專利名稱：治療、預(yù)防和診斷豬ttv感染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及病毒病原體。具體說，本發(fā)明涉及豬托克特諾病毒 (Torque teno virus, TTV);治療、預(yù)防和診斷豬感染TTV和豬TTV相關(guān) 疾病的方法，以及用于研究TTV和TTV相關(guān)疾病的動物模型。
背景技術(shù)：
托克特諾病毒OTV)也稱為輸血傳播性病毒，屬于艾內(nèi)羅浮動病毒屬 (Anellovirus floating genus)，以前曾稱為環(huán)病毒科(Circoviridae)。 TTV最初 分離自輸血后未知病因的肝炎病人的血液。Nishizawa等，Aoc/ em.6/o/ /y^， i "Cowmm(1997) 211:92-97。也已在除人類以外的一些動物包括豬中鑒定 到TTV。在幾個國家已分離到豬TTV，序列分析顯示TTV不同病毒株的核 苷酸序列相同性在71%-100%之間。Mckeown等，rw.M/craWo/ (2004) 104:113-117。
TTV是一種小的無包膜病毒，具有負(fù)極性單鏈環(huán)形DNA基因組。其 基因組包含一非翻譯區(qū)和至少三個主要的重疊開放讀框。Biagini.P., r"M/cro6/0/ (2004) ￡^:95-101。 ORF1編碼DNA復(fù)制酶，ORF2編碼核衣 殼蛋白，ORF3編碼具有凋亡活性的蛋白。
TTV感染的人常常無癥狀，但TTV病毒血癥發(fā)生率在各種不同臨床疾 病，包括病毒性肝炎、HIV/AIDs、哮喘和兒童相關(guān)呼吸道疾病及腎病病人 中傾向于升高。然而，對照組人群無癥狀TTV病毒血癥的高發(fā)生率，TTV病毒科內(nèi)基因組的顯著多樣性，在體外此病毒不能增殖和缺乏TTV疾病的 動物模型使得將TTV感染與人類疾病相關(guān)聯(lián)的嘗試遇到困惑(Yzebe等， 尸fl麵鮮va 她d. (2002)44:167-177; Biagini,P., F^.m/cro編 (2004) ^:95-101)。雖然看來TTV是通過口鼻或糞-口傳染而獲得的，但也已證明 其可經(jīng)母-嬰和/或子宮內(nèi)傳染。(Geraer等，尸W./"/e"力&J. (2000) 1^:1074-1077)。感染者的特征是長期(數(shù)月至數(shù)年)TTV病毒血癥。人類可 能感染一種以上基因型的TTV(Saback等，ScW.,/"/e".Z^. (2001) 11:121-125)。 一個提議是這些基因型可能是在受感染的人體內(nèi)重組產(chǎn)生的 (Rey等，/w/e"(2003)li:226-233)。雖然此資料可能有片面性，但也有證據(jù)說 明在感染過程中可產(chǎn)生對TTV病毒衣殼蛋白的抗體應(yīng)答，受感染個體可產(chǎn) 生循環(huán)性TTV-抗體免疫復(fù)合物((Yzebe等，尸awm/"en^ me《2002) 41:167-177; Biagini,P., m/croWo/(2004)^:95陽101)。雖有報導(dǎo)說病毒DNA 的水平每毫升可達(dá)到10"個拷貝(Rey等，/"/e"(2003)U:226-233)，但大多數(shù) 研究者采用靈敏度較高的套式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來監(jiān)測血清和組織提取 物中的TTV DNA。靶序列可不同，但DNA基因組非翻譯區(qū)(UTR)特異性 的引物對具有最廣泛的活性，可用于篩選可能包含多種TTV基因型的疑似 樣品。(Rey等，/"/e"(2003)li:226誦233 ; Leary等，J,Ge".^Vo/ (1999) M:2115-2120)。由于已在肝臟、外周血單個核細(xì)胞和骨髓中發(fā)現(xiàn)雙鏈同種 型(復(fù)制性)中間體，推測這些是該病毒在體內(nèi)復(fù)制的部位(Kikuchi等， ,A/ec/.K/ra/ (2000) ^i:165-170; Okamoto等，5/oc/zem.5/o; /z;^.7 e&Commw". (2002)，:657誦662; Rodriguez-Inigo等，v4/nJ.尸^/zo/.(2000)156:1227-1234)。 因為疾病過程和癥狀與TTV不直接相關(guān)，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為TTV是人類和 動物的"孤兒(orphan)"或無毒病毒，即一種仍然有待弄清楚與給定疾病相 聯(lián)系的病毒(Biagini,P., P^.w/cro6/o/.(2004) 絲:95墨101 ; Irshad., 『orWJ.Gw^oe"/ero/. (2006) U:5122-5134; Simmonds等，(1999) 巡:1748-1750; Zein，N,， /尸eW^ (2000) ^:379-383; Beninelli等，C//". M/cro嵐i^ (2001)11:98-113)。
豬TTV是一種普遍存在的病毒，收集自不同地理區(qū)域的血清樣品用 PCR檢測到此病毒表明其在豬中的流行率為33%-100%。 Mckeown等，W.M/cro6/0/.(2004) 104:113 -117。已在豬中鑒定到二種基因(l和2)型(Neil 等，/Ge".P7ro/.(2005)M: 1343-1347);大約一半受檢的豬血清含有此二種 TTV基因型(Kekarainen等，^>o/,(2006)^2:833-837)。已報導(dǎo)患斷奶后 多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的豬血清TTV感染患病率較高(Kekarainen等, /Ge".Wra/.(2006)^2:833-837)。然而，未能證明PMWS臨床癥狀與TTV之 間的相關(guān)性。還有，患PWMS的豬中對PWMS疾病狀態(tài)沒有影響的其它病 毒感染的發(fā)生較高。Segales和Domingo.,g.(2002)2i:109-124。因此，豬 TTV與任何特定病理學(xué)之間的關(guān)系迄今仍不清楚。而且TTV與其它病原體 在共同感染中的作用仍待闡明。
豬環(huán)病毒-相關(guān)疾病(PCVAD)，也稱為豬環(huán)病毒疾病(OCVD)，指豬的 一種復(fù)雜疾病，包括豬環(huán)病毒2型(PCV2)，其原發(fā)疾病表現(xiàn)為在伴有PCV2 肺部病損的正成長和養(yǎng)肥豬中的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、腸炎、 呼吸道疾病以及豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)?？磥鞵CVAD需要多種病原 因子才能發(fā)生。例如，PCV-2是其中的一種因子，但罕見它本身就足以引 起臨床疾病癥狀。其它感染因子似乎是必須的，如豬生殖和呼吸道綜合征 病毒(PRRSV)、豬流感病毒和支原體肺炎。環(huán)境應(yīng)激因子也是發(fā)生PCVAD 的因素。
所有這些協(xié)同因子的共同潛在特征是上調(diào)康復(fù)期的免疫應(yīng)答，其表現(xiàn) 為全身淋巴組織的反應(yīng)性肥大和增生。用強佐劑(不完全弗氏佐劑)乳化免疫 原進(jìn)行的免疫接種模擬了這種淋巴增殖反應(yīng)，已被用于在缺乏其它豬感染 疾病因子的PCV2-感染悉生(gnotobiotic)小豬中誘導(dǎo)PWMS (Krakowka 等，F(xiàn)&P"/;w/(2001)M:31-42)。在現(xiàn)場用某些豬肺炎支原體菌苗免疫接種的 小豬中(Kyriakis等，,Com/ .尸^/K /. (2002) 126:38-46)和實驗(Krakowka等, Caw.(2007) ^:716-724)條件下也觀察到此作用。
然而，許多PMWS的流行與已知的豬傳染病、處理或接種疫苗的改變 無關(guān)，觀察提示此復(fù)雜疾病還有未鑒定出來的因素在起作用。
這些相關(guān)疾病已迅速成為對美國和其他國家豬健康的主要威脅。如今 全球面臨著PCVAD的嚴(yán)重流行，包括加拿大、美國、遠(yuǎn)東、新西蘭和歐 洲，這嚴(yán)重影響到豬的供應(yīng)?；疾÷?8-50%，可能升高到70%;死亡率約4-30%，發(fā)作時超過50%。Miller,M.，豬肉雜志fPoAMagaz/"e),"PCVAD:什 么是已知的和未知的(PCVAD: What's Known and Unknown)"(2006年7月1曰)。
由于PCVAD對經(jīng)濟(jì)的巨大沖擊，需要治療、預(yù)防和診斷其感染的方法。
發(fā)明概述
本文中發(fā)明人令人驚訝地將TTV與PWMS相聯(lián)系，提出TTV是另一 種能促進(jìn)PCV2-誘導(dǎo)PWMS的感染性病毒。此發(fā)現(xiàn)的證據(jù)是TTV促進(jìn)了 豬的其它一種感染因子導(dǎo)致的相關(guān)臨床癥狀，因此可用于開發(fā)抗PCVAD 的疫苗。以下顯示gl-TTV感染對PCV2-誘導(dǎo)的PCVAD的表現(xiàn)的可能影響。 另外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)在雙重感染小豬中，感染順序決定了疾病的臨床表現(xiàn)。
本發(fā)明人也制備了 TTV感染的動物模型。具體說，在PCV2陰性的健 康豬血清中，nPCR檢測顯示存在豬基因型1 TTV(gl-TTV) DNA，以及用 感染了病毒的悉生豬TTV-陽性血漿幾次傳代可檢測gl-TTV的感染性。在 TTV-感染的悉生豬中觀察到可重復(fù)的病損譜，但在無感染的對照悉生小豬 中不存在這種病損。TTV能在豬中復(fù)制的證據(jù)是，用常規(guī)PCR方法不難檢 測出血清TTV DNA。因此，本發(fā)明人第一次證明在TTV是病原體的任何 物種中，如果可以適當(dāng)操縱宿主狀態(tài)的話，其即為(感染的)起源宿主動物。 然而，如以下進(jìn)一步描述的那樣，悉生豬和TTV感染豬可提供豬和人類TTV 感染的動物模型。悉生生物學(xué)提供了研究TTV的新方法。使用悉生動物可 排除環(huán)境影響，包括實驗對象在居住環(huán)境中不慎感染了 TTV。在病原體感 染的悉生動物中觀察到肉眼可見的組織學(xué)改變，這直接反映了致病因子與 宿主之間的相互作用，這是明確的，不會因外部變化如共生和并存的感染、 飲食差異和環(huán)境壓力而造成混亂。
因此，本發(fā)明涉及用TTV制品來治療、預(yù)防和/或診斷TTV-相關(guān)疾病， 如治療、預(yù)防和/或診斷PCVAD-相關(guān)疾病，包括成長和育肥豬的PMWS、 PCV2、 PDNS、生殖疾病、腸炎和呼吸道疾病。可用減毒、滅活或亞單位 疫苗，包括豬TTV分離物來源的免疫原或免疫原混合物來提供抵抗今后TTV感染的保護(hù)力，從而可用于保護(hù)抵抗與TTV感染有關(guān)的疾病。因而本 發(fā)明提供了治療、預(yù)防和/或診斷豬TTV感染的商業(yè)化有效方法。
因此，在一實施方式中，本發(fā)明涉及包含藥學(xué)上可接受的運載體和至 少一種豬TTV免疫原的組合物，所述TTV免疫原選自滅活的免疫原性 豬TTV，減毒的免疫原性豬TTV和分離的免疫原性豬TTV多肽。在某些 實施方式中，此組合物還包含佐劑。
在其它實施方式中，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防豬對象TTV感染的方法， 該方法包括給予豬治療有效量的上述組合物。在某些實施方式中，PCVAD 是斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)和/或豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)。
在還有的其它實施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)組合物的方法，該方法包 括(a)提供選自滅活的免疫原性豬TTV，減毒的免疫原性豬TTV和分離的 免疫原性豬TTV多肽的至少一種豬TTV免疫原，和(b)將此TTV免疫原與 藥學(xué)上可接受的運載體組合。在某些實施方式中，此方法還包括提供佐劑。
在某些實施方式中，上述方法中所用的組合物包含引起豬疾病的其它 病原體的免疫原，例如但不限于豬細(xì)小病毒、豬環(huán)病毒(circovirus)、豬生 殖和呼吸道綜合征病毒、豬流感病毒、偽狂犬病毒、引起豬發(fā)熱的豬瘟病 毒、豬嗜淋巴皰疹病毒(PLHV1和PLHV2)、支原體、纏繞桿菌、彎曲桿菌 (cam; y/o6a"e/" sp; )、 胞內(nèi)勞森菌(/awyo"/a 、 胸膜月巿炎放線菌 (ac""o6acz'〃1^ / /ewropwewmom.ae)、畐l)豬嗜血桿菌(/ aewop/n7^/7araw/力、鏈 球菌、巴斯德菌(p(xste群〃a卿)、沙門菌、大腸桿菌、梭菌(c/o血Wwm鄉(xiāng))、 紅斑丹毒桿菌(er_y，/o,/zr/x r/m"opfl^z/ae)的免疫原。
在其它實施方式中，本發(fā)明涉及檢測脊椎動物對象TTV感染的方法， 包括(a)提供對象的生物學(xué)樣品，和(b)在生物學(xué)樣品中存在的TTV抗體能與 分離的豬免疫原性TTV多肽結(jié)合的反應(yīng)條件下，使生物學(xué)樣品與至少一種 TTV多肽反應(yīng)，從而檢測該對象是否有TTV感染。在某些實施方式中，該 方法還包括(c)除去未結(jié)合的抗體；(d)提供一種或多種能與所述結(jié)合抗體締 合的分子；和(e)檢測該一種或多種分子是否存在，從而檢測是否存在TTV 感染。
在某些實施方式中，可檢測標(biāo)記是熒光素(fluorescer)或酶。在其它實施方式中，所述生物學(xué)樣品是豬血清樣品。
在還有其它實施方式中，本發(fā)明涉及用分離的豬TTV感染TTV-陰性
的幼豬、隔離屏障飼養(yǎng)的無特定病原體的小豬、或剖腹產(chǎn)小豬的方法。該
方法包括(a)分離對象豬的TTV;和(b)給予小豬足以引起TTV感染的劑量 的此TTV分離物。
在其它實施方式中，本發(fā)明涉及評價疫苗預(yù)防TTV感染的能力的方法， 該方法包括(a)給予對象豬一種候選疫苗；(b)使步驟(a)的對象豬接觸劑量足 以引起未接種疫苗豬感染的豬TTV分離物；和(c)觀察該對象豬中TTV的 感染發(fā)生率，從而評價該候選疫苗預(yù)防TTV感染的能力。在某些實施方式 中，所述對象豬是TTV-陰性的幼豬、隔離屏障詞養(yǎng)的無特定病原體小豬、 或剖腹產(chǎn)小豬。
在另一實施方式中，本發(fā)明涉及評價疫苗預(yù)防PCVAD的方法，該方 法包括(a)給予對象豬一種候選疫苗；(b)使步驟(a)的對象豬接觸劑量足以引 起未接種疫苗豬感染的豬TTV分離物；和(c)觀察該對象豬中PCVAD的發(fā) 生率，從而評價該候選疫苗預(yù)防PCVAD的能力。
在某些實施方式中，所述對象豬是TTV-陰性的幼豬、隔離屏障飼養(yǎng)的 無特定病原體小豬、或剖腹產(chǎn)小豬。在其它實施方式中，所述PCVAD是 PMWS、 PCV2禾口/或PDNS。
在另一實施方式中，本發(fā)明涉及鑒定能治療豬TTV感染的化合物的方 法。該方法包括(a)使TTV-陰性的幼豬、隔離屏障飼養(yǎng)的無特定病原體小 豬、或剖腹產(chǎn)小豬接觸足以引起小豬感染劑量的豬TTV分離物；(b)向感染 小豬遞送某化合物或一系列化合物；(c)檢測與未治療的TTV-感染小豬相 比，步驟(b)的小豬是否存在TTV，和/或是否發(fā)生、抑制或改善了PCVAD 癥狀。
本文所涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員不難理解本發(fā)明的這些和其它實施方式。 發(fā)明詳述
除非另有說明，可采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)、重 組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)實施本發(fā)明，這些技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。文獻(xiàn)中有這些技術(shù)的全面解釋。參見例如Sambrook，F(xiàn)ritsch 和Maniatis的"分f實毅室手iT最新版；"基鄉(xiāng)諒毒學(xué)(Fw^ame"M/ K>o/ogy/，最新版第I和II巻(B.N.Fields和D.M.Knipe編)；"DA^4克廣"第 I和II巻(D.N. Glover編，最新版)；"寡核苷酸合成"(M丄Gait編,1984); "孩糜染文"(B.D.Hames & S丄Higgins編，1984);動笏^應(yīng)潛^ (R.K.Freshney編，1986); " y^定游^^應(yīng)^7Jff7mmoW"zed ￡"z_yme""
IRL出版社,1986); Perbal，B.的"分f克廣實嫂^廢^尸rac"ca/ G^We M mo/ecw/ar C/o"/"g」"(1984)系列叢書；"艨學(xué)方法"(S.Colowick and N.Kaplan編，學(xué)術(shù)出版公司；和"實驗i資學(xué)手iT第I-IV巻(D.M.Weir C.C.Blackwell編"1986，布萊威爾科學(xué)出版社(Blaekwell Scientific Publications))。
本文引用的所有出版物、專利、專利申請的內(nèi)容作為參考納入本文。 l.定義
在本文的描述中采用的以下術(shù)語具有如下定義。
必須注意，在本說明書和附件權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式"一種" 和"該種"包括其復(fù)數(shù)形式，除非其內(nèi)容另有清楚說明。因此，例如"一 種TTV免疫原"包括二個或多個這種免疫原的混合物等等。
"TTV感染"指由托克特諾病毒直接或間接引起的疾病，包括但不限 于任何已知的TTV病毒株和任何TTV基因型分離物所引起的感染。近年 來已將此病毒細(xì)分為大約40個基因型，屬于5個明顯不同的種系發(fā)生簇中 的群，稱為l-5群(Biagini等，"艾內(nèi)羅病毒(Anellovirus)"，刊登在Fauquet 主編的"嫁毒分類學(xué)，第S眉瘋毒分類學(xué)像y^會議叛告"335-341頁， Elsevier/Academic出版社，紐約(2004); Devalle和Niel.， J.M^/. J^o/. (2004) 21: 166-173; Hino，S.， i ev.Me《^>o/.(2002) U:151-158; Nishizawa等， 5/oc/zem.5/o/ /y^./ e&Comwim.(1997) 241:92-97 ; Okamoto 禾口 Mayumi.， G。^"oe"^n9/.(2001巡:519-529; Peng等，Ac/;, 02) 147:21-41)。具體 的豬分離物包括但不限于Sd-TTV31、 Sd-TTVlp、 Sd-TV2p、 TTV分離物 3h和2h(例如，參見Niel等，乂Ge". J^>o/.(2005) M:1343-1347; Okamoto等,/Ge".^>o/. (2002)^1:1291-1297)。這類疾病包括但不限于豬環(huán)病毒相關(guān) 疾病(PCVAD)，如豬環(huán)病毒2型(PCV-2)，成長和育肥豬的斷奶后多系統(tǒng)衰 竭綜合征(PMWS)、腸炎和呼吸道疾病，生殖疾病，以及豬皮炎和腎病綜合 征(PDNS)。
該術(shù)語也指亞臨床(sub-clinical)疾病，如存在TTV感染，但本身不表 現(xiàn)出疾病的臨床癥狀。亞臨床疾病的對象可以無癥狀，但處在發(fā)生以上任 何疾病的危險中。
"幼豬"指出生至6周齡，優(yōu)選出生至3周齡的小豬。
術(shù)語"多肽"用于指TTV免疫原時，指由任何TTV病毒株衍生的天 然、重組或合成的免疫原。所述多肽不需要包含參考分子的全長氨基酸序 列，但如以下所述，可只包含保留了該多肽分子的免疫原性和/或治療、預(yù) 防或診斷TTV感染能力所必須的序列。因此只存在參考分子的一個或幾個 表位。另外，該多肽可包含全長參考分子或參考分子某片段與不會破壞該 TTV多肽反應(yīng)活性的另一種蛋白之間的融合蛋白。不難明白，該多肽可包 含全長的序列、片段、截短的和部分序列，以及所述參考分子的同類物和 前體形式。該術(shù)語也包括所述參考分子中的缺失、添加和取代，只要該多 肽保留了免疫原性。
因此，本文可以采用所述天然序列的全長蛋白和其片段，以及含修飾 的蛋白，如缺失、添加和取代(保守或非保守性質(zhì))，只要所述蛋白維持了所 需活性。這些修飾可以是仔細(xì)考慮過的，如通過定點誘變；或可以是偶然 的，如通過宿主的突變產(chǎn)生的蛋白，或由于PCR擴(kuò)增錯誤產(chǎn)生的蛋白。因 此，本文考慮采用基本上與親代序列同源的這種活性蛋白，如具有70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%、 99%等相同性的保留了生物學(xué)活性的蛋白。
術(shù)語"同類物"指保留了以上所述參考分子的生物學(xué)活性的衍生物， 或這類衍生物的片段。術(shù)語"同類物"通常指具有天然多肽序列和結(jié)構(gòu)但 相對于天然分子含有一個或多個氨基酸添加、取代和/或缺失的化合物。特 別優(yōu)選的同類物包含性質(zhì)保守的取代，即發(fā)生在同家族氨基酸中相對于其 側(cè)鏈的那些取代。具體說，氨基酸通常分成4個家族(l)酸性一天冬氨酸 和谷氨酸；(2)堿性一賴氨酸、精氨酸和組氨酸；(3)非極性一丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)無
電荷極性一甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、 酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時分類為芳族氨基酸。例如，可合 理地預(yù)計，分別用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸，用谷氨酰胺取代天冬酰 胺，用絲氨酸取代蘇氨酸，或用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸類似地保守性取代某氨 基酸對其生物學(xué)活性不會有顯著影響。例如，所述感興趣多肽可包含最高
約5-10個保守性或非保守性氨基酸取代，或甚至最高達(dá)約15-25或50個保 守或非保守性氨基酸取代，或5-50個之間的任何數(shù)目的取代，只要保留了 該分子的所需功能。
"純化的"蛋白或多肽是重組或合成產(chǎn)生的，或分離自天然宿主的蛋 白，因此，組合物中存在的蛋白質(zhì)的量顯著高于粗制品中存在的量。通常 純化的蛋白至少約50%均質(zhì)，更優(yōu)選至少約80%-90%均質(zhì)。
"生物學(xué)活性"指TTV蛋白能誘以下所述的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
"亞單位疫苗組合物"指含TTV衍生的免疫原或與其同源的至少一種 免疫原，但不是所有免疫原的組合物。這種組合物基本上不含完整的病毒。 因此，可用至少部分純化的(優(yōu)選基本純化的)TTV免疫原，或其重組同類 物來制備"亞單位疫苗組合物"。亞單位疫苗組合物可包含基本上沒有其 它病原體的抗原或多肽的感興趣亞單位抗原。代表性的免疫原包括TTV基 因組任意0RF1、 2或3產(chǎn)生的免疫原，如0RF2產(chǎn)生的免疫原，即核衣殼 蛋白，包括其全長蛋白或片段。而且，此亞單位組合物中也可存在多種基 因型TTV病毒或病毒分離物產(chǎn)生的免疫原，例如豬基因型1和2的ORF2 表達(dá)的蛋白(Neil等,《/r/ro/.(2005)M:1343-1347)以及TTV或其它病毒的 其它免疫原。還考慮可采用基于TTV多種基因型，例如但不限于TTV基 因型1和2的任意ORF的共有序列。
"表位"指抗原中能引起特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞應(yīng)答的位點。此術(shù)語 也可與"抗原決定簇"或"抗原決定位點"互換使用。 一個表位可以包含 該表位空間構(gòu)象所獨有的3個或多個氨基酸。通常一個表位包含至少5個 氨基酸，更常包含至少8-10個氨基酸。測定氨基酸空間構(gòu)象的方法是該領(lǐng) 域已知的，包括例如，X-光晶體學(xué)和2-維核磁共振。另外，采用該領(lǐng)域熟知的技術(shù)，例如采用疏水性研究和定點血清學(xué)不難鑒定給定蛋白質(zhì)中的表
位。也參見Geysen等，尸rocA^/Jcad.Sc/.t7&4(1984)81:3998-4002(快速合成
肽來測定給定抗原中免疫原性表位的位置的一般方法)；美國專利 No.4,708,871(鑒定和化學(xué)合成抗原表位的方法)；和Geysen等，Mo/ecw/ar /mmmo/ogy(1986)23:709-715(鑒定對給定抗體具有高親和力的肽的技術(shù))。 可在單一種免疫試驗中鑒定能識別相同表位的抗體，顯示一種抗體能否阻
斷另一種抗體結(jié)合靶抗原。
對某組合物或疫苗的"免疫應(yīng)答"是宿主產(chǎn)生了對感興趣的該組合物 或疫苗的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常"免疫應(yīng)答反應(yīng)"包括但不 限于以下一種或多種作用產(chǎn)生對感興趣的該組合物或疫苗所包含抗原的 特異性抗體、B細(xì)胞、T輔助細(xì)胞、T抑制細(xì)胞和/或細(xì)胞毒T細(xì)胞，和/或 TyS細(xì)胞。優(yōu)選該宿主將顯示對所述TTV免疫原產(chǎn)生保護(hù)性的免疫應(yīng)答反 應(yīng)，例如該宿主受到保護(hù)避免了隨后該病原體的感染，證明這種保護(hù)表現(xiàn) 為受感染的宿主通常癥狀減輕或缺乏，或康復(fù)時間更快。
術(shù)語"免疫原性"蛋白或多肽指能誘導(dǎo)上述免疫應(yīng)答的氨基酸序列。 如本文所用，"免疫原性"蛋白或多肽包括所述具體TTV免疫原的全長序 列，包括任意前體和成熟形式、其同類物，或其免疫原性片段。"免疫原 性片段"指所述TTV免疫原的片段，其包含有一個或多個表位，因此能誘 導(dǎo)上述免疫應(yīng)答反應(yīng)。
用于本發(fā)明目的的免疫原性片段通常至少長約2個氨基酸，更優(yōu)選至 少長約5個氨基酸，最優(yōu)選至少長約10-15個氨基酸。此片段的長度沒有 嚴(yán)格的上限，可包含接近該蛋白全長的序列，或是包含所述TTV免疫原的 2個或多個表位的融合蛋白。
"同源性"指二條聚核苷酸或二條多肽之間的相同性百分比。當(dāng)二條 DNA或二條多肽的序列顯示在限定分子長度上至少約50%,優(yōu)選至少約 75%，更優(yōu)選至少約80%-85%，還要優(yōu)選至少約90%，最優(yōu)選至少約 95%-98%序列相同時，這兩個序列"基本上同源"。如本文所用，基本上 同源也指序列顯示與特定的DNA或多肽序列完全相同。
通常"相同性"指二條聚核苷酸或二條多肽序列相應(yīng)的核苷酸與核苷酸，或氨基酸與氨基酸分別精確相同。可通過將二種分子的序列分成長度 較短的序列，進(jìn)行排列對比直接比較，精確計算二條序列相匹配的數(shù)目， 結(jié)果乘以100，來測定相同性百分比?？衫媚壳翱傻玫降挠嬎銠C程序來幫
助分析，例如ALIGN, M.O.Dayhoff主編的"蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的圖冊G4"w
iSVrw由W， ， Dayhoff，M.O，增補本5期，2: 353-358， 國立生物醫(yī)學(xué)研究基金會(National biomedical Reseach Foundation),華盛頓 DC，對于肽分析，其采納了 Smith和Waterman的局部同源性算法，^/v朋ce /"^/7/.MflAj:482-489,1981。測定核苷酸序列相同性的程序可獲自威斯康 新序列分析軟件包第8版(獲自美國威斯康星州麥迪遜的遺傳學(xué)計算機小組 (Genetics Computer Group ， Madison,WI)，例如BESTFIT、 FASTA和GAP 程序，它們也依賴于Smith和Waterman的算法。采用廠商推薦的默認(rèn)參數(shù)， 按照上述威斯康新序列分析軟件包的說明不難使用這些程序。例如，可采 用Smith和Waterman同源性算法中6個核酸苷位置的默認(rèn)評分表和空格罰 分，測定某具體核苷酸與參比序列的相同性百分比。
本發(fā)明說明書中測定相同性百分比的另一種方法是采用愛丁伯格大學(xué) 版權(quán)所有，由John F.Collins和ShaneS.Sturrok開發(fā)的，加利福尼亞州芒廷 維尤的IC公司(IntelliGenetics， Mountain View, CA))分發(fā)銷售的MPSRCH 程序包。這套軟件包中采用Smith-Waterman算法，可采用評分表中的默認(rèn) 參數(shù)(如開放空格罰12分，延伸空格罰l分， 一個空格罰6分)。從數(shù)據(jù)產(chǎn) 生的"匹配"值反映了 "序列相同性"。計算序列之間相同性或相似性的 其它合適的程序一般是該領(lǐng)域知道的，例如，另一種采用默認(rèn)參數(shù)的排列 對比程序是BLAST。例如，可用的BLASTN和BLASTP采用以下默認(rèn)參 數(shù)遺傳密碼=標(biāo)準(zhǔn)；過濾=無；鏈=二條；截斷值=60;期望值=10;矩陣 =BLOSUM62;描述=50條序列；檢索-HIGH SCORE;數(shù)據(jù)庫=非豐余， GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 翻譯十Swiss 蛋白 +Spupdate+PIR。這些程序的細(xì)節(jié)是該領(lǐng)域熟知的。
或者，可在二條聚核苷酸同源區(qū)之間能形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下使它 們雜交，然后用單鏈特異性核酸酶消化，測定消化片段的大小，來測定同 源性。例如在特定系統(tǒng)規(guī)定的嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行Southern雜交實驗來鑒定DNA序列是否基本上同源。確定合適的雜交條件在該領(lǐng)域技術(shù)人員的能力 范圍內(nèi)。參見例如Sambrook等，同上；"DM4克潑"，同上； 文"，同上。
"編碼序列"或"編碼"所選多肽的序列是一種核酸分子，當(dāng)將其安 置在合適控制序列的控制下，在體外或體內(nèi)能轉(zhuǎn)錄(對于DNA)和翻譯(對于 mRNA)成為多肽。編碼序列的二邊界由其5'(氨基)末端的起始密碼子和 3'(羧基)末端的翻譯終止密碼子所確定。轉(zhuǎn)錄終止序列可位于編碼序列的3' 端°
"載體"指遺傳元件，如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、病 毒、病毒顆粒等等，當(dāng)將它們與適當(dāng)?shù)目刂圃噙B時能夠復(fù)制并能將基 因序列轉(zhuǎn)移給細(xì)胞。因此，該術(shù)語包括克隆載體和表達(dá)載體，以及病毒載 體。
"重組載體"指包含了能在體外或體內(nèi)表達(dá)的異源核酸序列的載體。 術(shù)語"轉(zhuǎn)染"用于指細(xì)胞攝入外源DNA，當(dāng)外源DNA被引入細(xì)胞膜 內(nèi)側(cè)時細(xì)胞即被"轉(zhuǎn)染"。該領(lǐng)域知道有許多轉(zhuǎn)染技術(shù)，參見例如Graham 等,(1973)J^o/ogy, H:456; Sambrook等,(1989)"分f克廣，實殺室手，"， 冷泉港實驗室(Cold Spring Harbour Laboratories),紐約；Davis等.(1986)"分 f生激學(xué)游基本方法"，Elsevier;和Chu等(1981)Ge"eJl:197?？衫眠@ 些技術(shù)將一種或多種外源DNA分子引入到合適的宿主細(xì)胞中。
術(shù)語"異源性"指正常時不是連接在一起和/或正常時與特定細(xì)胞無關(guān) 的核酸序列，如編碼序列和控制序列。因此，某核酸結(jié)構(gòu)或載體中的"異 源區(qū)"是天然與另一種分子無關(guān)的其他核酸分子內(nèi)或與其相連的核酸區(qū)段。 例如，核酸結(jié)構(gòu)中的異源區(qū)可包括編碼序列側(cè)接了天然狀況下與該編碼不 相連接的序列。異源編碼序列的另一個例子是在天然狀況下本身不存在的 編碼序列(如含有不同于天然基因的密碼子的合成序列)。類似地，用細(xì)胞在 正常狀況下不存在的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化細(xì)胞應(yīng)認(rèn)為是符合本發(fā)明目的的異源結(jié)構(gòu)。 等位基因變體或天然發(fā)生的突變不能算是這里所說的異源DNA。
"核酸"序列指DNA或RNA序列。此術(shù)語的序列包括已知的DNA 和RNA堿基同類物的任何序列，例如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥基-甲基)尿嘧啶、5-
氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲 基尿嘧啶、二羥尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基 假-尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、l-甲基肌苷、2,2-二甲基-鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、 2-甲基鳥嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥 嘌呤、5-甲基氨基甲基尿啼啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、(3-D-甘露 糖基Q核苷(queosine)、 5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲 基硫-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、氧 基丁氧核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫 尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、 尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。
集合名詞術(shù)語DNA的"控制序列"指啟動子序列、聚腺苷酸信號、轉(zhuǎn) 錄終止序列、上游調(diào)節(jié)區(qū)、復(fù)制起點、核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點("IRES")、 增強子等等，它們共同實現(xiàn)了編碼序列在受體細(xì)胞中的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。 并非需要總是存在所有這些控制序列，只要所選擇的編碼序列在適當(dāng)?shù)乃?主細(xì)胞中能被復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯即可。
術(shù)語"啟動子"本文采用其普通含義，指包含DNA調(diào)節(jié)序列的核苷酸 區(qū)域，此調(diào)節(jié)序列源自能夠結(jié)合RNA聚合酶和啟動下游(3'-方向)編碼序列 的轉(zhuǎn)錄的基因。轉(zhuǎn)錄啟動子可包括"可誘導(dǎo)啟動子"(可用分析物、協(xié)同因 子、調(diào)節(jié)蛋白等誘導(dǎo)與該啟動子操作性相連的聚核苷酸序列表達(dá))、"阻抑 型啟動子"(可用分析物、協(xié)同因子、調(diào)節(jié)蛋白等誘導(dǎo)與該啟動子操作性相 連的聚核苷酸序列表達(dá))和"組成性啟動子"。
"操作性相連"指各元件的安排使得所述各組分能執(zhí)行它們通常的功 能。因此，與某編碼序列操作性相連的控制序列能夠影響該編碼序列的表 達(dá)?？刂菩蛄胁恍枰c編碼序列毗連，只要它們能發(fā)揮功能指導(dǎo)其表達(dá)。 例如，在啟動子序列與編碼序列之間可存在插入的不翻譯、不轉(zhuǎn)錄序列， 該啟動子序列仍認(rèn)為是"操作性相連于"該編碼序列。
在本申請書中為了便于描述特定核酸分子中核苷酸序列的相對位置，
例如當(dāng)所描述的特定核酸苷位于另一序列的"上游"、"下游"、"3引物(3')"或"5引物(5')"時，應(yīng)理解為此序列的位置是DNA分子的"有義" 鏈或"編碼"鏈，參見該領(lǐng)域常規(guī)。
本文提供的術(shù)語，某組合物或藥物的"有效量"或"治療有效量"指 該組合物或藥物能提供所需"治療效果"，如誘導(dǎo)上述的免疫應(yīng)答，優(yōu)選 預(yù)防、減輕或逆轉(zhuǎn)TTV感染相關(guān)癥狀的無毒但足夠的量。這種效果可以是 改變疾病向所需的結(jié)果或終點發(fā)展，從而使對象的疾病顯示出改善，這常 常表現(xiàn)為疾病的相關(guān)體癥或癥狀減輕。例如， 一種有代表性的治療效果可 以是當(dāng)對取自豬的樣品作TTV培養(yǎng)時，對象豬的TTV感染為陰性。類似 地，組織活檢表明有治療效果是抗TTV的IgG、 IgM和IgA抗體產(chǎn)生降低。 類似地，血清抗TTV抗體降低表明有治療效果。PCVAD-相關(guān)疾病的癥狀 減輕也表明有治療效果。所需的精確劑量對象之間互不相同，取決于對象 動物的種類、年齡和全身狀況，要治療疾病的嚴(yán)重程度和給予的組合物的 具體成分，給藥方式等等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員采用常規(guī)實驗可確定個體 病例的合適"有效量"。
"治療"或"處理"TTV感染包括(l)預(yù)防TTV疾病，或預(yù)防包含 其它病原體如PCV2的TTV-相關(guān)疾病，或(2)使接觸TTV的對象豬的TTV 感染相關(guān)疾病發(fā)生率降低，(3)減少對象豬中存在的TTV含量，和/或改善 TTV感染相關(guān)的癥狀。
"生物學(xué)樣品"本文用于指分離自個體的組織或體液的樣品，包括但 不限于例如，血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髓、膽汁、精液、淋巴液、 皮膚樣品、皮膚外分泌物、呼吸道、腸道和泌尿生殖道樣品、眼淚、唾液、 乳汁、血細(xì)胞、器官、活檢樣品，以及體外細(xì)胞培養(yǎng)樣品，包括但不限于 用培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞(例如重組細(xì)胞)和組織生長產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液，和細(xì)胞 成分。
"標(biāo)記"和"可檢測標(biāo)記"本文用于指能被檢測的分子，包括但不限 于放射性同位素、熒光素、化學(xué)發(fā)光素、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑 制劑、生色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬溶膠、配體(如生物素或半抗原)等等。 術(shù)語"熒光素"指能顯示可檢測范圍熒光的物質(zhì)或其一部分?？捎糜诒景l(fā) 明的標(biāo)記物的具體例子包括熒光黃、羅丹明、丹磺酰、傘形酮、德克薩斯紅、魯米諾、阿克迪酯(acradimum ester)、 NADPH和a-(3-半乳糖苷酶。 2.實施本發(fā)明的方式
在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于具體的制劑或工藝參數(shù)， 它們當(dāng)然可以改變。也應(yīng)理解本文所用術(shù)語目的只是為了描述本發(fā)明的具 體實施方式，不意味著限制本發(fā)明。
雖然實施本發(fā)明可采用類似于或相等于本文所述的一些方法和材料， 但本文描述的是優(yōu)選的材料和方法。
本發(fā)明的中心內(nèi)容是利用TTV和其產(chǎn)生的免疫原來開發(fā)用于疫苗和診 斷試劑的免疫原性組合物，以預(yù)防、治療和診斷TTV感染。如以上所解釋， TTV與PCVAD-相關(guān)疾病有關(guān)。因此。本發(fā)明提供預(yù)防、治療和診斷這類 疾病，如PMWS和PDNS的組合物和方法。
可開發(fā)用于研究豬TTV感染的致病機理、治療和預(yù)防TTV感染的新 的動物模型。例如，TTV-陰性的幼豬、隔離屏障飼養(yǎng)的無特定病原體小豬、 或剖腹產(chǎn)小豬可用于研究各種TTV乙醚預(yù)防TTV感染的能力。此外，TTV-陰性的幼豬、隔離屏障飼養(yǎng)的無特定病原體小豬、或剖腹產(chǎn)小豬也可用于 篩選能夠治療TTV感染的各種化合物。
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面將關(guān)于動物模型、TTV免疫原及其各種 應(yīng)用進(jìn)行更詳細(xì)的討論。
TTV動物模型
豬是單胃雜食動物，胃部解剖學(xué)與生理學(xué)與人體非常接近。TTV-陰性 的幼豬、隔離屏障飼養(yǎng)的無特定病原體小豬、或剖腹產(chǎn)小豬適合研究TTV 感染，因而適合鑒定疫苗候選物，例如包含一種或多種源自TTV的免疫原 的疫苗，可用于預(yù)防豬的TTV感染。隔離屏障詞養(yǎng)的豬沒有影響個體牲畜 群的特定病原體。已經(jīng)證明剖腹產(chǎn)小豬和隔離屏障飼養(yǎng)的小豬PCV和 PLHV的流行率非常低。參見例如Tucker等，Ze"Wra"s/ /a" a"o" (2003) 10:343-348。
因此，本發(fā)明優(yōu)選利用動物模型來開發(fā)用于預(yù)防和/或治療TTV感染的豬和其相關(guān)疾病的疫苗。
在此內(nèi)容中，給予TTV-陰性的幼豬、隔離屏障飼養(yǎng)的無特定病原體小 豬、或剖腹產(chǎn)小豬候選疫苗至少一次，優(yōu)選再給予至少一次加強免疫。例
如，給予1-5日齡小豬待測試的疫苗組合物，然后于5-10天后給予加強， 任選第二次給予疫苗后5-10天進(jìn)行第三次免疫。如需要可給小豬多次接種 疫苗。大約3-20天后，如最后一次免疫后4-10天，使接種疫苗的小豬接觸 TTV。通常經(jīng)胃腸道外或口服接種給予小豬10M()Spfu的TTV疫苗，更優(yōu) 選105-107 pfu的TTV，并監(jiān)測TTV感染指標(biāo)。
這類指標(biāo)包括TTV病毒滴度及PCVAD疾病癥狀，如PMWS癥狀、呼 吸道和腸道問題、消瘦、淋巴樣病損、肉芽腫炎癥、存在PCV2抗原和組 織病理學(xué)變化，及原位雜交檢測PCV2。參見例如，Segales等，Sw/"e/^a欣 尸rod.(2002)邊:277-281禾卩Rosell等，JCom; .尸W/w/.(1999)里:59-78。類似 地，可監(jiān)測PDNS的癥狀。最明顯的癥狀是豬皮膚常常出現(xiàn)輕度隆起的紅-紫色疙瘩。這種疙瘩位于后腿、腰部、陰囊和耳部，但可延伸至腹部、腹 側(cè)和前腿，最終覆蓋全身。幾天后病損結(jié)痂呈棕色。豬也出現(xiàn)昏睡和體溫 升高。急性病例時豬腿腫脹導(dǎo)致跛行。也觀察到呼吸窘迫和/或家畜腹瀉。
或者，可先用TTV感染TTV-陰性的幼豬、隔離屏障飼養(yǎng)的無特定病 原體小豬、或剖腹產(chǎn)小豬以建立TTV感染。例如，給l-5日齡小豬經(jīng)胃腸 道外接種TTV，其用量應(yīng)足以引起感染，例如采用104-101()或更高pfu的 TTV，更具體用104-10"pfu的TTV接種。采用本領(lǐng)域熟知的PCR技術(shù)， 檢査生物學(xué)樣品如血清樣品中有無病毒，和/或有無上述感染癥狀以證實 TTV感染的存在。
一旦確定有病毒感染，可在不同時間給予受感染小豬不同劑量的一種 化合物或一系列化合物，取決于篩選的具體目標(biāo)。在這種方法的變化形式 中，可能需要給予TTV與化合物來確定與對照動物相比，該化合物是否能 在體內(nèi)有效預(yù)防TTV病毒的初次感染/或預(yù)防隨后的感染或病理過程。
因此，可以利用受感染小豬來篩選能預(yù)防TTV感染的化合物和條件， 如能阻斷TTV進(jìn)入宿主細(xì)胞和/或能減輕PCVAD-相關(guān)疾病所見到的TTV-相關(guān)變化的化合物和條件。通過在選擇的時間檢査受感染動物的生物學(xué)樣
20品是否存在TTV和/或是否發(fā)生、抑制或改善了 PCVAD相關(guān)疾病(與相應(yīng) 的對照動物，例如未治療的TTV-感染動物作比較)來評估化合物的效果。 本文描述的動物模型能夠根據(jù)不同的給藥方式和化合物制劑，容易地評估 各種藥物或化合物的效果。
除了利用TTV-感染動物來篩選治療化合物外，也可利用這些動物來篩 選其作用是阻斷或改善TTV感染和/或相關(guān)疾病的條件或刺激。這種刺激或 條件包括環(huán)境或飲食的變化，或?qū)е聞游飸?yīng)激狀態(tài)的各種刺激或條件的聯(lián) 合作用。例如，可使TTV-感染動物接觸所選擇的刺激或條件，或待測試的 刺激或條件的聯(lián)合作用。然后定期檢查接觸動物的生物學(xué)樣品中TTV數(shù)目 的變化和/或?qū)⑾嚓P(guān)疾病狀態(tài)與未接觸病毒的對照動物作比較。
TTV組合物
可利用本文所述的動物模型來鑒定TTV免疫原性組合物，用于診斷、 治療和/或預(yù)防豬TTV感染。如以上所解釋，用作疫苗和診斷的TTV組合 物可包含減毒或滅活的病毒?；蛘?，也可提供包含分離的TTV免疫原，如 源自任何ORF的免疫原，特別是病毒ORF2編碼的核衣殼蛋白的亞單位組 合物。也可用0RF1和ORF3產(chǎn)生的免疫原。也可利用包含源自多種基因 型，如豬基因型l和2的共有序列的蛋白質(zhì)。
TTV組合物可源自任何TTV毒株和任何TTV基因型的分離物。已知 有許多TTV，其描述可參見Biagini等，"艾內(nèi)羅病毒(Anellovirus)"，刊登 在Fauquet主編的"癆毒分類學(xué)，第S廟瘋毒分類學(xué)房y^會議叛告"，第 335-341頁，Elsevier/Academic出版社，紐約(2004); Devalle禾P Niel.， 丄Met/.KVo/. (2004)22: 166-173; Hino， S.,7 ev.MedK>o/.(2002) ]1:151-158; Nishizawa等，B/oc/^m.^/op/my./gM. Commww.( 1997)241:92-97; Okamoto和 Mayumi., GaWroeWero/. (2001) 1^:519-529;禾口 Peng等，Jn^.KVo/. (2002) 147:21-41。
具體的豬分離物包括但不限于Sd-TTV31、 Sd-TTVlp、 Sd-TTV2p、 TTV分離物3h和2h(參見例如，Niel等，^>o/.(2005)M: 1343-1347; Okamoto., Wro/.(2002)^1:1291-1297)。這些分離物的基因組序列，包
括分別編碼DNA復(fù)制酶、核衣殼蛋白和凋亡序列的ORFl、 ORF2和ORF3序列例如在Niel等，^yo/.(2005)M: 1343-1347; Okamoto., /Ge". ^>o/, (2002) M:1291-1297以及在NCBI登錄號AB076001 、 AY823991 、AY823990、 AY823989和AY823988中有所描述。登錄號DQ229865和DQ229860分別 提供了豬基因型1 TTV和豬基因型2 TTV的序列。
可用各種技術(shù)來產(chǎn)生TTV免疫原，包括TTV全病毒。例如，可用該 領(lǐng)域熟知的技術(shù)直接從TTV-感染對象(如豬)分離得到TTV而獲得此免疫 原。通常用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)來獲得TTV DNA，包括T^qManTM 方法，采用源自TTV基因組序列的引物，其描述可參見Desai等， JMW.J^o/.(2005)22:136-143; Haramoto等，i e&(2005) !￡:2008-2013; Kekarainen等，JGe". P7ro/.(2006)^2:833陽837;和Martelli等，,F".MeA (2006) 11:234-238。
如此得到的TTV可在各種細(xì)胞系中復(fù)制，如肝細(xì)胞和白細(xì)胞系，包括 張氏肝細(xì)胞系、植物凝集素(PHA)-激活的外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)物和 B淋巴母細(xì)胞系如Raji、 L23、 L35、 LCL13271細(xì)胞系。參見例如Desai.， JU.PW.(2005)22:136-143; Bonenfant等，X譜&謹(jǐn)盧齒細(xì)(2003) 辺:107-119;禾P Sinkora等，ye"mmw"o/./wmw"o; ^/z.(2001)^:79-91。各出版 物中描述了以上類型細(xì)胞的培養(yǎng)條件。適合所需應(yīng)用的細(xì)胞培養(yǎng)條件(溫 度、細(xì)胞密度、pH值等)變化范圍很廣，取決于所用的細(xì)胞系，不難適配成 符合所述TTV病毒要求的培養(yǎng)條件。在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖TTV的方法包括 以下步驟用TTV接種培養(yǎng)的細(xì)胞，培養(yǎng)受感染的細(xì)胞到病毒增殖所需的 時間，例如通過病毒滴度測定或病毒抗原表達(dá)(如接種后24—168小時之間) 測定的時間，和收集增殖的病毒。用所需病毒接種培養(yǎng)的細(xì)胞，病毒與細(xì) 胞的比例(用PFU或TCID50測定)為1:500-1:1，優(yōu)選1:100-1:5，更優(yōu)選 1:50-1:10。將病毒加到細(xì)胞懸液中或加到單層細(xì)胞上，病毒吸附于細(xì)胞至 少60分鐘但通常少于300分鐘，優(yōu)選25。C-40。C時90-240分鐘，優(yōu)選28 °C-37°C。通過凍融或酶作用除去感染的細(xì)胞培養(yǎng)物(如單層細(xì)胞)以提高收 獲的培養(yǎng)上清液中的病毒成分。然后滅活或凍存收獲的液體。
滅活或殺死病毒的方法是本領(lǐng)域已知的。這種方法破壞了病毒感染哺 乳動物細(xì)胞的能力。可用化學(xué)或物理方法滅活。滅活TTV的化學(xué)方法包括用有效量的以下一種或多種試劑處理病毒洗滌劑、甲醛、福爾馬林、(3-丙內(nèi)酯或UV光。本領(lǐng)域知道滅活病毒的其它方法，如二元乙胺、乙酰乙
烯亞胺處理或Y射線照射。
例如，可用濃度0.01%-0.5%，優(yōu)選0.5%-0.2%，還要優(yōu)選0.025%-0.1% 的(3-丙內(nèi)酯?？稍谑斋@之前或之后將滅活制劑加到含病毒的培養(yǎng)物(病毒材 料)中?？芍苯邮褂门囵B(yǎng)物或破壞細(xì)胞以釋放與細(xì)胞結(jié)合的病毒然后進(jìn)行收 集。另外，可在培養(yǎng)物凍存和融化后，或在一步或多步純化去除污染細(xì)胞 后加入滅活劑。在病毒材料中加入P-丙內(nèi)酯，用氫氧化鈉(如1NNaOH)或 碳酸氫鈉溶液控制pH偏酸的不良漂移。在4°C-37°C的溫度下培育合并的滅 活劑-病毒材料，培育時間宜為24-72小時。
或者，可用二元乙烯亞胺(BEI)滅活病毒， 一種代表性的滅活TTV的方 法如下。將等體積的0.2摩爾溴化乙胺氫溴酸鹽溶液與0.4摩爾氫氧化鈉溶 液混合以制備BEI。此混合液在約37。C培育60分鐘。將產(chǎn)生的環(huán)化滅活劑 BEI，以0.5%-4%，優(yōu)選1-3%(體積比)加入到病毒材料中。滅活的病毒材料 在4'C-37"C保持24-72小時并定時攪拌。培育結(jié)束時，加入20ml除菌的1 摩爾硫代硫酸鈉液以確保BEI的中和。將滅活的病毒材料經(jīng)稀釋和未經(jīng)稀 釋的樣品加入到易感細(xì)胞(組織)培養(yǎng)物中以檢測有無未被滅活的病毒。多次 傳代培養(yǎng)細(xì)胞，用各種方法檢査是否存在TTV，這些方法包括細(xì)胞病變效 應(yīng)(CPE)和抗原檢測。這種試驗?zāi)軠y定病毒滅活是否完全。
本領(lǐng)域知道純化滅活病毒的方法，包括梯度離心、超速離心、連續(xù)流 超離心和層析，如離子交換層析、分子大小排斥層析、液相親和層析中的 一種或多種。適用于本發(fā)明的純化方法的其它例子包括聚乙二醇劃硫酸 銨沉淀，以及超濾和微濾。
本發(fā)明的純化病毒制品基本上沒有源自細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物的污染蛋白 質(zhì)，優(yōu)選每微克病毒抗原所含細(xì)胞核酸不到50pg。還要優(yōu)選此純化的病毒 制品包含不到約20pg，甚至更優(yōu)選不到約10pg的細(xì)胞核酸。本領(lǐng)域知道檢 測病毒樣品中宿主細(xì)胞核酸的方法。優(yōu)選管理當(dāng)局如WHO或FDA批準(zhǔn)的 或推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法。
本發(fā)明也包括含減毒TTV的組合物。如本文所用，減毒指TTV在對象豬中的毒力降低。使病毒減毒的方法是本領(lǐng)域已知的。這種方法包括在 上述培養(yǎng)細(xì)胞中系列傳代病毒直到該病毒顯示功能減退。培養(yǎng)病毒的溫度 可以是導(dǎo)致組織傳代培養(yǎng)物減毒的任何溫度。本領(lǐng)域技術(shù)人員能檢測經(jīng)細(xì) 胞培養(yǎng)物一次或多次傳代后病毒的功能是否減退。在上述動物模型中病毒 復(fù)制水平降低或毒力降低，表明其功能已減退。
產(chǎn)生減毒TTV的一種具體方法包括在亞適溫度或"冷"溫度下在細(xì)胞
培養(yǎng)物中傳代病毒，和/或通過隨機誘變(如利用5-氟尿嘧啶的化學(xué)誘變)或 定點誘變將減毒突變引入TTV基因組中。冷適應(yīng)通常包括在約20°C-32°C 之間，優(yōu)選在約22。C-30。C之間，最優(yōu)選在約24。C-28。C之間的溫度下傳代。 冷適應(yīng)或減毒可通過在逐漸降低的溫度下傳代進(jìn)行，以引入額外的限制生 長突變。獲得安全的免疫減毒的病毒所需的傳代次數(shù)至少部分地取決于所 用的條件。利用對TTV培養(yǎng)物在動物中的毒力和免疫能力的定期檢測，不 難確定組織培養(yǎng)與溫度特定組合的參數(shù)。
也可通過突變各個病毒區(qū)域，如0RF1、 0RF2和0EF3中的一個或多 個以降低病毒的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)而使TTV減毒。這種減毒 TTV在病毒基因組的一個或多個區(qū)域中可包含一個或多個添加、缺失或插 入。
一旦減毒，用本領(lǐng)域知道的技術(shù)如上述滅活病毒中所述的方法來純化 病毒。
也可制備亞單位組合物。例如，采用本領(lǐng)域熟知的重組方法，產(chǎn)生源 自病毒基因組任何區(qū)域，如ORFl、 OEF2和/或ORF3區(qū)衍生的一種或多種 免疫原。就這方面而言，可根據(jù)TTV基因組的序列設(shè)計寡核苷酸探針，用 于探測基因組或cDNA文庫中編碼可用作本發(fā)明免疫原的TTV基因。然后 可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)一步分離此種基因，如果需要可用限制性酶在全長序列的 所需部分突變該基因。或者，可用合成法而非克隆法制備編碼感興趣蛋白 質(zhì)的DNA序列。設(shè)計的此DNA序列含有編碼特定氨基酸序列的適當(dāng)密碼 子。 一般而言，如果這種序列將用于表達(dá)，應(yīng)選擇指定宿主的優(yōu)選密碼子。 完整序列由通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡核苷酸裝配得到，并裝配成完整的 編碼序列。參見例如，Edge(1981)淑匿292:756: Nambair等(1984)Sc/e"ce
24221:1299; Jay等(1984>/編.CAem. 259:6311。也可采用已知技術(shù)，如苯酚 抽提從病毒直接分離TTV基因，可進(jìn)一步操縱此序列以產(chǎn)生所需的改變。 參見例如Sambrook(同上)描述的用于獲得和分離DNA的技術(shù)。
一旦制備或分離得到所需蛋白的編碼序列，可將它們克隆到合適的載 體或復(fù)制子中。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道有許多克隆載體，選擇合適的克隆載 體是一項選擇工作。可用于克隆的重組DNA載體和用作轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的 例子包括噬菌體n義^l,熟、pBR322(尤嫁,熟、pACYC177(乂「應(yīng), 勒、pKT230(革！銜絲熟、pGV1106(革^厥絲熟、pLAFRl(革^像絲熟、 pME290(求乂濕^慮應(yīng)革上歷絲熟、pHV 14((尤嫁伴慮，祐享,范^熟、 pBD9(芽溜〃熟、pIJ61(慈霉熟、pUC6(楚霉熟、YIp5(摩母熟、YCpl9(摩 母熟和牛乳頭瘤病毒(喊晃動激一智廁。參見"DNA克隆"第I和II巻，同 上；Sambrook等，同上；B.Perbal,同上。
可將此基因置于啟動子、核糖體結(jié)合位點(對于細(xì)菌表達(dá))和任選的操縱 子(本文總稱為"控制"元件)的控制下，使得在用含此表達(dá)結(jié)構(gòu)的載體轉(zhuǎn)化 的宿主細(xì)胞中將編碼所需蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)錄為RNA。此編碼序列可含 或不含信號肽或引導(dǎo)序列。如果包含信號序列，它們可以是天然的同源序 列或異源序列。引導(dǎo)序列可在翻譯加工后被宿主去除。參見例如美國專利 No.4,431，739; 4,425,437; 4,338,397。
也可能需要其它調(diào)控序列，以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞生長時該蛋白序列的表達(dá)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員知道調(diào)控序列，例子包括在響應(yīng)化學(xué)或物理刺激應(yīng)答時(包 括存在調(diào)節(jié)化合物時)開放或關(guān)閉基因表達(dá)的那些序列。載體中也可存在其 它類型的調(diào)控元件，例如增強子序列。
可在插入載體例如上述克隆載體之前，將控制序列和其它調(diào)控序列連 接于該編碼序列。或者，將此編碼序列直接克隆入已經(jīng)含有控制序列和合 適的限制性位點的表達(dá)載體中。
在某些情況下，可能需要修飾此編碼序列，使之以適當(dāng)朝向(即保持讀
碼框正確)連接于控制序列。也可能需要制造感興趣序列的突變體或類似
物。可通過刪除編碼該蛋白序列的一部分，在其序列中插入一序列，和/或 取代其序列中的一個或多個核苷酸來制造突變體或類似物。修飾核苷酸序列的技術(shù)，如定點誘變的描述可參見例如Sambrook等，同上；"DNA克 隆"第I和II巻，同上；"核酸雜交"，同上。
用上述系統(tǒng)制備的多肽常常需要是融合多肽。如采用非融合蛋白，這 些蛋白可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或由細(xì)胞分泌到生長培養(yǎng)液中。
此外，可構(gòu)建包含編碼例如多種TTV免疫原的嵌合基因序列的質(zhì)粒。 此種基因序列可以是雙順反子基因構(gòu)型。位于不同基因之間的其它調(diào)控元 件可對遠(yuǎn)處編碼區(qū)的RNA進(jìn)行有效翻譯。或者，也可構(gòu)建具有編碼多種抗 原的一個開放讀碼框的嵌合基因轉(zhuǎn)錄單元。制備的融合基因可合成嵌合蛋 白，或者可工程改造蛋白加工信號以提供蛋白酶(如信號肽酶)的切割位點， 使模板RNA翻譯產(chǎn)生的兩種或更多種蛋白釋放。此種加工蛋白酶也可在此 系統(tǒng)中獨立地表達(dá)或作為與抗原和/或細(xì)胞因子編碼區(qū)嵌合體的一部分表 達(dá)。此蛋白酶本身既是加工酶又是疫苗抗原。
然后用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。可在廣泛的各種系統(tǒng)中表達(dá)此 種分子，包括昆蟲、哺乳動物、細(xì)菌、病毒和酵母菌表達(dá)系統(tǒng)，所有系統(tǒng) 為本領(lǐng)域熟知。例如，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如桿狀病毒系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人 員知道的，其描述可參見例如Summers和Smith,得克薩斯農(nóng)業(yè)試驗田第 1555號文件(7"ems爿gn'c咖m/ ￡JcpeWwe"Z S她'ow M>.7555)(1987)。
桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法可從加利福尼亞州圣地亞哥的英 吉公司(Invitrogen, San Diego CA)的商品化試劑盒("MaxBac"試劑盒)中獲 得。類似地，細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)為本領(lǐng)域所熟知，其描述可參 見例如Sambrook等，同上。酵母菌表達(dá)系統(tǒng)也為本領(lǐng)域所熟知，其描述可 見例如"酵母菌基因工程"(Barr等，主編，1989)倫敦巴特沃思(Butterworths, London)。
也知道可用于上述系統(tǒng)的一些合適的宿主細(xì)胞。例如，本領(lǐng)域知道的 哺乳動物細(xì)胞系包括從美國典型培養(yǎng)物收藏所(ATCC)獲得的永生細(xì)胞系， 例如但不限于中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、HeLa細(xì)胞、乳倉鼠腎細(xì)胞(BHK)、 猴腎細(xì)胞(COS)、人胚腎細(xì)胞(如HEK293)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如Hep G2)、 馬-達(dá)二氏牛腎細(xì)胞("MDBK")及其它細(xì)胞。類似地，細(xì)菌宿主如大腸桿 菌、枯草芽孢桿菌和鏈球菌也可用作本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物。本發(fā)明可用的
26酵母菌宿主包括釀酒酵母菌、白色念珠菌、麥芽糖念珠菌、多形漢森酵 母菌、脆壁克魯維酵母菌、乳酸克魯維酵母菌、高里畢赤酵母菌(P/c/n'a gw〃/eWmo"A7)、巴斯德畢赤酵母菌(尸/c/ /a pflWo〃\s)、稷酒裂殖酵母菌 OS"c/n'z(Wflcc/ flromj;ces pom6e)禾卩耳l5羅維亞洲酵母菌(7(a7Tow,fl /^ o/j"ca)等。 用于桿狀病毒表達(dá)載體的昆蟲細(xì)胞包括埃及伊蚊、苜蓿丫紋夜娥 (y4wtogra/ /^ ca/z/orm'ca)、家香、黑腹果蟲場、秋行軍蟲0S; O(iop/era々wg^7e^/a) 和粉紋夜娥(7Wc/w/ /w^ "/)細(xì)胞等。
根據(jù)所選擇的表達(dá)系統(tǒng)和宿主，可在能表達(dá)感興趣免疫原的條件下， 培養(yǎng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來生產(chǎn)本發(fā)明的免疫原。然后從宿主細(xì)胞 分離得到免疫原并純化。如果表達(dá)系統(tǒng)提供的是分泌型免疫原，可直接從 培養(yǎng)液中純化。如果免疫原不分泌，需從細(xì)胞裂解液中分離。選擇合適的 培養(yǎng)條件和回收方法屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍。
也可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如固相或液相肽合成法，通 過化學(xué)合成來產(chǎn)生TTV免疫原。如果所述抗原較小則優(yōu)選化學(xué)合成肽。固 相肽合成技術(shù)可參見例如，J. M. Stewart和J. D. Young,"腐賴嚴(yán)合成"第 2版，伊利諾斯州羅克福德的皮爾斯化學(xué)公司(Pierce Chemical, Rockford, IL) (1984);以及G. Barany和R. B. Merrifield "肽分析、合成、生物學(xué)(The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology)" , E. Gross禾口 J. Meienhofer主編，第 2巻，紐約學(xué)術(shù)出版社(Academic Press, New York), (1980), 3-254頁；和M. Bodansky，"嚴(yán)會成游辰湮"柏林SV(Springer-Verlag, Berlin) (1984);經(jīng)典 的液相合成技術(shù)可參見E. Gross和J. Meienhofer主編的"肽分析、合成、 生物學(xué)"同上，第l巻。
可利用TTV免疫原來產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體。如需要多克隆抗體， 可用本發(fā)明的免疫原或其片段或突變的免疫原來免疫所選哺乳動物(如小 鼠、家兔、山羊、馬等等)。收集免疫動物的血清并根據(jù)已知方法進(jìn)行處理。 參見例如Jurgens等.(1985)JC/^o肌348:363-370。如果采用含多克隆抗體的 血清，可用已知方法通過免疫親和層析純化此多克隆抗體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也不難制備TTV免疫原的單克隆抗體。利用雜交瘤技 術(shù)制備單克隆抗體的方法是熟知的。通過細(xì)胞融合，也可通過其它技術(shù)如用致癌性DNA直接轉(zhuǎn)化或用EB病毒轉(zhuǎn)染B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生永生的抗體產(chǎn)生 細(xì)胞系。參見例如M. Schreier等，雜3t^"發(fā)術(shù)(7fy6〃V/omfl rec/m/《we^ (1980); Hammerling等，牽克潑貧體與r潘應(yīng)染^"i(Mo"oc/o"a/ ^""6o力'^朋d T-ce〃外6nWom— (1981); Kennett等，卓克廣貧沐fMowoc/om3/ J油7W/e^ (1980);也可參見美國專利4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,452,570; 4,466,917; 4,472,500, 4，491，632和4，493,8卯?？珊Y檢產(chǎn)生的抗感 興趣TTV免疫原或其片段的多組單克隆抗體的各種性質(zhì)，即同種型、表位、 親和力等。利用單克隆抗體通過免疫親和技術(shù)純化它們所針對的各自抗原。 也可將多克隆和單克隆抗體共同用于被動免疫，或與亞單位疫苗聯(lián)用以增 強免疫應(yīng)答反應(yīng)。
TTV制劑和給藥
可將本發(fā)明的滅活、減毒或分離的TTV免疫原單獨或與其它抗原組合， 配制成組合物，如疫苗或診斷組合物，如下所述用于免疫對象。例如，此
組合物可包含其它引起豬疾病的病原體的免疫原，例如但不限于豬細(xì)小
病毒、豬環(huán)病毒、豬生殖和呼吸道綜合征病毒、豬流感病毒、偽狂犬病毒、
引起豬發(fā)熱的豬瘟病毒、豬嗜淋巴皰疹病毒(PLHV1和PLHV2)、支原體 (Afycop/fw廳s; ; )、 纏繞桿斷//￡//006""^ 彎曲桿菌(C續(xù)p盧6fl"er
^; )、 胞內(nèi)勞森菌(Z證s畫'"卿)、胸膜肺炎方文線菌(v4c""o6ac〃/ws 7 /ewro/7wewwow/ae)、雖lJ豬嗜血桿菌(/faemop/n7w5/ anxyw&)、鏈球菌、巴斯《恵 菌CPaWewe〃fl s; ; )、 f少門菌OS"a/mowe〃a ^; / )、 大腸桿菌、梭菌(C7oWn.tZ/wm J7 p)、 紅斑丹毒桿菌C&";Ay;^/c^An'x r力ww'o/ flA,ae)的免疫原。
制備此種制劑的方法可參見例如"雷明頓藥物科學(xué)"，賓夕法尼亞州伊 斯頓(Easton, Pennsylvania)的Mack出版公司，第18版，1990。通常將本發(fā) 明的疫苗制成可注射的液體溶液或懸浮液。也可制成適合的固體劑型，在 注射前溶于運載液配成溶液或懸浮液。也可乳化此制品或?qū)⑵浠钚猿煞职?裹在運載脂質(zhì)體中。配制適合口服的疫苗并不難。通常將免疫原活性成分 與相容的藥物運載體，如水、鹽水、葡聚糖、甘油、乙醇等及其組合混合 在一起。此外，如需要，運載體可含有微量輔助物質(zhì)，如增濕劑、乳化劑和pH緩沖劑。
也可在該制劑中加入能增強疫苗效力的佐劑。佐劑可包括例如胞壁 酰二肽、阿夫立定(avridine)、氫氧化鋁、明礬、弗氏佐劑、不完全弗氏佐 劑(ICFA) 、 二甲基二十八烷基溴化銨(dimethyl dioctadecyl ammonium bromide, DDA)、油、水包油乳劑、皂甙、細(xì)胞因子和該領(lǐng)域已知的其它物 質(zhì)。這類佐劑是熟知的，可從許多商品生產(chǎn)公司來源如迪弗可(Difco)、輝 瑞動物健康公司(Pfizer Animal Heath)、新港實驗室(Newport Laboratories) 等購得。
也可將TTV免疫原與載體相連以提高其免疫原性。合適的載體包括 代謝緩慢的大分子如蛋白質(zhì)，包括血清白蛋白、匙孔血蘭蛋白、免疫球蛋 白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白和該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它蛋白質(zhì)； 多糖，如葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠等；聚合氨基酸如聚谷氨酸、 聚賴氨酸等；氨基酸共聚物；和滅活的病毒顆粒。
可采用天然形式的TTV免疫原，或其功能基團(tuán)經(jīng)修飾后的形式，如琥 珀?；滟嚢彼釟埢蚺c半胱氨酸硫代內(nèi)酯反應(yīng)的修飾形式。例如，也可 通過2-亞氨基硫解酶或3-(4-二硫代吡啶基)丙酸酯的N-羥基琥珀酰亞胺酯
的氨基官能團(tuán)的反應(yīng)將巰基引入載體(或抗原)中。合適的載體也可經(jīng)修飾以 引入間隔臂(例如環(huán)己二胺或類似大小的其他雙官能性分子)用于連接肽。
此外，可將TTV免疫原以中性或其鹽形式配制成疫苗組合物。藥學(xué)上 可接受的鹽包括酸加成鹽(與活性多肽的游離氨基形成的鹽)，它是與無機酸 如鹽酸或磷酸形成的鹽，或與有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等 形成的鹽。也可使游離羧基與無機堿如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵反應(yīng)形 成鹽，與有機堿如異丙胺、三甲基胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因 等反應(yīng)形成鹽。
疫苗制劑含有"治療有效量"的活性成分，即其用量能在給予該組合 物的對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在治療和預(yù)防TTV感染時，本領(lǐng)域技術(shù)人員不 難用標(biāo)準(zhǔn)試驗測定這種"治療有效量"。通常TTV免疫原在組合物中的含 量約為1%-95%(w/w)，或者適當(dāng)時甚至高于或低于此范圍。對于本發(fā)明的 疫苗制劑，當(dāng)每只動物給予0.25-3ml劑量的注射溶液時，每毫升注射液中0.1-500mg，優(yōu)選l-100mg，更優(yōu)選10-50mg，如20、 25、 30、 35、 40mg
等等或以上所述范圍內(nèi)的任何劑量的活性成分應(yīng)足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
如采用滅活的或減毒的制品，組合物通常包含10M0^pfu的TTV，更 具體說104-108 pfu的TTV，優(yōu)選105-107 pfu的TTV。
為了免疫對象，疫苗通常胃腸外給予，常常肌內(nèi)注射給予。然而，其 它給藥方式，如皮下、腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi)注射也是可以接受的。給藥量取決 于所治療的動物，該動物免疫系統(tǒng)合成抗體的能力及所需的保護(hù)程度。本 領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)試驗建立劑量反應(yīng)曲線，不難確定有效劑量。給予 至少一個劑量、優(yōu)選二個或多個劑量的疫苗來免疫對象動物。而且，可能 需要給予動物多個劑量以維持對感染的免疫力。
適合其它給藥方式的其它疫苗劑型包括栓劑，在某些情況下為氣溶膠、 鼻內(nèi)、口服制劑和緩釋制劑。對于栓劑，運載體組合物包含傳統(tǒng)粘合劑和 運載體，如聚亞烷基二醇(polyalkaline glycol)或甘油三酯。由包含約 0.5%-10%，優(yōu)選約1。/。-2。/。(w/w)的活性成分的混合物形成此種栓劑?？诜?運載體包括常用的賦形劑，如藥用甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精 鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些口服疫苗組合物可采取溶液、懸浮液、片劑、 丸劑、膠囊、緩釋制劑或粉末劑的形式，含約10%-95%，優(yōu)選約25%-70% 的活性成分。
鼻內(nèi)給藥劑型通常包含不會刺激鼻粘膜或不會明顯破壞鼻纖毛功能的 運載體?？捎糜诒景l(fā)明的稀釋劑例如有水、鹽水或其它已知物質(zhì)。鼻給藥 制劑也可含有防腐劑，例如但不限于三氯叔丁醇和潔爾滅(benzalkonium chloride)。可加入表面活性劑以促進(jìn)鼻粘膜吸收疫苗蛋白。
控釋或緩釋劑型的制備是將蛋白摻入到載體或運載體中，所述載體或 運載體包括脂質(zhì)體，非重吸收性不能滲透的聚合物如乙烯乙酸乙烯酯共聚 物和熱塑性聚酯彈性共聚物(Hytrel copolymers),可溶脹聚合物如水凝膠， 或重吸收性聚合物如用于制備可吸收縫線的膠原蛋白和某些聚酸或聚酯。 也可利用本領(lǐng)域熟知的植入型微小泵遞送TTV免疫原。
也可通過表達(dá)本發(fā)明TTV免疫原的載體病毒來給予此免疫原。本發(fā)明 可用的載體病毒包括但不限于牛痘苗病毒和其它痘病毒、腺病毒和皰疹
30病毒。例如，可如下構(gòu)建表達(dá)新型蛋白質(zhì)的重組牛痘苗病毒。將編碼特定
蛋白的DNA先插入到合適的載體中，使之毗鄰牛痘啟動子和側(cè)連牛痘DNA 序列，如編碼胸苷激酶(TK)的序列。然后用此載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時用牛痘 感染。同源重組可將牛痘啟動子和編碼本發(fā)明蛋白的基因一起插入到病毒 基因組中。在5-溴脫氧尿苷的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，挑選抗該試劑的病毒空斑， 選出產(chǎn)生的TK'重組體。
另一種可選的給藥途徑涉及基因治療或核酸免疫。可直接給予對象動 物編碼對象TTV免疫原的核酸序列(伴隨調(diào)控元件)使之在體內(nèi)翻譯?；蛘?在活體外用此基因轉(zhuǎn)染對象細(xì)胞或組織，將轉(zhuǎn)化材料重新引入宿主體內(nèi)進(jìn) 行基因轉(zhuǎn)移。通過注射將DNA直接引入宿主生物體內(nèi)(參見國際公開 WO/90/111092和Wolff等(1990)Science MZ: 1465-1468)。也可用已知方法 實施脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。參見例如Hazinski等，(1991) J 7 e^k Ce〃 Mo/. 5/。/. 4:206-209; Brigham等.(1989) / MW Sc,. 298:278-281: Canonico等，(1991) C7/". h. 39:219A;和Nabel等，Sc/e"ce (1990) 249: 1285-1288?？蓪蚁蛑苿玑槍μ囟愋图?xì)胞表面表達(dá)抗原的抗體共 價偶聯(lián)于脂質(zhì)體表面，而將核酸遞送給易感的特定組織和細(xì)胞。
診斷學(xué)
也可利用TTV組合物作為診斷試劑來檢測生物學(xué)樣品中抗TTV的反 應(yīng)活性抗體的存在。例如，用標(biāo)準(zhǔn)的電泳和免疫診斷技術(shù)，包括諸如免疫 競爭試驗、直接反應(yīng)或夾心試驗等免疫試驗，來檢測是否存在與TTV制品 反應(yīng)的抗體。這類試驗包括但不限于蛋白質(zhì)印跡；凝集試驗；酶標(biāo)記介 導(dǎo)的免疫試驗如ELISA;生物素/親和素試驗；放射免疫試驗；免疫電泳； 免疫沉淀試驗等等。反應(yīng)通常包括顯示標(biāo)記如熒光、化學(xué)發(fā)光、放射活性 標(biāo)記、酶標(biāo)記或染料分子，或檢測抗原與抗體之間反應(yīng)形成的復(fù)合物的其 它方法。
上述試驗通常包括將液相中未結(jié)合的抗體與固相支持物上的抗原-抗 體結(jié)合形成的復(fù)合物進(jìn)行分離?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的固相支持物包括硝 酸纖維素基材(如膜或微滴孔形式)；聚氯乙烯基材(如片層或微滴孔)；聚苯乙烯膠乳基材(如珠或微滴板)；聚偏氟乙烯基材；重氮化紙、尼龍膜、活化
珠、反應(yīng)性磁珠等等。
通常在適合結(jié)合的條件，先使固相支持物與固相組分(如一種或多種
TTV抗原)反應(yīng)，使得該組分被充分固定到支持物上。有時，先將抗原與具 有較佳結(jié)合性能的蛋白質(zhì)偶聯(lián)以促進(jìn)抗原固定于支持物。合適的偶聯(lián)蛋白 包括但不限于大分子如血清白蛋白、包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蘭 蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白和該領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的其它蛋白質(zhì)?？捎糜谑乖摽乖c支持物相結(jié)合的其它分子包括多糖、
聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物等。這些分子和將這些分
子與抗原偶聯(lián)的方法是該領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。參見例如Brinkley, M.A" 5/oco"乂wg^e C/zem. (1992) 3:2-13; Hashida等，《/ (1984) 6:56-63; 以及Anjaneyulu禾口 Staros, /",ema〃owa/ J! o/尸ep"V/e awt/ /VWe/w (1987) 30: 117- 124。
固相支持物與固相組分反應(yīng)后，洗漆支持物去除未固定的固相組分， 然后在結(jié)合的結(jié)合條件下，使結(jié)合在支持物上的組分與懷疑含有配體分子 (如針對固定抗原的抗體)的生物學(xué)樣品相接觸。洗滌除去任何未結(jié)合的配體 后，在結(jié)合的結(jié)合條件下加入第二結(jié)合分子，此第二結(jié)合分子能與結(jié)合的 配體選擇性締合。然后用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)檢測是否存在此第二結(jié)合分子。
更具體說，可用ELISA方法，此法中微滴板的各孔被TTV抗原包被。 將含有或懷疑含有抗-TTV免疫球蛋白分子的生物學(xué)樣品加入包被孔中。試 驗中需要用一塊微滴板，用第一抗原分子包被選定數(shù)目的孔，用第二抗原 分子包被另一組孔等等?；蛘?，連續(xù)進(jìn)行一系列ELISA。培育足夠時間使 抗體結(jié)合固定的抗原后，洗滌平板去除未結(jié)合物質(zhì)并加入可檢測標(biāo)記的第 二結(jié)合分子。讓該第二結(jié)合分子與任何捕獲的樣品抗體反應(yīng)，洗滌平板并 用本領(lǐng)域熟知的方法檢測第二結(jié)合分子的存在。
因此，在一個具體的實施方式中，用包含針對抗體配基的抗體的第二 結(jié)合分子不難檢測出生物學(xué)樣品中結(jié)合抗-TTV抗原的配體的存在。本領(lǐng)域 熟知有用的免疫球蛋白(Ig)分子并可從市場上購買。本文所用的Ig分子優(yōu) 選IgG或IgA類，然而在某些情況下，IgM也可能適合。采用該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，不難將Ig分子與可檢測的標(biāo)記酶，如辣根過氧化物酶、 葡萄糖氧化酶、P-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和脲酶等偶聯(lián)。然后用相應(yīng)的 酶底物產(chǎn)生可檢測信號。在其它有關(guān)實施方式中，可用該領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法進(jìn)行競爭性ELISA技術(shù)。
也可在溶液中進(jìn)行試驗，如此病毒蛋白與病毒蛋白的特異性抗體在沉 淀條件下形成復(fù)合物。在一個具體的實施方式中，采用本領(lǐng)域已知的偶聯(lián)
技術(shù)如直接或間接化學(xué)偶聯(lián)，使TTV抗原連接于固相顆粒(如瓊脂糖珠等)。 然后在適合的結(jié)合條件下使抗原包被顆粒與懷疑含有TTV抗體的生物學(xué)樣 品相接觸。結(jié)合抗體之間的交聯(lián)導(dǎo)致形成顆粒性抗原-抗體復(fù)合物凝聚體， 該凝聚體可沉淀并通過洗滌和/或離心與樣品分離?？衫靡恍?biāo)準(zhǔn)方法， 例如上述免疫診斷方法來分析反應(yīng)混合物，以確定其是否存在抗體-抗原復(fù) 合物。
在還有一種實施方式中，提供免疫親和基質(zhì)，將懷疑含有TTV抗體的 生物學(xué)樣品中的多克隆抗體固定在基板上。就這方面而言，先利用固定的 抗原進(jìn)行樣品的初步親和純化。經(jīng)此處理的樣品只含有抗TTV分子，避免 了親和支持物潛在的非特異性結(jié)合。本領(lǐng)域知道有許多固定免疫球蛋白(完 整的或其特異性片段)的方法，產(chǎn)量高并具有良好的抗原結(jié)合活性。不受任 何具體方法的限制，可利用固定的蛋白A或蛋白G來固定免疫球蛋白。
因此，在固定免疫球蛋白以提供免疫親和基質(zhì)后，在適合的結(jié)合條件 下，使具有不同和獨特標(biāo)記的TTV抗原與結(jié)合抗體相接觸。洗滌除去免疫 親和支持物上非特異結(jié)合的抗原之后，用本領(lǐng)域已知方法檢測各特異性標(biāo) 記來確定結(jié)合抗原的存在。
可以試劑盒的形式提供上述分析試劑，包括TTV免疫原、任選固定在 固相支持物上，以及合適的說明書和其它必須試劑，以便執(zhí)行上述免疫試 驗。試劑盒也裝有(取決于所用的具體免疫試驗)合適的標(biāo)記物和其它包裝試 劑和材料(即洗滌緩沖液等)?？捎么嗽噭┖羞M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)免疫試驗，如上述那些 試驗。
3.實施例以下是實施本發(fā)明具體實施方式
的例子。提供這些實施例的目的是為 了說明，不意味以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
業(yè)已作出努力來確保所用數(shù)字(如用量，溫度等)的準(zhǔn)確，但是當(dāng)然應(yīng)允 許存在某些實驗性誤差和偏差。
實施例1
豬基因型1TTV傳染悉生豬
為了確定TTV能否傳染悉生豬而產(chǎn)生TTV豬模型，進(jìn)行了以下實驗。
材料和方法
動物
由剖腹產(chǎn)小隊從擇日交配的妊娠母豬接生獲得悉生小豬，動物飼養(yǎng)條 件和定期收集血液樣品的取樣程序按前人(Krakowka S, Eaton KA (1996)，豬 生物醫(yī)學(xué)石開究進(jìn)展 n(y4t/vo!"ces /" Sw/"e i e5earc/z //),
Tumbleson M, Schook L主編(紐約布萊出版社(Plenum Press, NY))，第 779-810頁)所報告的進(jìn)行。
傳染性TTV的來源和PCR試驗
收集來自20頭無特定病原體飼養(yǎng)的健康幼豬(14-16周齡)的無菌檸檬 酸化血液和血清樣品，冰上保存直到輸送給實驗室。低速離心收集富含白 細(xì)胞的血漿分別-70。C凍存。用PCR按Mclntosh等，Ca"J. (2006)2^:58-61所述檢測配對血清有無豬環(huán)病毒2(PCV2)DNA，也用發(fā)表的 豬引物序列以nPCR試驗檢測有無豬基因型(g)l和g2-TTV DNA(Kekarainen 等，^>o/.(2006)^2:833-837)。
擴(kuò)增序列的分析
擴(kuò)增nPCR-陽性樣品以常規(guī)方法測序。然后將獲得的序列與Genbank 保存的豬基因型(g)l和2TTVDNA排列對比，鑒定為豬gl或2，與這些發(fā) 表的序列同源。
在悉生豬中系列傳代
收集PCV2-DNA陰性、TTV-陽性富含白細(xì)胞的血漿(r^18)，腹膜內(nèi)接 種(IP)3日齡悉生小豬(8.5ml/小豬)。接種28天后，nPCR檢測二頭豬TTVDNA-病毒血癥陽性。結(jié)束此二頭豬生命，制備一頭豬肝臟的20。/。(w/v)勻漿， -70°。凍存。融化第一代(p)勻漿用氯仿抽提二輪(c)以消除了 pl勻漿液中所 含外包膜病毒的感染力(Feinstone等，/"/ec"附mw".(1983)4i:816-821)。將 5ml新融化的cTTVpl勻漿液經(jīng)IP給予2日齡悉生小豬；感染后10天(PID10) 結(jié)束這些小豬生命。無菌收集這些小豬的肝臟和骨髓，分別用nPCR檢測 TTV。制備的小豬10。/。(w/v)骨髓-肝臟勻漿液具有最強的nPCRTTV信號， 用氯仿處理2次取其水相(cTTVp2)-7(TC凍存。融化cTTVp2勻漿液，取0.5ml 如上所述接種(IP)二頭15日齡悉生小豬，在PID10天結(jié)束后收集各小豬的 肝臟和骨髓(cTTVp3)。如上所述，用PCR和nPCR分別檢測骨髓和肝臟有 無TTV DNA，用磷酸緩沖鹽水制作具有最優(yōu)良引物對結(jié)合條帶的配對BM/ 肝臟樣品的勻漿，以10y。(w/v)懸液形式接體內(nèi)接種產(chǎn)生第4代 TTV(TTVp4)。不用氯仿抽提此第4代(TTVp4)而將其分成2.0ml等份-70。C 凍存，作為感染性病毒貯存液供隨后的體內(nèi)致病機理研究。 組織學(xué)和免疫組化分析(IHC):
結(jié)束時，將所有TTV-接種小豬和對照豬的組織切片(腹股溝、腋窩、 腸系膜和支氣管淋巴結(jié)、胸腺、骨髓，脾臟、肝、肺、腎和回腸)收集存放 在冷(4。C)乙醇中，固定24小時，然后作組織學(xué)檢査，用常規(guī)方法蘇木精伊 紅染色。如Krakowka等，r".尸aAo/.(2001) 1^:31-42和Krakowka等， Ca".&t乂 (2007)化:716-724所述，染色雙份組織切片有無PCV2核衣殼蛋 白。用Jones銀染色雙份腎切片和用過碘酸Schiff(PAS)染色基底膜，然后 用生物素化馬抗小鼠IgG檢測豬纖維蛋白原/纖維蛋白(克隆MFB-HB,紐約 州懷斯布的ACS公司(Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY))，用標(biāo)準(zhǔn)ABC試劑盒(Vectastain,加利福尼亞州伯林蓋姆的維克托實 驗室(Vector Laboratories, Burlingame， CA))和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)過氧化 物酶底物顯色。用山羊抗-豬IgG，然后用生物素化抗-山羊IgG(馬里蘭州蓋 瑟斯堡的KP實驗室(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg， MD))， 用標(biāo)準(zhǔn)ABC試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，檢測所選雙份腎切片中豬 IgG的沉積。
原位雜交用設(shè)計的gl-TTV引物和地高辛-標(biāo)記的核苷酸通過原位雜交(ISH)檢測 所選組織是否存在TTVDNA。簡言之，乙醇固定的雙份組織切片用二甲苯 脫蠟，用過氧化氫甲醇液猝滅，經(jīng)蛋白酶消化后用標(biāo)準(zhǔn)方法與標(biāo)記探針(37 。C和55。C)雜交。基本上如Hamberg等，J. F"D/agJ"veW.(2007)i^:135-141 所述，用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗地高辛單克隆抗體檢測標(biāo)記探針，用二 氨基聯(lián)苯胺顯色。ISH的對照包括用PCV2-特異性探針的ISH，省略單克隆 抗地高辛抗體的ISH，無先前ISH用單克隆染色組織以及在TTV陰性組織 切片上的ISH。
篩檢豬病原體
檢測了所有終末血清，包括從傳染實驗前TTV-陽性常規(guī)豬收集的樣品 和隨后合并的組織勻漿TTV樣品，以及悉生豬的終末血清樣品，檢測其是 否存在豬細(xì)小病毒(PPV)、豬流感病毒(SIV)、豬生殖和呼吸道綜合征病毒 (PRRSV)，用逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)PCR檢測PRRSV和用PCR檢測SIV RNA和豬環(huán) 病毒(PCV)l型和2型?？祻?fù)期血清用病毒中和試驗(腦心肌炎病毒和傳染性 胃腸病毒)，瓊脂凝膠免疫沉淀試驗(SIV)，血凝抑制試驗(PPV)和 ELISA(PRRSV)檢測有無抗這些病毒的抗體。
實驗設(shè)計
給2日齡悉生小豬腹膜內(nèi)(IP)接種2.0ml氯仿抽提的第一代TTV(cTTV pl)，于PID5(N-2)、 7(N=2)、 21(N二2)和34(N-3)天結(jié)束，進(jìn)行肉眼和組織 學(xué)評價。未感染的分開詞養(yǎng)的對照小豬是同窩小豬(n^2)，不感染，分別于 PID6和34天結(jié)束。第二次體內(nèi)攻擊實驗中，類似地給二窩(n-11)2日齡悉 生小豬IP接種2.0mlTTVp4，于PID 3(N=1)、 5(n=2)、 7(N=1)、 14(N:3)和 35(N-2)天結(jié)束(生命)。保存二窩分開飼養(yǎng)的小豬作為非感染對照，于34天 時結(jié)束。
結(jié)果
直接PCR和嵌套式PCR檢測擴(kuò)增子
嵌套式PCR和直接PCR 二者均從首次接種小豬的合并血漿以及接種 cTTVpl到cTTVp3和cTTVp4的小豬血清、肝臟和骨髓中產(chǎn)生了 292個堿基的擴(kuò)增子。擴(kuò)增從cTTVpl和cTTVp4回收的序列，測序并與Genbank 報告的豬TTV參比基因型(g)l(DQ229865)和g2(DQ229860)的序列作比較。 cTTVpl和cTTVp4擴(kuò)增子與基因組的UTR相匹配；與gl-TTV的同源性各 為94.3%，與g2-TTV序列的相同性低于45%。在接種cTTVpl到cTTVp4 的小豬未發(fā)現(xiàn)基因型2 TTV DNA。用定量PCR(qPCR)檢測每納克(ng)提取 的體內(nèi)各次傳代接種產(chǎn)生的總DNA的gl-TTV DNA拷貝數(shù)。計算得到的數(shù) 值如下cTTVpl(<10拷貝/ng DNA)， cTTVp2(2.0 x 103拷貝/ng DNA)， cTTVp3(1.6x 1()3拷貝/ng DNA)禾口 cTTVp4(1.1 x 1()4拷貝/ng DNA)。 臨床癥狀和肉眼觀察發(fā)現(xiàn)
在cTTVpl或cTTVp4-感染的悉生小豬中均沒有觀察到臨床癥狀。組 織肉眼檢査鑒定發(fā)現(xiàn)PID5天終止時3只小豬有2只，PID7天終止時3只 小豬有1只，14天終止時3只小豬有2只患間質(zhì)性肺炎。PID3-7天終止的 小豬見到輕度胸腺萎縮。2只PID14天終止的小豬頭頸部腹側(cè)和胸腔縱隔 有局灶性水腫。1只PID21天小豬顯示右腋窩淋巴結(jié)和臂神經(jīng)叢區(qū)域有局 部水腫。PID34終止小豬大致正常。未感染的悉生小豬無肉眼可見的病損。
組織學(xué)發(fā)現(xiàn)
所有的淋巴組織，不論感染狀態(tài)時或PID時都有細(xì)胞減少和活性不良；
感染和對照小豬的支氣管和腸系膜淋巴結(jié)罕見生發(fā)中心，最可能與飲食中
的粘膜抗原(母豬奶代用品)刺激有關(guān)。PID7天以前終止的小豬胸腺大小減 少不同，主要是由于富含T淋巴細(xì)胞的皮質(zhì)減少。這種變化是暫時的(PID14 天的胸腺與對照豬無區(qū)別)，皮質(zhì)厚度的減少與觀察到的皮質(zhì)細(xì)胞壞死和炎 癥變化無關(guān)。PID21天或較早終止的所有小豬肝臟的肝細(xì)胞胞漿有空泡樣 改變，與輕度脂肪變性/肝糖原浸潤相符。10日齡(PID7)的對照和感染小豬 存在局灶性骨髓外造血。PID14前的肝臟中存在小的(淋巴細(xì)胞和組織細(xì)胞) 混合灶。
gl-TTV-感染小豬肺部組織隨時間(PID依賴)的變化最為顯著。PID5-7 天小豬的肺泡間隔壁增厚，有單個核細(xì)胞和胞外蛋白物質(zhì)中度浸潤。 一只 PID7天小豬的肺切片肺泡間隙中存在纖維蛋白滲出。PID14天3只小豬中 的1只(和PID34天4只小豬中的1只)肺泡間隙有細(xì)胞碎片和纖維蛋白滲出。在PID14-21天，肺部變化成熟可見彌散性間質(zhì)肺炎，特征是蛋白性物質(zhì)集
聚在毛細(xì)血管腔中，肺間隙有彌散性淋巴細(xì)胞和組織細(xì)胞浸潤。PID34終 止時4只小豬中的3只仍存在彌散的小葉間質(zhì)性肺炎。這些小豬的肺病損 嚴(yán)重程度低于PID21天小豬所見到的程度，除了一只小豬有與炎癥性單個 核細(xì)胞活化和出現(xiàn)巨大合胞體細(xì)胞相關(guān)的區(qū)域廣泛的纖維滲出性肺泡炎和 間質(zhì)性肺炎。
PID7天前終止gl-TTV-感染小豬的腎臟未見組織學(xué)改變。然而PID14 天gl-TTVp4-感染小豬的腎臟中腎小球有不同程度腫脹和胞外嗜酸性蛋白 物質(zhì)滲出腎小球間隙偶見炎癥細(xì)胞。PID21天時腎小球病損發(fā)展至PID34 天仍存在，此時所選擇的腎小球中有微量纖維結(jié)締組織增生而瘢痕化。腎 小球的形態(tài)變化與先前膜性腎小球腎病的形態(tài)變化相符。未感染對照小豬 中不存在這種腎小球病損。這些腎小球病損為PAS-陽性，用Jones銀染色 顯示基底膜有不規(guī)則的結(jié)節(jié)性增厚，且豬纖維蛋白原、纖維蛋白和IgG為 IHC-陽性。
原位雜交(ISH)
對所選組織用ISH直接觀察gl-TTV DNA。 PID5-感染小豬的骨髓樣品 含有陽性信號。DAB反應(yīng)產(chǎn)物局限于胞漿，在未確定譜系的大的單核細(xì)胞 樣細(xì)胞核內(nèi)罕見。反應(yīng)產(chǎn)物在胞漿中呈彌散性著色或呈分散性顆粒，提示 為病毒包涵體。在PID5天的脾臟中也發(fā)現(xiàn)含TTV DNA的類似細(xì)胞。
其它豬病原體
ELISA檢測所有小豬為豬呼吸生殖道病毒(PRRSV)血清陰性，rtPCR檢 測所有終末血清為PRRSV RNA陰性。PCR檢測小豬的終末血清為PCV2 DNA陰性，雙份組織切片PCV2核衣殼蛋白染色均為陰性。終末血清豬流 感病毒(SIV)抗體陰性，豬細(xì)小病毒HAI-陰性。
TTV PCR:
各種TTV組織勻漿和所有接種這些勻漿的小豬的gl-TTV nPCR或直 接PCR均為陽性。在所有病例中，接種前悉生小豬血清為TTV-DNA陰性。 接種cTTVp2和其后的小豬組織中含有足夠的TTV DNA，因此常規(guī)PCR 試驗足以檢測出TTV DNA。所有檢査的組織(血清、淋巴結(jié)、胸腺、肺、肝、腎、脾和骨髓)在PID10天后均存在基因型1病毒DNA(數(shù)據(jù)未示出)。
綜上所述，在上述傳染實驗中，所有20只用作悉生小豬體內(nèi)傳代的 TTV原料的常規(guī)小豬的血清中均鑒定到gl-TTV DNA。采用TTV-陽性合并 血漿易于將TTV傳給TTV DNA陰性的悉生幼豬，通過一系列傳代提高了 這些小豬(血漿)的TTVDNA含量，因而體內(nèi)傳代3次后不再需要用嵌套式 PCR來檢測TTV DNA。 PID10天后，所有組織中均檢測到TTV DNA。用 ISH，先在骨髓細(xì)胞中鑒定到TTVDNA，所鑒定的部位是TTV在人體內(nèi)的 復(fù)制位點(Kikuchi等，JM^/.^W. (2000)61:165-170; Okamoto等， 5/o; /2;as.7 es.Comww". (2002) 270:657-662; Rodriguez-Inigo等，^im.J.尸C/zo/. (2000) 156:1227-1234)。
與悉生豬TTV感染有關(guān)的組織學(xué)病損譜顯示其嚴(yán)重程度為PID-依賴 性升高，然后在康復(fù)期(PID21天后)下降。此病損可重現(xiàn)，但在年齡匹配的 未感染對照同窩小豬中不存在；TTV-相關(guān)組織學(xué)變化與疾病的臨床癥狀無 關(guān)。在兒童中，TTV感染與呼吸道疾病和哮喘相關(guān)(Matti等，乂 Km/. (2003) 77:2418-2425; Biagini等，C〃". /"/e".版(2003) 36: 128-129; Pifferi等，J. /"/e". (2005) 192:1141-1148)。肉眼檢查可檢測出TTV-感染豬發(fā)生間質(zhì) 性肺炎并經(jīng)組織學(xué)證實，這強烈提示豬感染TTV也能引起亞臨床呼吸疾病。 類似地，TTV-感染悉生豬肝臟中淋巴細(xì)胞-組織細(xì)胞浸潤提示，肝臟可能是 TTV的復(fù)制位點。的確在人類肝勻漿中證明有TTV復(fù)制性亞型(雙鏈DNA)， 原位雜交在肝細(xì)胞胞漿中鑒定到有TTV DNA(Rodriguez-Inigo等，</. 尸"組(2000) 156: 1227-1234)。
在TTV-感染悉生豬中鑒定到的腎小球病損具有特點。膜性腎小球腎病 可能與循環(huán)的TTV免疫復(fù)合物有關(guān)。對于TTV感染的人，多位學(xué)者提出 腎小球病損可能與TTV感染有關(guān)(Usta等，C/!'". W印/wo/. (2001) 11:335)。在 本實驗中，Jones銀染色顯示腎小球基底膜增厚程度不同，為PAS陽性，基 底膜中或其上面有豬纖維蛋白/纖維蛋白原和IgG的不連續(xù)聚集體。在 PID5/7天豬中無這些改變但在PID14-21天時存在，這強烈提示它們與TTV 病毒血癥有關(guān)，受感染的悉生豬產(chǎn)生了抗TTV抗體效應(yīng)。
悉生生物的標(biāo)志之一是全身淋巴結(jié)和相關(guān)的淋巴細(xì)胞聚集發(fā)育不良。B細(xì)胞相關(guān)生發(fā)中心非常缺乏，富含T細(xì)胞的旁皮質(zhì)區(qū)發(fā)育不良且被膜下竇
缺乏淋巴細(xì)胞。因此，悉生生物缺乏淋巴細(xì)胞和患有低丙球血癥(Krakowka S, Eaton KA (1996)，豬生物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展11(y^va"c^ /" Sw/"e /" 5/omed/cfl/ 7 ewarc/z //), Tumbleson M, Schook L主編(紐約布萊出版社(Plenum Press, NY),第779-810頁)。然而悉生生物的淋巴組織對傳染疾病有反應(yīng)，例如 PCV2感染(Krakowka等，F(xiàn)".尸aAo/. (2001) 38:31-42)，豬細(xì)小病毒 (Krakowka等，F(xiàn)".尸a組(2000) 37:254-266)和纏繞桿菌(Krakowka等， /"/ec,. /mmw". (1987) 55:2789-2796; Krakowka等，K". P^/w/, (1998) 35:274-282; Krakowka等，Jm. 乂 FeL (2005) 66:945-952)。用這些病原體 感染可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞迅速激活，表現(xiàn)為淋巴組織增生和淋巴濾泡發(fā)育；在 病原感染的悉生生物中全面的免疫應(yīng)答。在TTV-感染豬中除短暫的胸腺萎 縮外沒有觀察到淋巴組織的組織學(xué)改變，這是令人驚奇的。無論如何，TTV-感染豬的肺、肝、腎中的組織學(xué)病損顯然與TTV感染有關(guān)。重要的是，這 些變化不能診斷為TTV，它們也在常規(guī)豬中發(fā)生(或其它同住共食豬或有關(guān) 的致病性微生物感染豬)，可能被排除作為與對各種未鑒定的環(huán)境因素的亞 臨床應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)的背景組織學(xué)改變。然而，不僅在此系列研究中而且前 人的報導(dǎo)(Krakowka S, Eaton KA (1996)，豬生物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展II04c/va"ces 〖"iSSW"e S/禱Wca/ i e"wc/z //)， Tumbleson M, Schook L主編(紐約布萊 出版社(Plenum Press, NY))，第779-810頁)中均認(rèn)為未感染的悉生豬缺乏這 些改變，悉生狀態(tài)能夠鑒定與TTV感染相關(guān)的細(xì)微組織學(xué)改變。
豬TTV的這些發(fā)現(xiàn)意味著對社區(qū)醫(yī)療有顯著意義。自從1997發(fā)現(xiàn)它 們以來，學(xué)者們經(jīng)過再三努力嘗試證明在各種人類疾病中TTV的作用。以 前的所有研究因年齡匹配對照組高發(fā)無癥狀TTV感染而造成混亂，事實上 不可能在人類中鑒定到最早期的TTV感染，除非是母-胎兒傳染的罕見情況 或是接受過TTV-陽性血液和血液產(chǎn)品病人的前瞻性研究。此外，缺乏TTV-感染的合適動物模型阻礙了對這些病原體導(dǎo)致人類疾病潛力的研究。已完 成了人源TTV傳染靈長動物的研究(Tawara等，S/oc/zem. 5/op/z;^. Comm肌(2000) 278:470-476)，但這些實驗由于非人靈長動物有它們自己的 猿TTV而變得復(fù)雜。
40因此，悉生生物提供了研究TTV的新方法。采用悉生動物可排除環(huán)境
影響，包括實驗對象在居住環(huán)境中不慎感染了 TTV。感染病原體的悉生動
物中觀察到肉眼可見的改變和組織學(xué)改變，這些改變直接明確地反映了病 原體與宿主之間的相互作用，外部變化如同住共食和合并感染、飲食差異
和環(huán)境壓力不會對其造成混亂。此動物模型系統(tǒng)的開發(fā)對研究人類TTV可 能有廣泛的意義。 實施列2
合并感染豬基因型1 TTV增強了 PCV2-相關(guān)的PWMS
材料和方法 悉生豬
剖腹產(chǎn)小隊從擇日交配的妊娠母豬接生獲得總共36頭悉生小豬，飼養(yǎng) 在無菌有圍欄的隔離單元中(每單元3-6只小豬)。如(Krakowka S, Eaton KA (1996)，豬生物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展II(Jdva"cw /" SvW"e /" i esearc/z //),
Tumbleson M， Schook L主編(紐約布萊出版社(Plenum Press, NY)),第 779-810頁)所述，各感染組在隔開的物質(zhì)齊備的隔離單元中飼養(yǎng)以維持生 物安全性，喂養(yǎng)商品化母豬奶替代品飲食。實驗前和結(jié)束時各隔離單元作 需氧菌和厭氧菌培養(yǎng)驗證悉生生物狀況；所有培養(yǎng)為細(xì)菌菌落陰性。
病毒
采用體內(nèi)傳代的第4代Stoon 1010 PCV2株(OSU/PCV2p4)作為PCV2 攻擊接種源。其10% (w/v)的組織液每毫升含5 x 108 PCV2感染單位，用嵌 套式PCR試驗(Kekarainen等，J. Gen. Virol. (2006) 87:833- 837)檢測沒有基 因型1和2TTVDNA。豬基因型l-TTV最初通過如上所述用來自常規(guī)幼豬 的TTV DNA-陽性血漿輸血給新生的悉生小豬，從悉生小豬中回收。用氯 仿抽提TTV DNA陽性的豬肝臟和骨髓勻漿液(Feinstone等，/"/e". /mmw". (1983) 41:816-821)以去除所有包膜致病病毒(TTVpl)，然后通過三次悉生小 豬系列傳代，第一代至第三代之間用氯仿抽提(分別為TTVpl-3)。第4代勻 漿(TTVp4)的10。/。(w/v)勻漿液不用氯仿抽提，將其分成2.0ml等份-70'C凍 存供隨后的體內(nèi)攻擊實驗用。
實驗設(shè)計將小豬分成以下感染組組A是三窩小豬中未感染的對照豬(n-5);組 B是經(jīng)口鼻單獨感染PCV2/OSUp4(n =6);組C是腹膜內(nèi)(IP)感染 gl-TTVpl(『4)或gl-TTVp4(n=4);組D是感染gl-TTVpl， 7天后感染 PCV2/OSDUp4(n =6);組E是感染gl-TTVp4， 7天后OSU/PCV2(n =6);組 F是感染PCV2/OSUp4， 7天后IP感染gl-TTVp4。收集感染前和每周的血 樣品制備血清，每天觀察小豬有無疾病癥狀至少3次。當(dāng)小豬垂死或感染 后(PID)32-34天終止生命。
PCR:
用常規(guī)方法抽提凍存(-7(TC)的每周和終末血清樣品中的DNA。采用已 發(fā)表的上述基因型1 TTV的引物序列，經(jīng)嵌套式(n)PCR進(jìn)行TTVDNA的 常規(guī)樣品篩檢。用PCR評估PCV2病毒血癥(Mclntosh等，Ca". (2006) 70:58-61)。
組織學(xué)和免疫組化分析(IHC):
收集肺、肝、腎、回腸、脾臟、胸腺、腹股溝、腋窩、支氣管和腸系 膜淋巴結(jié)樣品存放在冷(4'C)100。/。乙醇中，4'C固定24小時，用常規(guī)方法作 組織學(xué)檢查。雙份組織切片用蘇木精伊紅染色，檢査PCV2核衣殼蛋白 (Krakowka等，PaAo/. (2000) 37:274-282; Krakowka等，尸a"o/. (2001) 38:31-42; Krakowka等，K/ro/. /mmw"o/. (2002) 15:567- 582)。也用市
場購得的抗豬纖維蛋白原/纖維蛋白和抗豬IgG的單克隆抗體，以常規(guī)方法， 用VectastainTM試劑盒中的技術(shù)染色雙份腎切片，觀察有無這些蛋白沉積。
簡言之，脫蠟的雙份切片用含3% (v/v)H202的PBS液滅活內(nèi)源性過氧化酶， 與相應(yīng)的單克隆抗體反應(yīng)，用4。/。(v/v)熱滅活的馬血清封閉，與生物素化馬 抗小鼠IgG反應(yīng)，與親和素-過氧化物酶反應(yīng)，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。 結(jié)果
A組未感染對照小豬
A組所有未感染小豬終末時臨床表現(xiàn)正常且組織學(xué)變化與前人報告相 符(Ellis等，J. Vet. Diagn. Invest. (1999) 11:3-14; Krakowka S， Eaton KA (1996)，豬生物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展 SW"e 5/o膨Wca/ 7 ，orc/z //), Tumbleson M, Schook L主編(紐約布萊出版社(Plenum Press, NY)),第779-810頁；Krakowka等，PflAo/. (2000) 37:274-282; Krakowka等， 尸aAo/, (2001) 38:31-42; Krakowka等，/mmww/. (2002) 15:567-582)。 雙份組織切片PCV2核衣殼蛋白染色陰性，接種前和終末血清PCV2和 gl-TTV均呈陰性。
B組只接種PCV2/OSUp4的小豬
所有6頭只感染PCV2/OSUp4的小豬病毒攻擊后均存活且臨床表現(xiàn)均 健康，但終末時有病毒血癥。此組中6頭小豬中的5頭有出現(xiàn)中等支氣管 淋巴結(jié)病，所有6頭有輕度全身性淋巴結(jié)病。6頭小豬中的一頭肝臟蒼白略 黃，6頭小豬中的4頭有輕度胸腺萎縮。組織學(xué)檢查，可見導(dǎo)致淋巴結(jié)病的 淋巴增生(生發(fā)中心，T細(xì)胞依賴區(qū)和中等RE增生)。 一頭豬淋巴結(jié)見有少 數(shù)合胞體巨大細(xì)胞，所有豬肝臟顯示有中等炎癥性單核細(xì)胞浸潤。雙份組 織切片PCV2核衣殼蛋白染色揭示有散在的小病灶或含有反應(yīng)產(chǎn)物的少數(shù) 單個單核細(xì)胞。這些病灶局限于淋巴組織中，或肝臟和肺中炎癥細(xì)胞浸潤，
但在支氣管淋巴結(jié)中最強。
C組單獨接種gl-TTVpl或gl-TTVp4的小豬
只感染gl-TTVpl的4頭小豬保持臨床表現(xiàn)健康，直至PID32天終止 時。組織學(xué)檢查，淋巴組織細(xì)胞減生，唯一的組織學(xué)變化是支氣管和腸系 膜淋巴結(jié)偶有生發(fā)中心形成，與A組未感染對照小豬相似。4頭小豬中的3 頭肝實質(zhì)中偶有炎癥細(xì)胞浸潤和彌散性間質(zhì)肺炎。腎臟中，腎小球中等腫 脹，伴細(xì)胞外嗜酸性蛋白滲出和區(qū)段性腎小球硬化。3頭小豬在PID20天 時gl-TTV DNA-nPCR強陽性，而一頭豬此期間gl-TTV DNA弱陽性。所 有4頭小豬終末血清樣品PCR檢測PCV2 DNA陰性。只感染gl-TTVp4的 悉生小豬中可見類似結(jié)果，只是腎小球病損更嚴(yán)重，間質(zhì)性肺炎更明顯， 且所有4頭豬終末血清gl-TTV DNA病毒血癥強陽性。這些接種小豬終末 時臨床也無癥狀。所有g(shù)l-TTV感染小豬的終末血清PCV2DNA陰性。
D組感染gl-TTVpl和OSDUp4， 7天后
6頭雙重感染小豬中的3頭發(fā)生急性致命的突發(fā)PMWS。感染PCV2 后18天1頭小豬突然死亡，另二頭小豬垂死并于感染PCV2后19天終止 生命。所有3頭患PMWS的小豬有全身性淋巴結(jié)病、胸腺萎縮、腹水，肝臟蒼白略黃。淋巴組織中深度淋巴缺損，所有的B和T細(xì)胞區(qū)被組織細(xì)胞 和肉芽腫炎癥完全取代。所有3頭小豬均存在大量肝細(xì)胞彌散性壞死。雙
份組織切片PCV2核衣殼蛋白染色揭示，肝細(xì)胞和其它上皮細(xì)胞如支氣管
上皮、扁桃腺上皮和覆蓋回腸淋巴濾泡的腸道上皮細(xì)胞有壓倒性彌散感染。 腎臟切片中，除了腎小管上皮細(xì)胞為病毒陽性外，腎小球顯示有免疫復(fù)合
物形態(tài)的PCV2-陽性物質(zhì)的強線性沉積。這些腎小球沉積物也是IgG和纖 維蛋白原/纖維蛋白陽性。
實驗后存活下來的3頭雙重感染小豬有肉眼可見的病損，為"中等-嚴(yán) 重"亞臨床PCV2感染。存在全身淋巴結(jié)病但所有3頭豬的胸腺大小在正 常范圍內(nèi)。 一頭豬輕度腹水，另一頭豬肝臟略"蒼白"。所有亞臨床/感染 豬中，肺部維持腫脹和堅硬，比正常"略硬"，提示有間質(zhì)性肺炎。2頭小 豬治愈了小的腎皮質(zhì)梗死。組織學(xué)和IHC檢查揭示，所有3頭豬為亞臨床 但主動感染了 PCV2。所有6頭小豬的終末血清含有g(shù)l-TTV和PCV2 DNA。
E組感染gl-TTVp4和OSDU/PCV2, 7天后
3日齡的6頭小豬IP感染TTVp4， 一周后ON接種PCV2/OSUp4。在 PCV2感染后PID18天， 一頭小豬發(fā)生急性食欲減退，PID19天發(fā)生臨床上 明顯的PMWS(黃疸、浮腫、腹水)而終止(生命)。第二頭小豬PCV2感染后 PID25天突然死亡。這頭小豬中，廣泛的胸腔積液和伴嚴(yán)重的彌散性間質(zhì) 性肺炎的肺水腫是最可能的死因。第3頭小豬于PID21天發(fā)生皮下水腫， 食欲減退，PCV2感染后32天時結(jié)束(生命)。所有3頭死亡的小豬均有全 身性淋巴結(jié)病、胸腺萎縮、肝臟小而蒼白略黃，是悉生豬發(fā)生PMWS的典 型特征。此接種組6頭小豬中的3頭在35天結(jié)束時仍存活，雖然其中一頭 結(jié)束時仍有輕度皮下水腫和腹水。其余2頭雙重感染的小豬結(jié)束時臨床表 現(xiàn)健康，有肉眼可見和組織學(xué)病損，與亞臨床PCV2感染相符。此第二次 實驗豬組織中的組織學(xué)和IHC發(fā)現(xiàn)類似于D組豬，只是胸腔積液的小豬有 廣泛的間質(zhì)性PCV2核衣殼蛋白陽性肺炎。
F組感染PCV2/ OSDUp4和gl-TTVp4， IP7天后 在該實驗組中，6頭3日齡悉生小豬感染PCV2/OSDUp4， 一周后感染 gl-TTVpl。此外，此感染組中2頭小豬還按前人(Krakowka等，尸flAo/.(2001) 38:31-42)所述，用不完全弗氏佐劑乳化的匙孔血蘭蛋白(KLH/ICFA) 免疫進(jìn)行免疫刺激。2頭KLH/ICFA免疫小豬在PCV2/ OSDUp4感染后約2 周顯示了短暫(2-3天)的食欲減退和皮下水腫但恢復(fù)，結(jié)束時臨床正常(35 天齡，PCV2感染后32天)。此感染方案雙重感染的所有6頭小豬均存活。 所有6頭小豬的肉眼可見和組織學(xué)病損與穩(wěn)定的亞臨床PCV2感染相符， 即胸腺大小正常，檢測到的淋巴結(jié)病歸因于KLH/ICFA-相關(guān)的肉芽腫和淋 巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生的聯(lián)合作用。IHC發(fā)現(xiàn)病毒抗原以單個陽性細(xì)胞的形 式限于淋巴組織。
綜上所述以上實驗表明，有效感染豬gl-TTV加速了用PCV2攻擊的 悉生小豬發(fā)生PMWS。雖然這些數(shù)據(jù)加強了 TTV是促進(jìn)PMWS的感染因 子的觀點，但TTV促進(jìn)的機制看來與PMWS的其它共同感染的機制有所 不同。對于后者，認(rèn)為免疫刺激是促進(jìn)PMWS的關(guān)鍵。而對于前者，TTV 感染伴隨的免疫激活組織學(xué)證據(jù)微弱甚至沒有，但用該物質(zhì)共同感染顯然 促進(jìn)了 PMWS。
而且，共同感染的順序決定了臨床結(jié)局。PCV2感染后再感染TTV不 能促進(jìn)PMWS，而TTV感染先于PCV2感染則可。也存在其它差別。雖然 潛伏期隨PPV或PMWS免疫方式而不同，但在PCV2感染后4-5周之間可 見臨床表現(xiàn)。以TTV為例，早至PID18天(平均PID23天)，大約二周前就 有PMWS表現(xiàn)。此外，在TTV動物模型中，PCV2的嗜性急速擴(kuò)大，能顯 著感染上皮細(xì)胞(腸道、呼吸道、腎小管和肝上皮細(xì)胞)，伴有全身淋巴組織 感染。就此點而言，此TTV模型更類似于環(huán)孢霉素A-誘導(dǎo)的PMWS免疫 抑制作用模型(Krakowka等，h>o/. /m m/"o/. (2002) 15:567-582)。
鑒于與TTV單獨感染相關(guān)的組織學(xué)病損譜(不同)，gl-TTV介導(dǎo)的這種 潛在作用出乎意料且確實不可預(yù)測。因此，如大多數(shù)學(xué)者假設(shè)的那樣，看 來TTV事實上不是^害的病毒。
因此，本發(fā)明描述了治療、預(yù)防和診斷TTV感染的方法，以及用于此 方法的組合物。雖然已相當(dāng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但應(yīng)理 解可不背離本發(fā)明權(quán)利要求書所明確的思路和范圍對其作出明顯的變化。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含藥學(xué)上可接受的運載體和至少一種選自下組的豬托克特諾病毒(TTV)免疫原滅活的免疫原性豬TTV，減毒的免疫原性豬TTV和分離的免疫原性豬TTV多肽。
2. 如權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含滅活的 免疫原性豬TTV。
3. 如權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含減毒的 免疫原性豬TTV。
4. 如權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含分離的 免疫原性豬TTV多肽。
5. 如權(quán)利要求1-4中任何一項所述的組合物，其特征在于，所述組合 物還包含佐劑。
6. —種治療或預(yù)防豬對象TTV感染的方法，所述方法包括給予所述對 象治療有效量的如權(quán)利要求1-5中任何一項所述的組合物。
7. —種治療或預(yù)防豬對象的豬環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)的方法，所述 包括給予所述對象治療有效量的如權(quán)利要求1-5中任何一項所述的組合物。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是斷奶后多 系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是豬皮炎和 腎病綜合征(PDNS)。
10. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是豬環(huán)病毒 2型(PCV2)
11. 一種制備組合物的方法，其包括(a) 提供至少一種選自下組的豬托克特諾病毒(TTV)免疫原滅活的免 疫原性豬TTV，減毒的免疫原性豬TTV和分離的免疫原性豬TTV多肽； 和(b) 將所述TTV免疫原與藥學(xué)上可接受的運載體組合。
12. 如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，所述方法還包括提供佐劑。
13. —種檢測脊椎動物對象的托克特諾病毒(TTV)感染的方法，所述方法包括(a) 提供來自對象的生物學(xué)樣品，和(b) 在所述生物學(xué)樣品中存在的TTV抗體能與TTV多肽結(jié)合的條件下， 使所述生物學(xué)樣品與至少一種分離的免疫原性豬TTV多肽反應(yīng)，從而檢測該對象是否存在TTV感染。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法還包括(c) 除去未結(jié)合的抗體；(d) 提供一種或多種能與所述結(jié)合抗體締合的分子；和(e) 檢測所述一種或多種分子的存在與否， 從而檢測是否存在TTV感染。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述可檢測的標(biāo)記是熒 光素或酶。
16. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)樣品是豬血 清樣品。
17. —種用豬托克特諾病毒(TTV)分離物感染TTV-陰性的幼豬、隔離 屏障飼養(yǎng)的無特定病原體小豬、或剖腹產(chǎn)小豬的方法，所述方法包括(a) 從豬對象分離TTV;和(b) 給予所述小豬足以導(dǎo)致TTV感染劑量的TTV分離物。
18. —種評價疫苗預(yù)防托克特諾病毒(TTV)感染的能力的方法，所述方 法包括(a) 將候選疫苗給予豬對象；(b) 使步驟(a)的豬對象接觸劑量足以引起未接種疫苗對象發(fā)生感染的 豬TTV分離物；和(c) 觀察該豬對象中TTV感染的發(fā)生率，從而評價該候選疫苗預(yù)防TTV 感染的能力。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述豬對象是TTV-陰 性的幼豬、隔離屏障詞養(yǎng)的無特定病原體小豬、或剖腹產(chǎn)小豬。
20. —種評價疫苗預(yù)防豬環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)的能力的方法，所述方法包括(a) 將候選疫苗給予豬對象；(b) 使步驟(a)的豬對象接觸劑量足以引起未接種疫苗對象發(fā)生感染的豬托克特諾病毒OTv;)分離物；和(c) 觀察該豬對象中PCVAD的發(fā)生率，從而評價該候選疫苗預(yù)防 PCVAD的能力。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述豬對象是TTV-陰 性的幼豬、隔離屏障飼養(yǎng)的無特定病原體小豬或剖腹產(chǎn)小豬。
22. 如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是斷奶后 多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)。
23. 如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是豬皮炎 和腎病綜合征(PDNS)。
24. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是豬環(huán)病毒 2型(PCV2)。
25. —種鑒定能治療豬托克特諾病毒(TTV)感染的化合物的方法，所述 方法包括(a) 使TTV-陰性的幼豬、隔離屏障飼養(yǎng)的無特定病原體小豬、或剖腹產(chǎn) 小豬接觸劑量足以引起所述小豬發(fā)生感染的豬TTV分離物；(b) 向所述受感染的小豬遞送某化合物或一系列化合物；和(c) 檢測步驟(b)的小豬是否存在TTV，和/或與未治療的TTV-感染小豬 相比，是否發(fā)生、抑制或改善了 PCVAD癥狀。
全文摘要
本說明書公開了治療、預(yù)防和診斷豬托克特諾病毒(TTV)感染的組合物和方法。也說明了鑒定用于治療和預(yù)防TTV感染的化合物的方法，以及產(chǎn)生這種感染動物模型的方法。
文檔編號C12Q1/70GK101588814SQ200780037541
公開日2009年11月25日 申請日期2007年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月5日
發(fā)明者J·A·埃利森 申請人:西爾巴斯生物學(xué)股份有限公司