專利名稱：：制備崁非醇-3-o-蕓香糖苷的方法和含崁非醇-3-o-蕓香糖苷的皮膚外用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于制備具有以下化學(xué)式1的崁非醇-3-0-蕓香糖苷(kaempferol-3-O-rutinoside)的方法以及含有崁非醇-3-0-蕓香糖苷作為活性成分的皮膚外用組合物。更具體地，本發(fā)明涉及一種通過利用能夠從植物提取物中的崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物(kaempferol-3-O-mtinosideglycosides)中選擇性地除去糖的酶或微生物而進(jìn)行水解來分離出崁非醇-3-0-蕓香糖苷的方法，以及含有防止皮膚產(chǎn)生皺紋的崁非醇-3-0-蕓香糖苷的皮膚外用組合物?；瘜W(xué)式l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>
背景技術(shù)：
：具有上述化學(xué)式1的崁非醇-3-0-蕓香糖苷是黃酮醇的一種典型成分，它是一種類黃酮并廣泛地分布在植物的花和葉中(RedoxR印ort(氧化還原作用報(bào)導(dǎo))，4,13-16,1999)。特別地，崁非醇-3-0-蕓香糖苷是一種具有優(yōu)異的生理活性(例如抗氧化)(RedoxReport，Vol.4,No.3,1999)并可以改進(jìn)血液循環(huán)(Biol.Pharm.Bull.(生物藥學(xué)通訊)25(4),505-508,2002)的物質(zhì)。因此，已經(jīng)對崁非醇-3-0-蕓香糖苷的各種功效進(jìn)行了研究，并已經(jīng)將崁非醇-3-0-蕓香糖苷應(yīng)用到各種領(lǐng)域中。然而，由于目前所用的崁非醇-3-0-蕓香糖苷大多僅以數(shù)ppm到數(shù)十ppm的含量包含于植物提取物中，因此難以展現(xiàn)崁非醇-3-0-蕓香糖苷的實(shí)際功效。此外，由于難以找到含有大量崁非醇-3-0-蕓香糖苷的植物，并且用來制備大量的崁非醇-3-0-蕓香糖苷的分離和提純也沒有經(jīng)濟(jì)效益，因此崁非醇-3-0-蕓香糖苷的大量生產(chǎn)的研究很少。同時(shí)，表皮(externalskin)包括真皮組織的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)組分以及膠原蛋白，基于所述ECM的總量，所述膠原蛋白占約70-80%。皮膚皺紋的形成是由于年齡增長或紫外(UV)光而導(dǎo)致的膠原蛋白的產(chǎn)生量的減少或膠原蛋白的破壞。特別地，諸如膠原酶的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloprotease)的表達(dá)導(dǎo)致了正常產(chǎn)生的膠原蛋白的降解，從而產(chǎn)生了鈹紋。已經(jīng)開發(fā)和利用了各種物質(zhì)來抑制膠原蛋白的減少，這種膠原蛋白的減少是皺紋產(chǎn)生的源頭。例如視黃醇、視黃酸等的類維生素A物質(zhì)(retinoidmaterials)表現(xiàn)出優(yōu)異的抗皺效果(Dermatologytherapy(皮膚病學(xué)治療)，1998，16，357-364)，并己經(jīng)采用含有麥芽汁等的組合物來對膠原酶進(jìn)行控制(日本專利No.5,105,693)。然而，即使在僅使用少量的類維生素A物質(zhì)時(shí)，類維生素A物質(zhì)也會刺激皮膚。而且，從天然產(chǎn)品中獲得的物質(zhì)以單純的提取物的形式使用，并沒有表現(xiàn)出各個(gè)成分的效果。因此，難以持續(xù)地保持并控制所述提取物的活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，不用于特定目的綠茶種子含有大量的配糖物，例如山茶糖苷A(camelliasideA)和山茶糖苷B(camelliasideB)。由于該發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了一種用于大量生產(chǎn)具有優(yōu)異的生理活性的崁非醇6-3-0-蕓香糖苷的方法，并且還證實(shí)了所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷具有優(yōu)異的抗鮍效果。因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于大量生產(chǎn)高純度的將被用作化妝品和食品成分的崁非醇-3-0-蕓香糖苷的方法，并且本發(fā)明還提供一種含有抗皺效果優(yōu)異的崁非醇-3-0-蕓香糖苷的皮膚外用組合物。為了實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明提供了一種制備具有以下化學(xué)式1的崁非醇-3-0-蕓香糖苷的方法，該方法包括通過利用能夠從植物提取物中的崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物中選擇性地除去糖的酶或微生物而進(jìn)行水解來分離出崁非醇-3-0-蕓香糖苷。本發(fā)明還提供了一種含有用來抗皺的崁非醇-3-0-蕓香糖苷的皮膚外用組合物。以下，將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。用來制備崁非醇-3-0-蕓香糖苷的方法包括(1)使用水和有機(jī)溶劑中的一種來獲取含有崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物的植物提取物；以及(2)利用酶和微生物中的一種從處于所述提取物內(nèi)的崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物中選擇性地除去糖以分離出崁非醇-3-0-蕓香糖苷。為了利用水或有機(jī)溶劑從步驟(1)中的植物(特別是綠茶(茶樹(Ow2e//^化學(xué)式lw'"e似&)))中獲取含有崁非醇-3-0-蕓香糖苷或者崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物的植物提取物，將水或有機(jī)溶劑倒入綠茶葉或綠茶種子中約l-6次，優(yōu)選約3次。隨后通過在室溫下對混合物進(jìn)行1-5輪的攪拌以除去脂肪來對綠茶葉或綠茶種子進(jìn)行提取。將水或有機(jī)溶劑倒入已除去了脂肪的綠茶葉或綠茶種子中約1-8次，優(yōu)選約4次。將混合物在回流下提取1-5次，并在10-20"C下進(jìn)行l(wèi)-3天的沉降。然后通過過濾和離心將殘?jiān)蜑V液分離，通過在減壓下濃縮所分離的濾液以得到提取物，并且將該提取物懸浮在水中，用有機(jī)溶劑除去所述提取物的色素。接著，用有機(jī)溶劑對水層進(jìn)行l(wèi)-5次萃取。通過在減壓下對得到的有機(jī)溶劑層進(jìn)行濃縮來獲得提取物，并且隨后將所述提取物溶解在少量的有機(jī)溶劑中。通過向混合物加入大量的有機(jī)溶劑而產(chǎn)生沉淀，并將所述沉淀干燥以獲得含有本發(fā)明的崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物的提取物。所述提取物含有崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物，特別是含有山茶糖苷A或山茶糖苷B。所述有機(jī)溶劑可以為選自由乙醇、甲醇、丁醇、醚、乙酸乙酯和三氯甲垸所組成的組中的至少一種溶劑，以及這些有機(jī)溶劑與水的混合物，優(yōu)選地，可以使用80%的乙醇。所述利用酶或微生物從位于所述提取物中的崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物中選擇性地除去糖而分離出崁非醇-3-0-蕓香糖苷的步驟(2)中，所述崁非醇_3-0-蕓香糖苷是利用酶或微生物由位于步驟(1)所制備的提取物中的均為崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物的山茶糖苷A或山茶糖苷B而制備的。從微生物等中獲得降解糖鍵的酶。該酶可以為市場上商購的酶，也可以為根據(jù)需要而制備得到的酶。特別地，所述酶具有從所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物中選擇性地除去糖以分離出崁非醇-3-0-蕓香糖苷的活性。由山茶糖苷A來制備崁非醇-3-0-蕓香糖苷的反應(yīng)在以下反應(yīng)式1中示出,反應(yīng)式l，n:酶或微生物*半乳糖在以上反應(yīng)中，通過從山茶糖苷A中選擇性地除去吡喃半乳糖基的糖而得到崁非醇-3-0-蕓香糖苷。用于從山茶糖苷A中除去所述糖的酶可以為選自由葡糖苷酶、纖維素酶、半乳糖苷酶和淀粉葡糖苷酶所組成的組中的至少一種酶。由山茶糖苷B來制備崁非醇-3-0-蕓香糖苷的反應(yīng)在以下反應(yīng)式2中示出。反應(yīng)式2，-:咖,，,翻mr艦'酶或微生物-木糖在以上的反應(yīng)中，通過從山茶糖苷B中選擇性地除去吡喃木糖基的糖而得到崁非醇-3-0-蕓香糖苷。用來從山茶糖苷B中除去所述糖的酶可以為選自由木糖苷酶、木聚糖酶和柚皮苷酶所組成的組中的至少一種酶。用于反應(yīng)式1和反應(yīng)式2中的微生物可以為選自由曲霉屬(aspergillussp,)、芽孢桿菌屬(bacillussp.)、青霉屬(penicilliumsp.)、根霉屬(rhizopus9sp.)、根毛霉屬(rhizomucorsp.)、籃狀菌屬(talaromycessp.)、雙歧桿菌屬(bifidobacteriumsp.)、豐皮f包霉屬(mortierellasp)、g急球菌屬(cryptococcussp.)以及微桿菌屬(microbacteriumsp.)所組成的組中至少一種微生物。當(dāng)酶或微生物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，pH值的范圍優(yōu)選為4.0-5.5。如果所述pH值低于4.0，則反應(yīng)速率低，并且如果所述pH值超過5.5，則產(chǎn)量低。此外，當(dāng)所述酶或微生物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，溫度范圍優(yōu)選為30-50°C。如果所述溫度低于30'C，則反應(yīng)速率低，并且如果所述溫度高于50°C，則酶的反應(yīng)選擇性降低。作為底物的綠茶種子提取物的濃度范圍優(yōu)選為5-20%。如果所述濃度高于20%，則相對于所使用的量，酶或微生物的經(jīng)濟(jì)效率降低，并且如果所述濃度低于5%，則所述酶或微生物的反應(yīng)速率低。當(dāng)所述酶或微生物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為48-76小時(shí)。通過薄層色譜法(thinlayerchromatography)來檢査底物的消除速率。當(dāng)?shù)孜锉煌耆龝r(shí)，將混合物在熱水(80-100°C)中加熱5-15分鐘以終止反應(yīng)。將獲得的反應(yīng)溶液在減壓下濃縮以除去溶劑，隨后向殘?jiān)屑尤氪疾旌衔镞M(jìn)行l(wèi)-5輪攪拌。通過過濾除去沉淀的鹽，并將濾液在減壓下進(jìn)行濃縮以獲得粗產(chǎn)品。用硅膠柱色譜法(三氯甲烷甲醇=8:1-4:1)對得到的粗產(chǎn)品進(jìn)行提純，從而提供了純凈的崁非醇-3-0-蕓香糖苷。本發(fā)明提供了含有用來抗皺的崁非醇-3-0-蕓香糖苷的皮膚外用組合物。含有崁非醇-3-0-蕓香糖苷的皮膚外用組合物通過將促進(jìn)前膠原的產(chǎn)生和抑制膠原酶的表達(dá)活性相結(jié)合的協(xié)同作用而具有優(yōu)異的抗皺效果，所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷是根據(jù)上述方法從植物(特別是綠茶)中獲得的。基于所述組合物的總重量，所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷的含量為0.0001-10重量％。如果所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷的含量低于0.0001重量％，則所述組合物不能獲得該組分的抗皺效果，并且如果所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷的含量高于10重量％，則與所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷的使用量相比，抗皺效果并沒有顯著的增加。根據(jù)本發(fā)明的崁非醇-3-0-蕓香糖苷可以被配制成皮膚外用組合物，但不特別地限定于此類制劑。所述制劑可以包括:化妝品組合物，例如柔膚劑(skinsoftener)、營養(yǎng)7K(nutritionwater)、營養(yǎng)霜(nutritioncream)、按摩霜(massagecream)、精華素(essence)、目艮霜(eyecream)、目艮部精華素(eyeessence)、清潔霜(cleansingcream)、清潔泡沬(cleansingfoam)、清潔xR(cleansingwater)、美容涂敷劑(pack)、粉劑(powder)、美體洗劑(bodylotion)、美體霜(bodycream)、美體油(bodyoil)、美體精華素(bodyessence)、化妝品底霜(makeupbase)、粉底(foundation)、染發(fā)齊l)(hair-dyeingagent)、洗發(fā)香波(shampoo)、護(hù)發(fā)素(rinse)禾口沐浴露(bodywashingagent)等；以及藥物組合物，例如藥膏(ointment)、凝膠(gel)、霜劑(cream)、貼布(patch)和噴劑等。在各種制劑的組合物中，可以適當(dāng)?shù)丶尤胗糜谥苽溥@些制劑所需要的各種材料和添加劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕松地選擇所述成分的類型和根據(jù)本發(fā)明，從植物(特別是綠茶)中提取山茶糖苷A或山茶糖苷B，然后利用酶或微生物從山茶糖苷A或山茶糖苷B中選擇性地除去所述糖以大量生產(chǎn)崁非醇-3-0-蕓香糖苷，所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷是主要的生理活性成分之一。所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷表現(xiàn)出對前膠原產(chǎn)生的促進(jìn)作用以及對膠原酶的表達(dá)活性的抑制作用，通過將上述活性相結(jié)合的協(xié)同作用，所述崁非醇_3-0-蕓香糖苷具有優(yōu)異的抗皺效果。本發(fā)明提供了一種含有用于抗皺的崁非醇-3-0-蕓香糖苷的皮膚外用組合物。具體實(shí)施例方式下面，用制備實(shí)施例、實(shí)施例以及實(shí)驗(yàn)實(shí)施例來更詳細(xì)地描述本發(fā)明。ii然而，本發(fā)明不限于此。制備實(shí)施例l:綠茶種子提取物的制備將6L的己烷加入到2kg的綠茶種子中，并將混合物在室溫下進(jìn)行3輪攪拌以從被提取的綠茶種子中除去脂肪。將4L的80%的甲醇倒入1kg的除去了脂肪的種子中，在回流下對混合物進(jìn)行3次提取并使得到的溶液在15。C下沉降l天。用濾布和離心進(jìn)行過濾，將殘?jiān)蜑V液分離。在減壓下濃縮所分離的濾液，并且將該濾液懸浮在水中，隨后分5次加入總量為1L的乙醚，并進(jìn)行萃取以除去色素。分三次加入總量為500ml的1-丁醇并除去水層。得到的余下的1-丁醇層在減壓下進(jìn)行濃縮以獲得1-丁醇提取物。將所獲得的提取物溶解在少量的甲醇中，并隨后加入到大量的乙酸乙酯中，從而獲得沉淀。將生成的沉淀干燥，從而獲得250g的綠茶種子提取物。實(shí)施例h對選擇性地水解山茶糖苷A的酶的篩選將10g的由制備實(shí)施例1獲得的綠茶種子提取物溶解在100ml的0.1M的醋酸緩沖溶液中(pH4.5)。向混合物中加入1.5g的酶，并且得到的混合物在37。C的水浴中反應(yīng)24-48小時(shí)。利用具有C18反相柱(流動相為乙腈水=40:60)的高效液相色譜法(HPLC)在270nm的紫外(UV)波長下分析山茶糖苷A的轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)中所用的酶以及轉(zhuǎn)化率的結(jié)果示于下表1中。12表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表1中的在48小時(shí)之后具有約50%的轉(zhuǎn)化率的酶被認(rèn)為是很有可能具有反應(yīng)選擇性的酶。因此，P-葡糖苷酶、淀粉葡糖苷酶、纖維素酶-A以及卩-半乳糖苷酶包含于在所述糖的選擇性消除反應(yīng)中具有高度選擇性的候選組中。實(shí)施例2:對選擇性地水解山茶糖苷B的酶的篩選將10g的由制備實(shí)施例1獲得的綠茶種子提取物溶解在100ml的0.1M的醋酸緩沖溶液中(pH4.5)。向混合物中加入1.5g的酶，并使得到的混合物在37。C的水浴中反應(yīng)24-48小時(shí)。利用具有C18反相柱(流動相為乙腈水=40:60)的HPLC在270nm的UV波長下分析山茶糖苷B的轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)中所用的酶以及轉(zhuǎn)化率的結(jié)果示于下表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2中的在48小時(shí)之后具有約50%的轉(zhuǎn)化率的酶被認(rèn)為是很有可能具有反應(yīng)選擇性的酶。因此，P-木糖苷酶、木聚糖酶以及柚皮苷酶包含于在所述糖的選擇性消除反應(yīng)中具有高度選擇性的候選組中。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1:崁非醇-3-0-蕓香糖苷的轉(zhuǎn)化率根據(jù)溫度的變化將10g的由制備實(shí)施例1獲得的綠茶種子提取物溶解在100ml的0.1M的醋酸緩沖溶液中(pH4.5)。向混合物中加入1.5g的來自于所述候選組的(3-半乳糖苷酶，并確定處于各個(gè)溫度下的水浴中的崁非醇-3-0-蕓香糖苷的轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率的結(jié)果示于下表3中。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>確定崁非醇-3-O-蕓香糖苷在30-5(TC下具有很高的轉(zhuǎn)化率。此外，在35'C下的轉(zhuǎn)化率高于在3(TC和4(TC下的轉(zhuǎn)化率，這表示在35。C之前，酶的活性隨著溫度的升高而增高。然而，在45。C以上轉(zhuǎn)化率顯著地降低，這是由于酶的不穩(wěn)定性隨著溫度的升高而增高所導(dǎo)致的。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2:崁非醇-3-0-蕓香糖苷的轉(zhuǎn)化率根據(jù)時(shí)間的變化將10g的由制備實(shí)施例1獲得的綠茶種子提取物溶解在100ml的0.1M的醋酸緩沖溶液中(pH4.5)。向混合物中加入1.5g的來自于所述候選組的卩-半乳糖苷酶，并確定處于37'C的水浴中的崁非醇-3-0-蕓香糖苷在各個(gè)反應(yīng)時(shí)間下的轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率的結(jié)果示于下表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表4中所示，在72小時(shí)后的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了98%，并且超過72小時(shí)后的轉(zhuǎn)化率都很接近。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3:崁非醇-3-0-蕓香糖苷的轉(zhuǎn)化率根據(jù)反應(yīng)的pH值的變化將10g的由制備實(shí)施例1獲得的綠茶種子提取物溶解在100ml的0.1M的具有各種pH值的醋酸緩沖溶液中。向混合物中加入1.5g的來自于所述候選組的(3-半乳糖苷酶，并確定處于37'C的水浴中的崁非醇-3-0-蕓香糖苷在緩沖溶液的各種pH值下的轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率的結(jié)果示于下表5中。表5反應(yīng)的pH值轉(zhuǎn)化率(％)4.0934.5985.0955.5906.0846.5777.0757.5788.0808.5829.083如表5中所示，pH值為4.0-5.5時(shí)，轉(zhuǎn)化率高于或等于卯％，并且最高轉(zhuǎn)化率為98%，對應(yīng)的pH值為4.5。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4:崁非醇-3-0-蕓香糖苷的轉(zhuǎn)化率根據(jù)底物濃度的改變將由制備實(shí)施例1獲得的綠茶種子提取物的濃度在5-50%的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。向混合物中加入1.5g的來自于所述候選組的P-半乳糖苷酶，并確定處于37"C的水浴中崁非醇-3-0-蕓香糖苷的在各種底物濃度下的轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率的結(jié)果示于下表6中。表6底物濃度(％)轉(zhuǎn)化率(％)5.09710.09815.09520.09125.08730.08335,07640.07145.06350.055如表6所示，底物濃度為5-20%時(shí)，轉(zhuǎn)化率高于90%，并且最高轉(zhuǎn)化率為98%，對應(yīng)的底物濃度為10%。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5:崁非醇-3-0-蕓香糖苷的鑒定實(shí)施例1和實(shí)施例2以及實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1-4中制備的產(chǎn)物表現(xiàn)出以下的特征，并因而被鑒定為崁非醇-3-0-蕓香糖苷(VarianGemini2000300MHz，Varian公司)<崁非醇-3-0-蕓香糖苷的物理化學(xué)特性>性質(zhì)淡黃綠色微晶體17正離子快原子轟擊質(zhì)譜(PositiveFAB-MS):595[M+H]+'H畫麗R:6.31(1H,d,2,H6)、6.63(1H,d,2,H8)、7.03(2H，d,8,H3,，5，)、8.21(2H,d，8，H2，，6，)、12.04(1H,s,5隱0H)、L10(3H，d，4,Me-rha)、4.61(1H,brs,Hl畫rha)、5.20(1H,d，8，Hl-glc)13C-NMR:156.6、133.5、177.5、161.3、98,9、164.2、93.8、156.9、104.2、121.1、130.9、115.2、159.9、115.2、130.9、101.6、74.4、76.7、70,9、76.0、67,1、100.8、70.5、70.2、72.1、68,3、17.7實(shí)施例3:通過山茶糖苷A的酶反應(yīng)來制備崁非醇-3-0-蕓香糖苷將10g的由制備實(shí)施例1獲得的綠茶種子提取物溶解在100ml的0.1M的醋酸緩沖溶液中(pH4.5)。向混合物中加入1.5g的酶，并使得到的混合物在37。C的水浴中反應(yīng)48-75小時(shí)。相應(yīng)的酶為P-葡糖苷酶(實(shí)施例3-l)、纖維素酶-A(實(shí)施例3-2)和|3-半乳糖苷酶(實(shí)施例3-3)，并且利用各個(gè)酶來制備崁非醇-3-0-蕓香糖苷。然后，用薄層色譜法來檢查底物的消除速率。當(dāng)?shù)孜锉煌耆龝r(shí)，將混合物在熱水(80-100°C)中加熱5-15分鐘以終止反應(yīng)。將反應(yīng)溶液在減壓下濃縮以除去溶劑，并將殘?jiān)尤氲揭掖贾?，進(jìn)行1-5輪攪拌。通過過濾除去產(chǎn)生的沉淀，并隨后將濾液在減壓下濃縮以獲得粗產(chǎn)品。所獲得的粗產(chǎn)品用硅膠柱色譜法(三氯甲烷甲醇=8:1-4:1)進(jìn)行提純，從而獲得純凈的崁非醇-3-0-蕓香糖苷。實(shí)施例4:通過山茶糖苷B的酶反應(yīng)來制備崁非醇-3-0-蕓香糖苷按照與實(shí)施例3相同的方法由山茶糖苷B制備崁非醇-3-0-蕓香糖苷，并且所使用的酶為(3-木糖苷酶(實(shí)施例4-l)、木聚糖酶(實(shí)施例4-2)以及柚皮苷酶(實(shí)施例4-3)。18實(shí)驗(yàn)實(shí)施例6:對膠原酶表達(dá)的抑制效果的測定對由實(shí)施例3和實(shí)施例4獲得的崁非醇-3-0-蕓香糖苷所能達(dá)到的抑制膠原酶表達(dá)的效果進(jìn)行測定，并與生育酚和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)所能達(dá)到的抑制膠原酶表達(dá)的效果進(jìn)行比較。生育酚和EGCG是使皮膚的表皮細(xì)胞再生并防止皮膚老化的抗氧化物質(zhì)。將人的成纖維細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔的量植入含有具有2.5%的胎牛血清的杜爾貝科改良的伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco，sModifiedEagle'sMedia,DMEM)的96孔的微量滴定板中，并進(jìn)行培養(yǎng)直到人的成纖維細(xì)胞生長了90%，然后在無血清的DMEM培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24小時(shí)。將實(shí)施例3和實(shí)施例4的崁非醇-3-0-蕓香糖苷、生育酚和EGCG以1X104M的濃度溶解在所述無血清的DMEM培養(yǎng)基中并處理24小時(shí)，收集所述細(xì)胞培養(yǎng)基。用測量膠原酶的儀器(Amershampharmacia公司)來測定所收集的細(xì)胞培養(yǎng)基的膠原酶產(chǎn)生的程度。將所收集的細(xì)胞培養(yǎng)基加入到均勻涂敷有第一膠原酶抗體的96孔板上，并在恒溫器中進(jìn)行3小時(shí)的抗原-抗體反應(yīng)。3小時(shí)后，將鍵合有發(fā)色團(tuán)的第二膠原酶抗體加入到96孔板中，進(jìn)行15分鐘的反應(yīng)。15分鐘之后，在室溫下植入顯色物質(zhì)并持續(xù)15分鐘以誘導(dǎo)顯色，然后加入lM的硫酸以終止反應(yīng)(顯色)。反應(yīng)溶液的顏色為黃色，并且所述黃色的色調(diào)的明暗程度可以根據(jù)反應(yīng)進(jìn)行的程度而不同。通過對405nm處的吸光度進(jìn)行測量來測定具有黃色的色調(diào)的96孔板的吸光度，并且通過以下等式l計(jì)算合成的程度。在該計(jì)算中，未用所述材料進(jìn)行處理的細(xì)胞培養(yǎng)基的吸光度作為對照組。也就是說，未處理組的膠原酶表達(dá)的程度為100，并且與該對照組的吸光度進(jìn)行比較得到用所述材料處理過的組的膠原酶表達(dá)的程度。結(jié)果示于表7中。等式l膠原歸糊程度〔%)=用所述材料處理過的細(xì)胞組的畫表7材料膠原酶表達(dá)的程度(%)未處理的組100生育酚75EGCG60實(shí)實(shí)施例3-1使用(3-葡糖苷酶(杏仁)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷A制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷70施例實(shí)施例3-2使用纖維素酶-A(黑曲霉)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷A制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷713實(shí)施例3-3使用P-半乳糖苷酶(米曲霉)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷A制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷63實(shí)實(shí)施例4-1使用(3-木糖苷酶(黑曲霉)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷B制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷68施例實(shí)施例4-2使用木聚糖酶(綠色木霉)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷B制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷734實(shí)施例4-3使用柚皮苷酶(斜臥青霉)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷B制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷70膠原酶表達(dá)的程度越低，膠原酶表達(dá)的抑制效果就越高并且皮膚中越少發(fā)生膠原蛋白的降解。因此，能減少產(chǎn)生的皺紋的量。從表7的結(jié)果中可以確定，膠原酶表達(dá)的程度根據(jù)實(shí)施例3和實(shí)施例4中所用的酶而不同，但是本發(fā)明的崁非醇-3-0-蕓香糖苷抑制了膠原酶在體外的表達(dá)。而且，崁非醇-3-0-蕓香糖苷所達(dá)到的膠原酶表達(dá)的抑制效果高于已知的抗氧化物質(zhì)生育酚所達(dá)到的抑制效果。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例7:對促進(jìn)前膠原產(chǎn)生的效果的測定對由實(shí)施例3和實(shí)施例4得到的崁非醇-3-0-蕓香糖苷所達(dá)到的促進(jìn)前膠原產(chǎn)生的效果進(jìn)行測定，并與由維生素C所達(dá)到的效果進(jìn)行比較。所述前膠20原為誘導(dǎo)膠原蛋白產(chǎn)生的物質(zhì)，而且是產(chǎn)生膠原蛋白和防止老化所需要的。己知維生素C是用于膠原蛋白合成的必要組分。將人的成纖維細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔的量植入到含有具有2.5%的胎牛血清的杜爾貝科改良的伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco，sModifiedEagle'sMedia,DMEM)的96孔的微量滴定板中，并進(jìn)行培養(yǎng)直到人的成纖維細(xì)胞生長了90%，然后在無血清的DMEM培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24小時(shí)。將實(shí)施例3和實(shí)施例4的崁非醇-3-0-蕓香糖苷和維生素C以1Xl(T4M的濃度溶解在所述無血清的DMEM培養(yǎng)基中并處理24小時(shí)，收集所述細(xì)胞培養(yǎng)基。24小時(shí)后，使用前膠原1型C肽酶免疫測定試劑盒(C-peptideEIAkit)(MK101，Takara，曰本)測定漂浮在所述培養(yǎng)基中的前膠原的量。在未處理的組中，前膠原產(chǎn)生的程度為100。與對照組的前膠原產(chǎn)生的程度進(jìn)行比較后獲得用所述材料處理過的組的前膠原產(chǎn)生的程度。結(jié)果示于表8中。表8材料前膠原產(chǎn)生的程度(%)未處理的組100維生素c120實(shí)實(shí)施例3-1使用p-葡糖苷酶(杏仁)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷A制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷121施例實(shí)施例3-2使用纖維素酶-A(黑曲霉)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷A制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷1183實(shí)施例3-3使用P-半乳糖苷酶(米曲霉)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷A制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷138實(shí)實(shí)施例4-1使用P-木糖苷酶(黑曲霉)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷B制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷145施例實(shí)施例4-2使用木聚糖酶(綠色木霉)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷B制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷1234實(shí)施例4-3使用柚皮苷酶(斜臥青霉)作為反應(yīng)酶由山茶糖苷B制備的崁非醇-3-0-蕓香糖苷122前膠原產(chǎn)生的程度越高，膠原蛋白產(chǎn)生的程度就越高。因此，能防止皺21紋的產(chǎn)生。從表8中的結(jié)果可以確定前膠原的產(chǎn)生的程度根據(jù)實(shí)施例3和實(shí)施例4中所用的酶而不同，但是本發(fā)明的崁非醇-3-0-蕓香糖苷促進(jìn)了前膠原在體外的產(chǎn)生。而且，由崁非醇-3-0-蕓香糖苷所達(dá)到的前膠原的產(chǎn)生的程度明顯高于由已知的為合成膠原蛋白的必要組分的維生素c所達(dá)到的程度。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一種利用酶或微生物從植物提取物中的崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物中選擇性地除去糖來大量生產(chǎn)崁非醇-3-0-蕓香糖苷的方法。本發(fā)明一種還提供了含有用于抗皺的崁非醇-3-0-蕓香糖苷的皮膚外用組合物。2權(quán)利要求1、一種用于制備由以下化學(xué)式1表示的崁非醇-3-O-蕓香糖苷的方法，該方法包括通過利用酶和微生物中的一種進(jìn)行水解而將崁非醇-3-O-蕓香糖苷從崁非醇-3-O-蕓香糖苷配糖物中分離出來，所述酶和微生物能選擇性地除去糖，化學(xué)式12、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，用于制備崁非醇-3-0-蕓香糖苷的方法包括(1)利用水和有機(jī)溶劑中的一種來獲取含有崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物的植物提取物；以及(2)利用所述酶和微生物中的一種對所述提取物進(jìn)行水解以從所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物中選擇性地除去所述糖，從而分離出所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物為山茶糖苷A或山茶糖苷B。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷是通過選擇性地將吡喃半乳糖基的所述糖中的一個(gè)從所述山茶糖苷A中除去而獲得的，以及通過選擇性地將吡喃木糖基的所述糖中的一個(gè)從所述山茶糖苷B中除去而獲得的。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，將所述糖從山茶糖苷A中除去的酶為選自由葡糖苷酶、纖維素酶、半乳糖苷酶和淀粉葡糖苷酶所組成的組中的至少一種酶，以及將所述糖從山茶糖苷B中除去的酶為選自由木糖苷酶、木聚糖酶和柚皮苷酶所組成的組中的至少一種酶。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述微生物為選自由曲霉屬(aspergillussp.)、芽抱桿菌屬(bacillussp.)、青毒屬(penicilliumsp.)、根毒屬(rhizopussp.)、根毛毒屬(rhizomucorsp.)、籃狀菌屬(talaromycessp.)、雙歧桿菌屬(bifidobacteriumsp.)、被孢霉屬(mortierellasp)、隱球菌屬(cryptococcussp.)以及微桿菌屬(microbacteriumsp.)所組成的組中的至少一種微生物。7、根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酶和所述微生物的反應(yīng)pH值為4.0-5.5。8、根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酶和所述微生物的反應(yīng)溫度為30-50°C。9、根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酶和所述微生物的反應(yīng)時(shí)間為48-76小時(shí)。10、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述含有崁非醇-3-0-蕓香糖苷配糖物的植物提取物為綠茶的提取物。11、一種皮膚外用組合物，該組合物含有由以下化學(xué)式l表示的用于抗皺的崁非醇-3-0-蕓香糖苷，化學(xué)式l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>12、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的組合物，其中，所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷具有將促進(jìn)前膠原產(chǎn)生和抑制膠原酶表達(dá)的活性相結(jié)合的協(xié)同作用。13、根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，基于該組合物的總重量，所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷的含量為0.0001-10重量％。14、根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述組合物為被配制為由柔膚劑、營養(yǎng)水、營養(yǎng)霜、按摩霜、精華素、眼霜、眼部精華素、清潔霜、清潔泡沬、清潔水、美容涂敷劑、粉劑、美體洗劑、美體霜、美體油、美體精華素、化妝品底霜、粉底、染發(fā)劑、洗發(fā)香波、護(hù)發(fā)素和沐浴露所組成的組中的一種化妝品組合物。15、根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述組合物為被配制為由藥膏、凝膠、霜劑、貼布和噴劑所組成的組中的一種藥用組合物。16、根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述崁非醇-3-0-蕓香糖苷分離自綠茶。全文摘要本發(fā)明涉及用于制備崁非醇-3-O-蕓香糖苷的方法以及含有所述莰非醇-3-O-蕓香糖苷作為活性成分的皮膚外用組合物。特別地，本發(fā)明涉及一種通過利用能夠從植物提取物中的崁非醇-3-O-蕓香糖苷配糖物中選擇性地除去糖的酶或微生物而進(jìn)行水解來分離崁非醇-3-O-蕓香糖苷的方法以及含有防止皮膚產(chǎn)生皺紋的莰非醇-3-O-蕓香糖苷的皮膚外用組合物。文檔編號C12P19/44GK101522907SQ200780038247公開日2009年9月2日申請日期2007年4月25日優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日發(fā)明者盧浩植,張利燮,樸惠胤,樸葰星,金德姬申請人:株式會社太平洋