到樣品中待分析的分子的結(jié)合分子。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫測定包含兩種不 同抗體，其結(jié)合到聚乙二醇化胰島素樣生長因子上兩種不同的無重疊的表位。在另一個實 施方案中，本發(fā)明的免疫測定包含一種特異性結(jié)合到聚乙二醇化胰島素樣生長因子或其聚 乙二醇化變體的抗體，以及結(jié)合到待檢測分子的無重疊表位的一種分子。為檢測的目的，至 少一種結(jié)合分子通過可檢測的標簽標記，例如，包括放射性同位素、酶或染料，它們可通過 放射性分解、酶催化的顏色產(chǎn)生、熒光輸出或抑制、或化學發(fā)光輸出進行檢測。免疫測定方 法包括下述方法如放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、熒光免疫測定(FIA) 和化學發(fā)光測定(CLA)。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫測定為異質(zhì)免疫測定。在這樣 的免疫測定中，能夠從包含捕獲抗體和分析物的復合體中除去待分析樣品中存在的未結(jié)合 的分子，該復合體結(jié)合到固相。可通過離心、過濾、磁性分離或從固相上抽吸樣品液體實施 分離，在一個實施方案中，隨之通過緩沖液反復洗滌與固相結(jié)合的復合體。在一個實施方案 中，免疫測定為夾心免疫測定(參見例如Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, John Ε. Butler,CRC Press，1991)。在這種免疫測定中，第一步中使聚乙二醇化胰島素樣生 長因子結(jié)合到固定于固相的抗體，該抗體特異性結(jié)合到聚乙二醇化胰島素樣生長因子的第 一表位。形成復合體后除去樣品，并通過緩沖液反復洗滌復合體。隨后向復合體中加入檢 測分子，該檢測分子結(jié)合到聚乙二醇化胰島素樣生長因子的與第一表位無重疊的表位。所 述檢測分子通常或者直接地(例如綴合到熒光基團、放射標簽或金屬螯合物)或者間接地 (例如綴合到結(jié)合對的第一配偶體)綴合到可檢測標簽。聚乙二醇化胰島素樣生長因子被 “夾心”在抗體和檢測分子之間。可進行第二洗滌步驟以便除去未結(jié)合的檢測分子。最后可 檢測的標簽通過適當?shù)臋z測劑進行檢測。在本發(fā)明的免疫測定和方法的一個實施方案中， 抗體結(jié)合到聚乙二醇化胰島素樣生長因子或其聚乙二醇化變體的聚乙二醇部分，檢測分子 結(jié)合到胰島素樣生長因子部分。本申請中使用的術(shù)語“樣品”是指，但不限于，來自于活體或以前為活體的任意量 的物質(zhì)。這樣的活體包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔及其他動物。在一個實施方案中， 本發(fā)明的免疫測定或方法中的樣品取自于小鼠、大鼠、犬、短尾猴或人。在另一個實施方案 中，本發(fā)明的免疫測定或方法中的樣品來自于短尾猴或人。這樣的樣品包括但不限于個體 的全血、血清或血漿，它們是臨床常規(guī)中最廣泛使用的樣品來源。本申請中使用的術(shù)語“固相”是指非流體物質(zhì)，包括顆粒(包括微粒和珠子)，其 通過下述材料制造如聚合物、金屬(順磁的、鐵磁的顆粒)、玻璃和陶瓷；凝膠物質(zhì)如二氧 化硅、鋁和聚合物凝膠；毛細管，其可通過聚合物、金屬、玻璃和/或陶瓷制造；沸石和其他 多孔物質(zhì)；電極；微量滴定板；固體條；和試管、導管或其它分光計樣品容器。測定的固相 成分與測定可能接觸的惰性固體表面的不同之處在于“固相”在其表面上包含至少一個部
10分，該部分的目的在于與測定中使用的捕獲分子相互作用。固相可以是固定不動的成分， 如導管、條、試管或微量滴定板，或可以是不固定的成分，如珠子和微粒。微粒也可用作異質(zhì) 測定形式的固相?？梢允褂迷试S蛋白質(zhì)和其它物質(zhì)共價或非共價附著的多種微粒。這樣 的顆粒包括聚合物顆粒如聚苯乙烯和聚(異丁烯酸甲酯)；金顆粒如金納米顆粒和膠體金; 和陶瓷顆粒如二氧化硅、玻璃和金屬氧化物顆粒。參見例如Martin，C. R.等，Analytical Chemistry-News & Features (1998) 322A-327A。本發(fā)明免疫測定的固相支持物在現(xiàn)有技術(shù) 中有廣泛描述(參見例如 Butler, J. Ε.，Methods 22 (2000) 4-23)。色原(熒光或發(fā)光基團或染料)、酶、NMR活性基團或金屬顆粒、半抗原(例如洋地 黃毒苷)是“可檢測標簽”的例子?？蓹z測標簽也可以是可光活化的交聯(lián)基團，例如疊氮或 吖丙因(azirine)基團。在一個實施方案中，可檢測的標簽為可通過電化學發(fā)光檢測的金 屬螯合物，特別優(yōu)選的是釕螯合物，例如釕(二吡啶基)32+螯合物。例如，在EP 0 580 979、 WO 90/005301, WO 90/11511和WO 92/14138中描述了適當?shù)尼憳撕灮鶊F。為直接檢測，標簽基團可選自任何已知的可檢測基團，如染料、發(fā)光標簽基團(如 化學發(fā)光基團，例如吖啶酯或1，2_二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane))、或熒光染料(例如熒光素、 香豆素、羅丹明、噁嗪、試鹵靈、花菁及其衍生物)。標簽基團的其他例子為發(fā)光金屬復合體 (如釕或銪復合體)、酶(例如用于ELISA或CEDIA(Cloned Enzyme Donor Immunoassay，即 克隆酶供體免疫測定，例如EP-A-O 061 888)的酶)、和放射性同位素。間接檢測系統(tǒng)包括，例如檢測試劑通過生物親和性結(jié)合對的第一配偶體標 記。適當結(jié)合對的例子為半抗原或抗原/抗體、生物素或生物素類似物如氨基生物素 (aminobiotin)，亞氨基生物素(iminobiotin)或脫硫生物素/抗生物素蛋白或鏈霉抗生物 素、糖/凝集素、核酸或核酸類似物/互補核酸、和受體/配體，例如類固醇激素受體/類固 醇激素。優(yōu)選的第一結(jié)合對成員包括半抗原、抗原和激素。特別優(yōu)選的是半抗原如洋地黃 苷毒素和生物素及其類似物。這樣的結(jié)合對的第二配偶體，例如抗體、鏈霉抗生物素等等通 常被標記(例如通過前述的標簽)從而允許直接檢測。在本發(fā)明的免疫學檢測方法中選擇的試劑條件允許所用的試劑結(jié)合，例如將抗體 結(jié)合到聚乙二醇化胰島素樣生長因子。本領域技術(shù)人員將這樣的結(jié)合事件的結(jié)果通過術(shù)語 “復合體”來表示。在本發(fā)明的測定方法中形成的復合體可用來確定存在，也可用來確定濃 度(即定量)。本申請中使用的術(shù)語“胰島素樣生長因子”是指SEQ ID NO :1(胰島素樣生長因子 I)或SEQ ID NO :2(胰島素樣生長因子II)的蛋白質(zhì)或其變體。在一個實施方案中，胰島素 樣生長因子的變體是SEQ ID NO :1的胰島素樣生長因子同時其27位賴氨酸被極性氨基酸 取代，并且或者65位賴氨酸或68位賴氨酸被極性氨基酸取代。術(shù)語“極性氨基酸”是指精 氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺，即賴氨酸被精氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺取代。在一個實施方 案中所述極性氨基酸是精氨酸。在另一個實施方案中，所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子 是單聚乙二醇化胰島素樣生長因子，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1同時其27和65位賴氨 酸被極性氨基酸取代，并且PEG殘基共價結(jié)合到68位氨基酸。在另一個實施方案中，所述 聚乙二醇化胰島素樣生長因子為單聚乙二醇化胰島素樣生長因子，其氨基酸序列為SEQ ID NO 1同時其27和68位賴氨酸被極性氨基酸取代，并且PEG殘基共價結(jié)合到65位氨基酸。 在又一個實施方案中，所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子為單聚乙二醇化胰島素樣生長因子，其氨基酸序列為SEQ IDNO :1同時其27位，或其27和65和/或68位賴氨酸被極性氨 基酸取代，并且PEG殘基共價結(jié)合到所述因子的氨基末端。本發(fā)明的第一方面是檢測聚乙二醇化胰島素樣生長因子的免疫測定，包含捕獲抗 體、胰島素樣生長因子/胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白復合體和示蹤抗體，其中a)所述捕獲抗體是單克隆抗聚乙二醇抗體，b)所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子作為與洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié) 合蛋白復合體而被檢測，c)所述示蹤抗體為單克隆抗洋地黃毒苷抗體。聚乙二醇(PEG)抗體是生物素?；?，在一個實施方案中，其結(jié)合到固相(例如鏈 霉抗生物素包被的微量滴定板)。在第一孵育步驟中，作為參比標準或來自于測試樣品的聚 乙二醇化胰島素樣生長因子或其聚乙二醇化變體結(jié)合到與固相綴合的抗聚乙二醇抗體。本 申請中使用的術(shù)語“聚乙二醇化胰島素樣生長因子”是指其上共價附著聚乙二醇殘基的“胰 島素樣生長因子”。其后，洋地黃毒苷化檢測試劑，在一個實施方案中為洋地黃毒苷化胰島 素樣生長因子結(jié)合蛋白(其是過量存在的)在第二孵育步驟中結(jié)合到前面形成的復合體。 在哺乳動物來源的樣品中，胰島素樣生長因子一般與內(nèi)源胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白形成 復合體。為了確定聚乙二醇化胰島素樣生長因子，必須用本測定的洋地黃毒苷化胰島素樣 生長因子結(jié)合蛋白(因此其是過量添加的)替換內(nèi)源胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白。綴合到 辣根過氧化物酶的抗洋地黃毒苷抗體和ABTS溶液用作檢測系統(tǒng)。在一個實施方案中，捕獲抗體是完整抗體，即其包含輕和重鏈，其中輕鏈包含可變 域和恒定域，其中重鏈包括可變域、ChU CH2、CH3、和可選的CH4結(jié)構(gòu)域以及鉸鏈區(qū)。在不同 實施方案中，捕獲抗體可選自所述抗聚乙二醇抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)、Fab、Fab’、F(ab)2、 或F(ab，)2片段，即其是所述抗聚乙二醇抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)、Fab、或Fab，、或F(ab)2、 或F(ab，)2片段。根據(jù)免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白分為不同類型IgA、 IgD、IgE、IgG和IgM。這些類型中的一些進一步分成亞類(同種型)，即IgG分為IgGl、 IgG2、IgG3和IgG4，或IgA分為IgAl和IgA2。在一個實施方案中，捕獲抗體是多聚抗體， 例如1#。可通過不同方法將示蹤和/或捕獲抗體綴合到其綴合配偶體，如被動吸附、化學 結(jié)合或通過特異性結(jié)合對結(jié)合。本文中使用的術(shù)語“綴合配偶體”是指例如固相、多肽、可 檢測標簽、或特異性結(jié)合對的成員。在一個實施方案中，捕獲和/或示蹤抗體與其綴合配偶 體的綴合是相互獨立的，通過化學結(jié)合經(jīng)抗體氨基酸骨架的N末端和/或ε氨基(賴氨 酸)、不同賴氨酸的ε氨基、羧基、巰基、羥基、和/或酚功能基團、和/或經(jīng)抗體碳水化合 物結(jié)構(gòu)的糖醇基團進行綴合。在一個實施方案中，捕獲和/或示蹤抗體通過特異性結(jié)合對 綴合到其綴合配偶體。在一個實施方案中，捕獲抗體綴合到生物素并通過固定在固相的抗 生物素蛋白或鏈霉抗生物素固定到固體支持物。在一個實施方案中，示蹤抗體綴合到辣根 過氧化物酶并且是抗洋地黃毒苷抗體。在另一個實施方案中，捕獲抗體通過被動吸附綴合 到固相。通過被動吸附綴合到固相的抗體包括通過不同抗體位點綴合到固相的抗體混合 物。因此，通過被動吸附綴合到固相的捕獲抗體是兩種或更多不同綴合物的混合物，該綴合 物用于有效綴合到固相的抗體位點(即抗體氨基酸殘基)不同。被動吸附是例如Butler，J. E.在"Solid Phases in Immunoassay，，(在 Diamandis,Ε· P.禾口 Christopoulos, Τ· K.編 輯 Jmmunoassay (1996)，Academic Press, San Diego 第 205-225 頁中)所描述的那樣。在本發(fā)明的一個實施方案中，捕獲抗體通過特異性結(jié)合對固定。這樣的結(jié)合對 (第一成分/第二成分)是，例如鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、抗體/抗原(參 見例如 Hermanson，G. T.等，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996)、凝集素 / 多糖、類固醇/類固醇結(jié)合蛋白、激素/激素受體、酶/底物、IgG/蛋白質(zhì)A和/或G和/ 或L等等。在一個實施方案中，捕獲抗體綴合到生物素并通過抗生物素蛋白或鏈霉抗生物 素固定。在另一個實施方案中，示蹤抗體綴合到電化學發(fā)光標簽(如釕二吡啶基復合體)。本發(fā)明的免疫測定利用胰島素樣生長因子與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的特異 性相互作用。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白特異性結(jié)合到胰島素樣生長因子，檢測所形成的 胰島素樣生長因子/胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白復合體。這一復合體不能直接檢測，因此 需要進一步的結(jié)合配偶體。所以，本發(fā)明的免疫測定包含作為核心成分的a)特異性結(jié)合到胰島素樣生長因子的捕獲抗體，b)特異性結(jié)合到胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的示蹤抗體。因此，本發(fā)明檢測聚乙二醇化胰島素樣生長因子的免疫測定包含下述化合物(也 參見

圖1)_ 固相，-捕獲抗體，其特異性結(jié)合到聚乙二醇并綴合到固相，-胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白，其或者直接綴合到可檢測標簽，或著綴合到結(jié)合對 的第一配偶體，-可選地，如果胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白綴合到結(jié)合對的第一配偶體，則還包括 包含所述結(jié)合對的第二配偶體的示蹤分子。綴合到固相的抗聚乙二醇抗體特異性結(jié)合到聚乙二醇化化合物的聚乙二醇殘基。 如果將含有聚乙二醇化化合物的樣品與綴合到固相的抗聚乙二醇抗體接觸，聚乙二醇化化 合物將被抗聚乙二醇抗體結(jié)合，因此，將通過抗聚乙二醇抗體綴合到固相。在一個實施方案 中，抗聚乙二醇抗體是單克隆抗體，可以屬于任何免疫球蛋白類型。在另一個實施方案中， 所述抗聚乙二醇抗體是IgM類型的單克隆抗聚乙二醇抗體。示例性的抗聚乙二醇抗體在US 7，320，791或WO 2002/094853中有報道。抗聚乙二醇抗體可共價或通過特異性結(jié)合對或通 過物理相互作用綴合到固相。在一個實施方案中，固相是微量滴定板的孔。在一個實施方案中，所述捕獲抗聚乙 二醇抗體通過特異性結(jié)合對綴合到固相，例如通過鏈霉抗生物素/生物素特異性結(jié)合對， 由此抗聚乙二醇抗體通過共價鍵連接到生物素，并且固相通過共價鍵連接了鏈霉抗生物
ο本發(fā)明中術(shù)語“胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白”包括胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白胰 島素樣生長因子結(jié)合蛋白1、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3、 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋 白6。人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1至6的序列在SwissProt Database (http //www. expasy. ch)中有詳細描述并通過下述登錄號鑒別
1權(quán)利要求
檢測聚乙二醇化胰島素樣生長因子的免疫測定，包含捕獲抗體和示蹤抗體，其特征在于a)所述捕獲抗體是單克隆抗聚乙二醇抗體，b)所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子作為與洋地黃毒苷化的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的復合體而得到檢測，c)所述示蹤抗體是單克隆抗洋地黃毒苷抗體，其中所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子與所述洋地黃毒苷化的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的孵育為室溫下12至24小時，所述洋地黃毒苷化的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的濃度為5.0μg/ml或更低。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫測定，其特征在于a)所述抗聚乙二醇抗體綴合到固相，并且b)所述抗洋地黃毒苷抗體綴合到可檢測標簽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的免疫測定，其特征在于所述綴合是通過共價鍵的綴合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3中任一項的免疫測定，其特征在于所述可檢測標簽選自酶、抗 原、熒光基團、化學發(fā)光基團、電化學發(fā)光基團和金屬螯合物復合體。
5.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的免疫測定，其特征在于所述聚乙二醇化胰島素樣生長因 子是聚乙二醇化胰島素樣生長因子I或其聚乙二醇化變體。
6.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的免疫測定，其特征在于所述胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白 是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4。
7.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的免疫測定，其特征在于所述聚乙二醇化胰島素樣生長因 子與所述洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的孵育為18至22小時。
8.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的免疫測定，其特征在于所述聚乙二醇化胰島素樣生長因 子與所述洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的孵育步驟中，所述洋地黃毒苷化胰島 素樣生長因子結(jié)合蛋白的濃度為0. 1 μ g/ml至5. 0 μ g/ml。
9.確定樣品中聚乙二醇化胰島素樣生長因子的方法，包括下述步驟a)提供待分析的樣品，b)將綴合到固相的抗聚乙二醇抗體與所述樣品孵育，從而形成抗聚乙二醇抗體/聚乙 二醇化胰島素樣生長因子復合體，c)將b)中形成的所述復合體與洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4在室溫下 孵育12至24小時，從而形成復合體，其包含b)中形成的復合體，所述洋地黃毒苷化的胰島 素樣生長因子結(jié)合蛋白4的濃度為5. 0 μ g/ml或更低，d)將c)中形成的所述復合體與辣根過氧化物酶綴合的抗洋地黃毒苷抗體孵育，從而 形成復合體，其包含c)中形成的復合體，e)通過將d)中形成的復合體與ABTS孵育并通過有色產(chǎn)物的形成確定聚乙二醇化胰島 素樣生長因子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于在步驟b)、C)、和/或d)之后進行洗滌步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的方法，其特征在于所述聚乙二醇化胰島素樣生長因子是聚 乙二醇化胰島素樣生長因子I或其聚乙二醇化變體。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項的方法，其特征在于所述聚乙二醇化胰島素樣生長2因子與所述洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4的孵育為18至22小時。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項的方法，其特征在于所述聚乙二醇化胰島素樣生長 因子與所述洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4的孵育中，所述洋地黃毒苷化胰島 素樣生長因子結(jié)合蛋白4的濃度為0. lyg/ml至5.0yg/ml。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的方法在患者隨訪中的用途，該患者施用了聚乙二醇化胰島素樣 生長因子I或其聚乙二醇化變體。
15.確定樣品中聚乙二醇化胰島素樣生長因子的試劑盒，包含a)鏈霉抗生物素包被的微量滴定板，b)綴合到生物素的抗聚乙二醇抗體，c)綴合到辣根過氧化物酶的抗洋地黃毒苷抗體，d)洋地黃毒苷化胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的試劑盒，其特征在于b)和c)中所述抗體是單克隆抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的試劑盒，其特征在于所述抗聚乙二醇抗體是IgM類型。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項的試劑盒，其特征在于所述胰島素樣生長因子結(jié)合 蛋白是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4。
19.定量確定樣品中聚乙二醇化胰島素樣生長因子的量的方法，包括下述步驟a)提供待分析的樣品，b)提供參比樣品，其含有確定量的聚乙二醇化胰島素樣生長因子，c)將綴合到固相的抗聚乙二醇抗體與所述樣品以及與至少兩種含有不同量聚乙二醇 化胰島素樣生長因子的參比樣品孵育，從而形成抗聚乙二醇抗體/聚乙二醇化胰島素樣生 長因子復合體，d)將c)中與各個樣品和參比樣品形成的所述復合體與洋地黃毒苷化胰島素樣生長因 子結(jié)合蛋白4孵育，從而形成第二復合體，其包含c)中形成的復合體，其中與洋地黃毒苷化 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4的孵育為室溫下12至24小時，所述洋地黃毒苷化胰島素樣 生長因子結(jié)合蛋白4的濃度為5. 0μ g/ml或更低，e)將d)中與各個樣品和參比樣品形成的所述復合體與辣根過氧化物酶綴合的抗洋地 黃毒苷抗體孵育，從而形成第三復合體，其包含d)中形成的復合體，f)將e)中與各個樣品和參比樣品形成的的復合體與ABTS孵育5至15分鐘，并確定所 形成的有色產(chǎn)物的量，g)基于標準曲線定量確定所述樣品中聚乙二醇化胰島素樣生長因子的量，該標準曲線 基于參比樣品中所形成有色產(chǎn)物的量計算而得。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于步驟d)中所述孵育為18至22小時。
全文摘要
本發(fā)明報道了確定聚乙二醇化胰島素樣生長因子的免疫測定，該免疫測定利用抗聚乙二醇抗體和抗洋地黃毒苷抗體檢測胰島素樣生長因子/胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白復合體。
文檔編號G01N33/543GK101965516SQ200980108314
公開日2011年2月2日 申請日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月3日
發(fā)明者A·肖布馬爾, J·施萊彭, K·朗, T·施洛特豪爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司